專利名稱：耐低溫杜氏藻的誘變、選育及其鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種杜氏藻，尤其是涉及一種單細胞綠藻——杜氏藻屬中的兩個種，巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)和鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)，以及采用紫外線誘變、選育獲得這兩種杜氏藻的耐低溫突變株及其鑒定的方法。
背景技術：
杜氏藻(Dunaliella sp.)又稱鹽藻，是一類單細胞真核綠藻，天然沒有細胞壁，容易被消化。杜氏藻細胞中灰分含量較低，富含甘油、蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素、碳水化合物以及一定量的不飽和脂肪酸和維生素，是較為理想的保健食品之一，也可以作為動物的優(yōu)質(zhì)餌料和飼料，因此成為人類主要的養(yǎng)殖微藻之一，在商業(yè)開發(fā)中具有很高的利用價值。杜氏藻最適生長溫度為25～30℃，當溫度低于10℃時，杜氏藻生長緩慢，甚至不生長，形成胞囊細胞。冬季氣溫低，杜氏藻難以露天養(yǎng)殖。因此世界幾個主要的杜氏藻養(yǎng)殖國家，如澳大利亞、美國和以色列都只能在熱帶或亞熱帶的氣溫較高的地區(qū)進行養(yǎng)殖，在氣溫較低的冬季整個養(yǎng)殖場只能閑置，導致養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益不夠高。如果能獲得一種能在較低溫度(5～10℃)下還能基本正常生長的杜氏藻，則既能明顯提高現(xiàn)有杜氏藻養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益，又能使杜氏藻的養(yǎng)殖區(qū)北移(北半球)和/或南移(南半球)，具有十分顯著的作用。參見以下文獻1.Ben-Amotz A，Avron M.The biotechnology of mass culturing Dunaliella forproducts of commercial interest.InCresswell R C et al.eds.Algal andCyanobacterial Biotechnology.Longman Scientific and Technocial Press.198990～114.
2.Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniantis T.Molecular CloningA Laboratory Mannual(2nd).Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.(金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南(第二版).北京科學出版社，1996).
3.Ginzburg M.Dunaliellaa Green Alga Adapted to Salt[J].Advances in BotanicalResearch，1987，1493-183.
4.張會勇，劉廣發(fā)，林慧馨.杜氏藻種間關系RAPD分析[J].廈門大學學報(自然科學版)，2001，40(6)1289-1294.
5.游蘭英，劉廣發(fā)，林建明.杜氏藻同步化生長及核型分析[J].廈門大學學報(自然科學版)，1997，36(2)276-281.
6.古玉環(huán)，陳軍.鹽生杜氏藻Dunaliella salina的生物學特性與培養(yǎng)研究[J].西北師范大學學報，1995，4(31)52-55.
7.鄭維發(fā)，曾昭琪.淡水藍藻的低溫適應.湖泊科學，1994，6(4)356-361.
8.姜建國，朱躍輝，黃洋.10L容積光生物反應器批次培養(yǎng)鹽藻的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(11)6～10.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的杜氏藻難以在低溫下誘變、選育等問題，提供一種耐低溫杜氏藻突變株以及采用紫外線誘變、選育耐低溫杜氏藻的技術路線及其鑒定方法。本發(fā)明的技術方案是以紫外線誘變的方法獲得在低溫(3～10℃)下還能基本正常生長的突變藻株。
本發(fā)明所述的耐低溫杜氏藻突變株的特征為(1)在3～10℃下光照培養(yǎng)還能基本正常生長，達到(1.05～8.11)×106個細胞/mL；(2)杜氏藻耐低溫突變株與野生型原出發(fā)株之間的遺傳相似系數(shù)I為0.680～0.910；(3)杜氏藻耐低溫突變株與野生型原出發(fā)株相比，在進行SDS-PAGE電泳時將出現(xiàn)一至若干條新的蛋白帶，如在大約36和158kDa處各多出一條新的蛋白帶，同時也可能喪失一至若干條蛋白帶；或在某一位置的蛋白帶前者比后者的表達量高，如在大約27和29kDa處耐低溫突變株表達的蛋白量比野生型原出發(fā)株高，或者反過來的情況也有出現(xiàn)。
本發(fā)明所述的耐低溫杜氏藻的誘變、選育及其鑒定方法的具體步驟如下1)將杜氏藻的人工海水培養(yǎng)基分裝封口、滅菌；2)取出滅菌過的培養(yǎng)基，冷卻至室溫后，接種杜氏藻；3)分別經(jīng)光照和黑暗的光周期誘導，杜氏藻出現(xiàn)同步化生長；4)取出藻液，以碘液或溴酚藍液混勻藻液，滅活杜氏藻，取樣計算藻液中杜氏藻細胞的密度；5)取處于指數(shù)生長期細胞分裂階段的杜氏藻藻液，傾注于培養(yǎng)皿中，置紫外燈下照射進行誘變，然后暗培養(yǎng)；6)將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液混勻，涂布到杜氏藻固體培養(yǎng)基上，低溫光照培養(yǎng)；7)挑取生長迅速的單藻落分別接種到少量培養(yǎng)液中，在低溫光照下擴大培養(yǎng)；8)取步驟7)所得的杜氏藻和野生型原出發(fā)株移接到含新鮮培養(yǎng)液的容器中擴大培養(yǎng)；9)取樣檢測、比較杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株在低溫光照下的生長曲線；10)提取各杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總DNA，并以10聚核苷酸隨機引物對這些總DNA進行隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)比較；
11)根據(jù)比較的統(tǒng)計數(shù)字計算杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株之間的遺傳相似系數(shù)；12)提取杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白質(zhì)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果；13)比較杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株兩者的蛋白電泳圖譜，找出杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株之間的共同點與不同之處；14)根據(jù)在低溫環(huán)境下基本能正常生長的新特征和RAPD研究及蛋白質(zhì)分析結(jié)果，確認獲得耐低溫杜氏藻突變株。
在步驟1)中，配制培養(yǎng)杜氏藻的人工海水培養(yǎng)液的組成如表1。將人工海水培養(yǎng)液分裝在100～250mL的錐形瓶中，每瓶裝量20～50mL，棉花塞塞緊或用8層紗布封口，包上牛皮紙。將包裝好的培養(yǎng)液放置在高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌15～20min。
在步驟2)中，取出滅菌過的培養(yǎng)液，冷卻至室溫后，在超凈工作臺中取1～5mL杜氏藻藻液接種在無菌培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，重新塞上棉花塞或封好紗布。
在步驟3)中，所述的光照和黑暗的光周期誘導是在20～30℃的培養(yǎng)箱中每天2000～4000燭光(lx)光照12h，黑暗12h，連續(xù)培養(yǎng)2～5d；可以是靜止培養(yǎng)，每天手搖數(shù)次，每次10～20s；或在搖床上以30～150rpm的速度搖動。獲得同步化生長的杜氏藻。
表1杜氏藻培養(yǎng)液組成

在步驟4)中，可每天或隔天取出0.3～0.5mL藻液，以等量的碘液或溴酚藍液混勻藻液，滅活杜氏藻。立即取樣在血球計數(shù)板上計算藻液中杜氏藻的密度。重復計數(shù)3次，取平均值，繪制杜氏藻的生長曲線。所用的碘液為碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水100mL。先用少量蒸餾水溶解碘和碘化鉀，待完全溶解后再定容到100mL。所用的溴酚藍溶液為0.25％的溴酚藍溶解在40％的蔗糖溶液中。杜氏藻藻液細胞密度的計算也可以用光密度法。即取出適量藻液，注入比色杯中，在OD630處讀取數(shù)值，依據(jù)公式“細胞密度＝899.08×OD630-12.544”換算成藻液細胞密度。以杜氏藻培養(yǎng)時間為橫軸，以培養(yǎng)液中的藻細胞密度為縱軸，繪制杜氏藻的生長曲線。
在步驟5)中，取處于指數(shù)生長期細胞分裂階段的杜氏藻藻液傾注于無菌培養(yǎng)皿中，置超凈工作臺中紫外燈下照射進行誘變，所用超凈工作臺應事先擦凈并以紫外線殺菌15～20min；每個無菌培養(yǎng)皿中約盛5～30mL藻液；超凈工作臺中的紫外燈為20～30瓦，紫外燈與培養(yǎng)皿的距離為12～18cm，紫外線照射時間為50～100s；照射后關閉紫外燈，蓋上培養(yǎng)皿蓋，用不透光的紙包好培養(yǎng)皿進行暗培養(yǎng)；暗培養(yǎng)的溫度為20～30℃，時間為48～72h。
在步驟6)中，可將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液按1∶(1～10)的比例混勻，吸取均勻藻液50～500μL涂布到杜氏藻固體培養(yǎng)基上。杜氏藻涂抹到固體培養(yǎng)基上后，培養(yǎng)皿要倒扣培養(yǎng)防止水珠產(chǎn)生，并以封口膜密封上下皿蓋間的縫隙，防止培養(yǎng)基水分逃逸。所述的杜氏藻固體培養(yǎng)基指的是在杜氏藻人工海水培養(yǎng)液中添加1.0％～2.0％的瓊脂；在低溫3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照培養(yǎng)。
在步驟7)中，所述的單藻落是指由單個杜氏藻細胞長成的細胞集落；所述的生長迅速的單藻落是指在同等條件下長得比較大的藻落；以無菌接種環(huán)挑取較大藻落的藻細胞分別接種到含3～8mL杜氏藻培養(yǎng)液的試管中，在低溫3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照的光照培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)。所述的培養(yǎng)杜氏藻的試管應斜放成15～45°，每天手工搖動數(shù)次，每次10～20s，或在搖床上以30～150rpm的速度搖動。
在步驟8)中，所述的擴大培養(yǎng)可在無菌超凈工作臺中取各誘變藻液和對照藻液0.5～2.0mL，加入到裝有50～200mL杜氏藻培養(yǎng)液的錐形瓶中，塞上棉花塞或封好紗布，其標準就是使各藻液的起始細胞密度(OD值)盡可能一致或十分接近；放在3～10℃、1000～4000lx、24h光照的光照培養(yǎng)箱中，每天手工搖動數(shù)次，每次10～20s；或在搖床上以30～150rpm的速度搖動。
在步驟9)中，所述的取樣檢測是指每1～3d取出0.5～4.0mL藻液，按步驟4)所述方法測定各藻液的細胞密度。
在步驟10)中，所述的提取總DNA，是指按常規(guī)方法提取植物總DNA，在紫外分光光度計上檢測該DNA的OD260與OD280的比值。若該比值小于1.8，則說明DNA的純度不夠，應進一步提純；若該比值大于或等于1.8，則可以進行下述實驗。所述的10聚核苷酸隨機引物是指計算機隨機設計的、由10個脫氧核糖核苷酸組成的單鏈DNA；所述的隨機引物對總DNA進行隨機多態(tài)性擴增是指以各藻的總DNA為模板，分別以單鏈10聚核苷酸為引物進行的PCR擴增反應。反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖含量0.8％～1.2％)，在凝膠成像系統(tǒng)掃描和記錄。所選取的引物至少要達到25～30個，每個引物至少重復進行兩次PCR反應，兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果。從這些擴增結(jié)果中遴選條帶清晰、重復性良好的引物進行正式擴增。
在步驟11)中，所述的計算杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株之間的遺傳相似系數(shù)，其公式為I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj為兩樣品經(jīng)過隨機引物擴增后各自顯示的帶數(shù)之和，Nij為兩樣品共有的帶數(shù)。
在步驟12)中，所述的提取杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白質(zhì)可采用對細胞反復凍融裂解的方法分別提取杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白質(zhì)，保持兩者蛋白濃度的一致性；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的分離膠濃度為10％～12％，濃縮膠濃度為4％～5％。
在步驟13)中，所述的比較杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株兩者的蛋白電泳圖譜是指檢測杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株兩者之間的蛋白泳帶是否有增加或/和減少，或者在兩者蛋白濃度基本一致的條件下，其中一條或幾條的蛋白泳帶比對方相對位置上的蛋白更濃些(含量更高)或更淡些(含量更低)。
由于突變株具有穩(wěn)定的可在較低溫度(3～10℃)下生長的新特點，同時RAPD和SDS-PAGE檢測都證明突變株與原出發(fā)株在DNA和蛋白質(zhì)水平基本相同，但也都各自出現(xiàn)一些不同的突變，因此可以確定已經(jīng)獲得耐低溫杜氏藻突變株。
杜氏藻養(yǎng)殖一般都是在露天的淺池中進行，氣候因素對其生長具有決定性的影響。具備耐低溫特征的杜氏藻將能顯著延長杜氏藻的露天養(yǎng)殖時間，大大提高養(yǎng)殖場的生產(chǎn)效率；此外耐低溫杜氏藻還能使杜氏藻的養(yǎng)殖區(qū)域北移，有利于開辟我國北方養(yǎng)殖杜氏藻的新局面?？梢?，本發(fā)明獲得在低溫(3～10℃)下還能基本正常生長的突變藻株，這必將對延長杜氏藻的一年中的養(yǎng)殖周期、提高養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益具有重要意義。成功誘變、培育耐低溫的杜氏藻具有重要的經(jīng)濟意義和應用價值。


圖1為耐低溫巴氏杜氏藻突變株L-5和野生型原出發(fā)株在5℃的生長曲線。在圖1中，橫坐標為培養(yǎng)天數(shù)/d，縱坐標為細胞數(shù)量(×106個/cm3)，Ba代表野生型原出發(fā)株。
圖2為耐低溫巴氏杜氏藻突變株L-5和野生型原出發(fā)株的RAPD擴增圖譜。在圖2中，M代表DNA分子量標志物，其單位為bp，即堿基對；圖上方的英文字母和數(shù)字的組合(S260、S264、S265)代表各種10聚寡核苷酸隨機引物；5148、2027、1375和831分別代表DNA分子量為5148、2027、1375和831個堿基對。
圖3為耐低溫巴氏杜氏藻突變株L-5和野生型原出發(fā)株用另三種10聚寡核苷酸隨機引物的RAPD擴增圖譜。在圖3中，M代表DNA分子量標志物，其單位為bp，即堿基對；圖上方的英文字母和數(shù)字的組合(S282、S283、S284)代表各種10聚寡核苷酸隨機引物；5148、2027、1375和947代表分別代表DNA分子量為5148、2027、1375和947個堿基對。
圖4為耐低溫巴氏杜氏藻突變株L-5與野生型原出發(fā)株的蛋白SDS-PAGE電泳圖譜。其中M代表蛋白質(zhì)分子量標志物，其單位為kDa(千道爾頓)；Ba代表野生型原出發(fā)株。在大約36和158kDa處L-5比野生型原出發(fā)株各多出一條新的蛋白帶，同時在大約27和29kDa處L-5表達的蛋白量比對照高得多。圖右側(cè)的數(shù)字158、116、66、56、43、36和27分別代表蛋白質(zhì)分子量為158、116、66、56、43、36和27kDa(千道爾頓)。
具體實施例方式以下實施例將對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1采用紫外線誘變、培育耐低溫杜氏藻，先配制培養(yǎng)巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)的人工海水培養(yǎng)液，將各成分事先分組配成50～1000倍的母液，使用時再按需稀釋配制成培養(yǎng)液。配制培養(yǎng)杜氏藻的人工海水培養(yǎng)液的組成如表1所示。將人工海水培養(yǎng)液分裝在100mL的錐形瓶中，每瓶裝量20mL，棉花塞塞緊，包上牛皮紙。把包裝好的上述培養(yǎng)液放置在高壓滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌15min。取出滅菌過的培養(yǎng)基，冷卻至室溫后，取1mL巴氏杜氏藻藻液接種在無菌培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，塞上棉花塞。在20℃的培養(yǎng)箱中每天光照12h，4000Lx，黑暗12h。連續(xù)培養(yǎng)2d，獲得同步化生長的巴氏杜氏藻，即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi)，巴氏杜氏藻出現(xiàn)大量的細胞分裂現(xiàn)象。每天定時取出藻液0.3mL，以等量的碘液滅活巴氏杜氏藻，取樣用血球計數(shù)板計算藻液中巴氏杜氏藻細胞的密度。超凈工作臺事先打開紫外燈殺菌15min。取處于指數(shù)生長期的細胞分裂階段(即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi))的巴氏杜氏藻藻液，傾注于無菌培養(yǎng)皿中，每皿5mL。置超凈工作臺中20w紫外燈下，距離12cm照射100s進行誘變，20℃暗培養(yǎng)72h。將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液以1∶1混勻，吸取混勻藻液50μL涂布到含瓊脂1.0％的杜氏藻固體培養(yǎng)基上，低溫5℃光照1000lx，不間斷光照培養(yǎng)。挑取生長迅速的單藻落分別接種到含3mL杜氏藻培養(yǎng)液的試管中，15°斜放，在5℃以1000lx的光照強度不間斷培養(yǎng)，每天手搖數(shù)次至藻液呈深綠色。取0.5mL上述長成的杜氏藻藻液移接到含50mL新鮮培養(yǎng)液的錐形瓶中，在5℃以1000lx的光照強度不間斷培養(yǎng)，每天手搖數(shù)次，每次10～20s。每3天取樣0.5mL在血球計數(shù)板計數(shù)藻液中耐低溫杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株在低溫培養(yǎng)時的細胞密度，描繪出各自的生長曲線(參見圖1)。由圖1可見，L-5在低溫5℃的情況下仍能基本正常生長，而野生型原出發(fā)株在第48d就已進入生長平衡期，且藻液的細胞密度低得多。實驗觀察到，在5℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，耐低溫杜氏藻突變株L-5藻液的細胞密度逐漸增大，經(jīng)過57d培養(yǎng)，其藻液細胞密度達到8.11×106個細胞/mL，是原始細胞密度的33.8倍，是野生型原出發(fā)株的2.59倍；野生型原出發(fā)株一直到第24d都沒有明顯增長，從第27d才緩慢進入指數(shù)生長期，而到第48d就已經(jīng)達到生長平衡期，其最終藻液密度僅為3.13×106個細胞/mL。提取各杜氏藻總DNA，經(jīng)檢測純度合格后，以25個10聚核苷酸隨機引物對這些總DNA進行隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)比較研究；每個引物至少重復進行兩次PCR反應，并將反應產(chǎn)物在含瓊脂糖0.8％的凝膠上進行電泳。兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果。實驗發(fā)現(xiàn)，其中1個引物不產(chǎn)生任何條帶，7個引物產(chǎn)生不清晰和無法檢測的產(chǎn)物，17個能產(chǎn)生多態(tài)性條帶。從中遴選條帶清晰、重復性良好的12個引物(參見表2)進行正式擴增。實驗共檢測到125個位點，其中11個引物擴增出差異條帶(參見圖2)。
表2 12個10聚核苷酸隨機引物序列及其擴增結(jié)果

根據(jù)上述統(tǒng)計數(shù)字計算耐低溫杜氏藻突變株與野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj為兩樣品經(jīng)過隨機引物擴增后各自顯示的帶數(shù)之和，Nij為兩樣品共有的帶數(shù)。根據(jù)表1計算耐低溫杜氏藻突變株L-5和野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I為0.768，符合變異株的特征。提取耐低溫杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白質(zhì)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。分離膠濃度為10％，濃縮膠濃度為4％。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果(參見圖3)。比較兩者(耐低溫杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株)的蛋白電泳圖譜(參見圖3)，可以看到，在大約36kDa和158kDa處耐低溫杜氏藻突變株L-5比野生型原出發(fā)株各多出一條新的蛋白帶，同時在大約27kDa和29kDa處耐低溫杜氏藻突變株L-5表達的蛋白量比原出發(fā)株高得多(箭頭指處)。根據(jù)在低溫環(huán)境(5℃)下基本能正常生長的新特征和RAPD研究及蛋白質(zhì)分析結(jié)果，確認已經(jīng)獲得耐低溫巴氏杜氏藻突變株。
實施例2與實施例1類似，其區(qū)別在于配制培養(yǎng)鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)的人工海水培養(yǎng)液，將人工海水培養(yǎng)液分裝在250mL的錐形瓶中，每瓶裝量50mL，8層紗布封口，包上牛皮紙。把包裝好的上述培養(yǎng)液放置在高壓滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌20min。取出滅菌過的培養(yǎng)液，冷卻至室溫后，取5mL鹽生杜氏藻藻液接種在無菌培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，8層紗布封口。在30℃的培養(yǎng)箱中每天光照12h，2000Lx，黑暗12h。連續(xù)培養(yǎng)5d，獲得同步化生長的鹽生杜氏藻，即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi)，鹽生杜氏藻出現(xiàn)大量細胞分裂。隔天定時取出藻液0.5mL，以等量的溴酚藍液混勻藻液，滅活鹽生杜氏藻，取樣用血球計數(shù)板計算藻液中鹽生杜氏藻細胞的密度。超凈工作臺事先打開紫外燈殺菌20min。取處于指數(shù)生長期的細胞分裂階段(即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi))的鹽生杜氏藻藻液，傾注于無菌培養(yǎng)皿中，每皿30mL。置超凈工作臺中30w紫外燈下距離18cm照射50s進行誘變，30℃暗培養(yǎng)48h。將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液以1∶10的比例混勻，吸取混勻藻液500μL涂布到含瓊脂2.0％的杜氏藻固體培養(yǎng)基上，低溫3℃光照強度4000lx，不間斷光照培養(yǎng)。挑取生長迅速的單藻落分別接種到含8mL杜氏藻培養(yǎng)液的試管中，45°斜放，在3℃以4000lx的光照強度，10rpm搖床培養(yǎng)至藻液呈深綠色。取2.0mL上述長成的鹽生杜氏藻藻液移接到裝有200mL新鮮培養(yǎng)液的錐形瓶中，在3℃以3000lx的光照強度，150rpm搖床培養(yǎng)。每天取樣4.0mL在分光光度計檢測耐低溫鹽生杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株在低溫培養(yǎng)時的藻液細胞密度，描繪出各自的生長曲線。實驗觀察到，在本培養(yǎng)條件下，耐低溫鹽生杜氏藻突變株藻液的細胞密度逐漸增大，經(jīng)過60d培養(yǎng)，其藻液密度達到1.05×106個細胞/mL，是原始細胞密度的29.2倍。野生型原出發(fā)株一直沒有明顯增長，實驗結(jié)束時其最終藻液細胞密度僅為0.051×106個細胞/mL。提取耐低溫鹽生杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株總DNA，經(jīng)檢測純度合格后，以30個10聚核苷酸隨機引物對這些總DNA進行隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)比較研究。每個引物至少重復進行兩次PCR反應，并將反應產(chǎn)物在含瓊脂糖1.2％的凝膠上進行電泳。兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果。實驗發(fā)現(xiàn)，其中2個引物不產(chǎn)生任何條帶，9個引物產(chǎn)生不清晰和無法檢測的產(chǎn)物，19個引物能產(chǎn)生多態(tài)性條帶。從中遴選條帶清晰、重復性良好的16個引物進行正式擴增。實驗共檢測到136個位點，其中14個引物擴增出差異條帶。
根據(jù)上述統(tǒng)計數(shù)字計算耐低溫鹽生杜氏藻突變株與野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I，I＝0.680，符合變異株的特征。提取耐低溫鹽生杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為5％。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果。比較兩者(耐低溫鹽生杜氏藻突變株與野生型原出發(fā)株)的蛋白電泳圖譜?？梢钥吹?，在大約37kDa和150kDa處耐低溫鹽生杜氏藻突變株比野生型原出發(fā)株各多出一條新的蛋白帶。根據(jù)在低溫環(huán)境(3℃)下基本能正常生長的新特征和RAPD研究及蛋白分析結(jié)果，確認已經(jīng)獲得耐低溫鹽生杜氏藻突變株。
實施例3與實施例1類似，其區(qū)別在于配制培養(yǎng)巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)的人工海水培養(yǎng)液，將人工海水培養(yǎng)液分裝在150mL的錐形瓶中，每瓶裝量30mL，棉花塞塞緊，包上牛皮紙。把包裝好的上述培養(yǎng)液放置在高壓滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌15min。取出滅菌過的培養(yǎng)液，冷卻至室溫后，取3mL巴氏杜氏藻藻液接種在無菌培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，塞上棉花塞。在25℃的培養(yǎng)箱中每天光照12h，3000Lx，黑暗12h。連續(xù)培養(yǎng)3d，獲得同步化生長的巴氏杜氏藻，即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi)，巴氏杜氏藻出現(xiàn)大量的細胞分裂。每天定時取出藻液5mL，在分光光度計檢測藻液的OD630數(shù)值，換算成藻液中巴氏杜氏藻細胞的密度。超凈工作臺事先打開紫外燈殺菌15min。取處于指數(shù)生長期的細胞分裂階段(即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi))的巴氏杜氏藻藻液，傾注于無菌培養(yǎng)皿中，每皿20mL。置超凈工作臺中25w紫外燈下距離15cm照射70s進行誘變，25℃暗培養(yǎng)60h。將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液以1∶5的比例混勻，吸取200μL涂布到含瓊脂1.5％的杜氏藻固體培養(yǎng)基上，低溫10℃，光強3000lx，不間斷光照培養(yǎng)。挑取生長迅速的單藻落分別接種到含5mL杜氏藻培養(yǎng)液的試管中，30°斜放，在10℃以3000lx的光照強度不間斷培養(yǎng)，每天手搖數(shù)次，每次10～20s，培養(yǎng)至藻液呈深綠色。取1.0mL上述長成的巴氏杜氏藻藻液移接到含100mL新鮮培養(yǎng)液的錐形瓶中，在10℃以2000lx的光照強度不間斷培養(yǎng)，每天手搖數(shù)次，每次10～20s。每3天取樣1.5mL在分光光度計測OD630數(shù)值，換算成藻液中耐低溫巴氏杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株在低溫培養(yǎng)時的細胞密度，描繪出各自的生長曲線。實驗觀察到，在10℃光照培養(yǎng)下，耐低溫巴氏杜氏藻突變株藻液的細胞密度逐漸增大，經(jīng)過60d培養(yǎng)，其藻液細胞密度可達7.88×106個細胞/mL，是原始細胞密度的31.2倍，是野生型原出發(fā)株的2.32倍；野生型原出發(fā)株一直到第21d都沒有明顯增長，從第24d開始才緩慢進入指數(shù)生長期，而到第45d就已經(jīng)達到生長平衡期，其最終藻液細胞密度僅為3.40×106個細胞/mL。分別提取耐低溫巴氏杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株的總DNA，經(jīng)檢測純度合格后，以28個10聚核苷酸隨機引物對這些總DNA進行隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)比較研究。每個引物至少重復進行兩次PCR反應，并將反應產(chǎn)物在含瓊脂糖1.0％的凝膠上進行電泳。兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果。實驗發(fā)現(xiàn)，其中3個引物不產(chǎn)生任何條帶，5個引物產(chǎn)生不清晰和無法檢測的產(chǎn)物，20個能產(chǎn)生多態(tài)性條帶。從中遴選條帶清晰、重復性良好的15個引物進行正式擴增。實驗共檢測到135個位點，其中13個引物擴增出差異條帶。
根據(jù)上述統(tǒng)計數(shù)字計算耐低溫巴氏杜氏藻突變株與野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj為兩樣品經(jīng)過隨機引物擴增后各自顯示的帶數(shù)之和，Nij為兩樣品共有的帶數(shù)。經(jīng)計算，耐低溫巴氏杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I為0.910，符合變異株的特征。分別提取耐低溫巴氏杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。分離膠濃度為11％，濃縮膠濃度為4％。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果。比較兩者(耐低溫巴氏杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株)的蛋白電泳圖譜?？梢钥吹剑偷蜏匕褪隙攀显逋蛔冎瓯纫吧驮霭l(fā)株多出兩條新的蛋白帶，同時在大約67kDa處，前者表達的蛋白量比后者高得多。根據(jù)在低溫環(huán)境(10℃)下基本能正常生長的新特征和RAPD研究及蛋白質(zhì)分析結(jié)果，確認已經(jīng)獲得耐低溫巴氏杜氏藻突變株。
實施例4與實施例1類似，其區(qū)別在于配制培養(yǎng)鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)的人工海水培養(yǎng)液，將人工海水培養(yǎng)液分裝在200mL的錐形瓶中，每瓶裝量40mL，8層紗布封口，包上牛皮紙。把包裝好的上述培養(yǎng)液放置在高壓滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌20min。取出滅菌過的培養(yǎng)液，冷卻至室溫后，取4mL鹽生杜氏藻藻液接種在無菌培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，8層紗布封口。在28℃的培養(yǎng)箱中每天光照12h，2500Lx，黑暗12h。連續(xù)培養(yǎng)4d，獲得同步化生長的鹽生杜氏藻，即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi)，鹽生杜氏藻集中出現(xiàn)大量的細胞分裂。隔天定時取出藻液4mL，在分光光度計測藻液的OD630數(shù)值，換算成藻液中鹽生杜氏藻細胞的密度。超凈工作臺事先打開紫外燈殺菌20min。取處于指數(shù)生長期的細胞分裂階段(即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi))的鹽生杜氏藻藻液，傾注于無菌培養(yǎng)皿中，每皿10mL。置超凈工作臺中25w紫外燈下，距離17cm照射60s進行誘變，28℃暗培養(yǎng)52h。將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液以1∶3的比例混勻，吸取300μL涂布到含瓊脂1.5％的杜氏藻固體培養(yǎng)基上，低溫7℃，光強2000lx，不間斷光照培養(yǎng)。挑取生長迅速的單藻落分別接種到含4mL杜氏藻培養(yǎng)基的試管中，20°斜放，在7℃以2000lx的光照強度不間斷培養(yǎng)，以150rpm的速度搖床培養(yǎng)至藻液呈深綠色。取1.5mL上述長成的鹽生杜氏藻藻液移接到含200mL新鮮培養(yǎng)液的錐形瓶中，在7℃以4000lx的光照強度，150rpm的速度搖床培養(yǎng)。每3天取樣3.0mL在分光光度計測OD630數(shù)值，換算成藻液中耐低溫鹽生杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株在低溫培養(yǎng)時的細胞密度，描繪出各自的生長曲線。實驗觀察到，在7℃光照培養(yǎng)下，耐低溫鹽生杜氏藻突變株藻液的細胞密度逐漸增大，經(jīng)過60d培養(yǎng)，其藻液細胞密度可達6.01×106個細胞/mL，是原始細胞密度的31.9倍，是野生型原出發(fā)株的2.11倍；野生型原出發(fā)株一直到第18d都沒有明顯增長，從第21d開始才緩慢進入指數(shù)生長期，而到第48d就已經(jīng)達到生長平衡期，其最終藻液密度僅為2.84×106個細胞/mL。分別提取耐低溫鹽生杜氏藻和野生型原出發(fā)株的總DNA，經(jīng)檢測純度合格后，以27個10聚核苷酸隨機引物對這些總DNA進行隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)比較研究。每個引物至少重復進行兩次PCR反應，并將反應產(chǎn)物在含瓊脂糖0.9％的凝膠上進行電泳。兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果。實驗發(fā)現(xiàn)，其中3個引物不產(chǎn)生任何條帶，6個引物產(chǎn)生不清晰和無法檢測的產(chǎn)物，18個能產(chǎn)生多態(tài)性條帶。從中遴選條帶清晰、重復性良好的14個引物進行正式擴增。實驗共檢測到121個位點，其中12個引物擴增出差異條帶。
根據(jù)上述統(tǒng)計數(shù)字計算耐低溫鹽生杜氏藻突變株與野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj為兩樣品經(jīng)過隨機引物擴增后各自顯示的帶數(shù)之和，Nij為兩樣品共有的帶數(shù)。經(jīng)計算，耐低溫鹽生杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I為0.831，符合變異株的特征。提取耐低溫鹽生杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。分離膠濃度為11％，濃縮膠濃度為5％。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果。比較兩者(耐低溫鹽生杜氏藻突變株和野生型原出發(fā)株)的蛋白電泳圖譜。可以看到，前者比后者多出3條新的蛋白帶，同時發(fā)現(xiàn)在大約56kDa處前者表達的蛋白量比后者低得多。根據(jù)在低溫環(huán)境(7℃)下基本能正常生長的新特征和RAPD研究及蛋白質(zhì)分析結(jié)果，確認已經(jīng)獲得耐低溫鹽生杜氏藻突變株。
權利要求
1.耐低溫杜氏藻突變株，包括耐低溫巴氏杜氏藻突變株和耐低溫鹽生杜氏藻突變株，其特征在于(1)在3～10℃不間斷光照培養(yǎng)1000～4000lx下基本正常生長，達到1.05×106～8.11×106個細胞/mL；(2)巴氏杜氏藻耐低溫突變株、鹽生杜氏藻耐低溫突變株與各自的野生型原出發(fā)株之間的遺傳相似系數(shù)I為0.680～0.910；(3)巴氏杜氏藻耐低溫突變株L-5比野生型原出發(fā)株在36kDa和158kDa處分別多出一條新的蛋白帶，同時在大約27kDa和29kDa處L-5表達的蛋白量比對照高得多。
2.如權利要求1所述的耐低溫巴氏杜氏藻突變株和耐低溫鹽生杜氏藻突變株的誘變、培育方法，其特征在于其步驟為1)將杜氏藻的人工海水培養(yǎng)基分裝封口、滅菌；2)取出滅菌過的培養(yǎng)基，冷卻至室溫后，接種杜氏藻；3)分別經(jīng)光照和黑暗的光周期誘導，杜氏藻出現(xiàn)同步化生長；4)取出藻液，以碘液或溴酚藍液混勻藻液，滅活杜氏藻，取樣計算藻液中杜氏藻細胞的密度；5)取處于指數(shù)生長期細胞分裂階段的杜氏藻藻液，傾注于培養(yǎng)皿中，置紫外燈下照射進行誘變，然后暗培養(yǎng)；6)將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液混勻，涂布到杜氏藻固體培養(yǎng)基上，低溫光照培養(yǎng)；7)挑取生長迅速的單藻落分別接種到少量培養(yǎng)液中，在低溫光照下擴大培養(yǎng)；8)取步驟7)培養(yǎng)所得的杜氏藻和野生型原出發(fā)株移接到含新鮮培養(yǎng)液的容器中擴大培養(yǎng)；9)取樣檢測、比較杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株在低溫光照下的生長曲線；10)提取各杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總DNA，并以10聚核苷酸隨機引物對這些總DNA進行隨機擴增多態(tài)DNA研究比較；11)根據(jù)比較后的統(tǒng)計數(shù)字計算杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株之間的遺傳相似系數(shù)；12)提取杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白質(zhì)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果；13)比較杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株兩者的蛋白電泳圖譜，找出杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株之間的共同點與不同之處；14)根據(jù)在低溫環(huán)境下基本能正常生長的新特征和RAPD研究及蛋白質(zhì)分析結(jié)果，確認獲得耐低溫杜氏藻突變株。
3.如權利要求2所述的耐低溫巴氏杜氏藻突變株和耐低溫鹽生杜氏藻突變株的誘變、培育方法，其特征在于在步驟1)中，配制培養(yǎng)杜氏藻的人工海水培養(yǎng)液的組成如表1所示，表1杜氏藻培養(yǎng)液組成
將人工海水培養(yǎng)液分裝在100～250mL的錐形瓶中，每瓶裝量20～50mL，棉花塞塞緊或用8層紗布封口，包上牛皮紙，把包裝好的培養(yǎng)液放置在高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌15～20min。
4.如權利要求2所述的耐低溫巴氏杜氏藻突變株和耐低溫鹽生杜氏藻突變株的誘變、培育方法，其特征在于在步驟3)中，所述的光照和黑暗的光周期誘導是在20～30℃的培養(yǎng)箱中每天2000～4000lx光照12h，黑暗12h，連續(xù)培養(yǎng)2～5d，采用靜止培養(yǎng)，每天手搖至少1次，每次10～20s；或在搖床上以30～150rpm的速度搖動，獲得同步化生長的杜氏藻。
5.如權利要求2所述的耐低溫巴氏杜氏藻突變株和耐低溫鹽生杜氏藻突變株的誘變、培育方法，其特征在于在步驟4)中，每天或隔天取出0.3～0.5mL藻液，以等量的碘液或溴酚藍液混勻藻液，滅活杜氏藻，立即取樣在血球計數(shù)板上計算藻液中杜氏藻的密度，重復計數(shù)至少2次，取平均值，繪制杜氏藻的生長曲線，所用的碘液為碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水100mL，先用少量蒸餾水溶解碘和碘化鉀，待完全溶解后再定容到100mL，所用的溴酚藍溶液為0.25％的溴酚藍溶解在40％的蔗糖溶液中；杜氏藻藻液細胞密度的計算或用光密度法，即取出藻液注入比色杯中，在OD630處讀取數(shù)值，依據(jù)公式“細胞密度＝899.08×OD630-12.544”換算成藻液細胞密度，以杜氏藻培養(yǎng)時間為橫軸，以培養(yǎng)液中的藻細胞密度為縱軸，繪制杜氏藻的生長曲線。
6.如權利要求2所述的耐低溫巴氏杜氏藻突變株和耐低溫鹽生杜氏藻突變株的誘變、培育方法，其特征在于在步驟5)中，取處于指數(shù)生長期細胞分裂階段的杜氏藻藻液傾注于無菌培養(yǎng)皿中，置超凈工作臺中紫外燈下照射進行誘變，所用超凈工作臺事先擦凈并以紫外線殺菌15～20min；每個無菌培養(yǎng)皿中盛5～30mL藻液；超凈工作臺中的紫外燈為20～30瓦，紫外燈與培養(yǎng)皿的距離為12～18cm，紫外線照射時間為50～100s；照射后關閉紫外燈，蓋上培養(yǎng)皿蓋，用不透光的紙包好培養(yǎng)皿進行暗培養(yǎng)；暗培養(yǎng)的溫度為20～30℃，時間為48～72h。
7.如權利要求2所述的耐低溫巴氏杜氏藻突變株和耐低溫鹽生杜氏藻突變株的誘變、培育方法，其特征在于在步驟6)中，將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液按1∶1～10的比例混勻，吸取均勻藻液50～500μL涂布到杜氏藻固體培養(yǎng)基上，杜氏藻涂抹到固體培養(yǎng)基上后，培養(yǎng)皿要倒扣培養(yǎng)防止水珠產(chǎn)生，并以封口膜密封上下皿蓋間的縫隙，所述的杜氏藻固體培養(yǎng)基指的是在杜氏藻人工海水培養(yǎng)液中添加1.0％～2.0％的瓊脂；在低溫3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照培養(yǎng)。
8.如權利要求2所述的耐低溫巴氏杜氏藻突變株和耐低溫鹽生杜氏藻突變株的誘變、培育方法，其特征在于在步驟7)中，所述的單藻落是指由單個杜氏藻細胞長成的細胞集落；所述的生長迅速的單藻落是指在同等條件下長得比較大的藻落；以無菌接種環(huán)挑取較大藻落的藻細胞分別接種到含3～8mL杜氏藻培養(yǎng)液的試管中，在低溫3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照的光照培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)杜氏藻的試管應斜放成15～45°，每天手工搖動至少1次，每次10～20s；或在搖床上以30～150rpm的速度搖動。
9.如權利要求2所述的耐低溫巴氏杜氏藻突變株和耐低溫鹽生杜氏藻突變株的誘變、培育方法，其特征在于在步驟8)中，所述的擴大培養(yǎng)是在無菌超凈工作臺中取各誘變藻液和對照藻液0.5～2.0mL，加入到裝有50～200mL杜氏藻培養(yǎng)液的錐形瓶中，塞上棉花塞或封好紗布，放在3～10℃、1000～4000lx、24h光照的光照培養(yǎng)箱中，每天手工搖動至少1次，每次10～20s；或在搖床上以30～150rpm的速度搖動。
10.如權利要求2所述的耐低溫巴氏杜氏藻突變株和耐低溫鹽生杜氏藻突變株的誘變、培育方法，其特征在于在步驟10)中，所述的提取總DNA是指按常規(guī)方法提取植物總DNA，在紫外分光光度計上檢測該DNA的OD260與OD280的比值，若該比值小于1.8，則說明DNA的純度不夠，應進一步提純；若該比值大于或等于1.8，則可以進行下述實驗；所述的10聚核苷酸隨機引物是指計算機隨機設計的、由10個脫氧核糖核苷酸組成的單鏈DNA；所述的隨機引物對總DNA進行隨機多態(tài)性擴增是指以各藻的總DNA為模板，分別以單鏈10聚核苷酸為引物進行的PCR擴增反應，反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖含量為0.8％～1.2％，在凝膠成像系統(tǒng)掃描和記錄；所選取的引物至少要達到25～30個，每個引物至少重復進行兩次PCR反應，兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果，從這些擴增結(jié)果中遴選條帶清晰、重復性良好的引物進行正式擴增。
全文摘要
耐低溫杜氏藻的誘變、選育及其鑒定方法，涉及一種杜氏藻，提供一種耐低溫杜氏藻突變株及采用紫外線誘變選育耐低溫杜氏藻及其鑒定方法。取培養(yǎng)基接種杜氏藻；經(jīng)光照和黑暗誘導后出現(xiàn)同步化生長；取藻液與碘液或溴酚藍液混勻，滅活杜氏藻，取杜氏藻藻液注入培養(yǎng)皿，置紫外燈下誘變后暗培養(yǎng)，再與新鮮培養(yǎng)液混勻，涂在杜氏藻培養(yǎng)基上低溫光照培養(yǎng)；取單藻落接種到培養(yǎng)液中，在低溫光照下培養(yǎng)；取樣檢測比較杜氏藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株在低溫光照下的生長曲線；提取總DNA進行RAPD比較；計算遺傳相似系數(shù)；提取總蛋白質(zhì)進行電泳后染色，記錄結(jié)果；比較蛋白電泳圖譜找出異同點；根據(jù)蛋白質(zhì)分析結(jié)果確認獲得耐低溫杜氏藻突變株。
文檔編號C12N13/00GK1888047SQ20061003663
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月24日 優(yōu)先權日2006年7月24日
發(fā)明者劉廣發(fā), 周韜, 陳昱 申請人:廈門大學