專利名稱：核糖體抗性誘變選育萬古霉素生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物的選育，尤其是涉及東方擬無枝酸菌Uff^co/ato;w"on'ewtoto) AO-l的誘變菌株V500-S400-1 (誘變菌株V500-S400-1稱為萬古霉素生產(chǎn)菌株)的誘變選 育方法及其萬古霉素生產(chǎn)菌株的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
萬古霉素是由McCormick等(McCormick MH, Stark WM， Plttenger GE, et al. Vancomycin, a new antibiotic [J]. Chemical and biological properties, 1955-1956， 23: 601-611)于1956年從印 度尼西亞土壤中選育到的一株被稱為東方擬無枝酸菌^附少co/ato/w^ 的發(fā)酵液中分 離得到的具有抗革蘭氏陽性菌的一種糖肽類抗生素。萬古霉素問世后的20年，由于青霉素 和頭孢菌素類抗生素的上市使用及其很強(qiáng)的耳腎毒性，它僅作為保留藥物，用于治療由少數(shù) 耐藥性金黃色葡萄球菌引起的嚴(yán)重感染性疾病，臨床使用很少。后來隨著A內(nèi)酰胺類抗生素 的大量使用，由甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)所引起的感染逐漸流行。1998 2000 年間，MRSA占金黃色葡萄球菌的比例高達(dá)30%以上。在這種情況下，萬古霉素愈來愈受人 們的重視，成為目前臨床上用于治療由MRSA引起的嚴(yán)重感染疾病的首選藥物 (Rimakrishnanl N. Antibacterial activities and modes of action of vancomycin and related glycopeptides[J]. Antimicrobical agents chem., 1991, 35(4): 605-609)，并被國際抗生素專家譽(yù)為 "人類對(duì)付頑固性耐藥菌株的最后一道防線"和"王牌抗生素"。由于萬古霉素作用機(jī)制獨(dú)特， 而且在體內(nèi)易分解，使其不僅在臨床上，而且在畜牧等行業(yè)上也得到了廣泛的應(yīng)用(徐嘉惠. 抗生素工業(yè)信息[M]，北京化學(xué)工業(yè)出版社.1993)。
目前萬古霉素的生產(chǎn)主要采用培養(yǎng)生產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌^ _yc0toto;w& on'e toto的方法獲得，但菌株生產(chǎn)能力有限。研究人員通過各種手段對(duì)菌株進(jìn)行分離、選育 或突變，獲得了一些萬古霉素生產(chǎn)菌株，但耗時(shí)耗力。核糖體突變選育的方法通過引入某些 抗生素(剌激物)對(duì)菌體核糖體蛋白合成的相關(guān)基因進(jìn)行刺激，使得抗生素基因超量表達(dá)，從 而提高菌株生產(chǎn)能力，是一種簡單有效的菌株誘變選育方法。Shima等(Shima J, Hesketh A, Okamoto S, et al. Induction of actinorhodin production by r^wZ (encoding ribosomal protein SI2) mutations that confer streptomycin resistance in Syrepfo附j(luò)v"cgs //vzWo"s and coe/z'co/orA3(2)[J]. Bacteriol, 1996, 178(24): 7276-7284)發(fā)現(xiàn)將鏈霉素抗性引入野生的d藍(lán)色鏈霉菌，可 以使放線菌紫紅素產(chǎn)量提高10倍，胡海峰等(Hu HF, Ochi K. Novel approach for improving the productivity of antibiotic-producing strains by inducing combined resistant mutations[J]. Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67(4): 1885-1892)利用聯(lián)合誘變(str-rif-gen)先后引入d藍(lán)色鏈霉菌， 使得放線菌紅素產(chǎn)量最大提高了 48倍。將這一技術(shù)應(yīng)用于Sdo7/船屬和Aewflfowo"as屬， 使其抗生素產(chǎn)量提高5 50倍。涂國全等(涂國全，劉姝.通過獲得鏈霉素抗性基因(str)突變 株選育梅嶺霉素萬古霉素生產(chǎn)菌株[J].中國抗生素雜志，2002， 27(6): 321-325)通過獲得str抗 性突變株選育梅嶺霉素萬古霉素生產(chǎn)菌株，獲得突變產(chǎn)量提高了 77.9%。陶純長等(陶純長, 諶頡.鏈霉素抗性突變理性選育avermetin萬古霉素生產(chǎn)菌株[J].中國抗生素雜志，2002, 27(9): 521-523)利用鏈霉素抗性選育avermetin萬古霉素生產(chǎn)菌株，得到的突變株產(chǎn)素能力提 高30%以上。Nagy等(Nagy M, Jarai M， Financsek I， et al. Process for the preparation of vancomycin[P]. U.S. 1993: N0.5223413)對(duì)萬古霉素產(chǎn)生菌株M&TOpo/yra NCAIM 001091進(jìn)行誘變，將誘變后的飽子懸液分別涂布在鏈霉素和卡那霉素抗性平板上，最終選 育到V-l和V-2兩株萬古霉素生產(chǎn)菌株，并進(jìn)行了 12 L發(fā)酵罐的放大試驗(yàn)，30 °C、 600 rpm 培養(yǎng)120 h，終產(chǎn)量可達(dá)3.6 3.8 g/L。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供東方擬無枝酸菌"附少co/"to戸"AO-1的誘變菌株 V500-S400-l (誘變菌株V500-S400-1稱為萬古霉素生產(chǎn)菌株)的誘變選育方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供萬古霉素生產(chǎn)菌株在制備萬古霉素中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述萬古霉素生產(chǎn)菌株為東方擬無枝酸菌"ff^co/ato/w/s w/e"tofc) AO-1的誘 變菌株V500-S400-l ，已于2009年4月保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心，微牛物菌種保藏號(hào)為CGMCCNo. 3046 。
本發(fā)明的技術(shù)方案是所述萬古霉素生產(chǎn)菌株以東方擬無枝酸菌(Jwyco/flffopw's on'e"tofc) AO-l為出發(fā)菌株，經(jīng)核糖體抗性誘變選育獲得，其具體歩驟如下
1 )將東方擬無枝酸菌AO-1接種至高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板中，28 30 'C培養(yǎng)5 7 d;
2) 取出孢子用無菌水制成103 10411止"的孢子懸液，將孢子懸液涂布于50 1250mg/L 的萬古霉素及100 15000 mg/L的鏈霉素混合抗性的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板中28 30 °C 培養(yǎng)7 10d;
3) 隨機(jī)選取生長出來的單菌落劃線接種于高氏1號(hào)瓊脂平板培養(yǎng)基上，28 30'C培養(yǎng) 5 7d，用瓊脂塊抑菌圈法對(duì)長出的誘變菌株進(jìn)行生物活性測(cè)定；
44) 選取抑菌圈直徑大于出發(fā)菌株AO-12mm的誘變菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于 28 30°C、 170 220rpm的搖床中培養(yǎng)90 130h，通過HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中萬古霉素的 含量，驗(yàn)證所獲的萬古霉素誘變菌株；
5) 將獲得的萬古霉素誘變菌株經(jīng)5次連續(xù)傳代穩(wěn)定性考察，獲得萬古霉素生產(chǎn)菌株。 所述東方擬無枝酸菌AO-l可購于美國菌種保藏中心，編號(hào)ATCCNo. 19795。 本發(fā)明所述萬古霉素生產(chǎn)菌株可用于生產(chǎn)萬古霉素，其方法如下 將萬古霉素生產(chǎn)菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，液體發(fā)酵種子培養(yǎng)基組成為酵母粉3
6g/L,麥芽提取物3 5g/L，蛋白胨10 15g/L，葡萄糖15 20g/L， pH6.8;種子培養(yǎng)條 件為28 30°C，裝液量40/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速150 220 rpm，培養(yǎng)24 48 h;液體發(fā)酵培 養(yǎng)基組成為糊精100 150g/L， 土豆蛋白15 25g/L，黃豆粉15 25 g/L，磷酸氫二鉀0.1 0.5g/L，消沫劑l 3g/L，氯化鈉1.2 1.6g/L， pH6.8 7.2，培養(yǎng)條件為28 30 °C,裝液 量40/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速150 220 rpm，培養(yǎng)90 130h，萬古霉素的產(chǎn)率8.0 8.9 g/L。
本發(fā)明采用核糖體誘變選育的手段進(jìn)行萬古霉素生產(chǎn)菌株選育，獲得一株東方擬無枝酸 菌J附少cototo;w/s 萬古霉素生產(chǎn)菌株，該菌株萬古霉素的生產(chǎn)能力比出發(fā)菌株提高
了7.12倍，高達(dá)8.9 g/L。且經(jīng)過傳代穩(wěn)定性研究，連續(xù)傳代5次后萬古霉素產(chǎn)量穩(wěn)定性高 達(dá)92.7%。


圖1為實(shí)施例1中誘變菌株對(duì)生物活性指示菌枯草芽孢桿菌a^7/wraZ^'fc抑制結(jié)果。 在圖l中，中心位置的瓊脂塊為空白高氏l號(hào)培養(yǎng)基(做空白對(duì)照)；最下方位置的含出發(fā)菌 株AO-l的瓊脂塊(陽性對(duì)照)；其余為含誘變菌株的瓊脂塊。
圖2為實(shí)施例1中誘變菌株的5次連續(xù)傳代穩(wěn)定性研究。在圖2中，口表示萬古霉素 生產(chǎn)菌株的萬古霉素產(chǎn)量遺傳穩(wěn)定性；O表示東方擬無枝酸菌AO-l的萬古霉素產(chǎn)量遺傳穩(wěn) 定性；橫坐標(biāo)為傳代次數(shù)Generation,縱坐標(biāo)為萬古霉素的濃度Vancomycin concertration(g/L)。
圖3為實(shí)施例2中萬古霉素生產(chǎn)菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)萬古霉素的曲線。在圖3 中，橫坐標(biāo)為時(shí)間Time(h)，左縱坐標(biāo)為菌體生物量Biomass concentration(g/L) (■)，右縱坐 標(biāo)為萬古霉素產(chǎn)量Vancomycin concentration(g/L) ( △)。
圖4為實(shí)施例3萬古霉素-鏈霉素混合抗性高氏1號(hào)平板培養(yǎng)基上所長的誘變菌株與在 普通高氏l號(hào)培養(yǎng)基平板上生長的出發(fā)菌株形態(tài)對(duì)比圖。其中，A:濃度為10000個(gè)/mL的 出發(fā)菌株AO-l的孢子在萬古霉素500 mg/L、鏈霉素濃度400 mg/L抗性的高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板生產(chǎn)出的萬古霉素生產(chǎn)菌株；B:濃度為1000個(gè)/mL的出發(fā)菌株AO-l孢子涂布于普通
高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板生張出的菌落。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
1)取購于美國菌種保藏中心，編號(hào)ATCC No. 19795的萬古霉素產(chǎn)生菌出發(fā)菌株AO-l 接種至高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板中28 'C培養(yǎng)7d，孢子長出后，取適量用無菌水制成104mL—1 的孢子懸液。將0.1 mL孢子懸液涂布于含有500、 1000 mg/L萬古霉素的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng) 基平板中28 'C培養(yǎng)7 d,隨機(jī)選取50株長出的單菌落劃線接種于高氏1號(hào)瓊脂平板培養(yǎng)基 上，28。C培養(yǎng)7d，用瓊脂塊抑菌圈法法對(duì)長出的誘變菌株進(jìn)行生物活性測(cè)定，選取抑菌圈 直徑比出發(fā)菌株AO-l大2mm的12株誘變菌株(參見圖1)。
2 )將以上12株誘變菌株接種于裝有40 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，于30°C 、 200 rpm的搖床中培養(yǎng)120 h,通過HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中萬古霉素的含量，驗(yàn)證選育出2 株萬古霉素高產(chǎn)誘變菌株。該2株經(jīng)5次萬古霉素產(chǎn)量連續(xù)傳代穩(wěn)定性研究，其中l(wèi)株的萬 古霉素產(chǎn)量遺傳穩(wěn)定性高達(dá)92.7% (參見圖2),該株即為萬古霉素生產(chǎn)菌株。
3)將萬古霉素生產(chǎn)菌株進(jìn)行液體二級(jí)發(fā)酵。液體發(fā)酵種子培養(yǎng)基組成為(g/L):酵母粉 3，麥芽提取物3，蛋白胨IO，葡萄糖15， pH6.8;種子培養(yǎng)條件為30°C，裝液量40/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)48 h;液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):糊精140， 土豆蛋白20， 黃豆粉20，磷酸氫二鉀0.1，消沫劑1，氯化鈉1.2， pH7.0;培養(yǎng)條件為30 °C，裝液量40/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm,培養(yǎng)120 h。取1 mL萬古霉素生產(chǎn)菌株發(fā)酵液加入離心管，10000 rpm 離心10 min，取上清，離心3次，上清液稀釋100倍后用0.22 nm過濾器過濾，濾液用于 HPLC。
HPLC流動(dòng)相按體積比，0.4%三乙胺甲醇=85 : 15;色譜條件色譜柱C18 ODS; 柱溫40°C;檢測(cè)器DAD(HP1200);檢測(cè)波長230nm;流速lmL/min;進(jìn)樣量:20|aL。
經(jīng)過以上色譜條件測(cè)定，萬古霉素生產(chǎn)菌株發(fā)酵液中萬古霉素的產(chǎn)量高達(dá)8.9g/L，其萬 古霉素生產(chǎn)能力較出發(fā)菌株AO-l提高了 7.12倍(生產(chǎn)曲線如圖3)。
實(shí)施例2
取0.1 mL濃度為10000個(gè)/mL的出發(fā)菌株孢子涂布于濃度為萬古霉素500 mg/L、鏈霉 素濃度為400 mg/L的混合抗性高氏1號(hào)瓊脂平板上，同時(shí)將出發(fā)菌株AO-l孢子稀釋成不 同濃度梯度后涂布于普通高氏1號(hào)瓊脂平板做對(duì)照，28 'C培養(yǎng)7d，共獲得若干株突變菌株。長出菌株生長情況差異如圖4和表1所示。
表l萬古霉素生產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株AO-l菌落形態(tài)差異比較
菌株特征萬古霉素生產(chǎn)菌株出發(fā)菌株AO-l
菌落形態(tài)圓形"凸"起，呈饅頭狀扁平圓形
菌落結(jié)構(gòu)緊密松散
袍子顏色淺黃類白色或黃色白色
袍子豐滿程度豐滿一般
邊緣有無皺紋狀突起有或無無
菌落表面是否光滑光滑或粗糙粗糙
實(shí)施例3
將實(shí)施例1獲得的萬古霉素生產(chǎn)菌株接入液體種子培養(yǎng)基(液體發(fā)酵種子培養(yǎng)基組成為 (g/L):酵母粉5，麥芽提取物4，蛋白胨13，葡萄糖17， pH 6.8;裝液量40/250 mL)，于 28 °C， 200 rpm培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)接到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):糊精 100~150， 土豆蛋白15 25，黃豆粉15 25，璘酸氫二鉀0.1 0.5，消沫劑1 3，氯化鈉 1.2 1.6， pH6.8 7.2，裝液量40/250 mL)， 于28。C， 200 rpm培養(yǎng)120 h，通過HPLC 法測(cè)定發(fā)酵液中的萬古霉素含量。根據(jù)實(shí)施例1提供的色譜條件，測(cè)得發(fā)酵液中萬古霉素產(chǎn) 量達(dá)8.5g/L。其生產(chǎn)曲線見圖3。
權(quán)利要求
1.萬古霉素生產(chǎn)菌株的誘變選育方法，其特征在于包括以下步驟1)將萬古霉素產(chǎn)生菌東方擬無枝酸菌出發(fā)菌株AO-1接種至高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板中，28～30℃培養(yǎng)5～7d；2)取出孢子用無菌水制成103～104mL-1的孢子懸液，將孢子懸液涂布于50～1250mg/L的萬古霉素及100～15000mg/L的鏈霉素混合抗性的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板中28～30℃培養(yǎng)7～10d；3)隨機(jī)選取生長出來的單菌落劃線接種于高氏1號(hào)瓊脂平板培養(yǎng)基上，28～30℃培養(yǎng)5～7d，用瓊脂塊抑菌圈法對(duì)長出的誘變菌株進(jìn)行生物活性測(cè)定；4)選取抑菌圈直徑大于出發(fā)菌株AO-12mm的誘變菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28～30℃、170～220rpm的搖床中培養(yǎng)90～130h，通過HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中萬古霉素的含量，驗(yàn)證所獲的萬古霉素誘變菌株；5)將獲得的萬古霉素誘變菌株經(jīng)5次連續(xù)傳代穩(wěn)定性考察，獲得萬古霉素生產(chǎn)菌株。
2. 如權(quán)利要求1所述的萬古霉素生產(chǎn)菌株在制備萬古霉素中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的萬古霉素的制備方法，其特征在于其步驟如下 將萬古霉素生產(chǎn)菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，液體發(fā)酵種子培養(yǎng)基組成為酵母粉3 6g/L，麥芽提取物3 5g/L，蛋白胨10 15g/L，葡萄糖15 20 g/L， pH 6.8;種子培養(yǎng)條 件為28 30°C，裝液量40/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速150 220 rpm，培養(yǎng)24 48 h;液體發(fā)酵培 養(yǎng)基組成為糊精100 150g/L, 土豆蛋白15 25g/L，黃豆粉15 25 g/L，磷酸氫二鉀0.1 0.5g/L，消沫劑l 3g/L，氯化鈉1.2 1.6g/L， pH6.8 7.2，培養(yǎng)條件為28 30 °C，裝液 量40/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速150 220 rpm，培養(yǎng)90 130h。
全文摘要
核糖體抗性誘變選育萬古霉素生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用，涉及一種微生物的選育。提供東方擬無枝酸菌的誘變菌株的誘變選育方法及其在制備萬古霉素中的應(yīng)用。將東方擬無枝酸菌接種至高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)；取出孢子用無菌水制成孢子懸液涂于萬古霉素及鏈霉素混合抗性的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)；隨機(jī)選取生長出來的單菌落劃線接種于高氏1號(hào)瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對(duì)長出的誘變菌株進(jìn)行生物活性測(cè)定；選取抑菌圈直徑大于出發(fā)菌株2mm的誘變菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中萬古霉素的含量，驗(yàn)證所獲的萬古霉素誘變菌株；將獲得的萬古霉素誘變菌株經(jīng)5次連續(xù)傳代穩(wěn)定性考察，獲得萬古霉素生產(chǎn)菌株。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101608209SQ200910112190
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者凌雪萍, 盧英華, 姚傳義, 敬科舉, 曾憲海 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)