專利名稱：：一種塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種熒光鑒別方法，尤其是涉及一種利用熒光染料熒光素雙醋酸酯(Fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA)X才有毒赤潮藻:t荅瑪亞歷山大藻(Jferam/r/wwto附werae)細(xì)胞進(jìn)行染色以鑒別活體細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：在赤潮防治研究領(lǐng)域中，藻類生物量的多少可以通過葉綠素a含量、葉綠素?zé)晒庵?、特定單?xì)胞藻類的OD值或藻細(xì)胞數(shù)來反應(yīng)。目前，用來反應(yīng)藻類生物量的技術(shù)方法主要有光學(xué)顯微鏡直接計數(shù)法、可見光分光光度法、熒光分光光度法([l]胡先文，等，可見分光光度法測定水華魚腥藻.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002.21(3):295-297)、葉綠素a測定法、流式細(xì)胞計數(shù)法、庫爾特計數(shù)法、活體熒光檢測技術(shù)等。其中顯微鏡直接計數(shù)法和葉綠素a含量測定法是藻類生物量測定的基本方法，是確定其它測定方法有效性依據(jù)([2]侯建軍，黃邦欽，戴相輝，赤潮藻細(xì)胞計數(shù)方法比較研究.中國公共衛(wèi)生，2004.20(8):907-908)。由于不同藻類其細(xì)胞色素組成及含量不同，細(xì)胞結(jié)構(gòu)大小不一，使得通過檢測葉綠素a含量或藻細(xì)胞OD值來反應(yīng)藻類生物量的指標(biāo)，局限于特定藻類而得不到廣泛應(yīng)用。同時，顯微鏡直接計數(shù)法和葉綠素a含量測定法都不能準(zhǔn)確的反應(yīng)藻細(xì)胞活性狀態(tài)。藻細(xì)胞計數(shù)僅適用于單細(xì)胞藻類生物量的檢測。其中，對活體藻細(xì)胞的計數(shù)在評價赤潮防治方法及實驗室篩選殺藻活性物質(zhì)方面具有重要的意義，是該領(lǐng)域最基礎(chǔ)的技術(shù)方法。對藻細(xì)胞的生長狀況及藻細(xì)胞密度進(jìn)行準(zhǔn)確監(jiān)控和測定，需要建立一種準(zhǔn)確可靠的活體藻細(xì)胞的鑒定方法。細(xì)胞膜的完整性是活細(xì)胞的基本表征([3]Gonzalez,J.E.andR.Y.Tsien，/wprovW/"d/ca/orso/ce〃附ew6rawepo&wria/fAflfwseyZworesrewceresowawceewergy/raws^rGhemistry&Biology,1997.4(4):269-277)。例如傳統(tǒng)的活體染色劑如臺盼藍(lán)，基于細(xì)胞膜的完整性來判定細(xì)胞的活性，臺盼藍(lán)能夠通過死細(xì)胞的細(xì)胞膜而不能通過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而死細(xì)胞在顯微鏡下顯藍(lán)色活細(xì)胞不顯色([4]張先杰等.臺盼藍(lán)染色與FDA/PI雙染色對檢測肝細(xì)胞活率的評價.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，21(3))。然而，該方法不能說明細(xì)胞內(nèi)部生理狀況，不能準(zhǔn)確反應(yīng)細(xì)胞活力。隨著流式細(xì)胞技術(shù)的廣泛應(yīng)用，根據(jù)熒光染料的不同選用，在對活細(xì)胞的檢測方面出現(xiàn)了3類檢測指標(biāo)l.細(xì)胞膜透性；2.胞內(nèi)酶活性；3.生物膜電位。本發(fā)明中的FDA染料是基于細(xì)胞膜完整性及胞內(nèi)酶活性兩個指標(biāo)來檢測藻細(xì)胞活性的一種活體熒料。其原理是FDA易透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在胞內(nèi)酯酶的水解作用下釋放出熒光素，而熒光素不易透過細(xì)胞膜積累于胞內(nèi)，在藍(lán)色(470495nm)激發(fā)光作用下發(fā)出亮綠色(515525nm)熒光，在熒光顯微鏡OlympusBX41下觀察，此類細(xì)胞鑒定為活細(xì)胞([5]Garveyl,M.，B.M.andU.P.,^p//cfl6//!Xvo/&e_FZX4owo[yto必evm'weAev/aM砂o//>/^op/flwAtowwm;fe/"ewv/rowwe"to/cow力Y/o肌MARINEECOLOGYPROGRESSSERIESMarEcolProgSer，2007.352:17-26)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法。本發(fā)明的另一目的是所述塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法應(yīng)用于塔瑪亞歷山大藻培養(yǎng)中活體細(xì)胞的篩查。本發(fā)明的另一目的是所述塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法應(yīng)用于具有抑制塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞生理活動的活性物質(zhì)的篩選。本發(fā)明包括以下步驟1)將熒光染料熒光素雙醋酸酯溶于丙酮，配制成熒光染料熒光素雙醋酸酯母液；2)取塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞液于1.5mL離心管或96孔板，加入熒光染料熒光素雙醋酸酯母液；3)室溫靜置染色后，得細(xì)胞懸液，放入冰盒避光待鏡檢；4)取染色后的細(xì)胞懸液于藻細(xì)胞計數(shù)框，分別在熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光和可見光下進(jìn)行觀察，藍(lán)色激發(fā)光的波長為470495nrn。所述母液的濃度最好為lmg/mL，母液最好置于4。C冰箱中避光保存。所述加入熒光染料熒光素雙醋酸酯母液最好使其終濃度為50500ng/mL。所述塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法可用于塔瑪亞歷山大藻培養(yǎng)中活體細(xì)胞的篩査。所述塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法可用于具有抑制塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞生理活動的活性物質(zhì)的篩選。本發(fā)明提供一種對有毒赤潮藻塔瑪亞歷山大藻活體藻細(xì)胞準(zhǔn)確有效的鑒定方法，并對活體塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)，從而應(yīng)用于該藻的相關(guān)研究領(lǐng)域研究。本發(fā)明涉及熒光染料FDA，當(dāng)其對塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞進(jìn)行染色時，該染料在活體藻細(xì)胞胞內(nèi)酯酶水解作用下降解釋放出熒光素，熒光素不能透過細(xì)胞膜而積累在胞內(nèi)，經(jīng)藍(lán)色激發(fā)光激發(fā)，活體藻細(xì)胞發(fā)出亮綠色熒光。在熒光顯微鏡下觀察，即可利用藻細(xì)胞計數(shù)框進(jìn)行計數(shù)，從而實現(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明涉及的染色目標(biāo)藻有毒塔瑪亞歷山大赤潮藻，是一種細(xì)胞相對比較大的單細(xì)胞藻類(細(xì)胞長度在2055pm，寬度在1745pm)，在喪失光照培養(yǎng)條件下發(fā)生沉降聚集，不能形成均一藻細(xì)胞懸液，且藻細(xì)胞濃度在實驗室條件下只能達(dá)到104105cells/mL，不能滿足流式細(xì)胞儀快速高通量的檢測要求，使得流式細(xì)胞技術(shù)不適合該藻的檢測計數(shù)，因此，需要利用熒光顯微鏡人工鏡檢計數(shù)。圖1是經(jīng)FDA染色后于明場活/死混合細(xì)胞的觀察結(jié)果。圖2是經(jīng)FDA染色后于熒光場下活/死混合細(xì)胞的觀察結(jié)果。圖3是終濃度為2.5pg/mL的FDA對藻細(xì)胞的染色效果。圖4是終濃度為25ng/mL的FDA對藻細(xì)胞的染色效果。圖5是終濃度為600pg/mL的FDA對藻細(xì)胞的染色效果。具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不限于下述實施例。實施例l:塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞的FDA染色濃度確定1)將FDA溶于丙酮中，配成濃度為25mg/mL的染色液，置于4'C冰箱中避光保存。2)稀釋25mg/mL的FDAjJC存液，至10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、lmg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL。3)取200pL指數(shù)期均勻藻細(xì)胞培養(yǎng)液于1.5mL離心管。4)分別加入25mg/mL貯存液及步驟2)中各FDA稀釋液5^L，使FDA染液終濃度分別為625pg/mL、250|xg/mL、125ng/mL、62.5pg/mL、25ng/mL、2.5pg/mL、0.25[ig/mL，各濃度梯度設(shè)3個平行。5)室溫靜置染色2min，放入冰盒避光待鏡檢。6)染色樣品混勻后，取10pL染色后的細(xì)胞懸液于藻細(xì)胞計數(shù)框，在熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光(470495nm)下進(jìn)行觀察，確定使藻細(xì)胞發(fā)出穩(wěn)定亮綠色熒光的FDA染色濃度范圍。7)FDA染色終濃度范圍2.560(Vg/mL。染色效果見圖35。實施例2:FDA對活/死細(xì)胞混合懸液的染色效果1)取10mL指數(shù)期藻細(xì)胞液于50mL三角瓶，加入1mL魯哥氏溶液固定10min，滅活藻細(xì)胞。2)1000xg離心10min，用滅菌的藻類培養(yǎng)基f/2反復(fù)洗滌至上清無色。3)10mLf/2藻培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成相同濃度的死細(xì)胞懸液。4)取10mL指數(shù)期藻細(xì)胞液作為活細(xì)胞懸液。5)死活細(xì)胞以不同比例混合，使活細(xì)胞比例分別為O、20%、50%、80%、100%。6)取200指數(shù)期均勻藻細(xì)胞培養(yǎng)液于1.5mL離心管，按實施例1所述，加入1mg/mL的FDA貯存液5pL使其終濃度達(dá)到最佳FDA染色濃度25嗎/mL。7)室溫靜置染色2min，放入冰盒避光待鏡檢。8)染色樣品混勻后，取10pL染色后的細(xì)胞懸液于藻細(xì)胞計數(shù)框，分別在熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光和可見光下進(jìn)行觀察計數(shù)。9)根據(jù)以下公式計算FDA染色效率染色效率(％)=(Ni/N2)x100式中N,為熒光場下的細(xì)胞數(shù)，N2為明場下細(xì)胞數(shù)。10)設(shè)置3個平行實驗組，進(jìn)行染色計數(shù)。實驗結(jié)果見表l。表1不同比例的活/死細(xì)胞混合懸液的FDA染色效率塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞活細(xì)胞含量(%)FDA染色效率(％)平行實驗組1平行實驗組2平行實驗組300.3090.2780.2332016.23323.32321.5465049.91553.71646.5918078.64177.20983.43210096.10598.02997.981實施例3:FDA對不同濃度藻細(xì)胞的染色效果1)取指數(shù)期塔瑪亞歷山大藻液10ml，顯微鏡下計數(shù)20ul藻液內(nèi)藻細(xì)胞數(shù)。2)通過離心、f/2藻培養(yǎng)基重懸及梯度稀釋的方法，調(diào)整藻細(xì)胞數(shù)至lX10、ells/mL、2X103cells/mL、1X104cells/mL、2X104cells/mL。3)按實施例l所述，對不同濃度的藻細(xì)胞懸液染色。64)設(shè)置3個平行實驗組，進(jìn)行計數(shù)。實驗結(jié)果見表2。表2不同濃度藻細(xì)胞的FDA染色效率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例4:光照和溫度對染色效果的影響1)按實施例l所述，將FDA染色后的細(xì)胞懸液分成兩份，一份置于冰上避光保存，另一份不作任何避光處理室溫保存。2)分別于染色后30min，60min，90min，120min，150min，180min和210min取樣，進(jìn)行計數(shù)。3)設(shè)置3個實驗組。實驗結(jié)果見表3。表3光照和溫度對染色效果的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明的塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞染色結(jié)果參見圖1和圖2。圖1為明場下觀察的活/死混合細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)基本一致，無法區(qū)別活/死細(xì)胞。圖2為熒光場下觀察的活/死混合細(xì)胞，活細(xì)胞(箭頭A所指)被染成亮綠色，死細(xì)胞(箭頭B所指)則由于自身自發(fā)的紅色熒光和背景的綠色疊加成為黃色，因此可以很好地將活/死細(xì)胞區(qū)分開。熒光染料熒光素雙醋酸酯FDA的使用濃度范圍為2.560(Hig/mL。圖35給出不同終濃度FDA的染色效果。圖3為終濃度2.5pg/mL的FDA對藻細(xì)胞的染色效果，活細(xì)胞的綠色很弱說明FDA濃度不夠高；圖4為25pg/mL的FDA對藻細(xì)胞的染色效果，活細(xì)胞亮綠色說明FDA濃度足夠；圖5為60(Hig/mL的FDA對藻細(xì)胞的染色效果，此時，出現(xiàn)FDA結(jié)晶說明FDA濃度過高不能完全溶解,但此時仍然可以使正常細(xì)胞發(fā)出亮綠色熒光。不同藻類自發(fā)熒光強度及胞內(nèi)酶組成的不同，使得本發(fā)明的熒光活體染色檢測藻細(xì)胞活性的方法不具普適性。因此，需要對該方法應(yīng)用于塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞檢測的可行性進(jìn)行驗證。本發(fā)明在以下三個方面探討該染色方法用于表征塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的可行性A.染色后，必須能夠簡便有效的區(qū)分死、活細(xì)胞；B.染色結(jié)果應(yīng)準(zhǔn)確、可重復(fù)且不會出現(xiàn)假陽性；C.染色后，熒光可以穩(wěn)定保持足夠的時間不淬滅，以供鏡檢計數(shù)。針對以上三方面，分別設(shè)計實驗進(jìn)行驗證1.制備一系列已知濃度比例的死/活藻細(xì)胞混合懸液，利用該熒光染色方法染色后鏡檢計數(shù)。鏡檢結(jié)果顯示，該熒光染色方法可以使活藻細(xì)胞在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出亮綠色熒光，死細(xì)胞不發(fā)綠色熒光。2.制備不同濃度的活藻細(xì)胞懸液，利用該熒光染色方法染色后鏡檢計數(shù)。鏡檢結(jié)果顯示，該熒光染色方法可以較準(zhǔn)確染色活藻細(xì)胞。3.染色后的藻細(xì)胞懸液，分別置于冰上并避光保存和不避光室溫保存。在避光冰上保存條件下，隨保存時間的增長，熒光顯微鏡下觀察到的亮綠色細(xì)胞數(shù)目基本維持平衡，背景綠色熒光強度基本保持不變，這樣可以保證實驗的觀察和計數(shù)需要。而未經(jīng)避光處理并保存在室溫條件下的細(xì)胞懸液，隨保存時間的增長，熒光顯微鏡下觀察到的亮綠色細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，背景綠色熒光亮度逐漸增強，說明藻細(xì)胞膜內(nèi)的熒光素外泄或熒光淬滅。實驗結(jié)果表明利用熒光素雙醋酸酯FDA染色塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞的熒光染色方法，可以鑒定活體塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞。細(xì)胞膜的完整性是活細(xì)胞的基本標(biāo)志。僅基于細(xì)胞膜的完整性來判定細(xì)胞活性的染色方法，不能表征細(xì)胞內(nèi)部的生理改變并準(zhǔn)確反應(yīng)細(xì)胞活力。基于細(xì)胞膜完整性及胞內(nèi)酶活性兩個指標(biāo)的熒光活體染色方法，能夠表征胞內(nèi)酶活性，從而準(zhǔn)確反應(yīng)細(xì)胞活力。其原理是非熒光底物在胞內(nèi)相關(guān)酶的作用下降解釋放熒光素，熒光素在胞內(nèi)積累，在激發(fā)光作用下發(fā)出熒光?；铙w染料熒光素雙醋酸酯FDA(Fluoresceindiacetate)為不具熒光性的非極性物質(zhì)，本身不發(fā)熒光，可以穿過細(xì)胞膜自由出入細(xì)胞且不能在細(xì)胞中積累。在活細(xì)胞中，F(xiàn)DA經(jīng)酯酶分解為熒光素，后者為具有熒光的極性物質(zhì)，不能自由出入細(xì)胞膜，從而在細(xì)胞中積累，使8細(xì)胞在藍(lán)色激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光。FDA染料對塔瑪亞歷山大藻的最佳濃度的判定，是根據(jù)在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞發(fā)出綠色熒光的強度來確定的，以能夠明顯區(qū)別周圍自發(fā)紅色熒光的死亡細(xì)胞為準(zhǔn)。不同藻種自發(fā)熒光強度及胞內(nèi)酶組成的不同，使得應(yīng)用熒光活體染色檢測藻細(xì)胞活性的方法不具普適性。因此，需要對該方法應(yīng)用于塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞檢測的可行性進(jìn)行驗證。該染色方法是否可以應(yīng)用于塔瑪亞歷山大藻屬內(nèi)其他藻種，基于2個前提1、藻細(xì)胞發(fā)出的綠色熒光不會被背景熒光所掩蓋。這要求藻細(xì)胞不能太小，否則不易在顯微鏡下分辨計數(shù)，可以應(yīng)用流式細(xì)胞儀來計數(shù)，這不是本發(fā)明所討論的問題。2、藻細(xì)胞發(fā)出的綠色熒光不會被自發(fā)紅色熒光所掩蓋。這要求激發(fā)藻細(xì)胞內(nèi)色素發(fā)出強烈紅色熒光的激發(fā)光波長與激發(fā)FDA降解產(chǎn)物發(fā)出綠色熒光的激發(fā)光波長不能在同一范圍內(nèi)，否則綠色熒光會被掩蓋。權(quán)利要求1.一種塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法，其特征在于包括以下步驟1)將熒光染料熒光素雙醋酸酯(Fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA)溶于丙酮，配制成熒光染料熒光素雙醋酸酯母液；2)取塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞液于1.5mL離心管或96孔板，加入熒光染料熒光素雙醋酸酯母液；3)室溫靜置染色后，得細(xì)胞懸液，放入冰盒避光待鏡檢；4)取染色后的細(xì)胞懸液于藻細(xì)胞計數(shù)框，分別在熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光和可見光下進(jìn)行觀察，藍(lán)色激發(fā)光的波長為470～495nm。2.如權(quán)利要求l所述的一種塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法，其特征在于所述母液的濃度為lmg/mL。3.如權(quán)利要求1或2所述的一種塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法，其特征在于母液置于4X:冰箱中避光保存。4.如權(quán)利要求l所述的一種塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法，其特征在于所述加入熒光染料熒光素雙醋酸酯母液使其終濃度為50500pg/mL。5.如權(quán)利要求l所述的一種塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法，用于塔瑪亞歷山大藻培養(yǎng)中活體細(xì)胞的篩査。6.如權(quán)利要求l所述的一種塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法，用于具有抑制塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞生理活動的活性物質(zhì)的篩選。全文摘要一種塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法，涉及一種熒光鑒別方法，尤其是涉及一種利用熒光染料熒光素雙醋酸酯對有毒赤潮藻塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞進(jìn)行染色以鑒別活體細(xì)胞。提供一種塔瑪亞歷山大藻活體細(xì)胞的熒光鑒別方法以及在塔瑪亞歷山大藻培養(yǎng)中活體細(xì)胞篩查和具有抑制塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞生理活動的活性物質(zhì)篩選的應(yīng)用。將熒光染料熒光素雙醋酸酯溶于丙酮，配制成熒光染料熒光素雙醋酸酯母液；取塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞液于1.5mL離心管或96孔板，加入熒光染料熒光素雙醋酸酯母液；室溫靜置染色后，得細(xì)胞懸液，放入冰盒避光待鏡檢；取染色后的細(xì)胞懸液于藻細(xì)胞計數(shù)框，分別在熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光和可見光下進(jìn)行觀察。文檔編號C12Q1/04GK101591694SQ20091011209公開日2009年12月2日申請日期2009年6月28日優(yōu)先權(quán)日2009年6月28日發(fā)明者周月霞,楊小茹,蘇建強,鄭天凌,鄭小偉申請人:廈門大學(xué)