專利名稱：一種高精確度檢測人類乳頭狀瘤病毒基因型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測和鑒定病原微生物制劑領(lǐng)域，特別涉及一種高精確度檢測人類乳頭狀瘤病毒基因型的方法。
背景技術(shù)：
德國豪森Harald zur Hausen博士于1983年證實人乳頭瘤病毒(HPV)的某些型與宮頸癌有關(guān)[1]，并于2008年榮獲諾貝爾生理或醫(yī)學獎。該成果開創(chuàng)了宮頸癌研究的新方向，推動了 HPV基因型分析和疫苗的研究和開發(fā)，使宮頸癌成為目前唯一一個病因明確、 可以預防、早期發(fā)現(xiàn)并治愈的人類癌癥。2003年國際腫瘤研究機構(gòu)Nubia Mimoz博士等公布了由9個國家11個研究機構(gòu)的分析報告，根據(jù)HPV不同型別與宮頸癌的關(guān)系，將被檢出的30個HPV基因型分為三大類，其中15種致癌高危型16，18，31，33，35，39，45，51，52，56， 58，59，68，73，82 (W13B/MM4亞型和IS39亞型)；3種可能致癌高危型26，53，66 ；及12種低危型6,11,40,42,43,44, 54,61, 70, 72,81 (CP8304)和 CP6108[2]。從而為 HPV 基因型分析的方法學研究，提供了可靠依據(jù)。此外，還發(fā)現(xiàn)高危型與肛門和生殖器癌、口咽癌等有關(guān)；低危型與生殖器疣、復發(fā)性呼吸道疣狀乳頭瘤病等有關(guān)。HPV是一類對表皮和黏膜鱗狀上皮具有特殊嗜性的小DNA病毒，基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，含有約7900對堿基(bp)。由3個基因區(qū)組成，包括早期區(qū)(early region, E區(qū))、 晚期區(qū)(lateregion，L區(qū))區(qū)和與非編碼區(qū)(Uncoding region,UCR)或上游調(diào)控區(qū)(URR)。 E區(qū)按順序為E6、E7、El、E2、E3、E4和E5共7個基因，參與病毒DNA的復制、轉(zhuǎn)錄、編碼病毒蛋白、維持細胞內(nèi)病毒的高拷貝數(shù)的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，與病毒細胞轉(zhuǎn)化功能及致癌性有關(guān)。L區(qū)主要有衣殼蛋白Ll和次要衣殼蛋白L2，L1高度保守，特異性強；L2編碼的衣殼蛋白較小，但變異多。LCR含有HPV基因組DNA的復制起點和HPV基因表達所必需的調(diào)控元件，調(diào)控病毒的轉(zhuǎn)錄與復制。美國FDA批準四種HPV檢測方法=HC II高危HPV檢測(Qiagen)，HC II低危HPV 檢測(Qiagen) ；Cervista HPV 16/18 檢測和 Cervista HPV 高危檢測 Otologics)。HC II 是第二代雜交捕獲法(Hybrid Capture II) 1999年上市，定性區(qū)分13種高危型(16/18/31/3 3/35/39/45/51/52/56/58/59/68)與 5 種低危型(6/11/42/43/44)，但不能分型。Cervista 是應用恒溫酶DNA擴增和熒光發(fā)光判讀法，2009年上市，可定性檢測14種高危型(增加了 66型)，除16/18可以另外檢測，也不能具體分型。中國SFDA批準上市的國產(chǎn)試劑，主要增添了分型功能。基于芯片和流式兩種技術(shù)亞能PCR-反向點雜交芯片法，凱普導流雜交低密度基因芯片法和透景Luminex流式熒光雜交法，分別檢測23、21和沈種型。此外，采用PCR-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)申報專利的方法有密執(zhí)安州立大學O006已批準) 和深圳華大基因(2008待批準)。前者針對E6基因區(qū)進行13種高危型作分型和定量檢測， 后者采用通用GP5+/GP6+引物針對Ll基因區(qū)分析17種型。上述方法存在的問題是
1.采用PCR技術(shù)為基礎(chǔ)加雜交或質(zhì)譜的方法，雖然靈敏度高達10-100個拷貝。但是均未排除因PCR擴增產(chǎn)物污染，弓丨起的假陽性問題。2.目前檢測HPV的基因區(qū)均采用單個目標基因探針，多數(shù)為Ll區(qū)，密執(zhí)安大學為 E6區(qū)。而臨床標本由于病毒在整合時容易發(fā)生目標片段(Li，El, E2，E6，E7)的缺失或變異，且HPV不同類型，在不同腫瘤和組織中，在潛伏期和活動期的E和L基因的拷貝數(shù)也不同，而易造成檢測漏診。也是導致目前采用不同方法，在檢測同一樣本中HPV類型時，獲得結(jié)果不一致，造成假陰性問題的主要原因(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。3.檢測的HPV型別種類，均未能達到2003年國際腫瘤研究機構(gòu)提出的30種致病型的要求，其檢測結(jié)果將使> 的人檢測漏診。[2]4.采用雜交方法檢測的靈敏度為5000COpieS/ml，F(xiàn)DA批準其用于宮頸癌的病毒檢測，而對于HPV與其它鱗狀上皮癌癥關(guān)系的研究，以及其它樣本，如血液及尿液等體液的檢測不適用。5.采用多重PCR探針混合識別在同一個通用引物擴增區(qū)中的相似序列，易產(chǎn)生交叉錯配的假陽性問題，導致結(jié)果難以重復。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種高精確度檢測人類乳頭狀瘤病毒基因型的方法，旨在徹底解決現(xiàn)有方法不能排除PCR擴增產(chǎn)物污染，引起的假陽性問題；所有檢測方法均以單基因探針為靶向，忽視病毒在整合時發(fā)生目標片段缺失或變異，特別是HPV病毒在潛伏期和活動期的E和L基因的拷貝數(shù)差異，而造成的假陰性問題；以及目前檢測方法均未達到涵蓋30種致病HPV基因型，因漏檢而引起的假陰性問題。本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種高精確度檢測人類乳頭狀瘤病毒基因型的方法，待檢測人類乳頭狀瘤病毒基因型為30種HPV基因型，包括HPV6、HPVl 1、HPV 16、HPV18、 HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81/CP8304、HPV 82、HPV CP6108 和 / 或 HPV 89 型中的一種或多種。注 CP6108 (U12478)與89型序列比對，僅有11個堿基區(qū)別，因此該型需與89型合并檢測，且只有L段序列，故采用單基因序列。包括以下步驟1、引物設(shè)計涵蓋國際腫瘤研究機構(gòu)2003年提出的全部30種致病HPV類型，包括 15 種致癌高危型 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82 (W1 3B/MM4 亞型和 IS39亞型)和3種可能致癌高危型26,53和66，以及12種低危型6、11、40、42、43、44、54、 61、70、72、81/CP8304及CP6108和/或89型。根據(jù)待測HPV基因型全序列，獲取E6和E7 基因區(qū)，以及Ll和L2基因區(qū)，選擇每個型別的特異性保守序列，設(shè)計一對PCR引物，在引物的5’端帶有10個堿基(ACGTTGGATG)任意組合的標簽序列，使總長度達到30個堿基以上， 用以從分子量上將引物與探針區(qū)別開。各種HPV基因型的擴增引物序列見表1。在擴增區(qū)中的保守序列區(qū)設(shè)計一條單堿基延伸探針，探針的長度為14- 個堿基，在探針的3’末端， 允許延伸一個經(jīng)設(shè)計確定的堿基，作為該基因型特異性序列標記，單堿基延伸后總長度不超過四個堿基，每個探針的延伸產(chǎn)物之間分子量相差至少16Da。各種HPV擴增引物序列見表1，其對應的堿基延伸探針見表2。2、PCR反應在PCR過程中引入尿嘧啶N糖基化酶(UNG酶)技術(shù)，在首次PCR反應體系中，采用以dUTP替代常規(guī)PCR的dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進行PCR擴增前，用UNG酶處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG酶在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR反應及產(chǎn)物，徹底排除了 PCR擴增產(chǎn)物污染引起的假陽性問題。通過第一輪PCR擴增，獲得待測樣本中靶序列擴增產(chǎn)物。3、蝦堿性磷酸酶(SAP)處理使未結(jié)合的剩余核酸(dNTPs)脫磷酸失活，預防干擾下一步堿基延伸反應。4、堿基延伸反應在第二輪擴增中進行單堿基延伸探針的3’端，延伸一個序列特異性單核苷酸，作分子量標記，得到的延伸產(chǎn)物與所述延伸探針及各型別延伸產(chǎn)物之間的分子量差異不小于16Da，5、樹脂脫鹽純化延伸反應產(chǎn)物。6、質(zhì)譜檢測將純化后產(chǎn)物采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-T0F-MASS)系統(tǒng)進行分子量檢測，根據(jù)分子量標記確定待測HPV基因型別，軟件自動處理報告每個基因型的檢測結(jié)果和可信程度。本發(fā)明的檢測方法，優(yōu)選的包括以下步驟(1)用一對PCR引物，在引物的5’端帶有ACGTTGGATG堿基的任意組合的標簽序列，使總長度達到30個堿基以上，以區(qū)別于探針；在擴增區(qū)中的保守序列設(shè)計一條單堿基延伸探針，探針的長度為1418個堿基，在探針的3’末端，允許延伸一個經(jīng)設(shè)計確定的堿基，作為該基因型特異性序列標記，單堿基延伸后總長度不超過四個堿基；(2)第一次PCR擴增反應，將dUTP/dNTP混合物、UNG酶、Tag酶和多重PCR引物一同加入PCR反應體系中，先進行dUTP的消化，降解PCR擴增產(chǎn)物，然后滅活UNG酶，隨后作 45個循環(huán)PCR擴增，獲得待測樣本中靶序列擴增產(chǎn)物；(3)用蝦堿性磷酸酶處理，使第一輪反應中剩余dNTP脫磷酸失活；(4)第二次單堿基延伸擴增，將ddNITs加入反應體系中，使之在單堿基延伸探針的3’端，延伸一個序列特異性單核苷酸，作分子量標記，擴增200個循環(huán)，每個探針的延伸產(chǎn)物之間分子量相差至少16Da ；(5)采用陽離子交換樹脂吸附鹽離子，純化延伸反應產(chǎn)物；(6)純化后產(chǎn)物采用質(zhì)譜技術(shù)進行分子量檢測，根據(jù)分子量標記確定待測HPV基因的類型。其中所述步驟(1)引物設(shè)計中每一種待測HPV基因同時采用兩個或兩個以上基因區(qū)檢測，其中一種致癌性早期轉(zhuǎn)錄區(qū)E6或E7基因區(qū)和一種衣殼蛋白晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)Ll或L2 基因區(qū)。所述步驟⑴中，優(yōu)選的采用β球蛋白基因作為樣品質(zhì)量控制參照，引物序列為 SEQ IDN0. 119 和 SEQ ID NO. 120，探針序列為 SEQ ID NO. 180。優(yōu)選的在每次反應中加入陰性對照和陽性對照，所述陰性對照為去離子雙蒸水； 陽性對照為HPV16，43，72 Ll段重組質(zhì)粒DNA。本發(fā)明的方法，檢測濃度低至1拷貝/ul。本發(fā)明還包括，一種檢測生物樣品中微生物DNA的試劑盒，所述試劑盒中包含一種或多種如表1，表2的合成的多核苷酸試劑。表 權(quán)利要求
1.一種檢測人類乳頭狀瘤病毒基因型的方法，所述HPV基因型，包括HPV6、11、16、18、 26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81、82 和89型，每種基因型采用雙探針檢測，包括一種致癌性早期轉(zhuǎn)錄區(qū)E6或E7基因區(qū)和一種衣殼蛋白晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)Ll或L2基因區(qū)，所述方法包括以下步驟(1)用一對PCR引物，在引物的5’端帶有ACGTTGGATG堿基的任意組合的標簽序列，使總長度達到30個堿基以上，以區(qū)別于探針；在擴增區(qū)域中的保守序列區(qū)設(shè)計一條單堿基延伸探針，探針的長度為1418個堿基，在探針的3’末端，允許延伸一個經(jīng)設(shè)計確定的堿基， 作為該基因型特異性序列標記，單堿基延伸后總長度不超過四個堿基；(2)第一次PCR擴增反應，將dUTP/dATP/dGTP/dCTP混合物、UNG酶、Tag酶和多重PCR 引物一同加入PCR反應體系中，先進行dUTP的消化，降解PCR擴增產(chǎn)物，然后滅活UNG酶， 隨后作45個循環(huán)PCR擴增，獲得待測樣本中靶序列擴增產(chǎn)物；(3)用蝦堿性磷酸酶處理，使第一輪反應中剩余dNTP脫磷酸失活；(4)第二次單堿基延伸擴增，將ddNIPs或類似核酸末端終止劑加入反應體系中，使之在單堿基延伸探針的3’端，延伸一個序列特異性單核苷酸，作分子量標記，擴增200個循環(huán)，每個探針的延伸產(chǎn)物之間分子量相差至少20Da ；(5)采用陽離子交換樹脂吸附鹽離子，純化延伸反應產(chǎn)物；(6)純化后產(chǎn)物采用質(zhì)譜技術(shù)進行分子量檢測，根據(jù)分子量標記確定待測HPV基因的類型。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中每一種待測HPV基因同時采用兩個或兩個以上基因區(qū)檢測，其中一種致癌性早期轉(zhuǎn)錄區(qū)E6或E7基因區(qū)和一種衣殼蛋白晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)Ll或L2基因區(qū)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)第一次擴增包括至少一組相匹配的所述HPV基因型的正向和反向引物序列選自表1中的序列SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 120。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)第二次單堿基延伸擴增包括至少一種堿基延伸探針選自表2中的序列SEQ ID NO. 121-SEQ ID NO. 180。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，采用β球蛋白基因作為樣品DNA提取質(zhì)量控制參照，引物序列為SEQ ID NO. 181和SEQ ID N0. 182，探針序列為SEQ IDN0. 183。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，采用典型模式植物擬南芥基因作為PCR反應質(zhì)量控制參照，引物序列為SEQ ID N0. 183和SEQ ID N0. 184，探針序列為 SEQ ID N0. 185。
7 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在每次反應中加入陰性對照和陽性對照，所述陰性對照為去離子雙蒸水；陽性對照為β球蛋白基因和植物擬南芥的重組質(zhì)粒cDNA。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述測定步驟檢測濃度可低至1拷貝/反應。
9.一種檢測生物樣品中病原體DNA的試劑盒，所述試劑盒中包含一種或多種如權(quán)利要求3、4、5和6所述的合成的多核苷酸試劑。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，測定步驟如下待檢測 HPV 基因型包括 HPV 類型 6、11、16、18、26、31、33、；35、39、40、42、43、44、45、51、 52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81/CP8304、82、CP6108 和 / 或 89 型中的一種或幾種，每種基因型同時采用包括但不限于兩個或兩個以上基因檢測，包括如下步驟(1)根據(jù)待測HPV基因型全序列，獲取E6和E7基因區(qū)，以及Ll和L2基因區(qū)，選擇每個型別的特異性保守序列，設(shè)計一對PCR引物，在引物的5’端帶有10個堿基(ACGTTGGATG)任意組合的標簽序列，使總長度達到30個堿基以上，用以從分子量上將引物與探針區(qū)別開。 各種HPV基因型的擴增引物序列見表1。在擴增區(qū)中的保守序列區(qū)設(shè)計一條單堿基延伸探針，探針的長度為14- 個堿基，在探針的3’末端，允許延伸一個經(jīng)設(shè)計確定的堿基，作為該基因型特異性序列標記，單堿基延伸后總長度不超過四個堿基，每個探針的延伸產(chǎn)物之間分子量相差至少16Da，各種HPV擴增引物序列見表1，其對應的堿基延伸探針見表2，(2)通過PCR擴增，獲得待測樣本中靶序列擴增產(chǎn)物，PCR反應體系配制見表3.先用37°C -50°C 2分鐘，進行dUTP的消化，然后94°C 4分鐘滅活，(同時這一步也達到預變性的效果)，隨后作PCR擴增。反應條件為95°C變性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸1分鐘，共45個循環(huán)；最終72°C延伸5分鐘，完成后恒溫于4°C，(3)通過蝦堿性磷酸酶(SAP)處理，使未結(jié)合的剩余核酸(dNTPs)脫磷酸失活，預防干擾下一步堿基延伸反應。SAP消化酶反應體系見表4，反應條件為37°C孵育40分鐘，去除剩余dNIPs ；然后用85 °C 5分鐘使SAP酶失活，(4)通過堿基延伸反應，在單堿基延伸探針的3’端，延伸一個序列特異性單核苷酸，作分子量標記，得到的延伸產(chǎn)物與所述延伸探針及各型別延伸產(chǎn)物之間的分子量差異不小于 16Da,延伸反應體系見表5，延伸反應探針mix的濃度，按照各型分子量大小進行線性關(guān)系調(diào)節(jié)，總濃度約為8-15M，最終濃度約為0. 84-1. 57M，循環(huán)反應為200個短階梯程序，包含兩個循環(huán)嵌合，開始為94°C變性30秒，隨后在94°C 5秒，52°C退火5秒，80°C延伸5秒，共40 個循環(huán)中，每個插入退火和延伸5個小循環(huán)；最終72°C延伸3分鐘，(5)采用樹脂脫鹽純化延伸反應產(chǎn)物，(6)將純化后產(chǎn)物采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)進行分子量檢測，根據(jù)分子量標記確定待測HPV基因型別，

圖1-31中，橫坐標為分子量，縱坐標為峰強度，圖中縱行虛線同色為該基因型延伸探針的分子量位置，如果不存在該型別探針峰不變；如果被檢出型別拷貝數(shù)大于10，探針可被完全消耗，左側(cè)峰消失轉(zhuǎn)至右側(cè)；右側(cè)的同色虛線表示延伸產(chǎn)物分子量位置，用TYPE4.0軟件閱讀譜圖，自動分析和報告結(jié)果，導出數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)解釋為，每一型HPV和內(nèi)參HBB的延伸探針在質(zhì)譜圖不同的質(zhì)量處有相應分子量峰，在探針發(fā)現(xiàn)目標基因工作時出現(xiàn)單堿基延伸產(chǎn)物，探針分子量峰發(fā)生轉(zhuǎn)移為產(chǎn)物分子量峰，分析結(jié)果報告為陽性。陽性結(jié)果分為四種A、結(jié)果可靠；B、中度可靠；C、一般可靠；D、低度可靠，前三種視為延伸反應有效，有相應HPV感染，第四種需要人工輔助判斷，觀察探針是否消耗， 判斷為可疑感染或陰性結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供一種高精確度檢測人類乳頭狀瘤病毒基因型的方法，每種基因型采用雙探針檢測，包括一種致癌性早期轉(zhuǎn)錄區(qū)E6或E7基因區(qū)和一種衣殼蛋白晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)L1或L2基因區(qū)，該方法以排除PCR擴增產(chǎn)物污染為前提、以雙基因探針識別同一基因型為基礎(chǔ)、以高靈敏度PCR-質(zhì)譜聯(lián)用為平臺的高精確度檢測和/或鑒定人類乳頭狀瘤病毒(HPV)基因型的方法。
文檔編號C12Q1/70GK102367487SQ20111026707
公開日2012年3月7日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者彭俊平, 郭軍華, 金奇 申請人:中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所, 郭軍華