專利名稱：含甲型流感病毒核蛋白的融合基因及其構(gòu)建和表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種含甲型流感病毒核蛋白的融合基因PEGFP-N1-NP及其構(gòu)建和表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
甲型流感病毒是呼吸道感染的重要病原體，多次引起世界性流感大流行1997年香港爆發(fā)高致病性H5m禽流感疫情，首次證實(shí)禽流感可以感染人類，至今全球已感染562 例，死亡3 例；2009年甲型Hmi流感席卷全球，未來流感流行的病毒株將可能會(huì)出現(xiàn)在任何時(shí)間、世界的任何地方、以及任何動(dòng)物來源的流感病毒重配株。甲型流感病毒核蛋白 (NucleoproteinjNP)是由流感病毒基因組第5片段編碼的，其開放讀碼框含1494個(gè)核苷酸，在流感病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要的作用，在各個(gè)不同亞型中具有高度保守性并可產(chǎn)生免疫交叉保護(hù)。因此，對核蛋白功能的研究，將有助于進(jìn)一步了解甲型流感病毒的致病機(jī)制，為防控流感大流行提供理論依據(jù)。為了能夠大量獲得甲型流感病毒核蛋白，以便進(jìn)行下一步研究，需要構(gòu)建甲型流感病毒核蛋白NP基因真核表達(dá)載體。真核表達(dá)質(zhì)粒載體pEGFP-Nl表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)，構(gòu)建NP與EGFP的融合基因，可使NP基因表達(dá)綠色熒光蛋白。所構(gòu)建的融合基因可進(jìn)行真核表達(dá)，對甲型流感病毒核蛋白的功能鑒定、藥物靶點(diǎn)篩選及其致病機(jī)理的進(jìn)一步研究奠定了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種含甲型流感病毒核蛋白的融合基因 pEGFP-Nl-NP及其構(gòu)建和表達(dá)方法，該融合基因pEGFP_Nl_NP的成功構(gòu)建和表達(dá)可進(jìn)行RNA 干擾抑制流感病毒NP基因，并在細(xì)胞及病毒中進(jìn)行功能鑒定。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案
本發(fā)明含甲型流感病毒核蛋白的融合基因pEGFP-Nl-NP的核苷酸序列如SEQ ID
NO. 1。上述融合基因的構(gòu)建方法，包括如下步驟
(1)以甲型流感病毒核蛋白基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)含限制性內(nèi)切酶EcoRI及Sma I酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增，得帶有雙酶切位點(diǎn)的核蛋白基因；
(2)將核蛋白基因與T載體pMD19-TSimple Vector混合進(jìn)行T克隆，經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后獲得PMD19-T-NP質(zhì)粒；
(3)將pMD19-T-NP質(zhì)粒亞克隆至增強(qiáng)型綠色熒光示蹤蛋白EGFP的目標(biāo)載體pEGFP-Nl， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5 α，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，Sma I、EcoR I雙酶切鑒定陽性克隆，即得融合基因 pEGFP-Nl-NP。在上述融合基因的制備方法中，步驟(3)中亞克隆是指采用限制性內(nèi)切酶Sma I和EcoR I雙酶切pEGFP-Nl質(zhì)粒及pMD19_T_NP質(zhì)粒分別獲得純化的pEGFP-Nl和目的核蛋白片段，添加到連接反應(yīng)中連接獲得連接反應(yīng)液。所述培養(yǎng)后提取質(zhì)粒是將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH-5 α接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)，挑取單克隆菌落至含卡那霉素的 S. 0. C液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在前述融合基因的構(gòu)建方法中，步驟(1)中所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增引物為 上游弓I物5，-ccgcgaattcatggcgtctcaaggcaccaaacgat-3，，其中 gaattc 是 EcoR I 的
酶切位點(diǎn)；
下游弓I物5' -cgcgcccgggcattgtcatactcctctgcatt_3'，其中 cccggg 是 Sma I 的酶切位點(diǎn)。在前述的構(gòu)建方法中，所述模板為甲型流感病毒H9N2核蛋白基因。前述甲型流感病毒核蛋白與綠色熒光蛋白融合基因pEGFP-Nl-NP的表達(dá)方法通過Lipofectamine 2000將pEGFP_Nl_NP融合基因轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)；用細(xì)胞免疫組化方法鑒定甲型流感病毒核蛋白的表達(dá)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將甲型流感病毒核蛋白與綠色熒光蛋白融合，形成融合基因，該融合基因在轉(zhuǎn)染真核表達(dá)細(xì)胞后可表達(dá)綠色熒光蛋白和甲型流感病毒核蛋白，該融合基因pEGFP-Nl-NP的成功構(gòu)建和表達(dá)可進(jìn)行RNA干擾抑制流感病毒NP基因，并在細(xì)胞及病毒中進(jìn)行功能鑒定。


圖1為本發(fā)明融合基因的結(jié)構(gòu)示意圖2為目的基因NP PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中M 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 =NP-F, NP-R擴(kuò)增NP基因片段。圖3為NP基因TA克隆質(zhì)粒電泳結(jié)果。其中M 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1_7 可能構(gòu)建成功的NP基因TA克隆質(zhì)粒；8、9 未構(gòu)建成功的NP基因TA克隆質(zhì)粒。圖4為NP基因TA克隆質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果。其中M 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-7:構(gòu)建成功的NP基因TA克隆質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳；8、9 未構(gòu)建成功的NP基因TA克隆質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳。圖5為NP、EGFP融合基因質(zhì)粒電泳結(jié)果。其中M 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-4，6-9，11-18 可能構(gòu)建成功的NP、EGFP融合基因質(zhì)粒；5、10 未構(gòu)建成功的NP融合基因。圖6為NP、EGFP融合基因質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果。其中M:分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1-4，6-9，11-18 構(gòu)建成功的NP、EGFP融合基因質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳；5、10 未構(gòu)建成功的NP 融合基因質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳。圖7為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果(X400)。其中A、D: pEGFP-m 轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞；B、E: pEGFP-Nl-NP 轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞；C、F: HEI^93T 細(xì)胞空白轉(zhuǎn)染對照。圖8為細(xì)胞免疫組化鑒定NP蛋白的表達(dá)觀察結(jié)果(X400)。其中B: pEGFP_Nl_NP 轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，加兔抗NP—抗，箭頭所指為陽性染色結(jié)果；A、C、D、E、F:未見陽性染色結(jié)果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 融合基因pEGFP-Nl-NP的構(gòu)建
1、設(shè)計(jì)含限制性內(nèi)切酶EcoR I及Sma I酶切位點(diǎn)的引物
上游弓丨物5' -Ccgcgaattcatggcgtctcaaggcaccaaacgat-Si，其中 gaattc 是 EcoR I 的酶切位點(diǎn)；
下游弓I物5' -CRCRCccRRRcattRtcatactcctctRcatt-3'，其中 cccggg 是 Sma I 的酶切位點(diǎn)。2、PCR擴(kuò)增NP片段甲型流感病毒核蛋白(NP)基因DNA來源病毒株為Influenza A virus (A/swine/Guangxi/S15/2005(H9N2)) (GenBank: EU086324.1
)，以NP基因DNA為模板，步驟(1)所設(shè)計(jì)的引物為引物，引入限制性內(nèi)切酶EcoR I和 Sma I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增NP基因片段全長為1508bp ； ddH2012. 5μ 1
5 X Buffer5μ 1
MgCl22 μ 1
dNTPmix2 μ 1
DNA Taq 酶0. 5 μ 1
NP-F0· 5 μ 1
NP-R0· 5 μ 1
NP DNA2 μ 1
總反應(yīng)體系 25 μ 1。PCR 擴(kuò)增條件如下94°C 3min ；94°C 30s, 59°C 20s, 72°C lmin30s, 共42個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果(如圖2所示)，按美國 Omega公司DNA純化回收試劑盒說明書切膠、純化大小為1508bp的NP基因片段。3、NP基因的TA克隆
(1)取步驟2所得的NP基因片段，按寶生物工程(大連)有限公司TA克隆操作說明書與 pMD19-T Simple Vector 混合連接； pMD19-T Simple Vector1 μ 1
NP DNA4 μ 1
Solution I5 μ 1
16°C連接池得連接產(chǎn)物。(2)轉(zhuǎn)化大腸桿菌取100 μ 1大腸桿菌DH-5 α感受態(tài)細(xì)胞于冰浴中融化，避免感受態(tài)細(xì)胞長時(shí)間暴露于室溫；向感受態(tài)細(xì)胞中加入10 μ 1目的DNA(連接產(chǎn)物)，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管使液體混勻，切忌不要吹打或震蕩混勻，冰浴30min ；42°C水浴熱激90s，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰浴:3min，過程中不要搖動(dòng)離心管；向離心管中加入900μ 1 LB液體培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻后置于37°C搖床200rpm震蕩培養(yǎng)lh，使質(zhì)?？剐詷?biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇；紫外燈照射LB (含氨芐青霉素)藍(lán)白斑篩選培養(yǎng)板20min，取100 μ 1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到板上，用玻璃棒均勻涂布，室溫放置直到液體完全吸收后倒置于37°C烘箱中16h。( 3 )菌株篩選挑選培養(yǎng)后菌體晶瑩透明體積較大，且周圍無其他融合菌落邊界清晰的白色單一克隆，用牙簽輕沾后扇形涂布于事先分格的LB (含氨芐青霉素)藍(lán)白斑篩選培養(yǎng)板上，標(biāo)號(hào)一一對應(yīng)，標(biāo)記清楚以備上溯；37°C烘箱倒置培養(yǎng)16h。(4)質(zhì)粒抽提挑選單克隆擴(kuò)增后仍為白色的菌落至含氨芐青霉素的S. 0. C液體
5培養(yǎng)基，37°C搖床200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)12-1他，利用北京天根生物公司的質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)提取質(zhì)粒，按以下步驟進(jìn)行
①選取單克隆板上長勢較好的菌株，取1. 5ml離心管加入ImlS. 0. C含氨芐青霉素液體培養(yǎng)基，用牙簽挑取少量菌落于離心管中攪拌，在15ml離心管中加入5mlS. 0. C含氨芐青霉素液體培養(yǎng)基，將混勻的菌液加入15ml離心管中，蓋子只螺旋約1/4行程便于通氣，37°C 200rpm IMi搖床過夜。②柱平衡步驟向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μ1的平衡液BL， 12，OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(使用當(dāng)天處理過的柱子)
③取2 ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，12，OOOrpm離心 Imin，盡量吸除上清。④向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ 溶液Pl (已加入RNaseA)，使用渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。⑤向離心管中加入250 μ 溶液Ρ2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 — 8次使菌體充分裂解。⑥向離心管中加入350 μ 溶液Ρ3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6_8次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12，000 rpm離心lOmin，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。⑦將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)， 注意盡量不要吸出沉淀。12，OOO rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。⑧向吸附柱CP3中加入600μ 1漂洗液PW (使用前已加入無水乙醇)，12000rpm 離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中；重復(fù)步驟⑧。⑨將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm離心^iiin，將吸附柱中的殘余漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘余會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切，PCR等)實(shí)驗(yàn)，為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，將吸附柱CP3開蓋，至于室溫放置lOmin，待吸附柱中殘余的漂洗液徹底晾干后再進(jìn)行后續(xù)步驟。⑩將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位滴加 100 μ 1脫洗緩沖液ΕΒ，室溫放置2min，12000rpm離心lmin，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中，-20°C保存?zhèn)溆谩?5) TA克隆鑒定0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，選擇目標(biāo)條帶為4200bp的質(zhì)粒，初步判定為陽性克隆結(jié)果。限制性內(nèi)切酶Sma I ,EcoR I進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系如下
IOXBuffer2μ 1
Sma I1 μ 1
ddH2011 μ 1
質(zhì)粒6μ 1 (lug)
30°C連接Ih后加入以下試劑 EcoR I1 μ 1
IOXBuffer2. 5 μ 1
37°C 連接 Ih。0. 8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證(如圖3所示)，若在2700bp及1500bp位置存在目標(biāo)條帶，則簽定為陽性克隆，命名為PMD19-T-NP。 4、NP基因亞克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒載體pEGFP-Nl，構(gòu)建融合基因表達(dá)載體 pEGFP-Nl-NP
(1)限制性內(nèi)切酶 Sma I、EcoR I 雙酶切 pEGFP-Nl 及 pMD19_T_NP
37°C 連接 Ih。0.8%瓊脂糖凝膠電泳(如圖4所示)，切膠純化得大小為1500bp目的片段NP及 4700bp質(zhì)粒pEGFP-Nl大片段。(2)各取2 μ 1純化后片段NP及pEGFP-Nl，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳粗略定量；目的片段NP與質(zhì)粒pEGFP-Nl按摩爾比5:1添加到連接反應(yīng)中
pEGFP-Nl4 μ 1
NP10 μ 1
Τ4 DNA連接酶1 μ 1
IOXBuffer2μ 1
ddH203 μ 1
16°C反應(yīng)12-1他。融合基因質(zhì)粒的電泳結(jié)果如圖5所示。(3)連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5 α，均勻涂布含卡那霉素的LB培養(yǎng)板上，37°C 培養(yǎng)12-1 ；挑取單克隆菌落至含卡那霉素的LB培養(yǎng)板上，37°C培養(yǎng)12-1 ；挑取經(jīng)擴(kuò)增后單克隆菌落至含卡那霉素的S. 0. C液體培養(yǎng)基，37°C搖床200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)12-1他，利用北京天根生物公司的質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)提取質(zhì)粒。Sma I ,EcoR I雙酶切鑒定陽性克隆(如圖6所示)，即得融合基因pEGFP-Nl-NP，送上海hvitrogen生命技術(shù)公司基因測序進(jìn)一步鑒定，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。實(shí)施例2 融合基因pEGFP-Nl-NP的表達(dá)
1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞將生長良好的融合度達(dá)80%以上的HEK293T細(xì)胞接種到6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)70%左右時(shí)按美國hvitrogen公司的Lipofectamine 2000說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中兩孔為質(zhì)粒pEGFP-Nl轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，兩孔為pEGFP-Nl-NP轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，兩孔為HEK293T細(xì)胞空白對照，以便下步的免疫組化檢測。2、倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞Mh后，在倒置熒光顯微鏡(Olympus IX71-A12FL/PH)下觀察，結(jié)果如圖7所示。3、NP蛋白表達(dá)的鑒定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后倒置熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)，可應(yīng)用細(xì)胞免疫組化的方法鑒定NP蛋白的表達(dá)。首先在六孔板中用PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，pEGFP-NU pEGFP-Nl-NP及空白細(xì)胞對照各一孔中加入兔抗NP —抗(1 =1000, 含0. 5%胎牛血清PBS稀釋)，另3孔中加含0. 5%胎牛血清PBS稀釋液作為對照，37°C孵育
IOXBuffer Sma I ddH20
質(zhì)粒(pEGFP-m/pMD I9-T-NP) 30°C連接Ih后加入以下試劑 EcoR I IOXBufferlh，4°C過夜；PBS漂洗3次，加山羊抗兔二抗，37°C孵育Ih ；PBS漂洗3次；DAB試劑盒顯色， 5min-lOmin，加蒸餾水漂洗終止顯色；蘇木素復(fù)染，3min-&iiin，蒸餾水漂洗；1%鹽酸酒精分化，蒸餾水漂洗，倒置顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖8所示。
權(quán)利要求
1.一種含甲型流感病毒核蛋白的融合基因PEGFP-N1-NP的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1。
2.權(quán)利要求1所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟(1)以甲型流感病毒核蛋白基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)含限制性內(nèi)切酶EcoRI及Sma I酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增，得帶有雙酶切位點(diǎn)的核蛋白基因；(2)將核蛋白基因與T載體pMD19-TSimple Vector混合進(jìn)行T克隆，經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后獲得PMD19-T-NP質(zhì)粒；(3)將pMD19-T-NP質(zhì)粒亞克隆至增強(qiáng)型綠色熒光示蹤蛋白EGFP的目標(biāo)載體pEGFP-Nl， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5 α，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，Sma I、EcoR I雙酶切鑒定陽性克隆，即得融合基因 pEGFP-Nl-NP。
3.按照權(quán)利要求2所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的構(gòu)建方法，其特征在于 步驟(3)中亞克隆是指采用限制性內(nèi)切酶Sma I和EcoR I雙酶切pEGFP-Nl質(zhì)粒及 PMD19-T-NP質(zhì)粒分別獲得純化的pEGFP-Nl和目的核蛋白片段，添加到連接反應(yīng)中連接獲得連接反應(yīng)液。
4.按照權(quán)利要求2所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的構(gòu)建方法，其特征在于 步驟(3)中所述培養(yǎng)后提取質(zhì)粒是將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH-5 α接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)，挑取單克隆菌落至含卡那霉素的S. 0. C液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
5.按照權(quán)利要求2所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的構(gòu)建方法，其特征在于 步驟(1)中所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增引物為上游引物5' -Ccgcgaattcatggcgtctcaaggcaccaaacgat-Si ；下游弓I物5，-cgcgcccgggcattgtcatactcctctgcatt-3，。
6.按照權(quán)利要求2述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(1)中所述甲型流感病毒為H9N2。
7.權(quán)利要求1所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的表達(dá)方法，其特征在于通過 Lipofectamine 2000將pEGFP_Nl_NP融合基因轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)；用細(xì)胞免疫組化方法鑒定甲型流感病毒核蛋白的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含甲型流感病毒核蛋白的融合基因pEGFP-N1-NP及其構(gòu)建和表達(dá)方法，該融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將甲型流感病毒核蛋白與綠色熒光蛋白融合，形成融合基因，該融合基因在轉(zhuǎn)染真核表達(dá)細(xì)胞后可表達(dá)綠色熒光蛋白和甲型流感病毒核蛋白，該融合基因pEGFP-N1-NP的成功構(gòu)建和表達(dá)可進(jìn)行RNA干擾抑制流感病毒NP基因，并在細(xì)胞及病毒中進(jìn)行功能鑒定。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102321651SQ20111026632
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者劉梅, 劉波, 張建勇, 張泓, 李娜娜, 王建華, 陳玲 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院