專利名稱：β-葡聚糖內(nèi)切酶PEGase-1基因及其表達(dá)產(chǎn)物和應(yīng)用的制作方法
β-葡聚糖內(nèi)切酶PEGase-1基因及其表達(dá)產(chǎn)物和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，尤其涉及一種β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfeise-I基因及其表達(dá)產(chǎn)物和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β-1,3 )-葡聚糖內(nèi)切酶(Endo-β _1，3 ⑷-glucanase，Efeise,以下簡稱“ β-葡聚糖內(nèi)切酶”，酶學(xué)分類號為EC3. 2.1.73)是一類能偶特異性的水解β-1,3 )-葡聚糖中與β_1，3糖苷鍵毗鄰的β _1，4糖苷鍵的糖苷水解酶(glycosylhydrolases，GH)，水解產(chǎn)物通常為3 5個(gè)寡糖[1]。大麥芽是啤酒生產(chǎn)的主要原料，大麥胚乳細(xì)胞壁約70%的組分為β-1，30)_葡聚糖[2]。在啤酒釀造過程中，糖化過程變性的蛋白質(zhì)會(huì)與過量的β-1，30)_葡聚糖結(jié)合會(huì)造成酵母早期沉積，從而影響發(fā)酵，并導(dǎo)致啤酒釀造過程中的雙乙酰還原期延長；過量的 β-1,3 )-葡聚糖還會(huì)引起啤酒渾濁和沉淀，影響啤酒的品質(zhì)。因此，啤酒在原料糖化后， 要添加適量的葡聚糖內(nèi)切酶以水解原料中的β-1，30)_葡聚糖。麥片因纖維含量高、 營養(yǎng)價(jià)值高成為老年人喜愛的食品，但食用過量的麥片容易引起老年人消化不良，因此，在麥片中添加適量的β-葡聚糖內(nèi)切酶或食用麥片后再食用幾片含β-葡聚糖內(nèi)切酶的多酶片可以有助于消化。玉米胚乳細(xì)胞壁中也含大量β-1，30)_葡聚糖，崽豬食用以玉米為主要原料的飼料時(shí)容易引起消化不良。因此，在飼料中添加適量的β-葡聚糖內(nèi)切酶，讓崽豬及早食用可消化的飼料，可以讓崽豬及早斷奶，從而提高生豬的生產(chǎn)效率。植物、真菌和細(xì)菌都含有β-葡聚糖內(nèi)切酶，植物β-葡聚糖內(nèi)切酶屬于糖苷水解酶的GH17家族，而微生物β-葡聚糖內(nèi)切酶則屬于糖苷水解酶的GH16家族。盡管GH16和 GH17家族的β-葡聚糖內(nèi)切酶有相似的功能，但他們在結(jié)構(gòu)上卻沒有相似性，GH17家族成員的三級結(jié)構(gòu)呈(β/α)8桶狀[3]，而GH16家族成員的三級結(jié)構(gòu)則呈β-三明治折疊卷狀 Μ。大麥β-葡聚糖內(nèi)切酶在種子萌芽早期表達(dá)量最高，其最適PH值(pH。pt)為4. 6、最適溫度(T。pt)為45°C [5’6]。芽孢桿菌β-葡聚糖內(nèi)切酶也能特異水解大麥β-1,3 )-葡聚糖，其pH。pt介于6.0 7.5、T。pt介于58°C 60°C [7_13]，但該類β-葡聚糖內(nèi)切酶大多對酸環(huán)境敏感[1]。浸麻芽孢桿菌β-葡聚糖內(nèi)切酶是最耐熱的β-葡聚糖內(nèi)切酶之一，T-為 65°C，在75°C時(shí)還有80%的活性，pH-為中性。淀粉液化芽孢桿菌的β-葡聚糖內(nèi)切酶的 pH-為6.0，受酸性環(huán)境影響最小[14]。用淀粉液化芽孢桿菌葡聚糖內(nèi)切酶N端的16個(gè)氨基酸替換浸麻芽孢桿菌β -葡聚糖內(nèi)切酶N端的16個(gè)氨基酸組合成的雜合酶Η(Α16-Μ) 在80°C時(shí)還有80%的活性，對酸性環(huán)境耐受能力有所提高，對大麥β-1，30)_葡聚糖的特異性還比野生型浸麻芽孢桿菌β-葡聚糖內(nèi)切酶還高40% [15]，但國內(nèi)沒有該類酶的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，啤酒行業(yè)使用的β-葡聚糖內(nèi)切酶目前主要依賴進(jìn)口。真菌β-葡聚糖內(nèi)切酶水解的底物比大麥和芽孢桿菌β-葡聚糖內(nèi)切酶廣泛，不僅能水解大麥β-1，30)_葡聚糖，還能水解羧甲基纖維素和昆布多糖[16_19]。盡管國內(nèi)在芽孢桿菌β-葡聚糖內(nèi)切酶和真菌β-葡聚糖內(nèi)切酶上也有一定的研究[11_13’19’2°]，但能替代進(jìn)口產(chǎn)品的β-葡聚糖內(nèi)切酶還沒有出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容基于此，有必要提供一種能夠表達(dá)具有葡聚糖內(nèi)切酶活性的蛋白的葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因，并提供其表達(dá)產(chǎn)物及應(yīng)用。一種β -葡聚糖內(nèi)切酶PEfeise-I基因，包括如下序列(a)、編碼由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈；(b)、和編碼由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸具有至少 98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈；(C)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述多肽由SEQ IDNo. 1所示的氨基酸序列組成，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β -葡聚糖內(nèi)切酶活性；或(d)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述多肽與由SEQ IDNo. 1所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98%的同源性。一種β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfeise-I基因，包括如下序列(a)、由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈；(b)、和編碼由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈；或(c)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述多核苷酸序列由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成，其中一個(gè)或多個(gè)密碼子被缺失、替代或增加，所述多肽具有 β-葡聚糖內(nèi)切酶活性。優(yōu)選的，所述β -葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因包括由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸。一種基因表達(dá)載體，包括上述的β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因。一種宿主細(xì)胞，包括如上述的基因表達(dá)載體，所述宿主細(xì)胞為真核生物細(xì)胞。優(yōu)選的，所述真核生物細(xì)胞為酵母細(xì)胞或里氏木霉細(xì)胞。一種蛋白質(zhì)的制備方法，包括如下步驟步驟一、提供上述的宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)得到表達(dá)液； 步驟二、利用40 %和70 %的飽和硫酸銨將所述表達(dá)液分級沉淀，分離粗產(chǎn)物；步驟三、利用HiTrap Capto Q離子交換層析膠純化粗產(chǎn)物，得到所述蛋白質(zhì)。一種蛋白質(zhì)，包括如下序列(a)、由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)、和由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98%同源性的多肽；或(C)、由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β -葡聚糖內(nèi)切酶活性。一種酶制劑，包括上述的蛋白質(zhì)；所述酶制劑用于水解β-1，30)_葡聚糖。
優(yōu)選的，所述酶制劑還包括用于提高酶活性的金屬陽離子。從多頭絨泡菌cDNA文庫中篩選PSRI3K相關(guān)蛋白基因，分離出一段編碼具有β-葡聚糖內(nèi)切酶活性的β-葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白的3' -cDNA片段。該3' -cDNA片段表達(dá)的β-葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，該3' -cDNA片段具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。上述β -葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因能夠表達(dá)具有β-葡聚糖內(nèi)切酶活性的蛋白質(zhì)，表達(dá)產(chǎn)物可以應(yīng)用于啤酒釀造，以及作為藥品、食品和飼料添加劑。

圖1為PEfese-I與嗜熱擬青霉的β -葡聚糖內(nèi)切酶的氨基酸序列比對圖。圖2為模擬的嗜熱擬青霉的β-葡聚糖內(nèi)切酶與PEfese-I的三級結(jié)構(gòu)示意圖；其中，A為模擬的嗜熱擬青霉β -葡聚糖內(nèi)切酶的三級結(jié)構(gòu)，B為模擬的PEfese-I的三級結(jié)構(gòu)。圖3為實(shí)施例2在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Trx-PEGase-I與硫氧還蛋白標(biāo)簽蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后考馬斯藍(lán)染色的示意圖。圖4為實(shí)施例3在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的PEfese-I進(jìn)行SDS-PAGE后考馬斯藍(lán)染色的示意圖；其中，箭頭指向表達(dá)的PEfese-1。圖5為實(shí)施例4在里氏木霉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的PEfese-I與陰性對照組同時(shí)進(jìn)行 SDS-PAGE后考馬斯藍(lán)染色的示意圖；其中，箭頭指向表達(dá)的PEfeise-l。圖6為從實(shí)施例4得到的表達(dá)PEfeise-I的T. reesei QM9414傳代7次后，選擇第 2代和第8代菌體提取基因組，PCR擴(kuò)增PEfese-I基因片段后電泳的得到的電泳示意圖。圖7為從實(shí)施例4得到的表達(dá)PEfeise-I的T. reesei QM9414傳代7次后，選擇第 2代和第8代菌體表達(dá)分泌的PEfese-I水解大麥β -glucan的活力檢測示意圖。圖8為實(shí)施例4中實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組收集到的上清液，與實(shí)施例6中粗分離得到的粗酶液和純化后得到的蛋白一起，進(jìn)行SDS-PAGESDS-PAGE后考馬斯亮藍(lán)染色的示意圖；其中，箭頭指向純化的PEfese-1。圖9為實(shí)施例6得到的純化PEGase-I水解大麥β -glucan的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程曲線圖。圖10為實(shí)施例6得到的純化PEfeise-I水解大麥β -glucan的活力隨反應(yīng)體系pH 的變化示意圖。圖11為實(shí)施例6得到的純化PEfeise-I水解大麥β -glucan的活力隨反應(yīng)體系溫度的變化圖。圖12為實(shí)施例6得到的純化PEfeise-I在不同溫度下水解大麥β -glucan活力隨時(shí)間的變化圖。圖13為實(shí)施例6得到的純化PEfeise-I在不同pH緩沖液中存放M小時(shí)后的水解大麥β-glucan活力變化圖。圖14為為實(shí)施例6得到的純化PEfese-I在不同濃度不同種類的金屬離子存在下水解大麥β-glucan活力的示意圖。圖15為PEfeise-I基因在里氏木霉QM9414重組轉(zhuǎn)化的技術(shù)示意圖。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對β -葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因及其表達(dá)產(chǎn)物和應(yīng)用做進(jìn)一步的解釋說明。以多頭絨泡菌SR蛋白激酶PSRPK(GenBank序列號DQ140379)為餌蛋白，通過酵母雙雜交，從多頭絨泡菌cDNA文庫中篩選PSRPK相關(guān)蛋白基因[22]，分離出一段編碼具有 β-葡聚糖內(nèi)切酶活性的β-葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白的3' -cDNA片段。該3' -cDNA片段表達(dá)的β -葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白具有如SEQ IDNo. 1所示的氨基酸序列，該3' -cDNA片段具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。提供一實(shí)施方式的β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因，該基因編碼具有β-葡聚糖內(nèi)切酶活性的蛋白質(zhì)。在較優(yōu)的實(shí)施方式中，該β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfeise-I基因包括編碼由SEQ IDNo. 1 所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈。特別的，該葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因包括由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈。該β -葡聚糖內(nèi)切酶PEfeise-I基因還可以為包括和編碼由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈；優(yōu)選為至少具有至少99%同源性。特別的，該β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因和編碼由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸， 或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈；優(yōu)選為至少具有至少99%同源性。該β -葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因還可以為包括編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述多肽由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有葡聚糖內(nèi)切酶活性。特別的，該葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因包括編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述多核苷酸序列由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成，其中一個(gè)或多個(gè)密碼子被缺失、替代或增加，所述多肽具有葡聚糖內(nèi)切酶活性。該β -葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因還可以為包括編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述多肽與由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98% 的同源性；優(yōu)選為至少具有至少99%同源性。這種β -葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因能夠表達(dá)具有β -葡聚糖內(nèi)切酶活性的蛋白質(zhì)，表達(dá)產(chǎn)物可以應(yīng)用于啤酒釀造，以及作為藥品、食品和飼料添加劑。由于蛋白編碼基因的多態(tài)性及變異，天然存在的蛋白質(zhì)會(huì)出現(xiàn)氨基酸的缺失、插入、取代或其它變異，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨基酸序列出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、替代或增加。事實(shí)上，存在著一些生理和生物活性上基本等同于無變異蛋白質(zhì)的蛋白。這些結(jié)構(gòu)不同于相應(yīng)的蛋白質(zhì)但與該蛋白質(zhì)沒有明顯的功能差異的多肽或蛋白稱為功能等同變異體。功能等同的變異體同樣適用于通過缺失、插入和突變等人工手段改變一個(gè)或多個(gè)密碼子，從而向一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列中導(dǎo)入這類變異而制成的多肽。盡管這樣能獲得更多不同形式的變異體，但所得的變異體作為功能等同變異體的前提是其生理活性基本等同于原始無變異蛋白質(zhì)的活性。
例如，用淀粉液化芽孢桿菌β-葡聚糖內(nèi)切酶N端的16個(gè)氨基酸替換浸麻芽孢桿菌β-葡聚糖內(nèi)切酶N端的16個(gè)氨基酸組合成的雜合酶Η(Α16-Μ)在80°C時(shí)還有80 %的活性，對酸性環(huán)境耐受能力有所提高，對大麥β-1，30)_葡聚糖的特異性還比野生型浸麻芽孢桿菌β-葡聚糖內(nèi)切酶還高40% [15]。此外，在用基因工程方法生產(chǎn)蛋白質(zhì)時(shí)，常把所需蛋白質(zhì)表達(dá)為融合蛋白質(zhì)，例如，把源于其他蛋白質(zhì)的N末端肽鏈加到所需蛋白質(zhì)的N末端以提高所需蛋白質(zhì)的表達(dá)，或者把一個(gè)合適的肽鏈加到所需蛋白的N或C末端，表達(dá)該蛋白并使用一種對所加肽鏈具有親和力的載體使所需蛋白的純化變得更加容易。就決定基因上特定氨基酸的密碼子(三聯(lián)體堿基組合)而言，每種氨基酸存在1 到6個(gè)密碼子。因此盡管依賴于氨基酸序列，但仍有許多編碼一種氨基酸的基因。在自然界中，基因并不穩(wěn)定，常發(fā)生核酸變異?；虻淖儺惪赡懿挥绊懰幋a的氨基酸序列(沉默變異)，這種情況下，會(huì)產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的不同基因。因此，即使分離出了編碼特定氨基酸序列的基因，隨著含有該基因生物體的傳代，仍不可避免地會(huì)產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的不同基因。用各種基因工程技術(shù)人工產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的各種基因并不困難。例如， 當(dāng)編碼所需蛋白質(zhì)的天然基因的密碼子在用于以基因工程技術(shù)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主中可利用性較低、表達(dá)的蛋白量不夠時(shí)，可以人工將密碼子轉(zhuǎn)變成在該宿主中可利用性高的另一密碼子而不改變所編碼的氨基酸序列，即可增強(qiáng)所需蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，這類人工生產(chǎn)的不同多核苷酸也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它能編碼出本發(fā)明公開的氨基酸序列即可。另外，由至少一種改變(如蛋白質(zhì)的氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白質(zhì)的活性，編碼這類多肽或蛋白的基因也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，不管它是從天然來源分離還是人工生產(chǎn)的。一般的，編碼功能等同變異體的基因是同源的。因此，能與本發(fā)明的基因雜交且編碼具有PEfese-I活性的蛋白質(zhì)的核酸分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。提供一實(shí)施方式的蛋白質(zhì)，由上述β -葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因表達(dá)得到。這種蛋白質(zhì)為β-葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白且具有β-葡聚糖內(nèi)切酶活性。在較優(yōu)的實(shí)施方式中，這種蛋白質(zhì)包括由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽。這種蛋白質(zhì)還可以包括和由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少 98%同源性的多肽。這種蛋白質(zhì)還可以包括由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β -葡聚糖內(nèi)切酶活性。提供一實(shí)施方式的基因表達(dá)載體，包括上述β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因。一般的，可以選擇將上述β -葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因采用標(biāo)準(zhǔn)程序充足到各種常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)載體，例如pPET-32a(+)、pPICZa A、pPIC-GST等，得到上述基因表達(dá)載體。將該基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，得到可以表達(dá)上述具有β-葡聚糖內(nèi)切酶活性的β-葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白。由于多頭絨泡菌為真核細(xì)胞，宿主細(xì)胞一般選擇真核生物細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞和里氏木霉細(xì)胞。
酵母細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，不僅可以在0. 5 %的甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)，還能將其分泌到細(xì)胞外。里氏木霉細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，表達(dá)的β-葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白可以經(jīng)過較好的化學(xué)修飾，具有較高的活性。提供一實(shí)施方式的上述類似蛋白的制備方法，包括如下步驟步驟一、提供包括上述β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因的基因表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)得到表達(dá)液。步驟二、利用40%和70%的飽和硫酸銨將所述表達(dá)液分級沉淀，分離粗產(chǎn)物。步驟三、利用HiTrap Capto Q離子交換層析膠純化粗產(chǎn)物，得到所述蛋白質(zhì)。通過上述方法制備得到β -葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白，還需要對得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測定，主要包括該葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白的最適底物、酶動(dòng)力學(xué)反應(yīng)常數(shù)、最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)酸堿度、溫度穩(wěn)定性、PH穩(wěn)定性、貯藏穩(wěn)定性以及宿主細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性。具體測定方法和測定數(shù)據(jù)在具體實(shí)施例中介紹。提供一實(shí)施方式的酶制劑，主要用于水解β-1，30)_葡聚糖，這種酶制劑包括上述的β-葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白。在較優(yōu)的實(shí)施方式中，酶制劑還包括用于提高酶活性的金屬陽離子。金屬陽離子的存在下一般會(huì)使得上述β-葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白的活性得到加強(qiáng)，具體的金屬陽離子可以為:Cu2\ Ni2+、Zn2+、Fe2+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+ 和 Co2+。下面為具體實(shí)施例部分。以下實(shí)施例中，如無特別說明，所有操作均采用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)操作過程，所采用的試劑或載體等均為常規(guī)試劑或常規(guī)載體，葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，β -葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因具有如SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列。實(shí)施例1PEGase-I基因的篩選、擴(kuò)增和結(jié)構(gòu)分析。取IOOmg多頭絨泡菌(濕重)，用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN,德國)提取總 RNA，用Genefcicer Kit (Invitrogen，美國)將多頭絨泡菌的完整mRNAs制備成cDNAs ；通過 5' -RLM RACE (RNA ligase—mediated rapid amplification of5' -cDNA ends)技術(shù)， 從多頭絨泡菌完整cDNAs中擴(kuò)增β-葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白的5' -cDNA片段；通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，用DNA Ligation Kit (Takara，大連)的Solution I將經(jīng) AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen，美國)回收的目標(biāo) DNA 片段連接到 pMD18T 載體(Takara，大連)上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli ToplO后測序，拼接5' -cDNA和 3' -cDNA序列，獲得多頭絨泡菌β-葡聚糖內(nèi)切酶類似蛋白的完整cDNA序列。本專利將該 cDNA 編碼的蛋白命名為 PEfeise-I (Physarum Endo- β -1, 3 (4) -glucanase 1)。PEGase-I 具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，PEGase-I基因具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。根據(jù)PEGase-I 完整 cDNA 的 ORF (Open Reading frame)序列，設(shè)計(jì)含 BamHI 酶切位點(diǎn)(帶下劃線的序列)的引物 5' -CGCGGATCCATGAACCCTAAAGTGTTCATTTTTG-3'和含 Hind III酶切位點(diǎn)的引物5 ‘ -GGGAAGCTTTTACTGTTGGTACACTTTGATGG-3 ‘，以多頭絨泡菌完整cDNA為模版，通過PCR技術(shù)從多頭絨泡菌完整cDNAs中擴(kuò)增出PEfeise-I基因。將PEGase-I基因編碼的氨基酸序列與嗜熱擬青霉(Paecilomyces thermophila) 的β-葡聚糖內(nèi)切酶氨基酸序列進(jìn)行比對。如圖1所示，PEGase-I基因編碼的氨基酸序列與嗜熱擬青霉的β -葡聚糖內(nèi)切酶的氨基酸序列有44%的相似性。將模擬的PEfese-I三級結(jié)構(gòu)與嗜熱擬青霉的β -葡聚糖內(nèi)切酶的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比。如圖2所示，模擬的PEfese-I三級結(jié)構(gòu)與嗜熱擬青霉的β-葡聚糖內(nèi)切酶的三級結(jié)構(gòu)類似，二級結(jié)構(gòu)以片層為主，都屬于熱穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)。由此說明，PEGase-I的熱穩(wěn)定性與嗜熱擬青霉Efese的熱穩(wěn)定性相似。實(shí)施例2PEGase-I基因在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和鑒定。用DNA Ligation Kit 的 Solution I 將經(jīng) BamH I 和 Hind III 酶切的 PCR 片段連接到經(jīng)同樣內(nèi)切酶酶切的pET3h(+)上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Ε. coli origami (DE3) (Invitrogen，美國)，在LB固體培養(yǎng)板(含50 μ g/ml Amp和30 μ g/ml Kan)上篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒pET32(a)-pegasel進(jìn)行PCR、雙酶切和測序鑒定。提取表達(dá)產(chǎn)物Trx-PEGase-I與該融合蛋白的標(biāo)簽蛋白(Thioredoxin，Trx，硫氧還蛋白)同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色后如圖3所示。如圖3所示，Trx-PEGase-I的相對分子質(zhì)量(51kD)比該融合蛋白的標(biāo)簽蛋白 (Thioredoxin，Trx，硫氧還蛋白)的相對分子質(zhì)量(17kD)多34kD，與PEfeise-I蛋白的理論分子質(zhì)量接近，說明PEfeise-I在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)沒有受到明顯的化學(xué)修飾。Trx-PEGase-I 也沒有水解大麥β-1,3 )-葡聚糖(β-glucan)、海帶多糖(Iaminarin)和羥甲基纖維素 (carboxymethyl cellulose, CMC)的酶活力。由此說明，原核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞表達(dá)得到的PEfeise-l不具有β-葡聚糖內(nèi)切酶活性。實(shí)施例3PEfeise-I基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和鑒定。以質(zhì)粒pET32(a)-pegasel 為模板，用含 EcoR I 位點(diǎn)的引物 5' -CCGGAATTCAA CCCTAAAGTGTTCATTTTTG-3 ‘和含 Xba I 位點(diǎn)的弓丨物 5 ‘ -GCTCTAGAAACTGT TGGTACACTTTGATGGA-3 ‘?dāng)U增 PEGase-I 的編碼基因片段；用 DNA Ligation Kit 中的Solution I將EcoR I和)(ba I酶切的PCR片段連接到相同酶切的酵母表達(dá)質(zhì)粒 PPICZaA(購自Invitrogen，美國)上，并轉(zhuǎn)化到E. coli ToplO內(nèi)克?。惶崛≈亟M質(zhì)粒 pPICZ a A-pegasel進(jìn)行PCR、雙酶切和測序鑒定；用限制性內(nèi)切酶Mc I將其線性化后，電轉(zhuǎn)化到感受態(tài)P.pastoris GSl 15 (Invitrogen，美國)細(xì)胞內(nèi)，在含50 μ g/ml Zeocin的 YPDS培養(yǎng)板上篩選陽性克隆菌落。挑取單克隆菌落，在含50 μ g/ml kocin的液體YPDS培養(yǎng)基中培養(yǎng)(30°C,250rpm)過夜，然后用 CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide) 法[23]提取重組菌基因組DNA，通過PCR檢測重組在酵母基因組上的PEfese-I基因。用 BMGY培養(yǎng)液將陰性對照酵母和含PEfese-I基因的重組酵母培養(yǎng)至0D_為2 6(30°C， 250rpm)，再將菌體轉(zhuǎn)移到BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)液[每隔Mhr補(bǔ)充0. 5% (ν/ν)甲醇一次]中誘導(dǎo)PEGase-I表達(dá)、分泌，在培養(yǎng)后的0、6、12、24、36、48、60、72和84h各取2ml菌液，離心收集上清，通過SDS-PAGE檢測重組酵母表達(dá)分泌的PEfese-1，得到圖4，檢測培養(yǎng)液中的 PEGase-I水解大麥β -glucan的酶活力。如圖4所示，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，泳道1 9分別對應(yīng)為酵母細(xì)胞誘導(dǎo)后0、 6、12、24、36、48、60、72和84h得到的菌液上清。由圖4可以看出，酵母細(xì)胞表達(dá)得到相對分子質(zhì)量為45kD的PEfese-I蛋白，比大腸桿菌表達(dá)的PEfese-I蛋白的相對分子質(zhì)量(34kD)多l(xiāng)lkD。說明酵母表達(dá)分泌的 PEfese-I蛋白是化學(xué)修飾蛋白。該蛋白具有水解大麥β-1，30)_葡聚糖(β-glucan)的活力，但沒有水解海帶多糖和羥甲基纖維素的酶活力。由此說明，酵母細(xì)胞作為宿主細(xì)胞表達(dá)得到的PEfese-I具有的β-葡聚糖內(nèi)切酶活性。實(shí)施例4PEGase-I基因在里氏木霉細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和鑒定。以質(zhì)粒 pET32 (a) -pegasel 為模板，用引物 5 ‘ -CGCAGCTAGTGTGCCTCTAGAGGAG CGGATGAACCCTAAAGTGTTCATTT-3 ‘和 5 ‘ -TTACTGTTGGTACACTTTGATGGAGTTGACC-3 ‘?dāng)U增PEfeise-I編碼基因片段；用DNA Ligation Kit中的Solution I將該P(yáng)CR片段連接到Eamll05I酶切的質(zhì)粒pPIC-PST上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε. coli ToplO克隆重組質(zhì)粒pPIC-PST-pegasel，提取質(zhì)粒pPIC-PST-pegasel進(jìn)行PCR和測序鑒定。之后再以質(zhì)粒 pPIC-PST-pegasel 為模板，用引物 5 ‘ -GATAGATCTAAAAAAATATGAGCGCAGGGACAAGCA-3 ‘和 5' -AGTGTCGACTGGTACTG GGATACACGAAGAGCG-3‘，擴(kuò)增PEfeise-I 表達(dá)盒Pgpd-Pegasel-Tbhlt5 參考Penttil和劉剛等建立的方法[26'27]，取10 μ g表達(dá)盒Pgpd-pegasel-T。bhl和10 μ g質(zhì)粒 PAN7-1 (總體積不超過 20 μ 1)，與 200 μ 1 濃度為 IO8 個(gè) /ml 的 T. reesei QM9414 (ATCC,美國)原生質(zhì)體溶液混合，48°C熱激anin后，加50 μ 1 60%的PEG4000 (含50mmol/L CaCl2W 10mmol/L Tris · Cl 的緩沖液，pH 7. 5)混勻，20min (室溫)后再加入 ^il 60% 的 PEG4000 混勻，5min后加anl STC混勻，8，OOOrpm離心15min后收集原生質(zhì)體，用Iml STC溶液重懸原生質(zhì)體并與IOml原生質(zhì)體再生培養(yǎng)液(含1. 2mol/L山梨醇的Mandels基礎(chǔ)培養(yǎng)液) 混合，于下培養(yǎng)Mh，離心20min收集菌體，用Iml STC溶液重懸菌體并涂布在5個(gè)含 100 μ g/ml潮霉素B的PDA培養(yǎng)板上，下培養(yǎng)2天；挖取培養(yǎng)板上的菌絲接種到新PDA 固體培養(yǎng)板上，28°C下繼續(xù)培養(yǎng)7天。用無菌水收集培養(yǎng)板上的菌絲體，按1 5%的比例接種于20ml含100 μ g/ml潮霉素B的Mandels培養(yǎng)液(同時(shí)接種在PDA培養(yǎng)板上，待其長出孢子后，收集孢子用于保種)中，28°C下培養(yǎng)2天，再按1 5%比例轉(zhuǎn)接于25ml Mandels 產(chǎn)酶培養(yǎng)液培養(yǎng)5天，250rpm)，收集上清液，通過SDS-PAGE檢測重組酵母表達(dá)分泌的 PEfeise-I，并測定培養(yǎng)液中的PEfeise-I水解大麥β -glucan的酶活力。圖15為PEfeise-I基因在里氏木霉QM9414重組轉(zhuǎn)化的技術(shù)示意圖，重組質(zhì)粒 pPIC-pegasel,由 pPICZ α A 載體的 Puc ori、Zeocin、PEM7、PTEFl 和 A0X1TT 構(gòu)件以及里氏木霉的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、里氏木霉的纖維二糖水解酶II的信號肽基因和里氏木霉的纖維二糖水解酶I終止子。其中，PEGase-I基因插在纖維二糖水解酶II的信號肽基因和纖維二糖水解酶I終止子之間。同時(shí)進(jìn)行陰性對照，對照組采用單一的攜帶潮霉素抗性基因的質(zhì)粒pAN7-l轉(zhuǎn)化到"Trichoderma reesei QM9414 (里氏木霉)，其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同，收集上清液。采用實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組收集到上清液進(jìn)行SDS-PAGE，得到圖5，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，泳道1為實(shí)驗(yàn)組收集到的發(fā)酵液，泳道2為陰性對照組收集到的發(fā)酵液。由圖5可以看出，里氏木霉表達(dá)分泌的PEfeise-I的相對分子質(zhì)量為66kD，比大腸桿菌表達(dá)的PEfese-I相對分子質(zhì)量多32kD ；比酵母表達(dá)分泌的PEfese-I相對分子質(zhì)量多 21kD，說明里氏木霉表達(dá)分泌的PEfese-I比酵母表達(dá)分泌的PEfese-I的化學(xué)修飾程度還高。里氏木霉表達(dá)分泌的PEfese-I具有水解大麥β-1,3 )-葡聚糖的活力。實(shí)施例5實(shí)施例4中得到的含PEfese-I編碼基因的里氏木霉的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。將實(shí)施例4中得到的表達(dá)PEfeise-I的T. reesei QM9414重組菌接種不含抗生素的PDA培養(yǎng)板上，長出的孢子后再接種到新的PDA培養(yǎng)板上，如此反復(fù)，傳代7次。第2代和第8代菌體用CTAB法提基因組，PCR擴(kuò)增PEfese-I基因片段進(jìn)行鑒定， 結(jié)果如圖6所示。將第2代和第8代菌體接到液體培養(yǎng)基，離心取上清，按常規(guī)方法測酶活力，結(jié)果如圖7所示。由圖6可以看出，傳代7次后仍然能從重組菌的基因組DNA中擴(kuò)增出PEfese-I基因。由圖7可以看出，傳代7次后的PEfese-I表達(dá)菌仍然具有水解大麥β-1,3 )-葡聚糖的活力。由此說明，PEGase-I表達(dá)菌在遺傳上是穩(wěn)定的，且保持著表達(dá)、分泌PEfese-I的功能。實(shí)施例6實(shí)施例4中里氏木霉表達(dá)分泌的PEGase-I的粗分離和純化。PEGase-I 的粗分離。將表達(dá)PEfeise-I的T. reesei QM 9414重組菌接種于含100 μ g/ml潮霉素B 的Mandels基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)( °C，250rpm) 2天后按1 5 %的比例接菌于Mandels 產(chǎn)酶培養(yǎng)基二8 °C下再培養(yǎng)4 5天，至培養(yǎng)液中的葡萄糖耗盡，之后在4°C下離心 (10，OOOrpm) 20min,收集發(fā)酵液上清加硫酸銨至40%飽和度，2hr后離心收集上清，加硫酸銨至70%飽和度，離心收集沉淀，用0. 05mol/LHAC · NaAC緩沖液(pH5. 5)溶解沉淀蛋白并透析3次，用3，000MW孔徑的濾膜(Millipore，美國)將透析液超濾濃縮成細(xì)1粗酶液。用 BCA (BicinchoninincAcid)法[24]測定濃縮液的蛋白含量(試劑盒由北京CWBIO公司生產(chǎn))， 并測定粗酶水解大麥β-glucan活力。PEGase-I 的純化。用0. 05mol/L 的 HAC · NaAC 緩沖液(ρΗ4· 5)平衡預(yù)裝好的 Hi Trap Capto Q 離子交換柱(GE Healthcare，美國)，取Iml粗酶液用0. 45 μ m濾膜過濾并上柱，用0. 05mol/ L HAC · NaAC緩沖液(pH4. 5)洗脫雜蛋白，用含0 lmol/L NaCl緩沖液(0. 05mol/L HAC · NaAC, pH4. 5)梯度洗脫蛋白，之后通過BCA法測定每個(gè)洗脫峰的蛋白含量，以及水解大麥β-glucan的酶比活力。將實(shí)施例4中實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組收集到的上清液，與本實(shí)施例中粗分離得到的粗酶液和純化后得到的蛋白一起，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖8所示。其中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，泳道1為實(shí)施例4中陰性對照組收集到的上清液，泳道2為實(shí)施例4中實(shí)驗(yàn)組收集到的上清液，泳道3為HiTrap Capto Q離子交換膠層析分離、純化后得到的PEfese-1， 泳道4為40% 70%的硫銨分級沉淀得到的粗酶液。BCA法測定蛋白含量，以及水解大麥β-glucan的酶比活力數(shù)據(jù)圖下表所示表權(quán)利要求
1.一種β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfeise-I基因，其特征在于，包括如下序列(a)、編碼由SEQID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈；(b)、和編碼由SEQID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈；(c)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述多肽由SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列組成，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有葡聚糖內(nèi)切酶活性；或(d)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述多肽與由SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98%的同源性。
2.一種β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因，其特征在于，包括如下序列(a)、由SEQID No. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈；(b)、和編碼由SEQID No. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈；或(c)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述多核苷酸序列由SEQID No. 2所示的核苷酸序列組成，其中一個(gè)或多個(gè)密碼子被缺失、替代或增加，所述多肽具有 β-葡聚糖內(nèi)切酶活性。
3.如權(quán)利要求2所述的β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因，其特征在于，所述β-葡聚糖內(nèi)切酶PEfese-I基因包括由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸。
4.一種基因表達(dá)載體，其特征在于，包括如權(quán)利要求1或2所述的葡聚糖內(nèi)切酶 PEGase-I 基因。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包括如權(quán)利要求4所述的基因表達(dá)載體，所述宿主細(xì)胞為真核生物細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述真核生物細(xì)胞為酵母細(xì)胞或里氏木霉細(xì)胞。
7.一種蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一、提供如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)得到表達(dá)液；步驟二、利用40%和70%的飽和硫酸銨將所述表達(dá)液分級沉淀，分離粗產(chǎn)物；步驟三、利用HiTrap Capto Q離子交換層析膠純化粗產(chǎn)物，得到所述蛋白質(zhì)。
8.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，包括如下序列(a)、由SEQID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)、和由SEQID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98%同源性的多肽；或 (C)、由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有葡聚糖內(nèi)切酶活性。
9.一種酶制劑，其特征在于，包括如權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)；所述酶制劑用于水解 β-1，30)_葡聚糖。
10.如權(quán)利要求9所述的酶制劑，其特征在于，所述酶制劑還包括用于提高酶活性的金屬陽離子。
全文摘要
本發(fā)明公開一種從多頭絨泡菌分離的β-葡聚糖內(nèi)切酶PEGase-1基因，該基因編碼的蛋白由309氨基酸組成，其氨基酸序列與嗜熱擬青霉有44％的同源性，模擬的三級結(jié)構(gòu)呈β-三明治折疊卷狀，屬于糖苷水解酶的GH16家族成員。將該基因重組到表達(dá)載體上后分別轉(zhuǎn)化到酵母和里氏木霉內(nèi)，表達(dá)的蛋白能分泌到細(xì)胞外，該蛋白可以通過40％～70％的硫銨分級沉淀粗分離，可以通過HiTrapTMCaptoTM Q離子交換層析膠純化，并且能特異性的水解大麥β-1，3(4)-葡聚糖，其水解活力可在金屬離子的存在下得到提高，從而可以應(yīng)用于啤酒釀造，以及作為藥品、食品和飼料添加劑。
文檔編號C12R1/885GK102311965SQ201110266138
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者劉士德, 張建華, 李小青, 歐陽秋玲, 田生禮, 邢苗 申請人:深圳大學(xué)