專利名稱：基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物細胞電融合的裝置。具體地，本發(fā)明涉及提供細胞電融合的芯片， 提供并產(chǎn)生細胞排隊、電穿孔、融合所需要的電場強度和電場梯度。
背景技術：
細胞電融合技術自上世紀80年代起，因為其效率較高、操作簡便、對細胞無毒害，便于觀察，適于儀器應用和規(guī)范操作等優(yōu)點，得到了快速發(fā)展和廣泛應用(參見美國專利文獻43269；34，April 27，1982，Pohl; 441972，April 10，1982，Pohl ； 4578168， March 25， 1986， Hofman； 4695547， Sep 22， 1987， Hillard; 4699881， Oct 13， 1987， Matschke, et al.；)。細胞電融合可以分為兩個主要階段細胞排隊和細胞融合。細胞排隊的原理在于生物細胞處于非均勻電場中時，被電場極化形成偶極子，該偶極子在非均勻電場作用中會受到特定的力而發(fā)生運動，即介電電泳 (dielectrophoresis).利用介電電泳可以控制細胞的運動，在細胞電融合過程中，利用介電電泳現(xiàn)象使細胞排列成串，壓緊相互接觸的細胞，完成細胞電融合過程所需的排隊和融合后壓緊。細胞融合的原理在于強電場作用會導致細胞膜穿孔，這種效應稱為細胞膜電致穿孔效應(electroporation)。在細胞電融合過程中利用電致穿孔效應，使兩接觸的細胞膜穿孔，從而使細胞間進行膜內(nèi)物質(zhì)交換，使細胞質(zhì)、膜融合，在一定強度的電場作用下的電穿孔是一種可逆穿孔，細胞膜會在減小或撤銷電場強度時回復原狀，產(chǎn)生細胞電融合過程的膜融合。傳統(tǒng)的細胞電融合系統(tǒng)通常都采用大型融合槽，其優(yōu)點在于(1)操作較為簡便， 采用大型融合槽降低了包括樣品進樣與出樣等步驟的難度；(2)加工簡便，大型融合槽的尺寸一般都在厘米量級，利用傳統(tǒng)的機械加工手段可以較為方便地加工出所需要的融合槽結構；(3)融合量大，傳統(tǒng)的融合槽可以容納數(shù)毫升樣品，一次實驗即可獲得足夠的細胞進行后期篩選、培養(yǎng)等工作。但傳統(tǒng)的細胞電融合設備也存在一些缺點(1)由于融合槽中的電極間距較大， 要達到夠強度的細胞排隊、融合及壓緊信號，需要很高的外界驅(qū)動電壓，往往高達幾百上千伏，對系統(tǒng)的電氣安全性要求高，系統(tǒng)的成本也因此大為提高；(2)電極間的較大間距不利于對細胞的精確控制等。為解決這一問題，研究者將細胞電融合技術與MEMS加工技術相結合。MEMS技術的加工范圍通常在1 50 μ m，這與細胞的直徑范圍相當，所產(chǎn)生的微結構能有效控制細胞。有多家研究機構開始研究利用微流控芯片技術或者微電極陣列技術構建生物芯片來實現(xiàn)細胞電融合操作。例如，美國MIT的研究人員提出了利用微流控芯片技術實現(xiàn)對細胞的精確控制， 達到高效的細胞配對和融合(參見J. Voldman, A.M. Skelley, 0. Kirak, H. Suh, R.Jaenisch, Microfluidic control of cell pairing and fusion, Nat Methods, 2009)； 國內(nèi)趙志強等研究人員(中國專利200610054121. x，2006年，重慶大學，趙志強等)也提出了利用MEMS技術構建微電極陣列，通過構建微米量級間距的微電極陣列，實現(xiàn)在低電壓條件下的細胞電融合。日本研究者提出的利用一對微電極(參見Daniel T Chiu, A microfluidics platform for cell fusion,Current Opinion In Biotechnology,2001), 通過流路控制細胞的流動，使細胞運動到微電極對位置區(qū)域后，利用電場作用使兩個細胞形成配對，再借助于電脈沖實現(xiàn)電融合。但上述芯片仍然存在一定的問題，如梁偉等人提出的金屬絲微電極陣列，其間距依然較大，電壓要求依然較高，同時，金屬絲的直徑較大不利于形成微電場細胞細胞配對與融合控制(中國專利文獻CN86210174，遼寧腫瘤研究所，梁偉)；如美國MIT所研究的微流控芯片雖然較好的解決了細胞配對的問題，但該芯片兩電極間的間距較大，仍然需要較高的外界電壓才能夠?qū)崿F(xiàn)電融合。而趙志強提出的芯片所集成的微電極數(shù)量較少，不能實現(xiàn)高通量融合；微電極所產(chǎn)生的電場強度和電場梯度也比較弱，難以實現(xiàn)細胞的精確控制；所選擇的加工材料的抗腐蝕、抗氧化能力也較差；同時，由于未集成進出樣裝置， 操作也較為不便。日本研究者提出利用微孔的方式實現(xiàn)兩個通道的分隔，進而實現(xiàn)不同細胞的獨立進樣完成細胞配對，但該方法對微孔的定位要求很高，無法進行大規(guī)模應用， 同時，該方法依然采用距離較大的平板電極實現(xiàn)電融合，工作電壓高(參見M. Gel, Y. Kimuraj 0. Kurosawa, H. Oanaj H. Koteraj Μ. Washizuj Dielectrophoretic cell trapping and parallel one-to-one fusion based on field constriction created by a micro-orifice array, Biomicrofluidics， 2010)。同時，重慶大學楊軍等人提出了交錯梳狀電極陣列，集成間距為幾十微米的齒狀微電極結構于梳狀電極陣列上，達到高通量融合的目地。但該專利的電極是連續(xù)電極，凹陷區(qū)的微通道側(cè)壁也是電極結構，上面所加載的電信號同樣會引起細胞排隊，但該區(qū)域電場強度不足以實現(xiàn)融合，進而影響效率(中國專利文獻2007100^892. 2)。同時，該課題組提出的基于微小室陣列結構的細胞電融合芯片裝置的細胞配對是基于一個隨機原理進行的細胞配對與融合，雖然能夠達到兩個細胞配對的目地，但仍然無法精確實現(xiàn)AB細胞的配對與融合(中國專利文獻200910191052.0)。本發(fā)明提出并構建了一種僅能容納單個細胞的微孔陣列結構，并結合微電極陣列結構、微流控蓋片/頂層電極較好地解決了細胞的兩兩配對問題；而借助于陣列化的結構， 芯片具有較高的融合通量，可為后期研究提供足夠的融合細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提出一種基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置，該芯片裝置上集成了陣列化的微孔微電極，結合微電極與頂層電極間獨特的電場分布，通過調(diào)節(jié)微孔尺寸結構使每個微孔中僅能容納單個細胞，從而實現(xiàn)極高的細胞配對效率及后期的兩兩融合率。本發(fā)明的技術方案如下
一種基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置，其特征在于它由微電極微孔陣列芯片和帶頂層電極的微流控蓋片組成。
所述微電極微孔陣列芯片是采用微加工技術在石英基底層上從下至上依次加工微電極陣列層和多聚物微孔陣列層而構成；所述微孔陣列層上的微孔與微電極陣列層上的微電極一一對應；所述多聚物微孔陣列層的厚度略小于目標細胞直徑，以控制在微孔內(nèi)部目標細胞的單層排布。所述帶頂層電極的微流控蓋片上設有進樣口和出樣口，在微流控蓋片的下表面設有與微電極陣列層上的電極區(qū)域面積一致的凹腔，進樣口和出樣口位于凹腔的兩端，進行細胞懸浮液的進樣、通過和出樣；在微流控蓋片下表面濺射有一層金屬薄膜，形成頂層電極。所述帶頂層電極的微流控蓋片蓋在微電極微孔陣列芯片上，微電極微孔陣列芯片上的微電極和微孔陣列區(qū)域與微流控蓋片的凹腔相吻合。所述微電極陣列層和頂層電極均留出有與外界電信號連接的鍵合點，外界電信號分別加載于微電極陣列層與頂層電極上，在微孔及微孔頂部形成一電場分布，使微孔內(nèi)部單個分布的目標細胞與上部凹腔中通過的目標細胞形成配對，實現(xiàn)高效的一對一電融合。采用本裝置，將細胞懸浮液通過進樣口進入到凹腔中，通過加載正弦信號于微電極陣列及頂層電極，在微電極陣列和頂層電極之間形成一非均勻電場，由于微電極尺度小， 微電極區(qū)域(微孔內(nèi)部)電場強度高，在介電電泳效應及細胞自身重力作用下，細胞將流到每一個微孔中，利用微流吹出腔體內(nèi)部多余的細胞，實現(xiàn)每個微孔內(nèi)部單層單個細胞的排布；再注入第二種細胞緩沖液，并加載排隊信號，進而實現(xiàn)微孔內(nèi)的細胞與再次加載的細胞之間的配對；再次加載融合信號實現(xiàn)配對后細胞的融合，而非均勻的電場分布將保證僅僅微孔內(nèi)的細胞與再次加載的細胞的一一融合，避免了多細胞融合。本發(fā)明的優(yōu)點如下
本裝置可實現(xiàn)每個微孔內(nèi)僅容納單個細胞，當其結合微流控控制與非均勻電場控制時，可實現(xiàn)同源/異源細胞間的高效配對，并能夠利用獨特的非均與電場分布避免多細胞融合的發(fā)生，提高兩兩融合率；微電極的頂層電極良好的電導率和相對電極間的較短間距使裝置僅需要很低強度的外圍電信號即可在微孔內(nèi)產(chǎn)生足夠強度的電場，實現(xiàn)細胞排隊和電融合過程，降低裝置對外圍信號發(fā)生器的要求和系統(tǒng)的制作成本；低的工作電壓也提高了系統(tǒng)的安全性；金屬電極層選用金、鉬等材料提高了芯片的生物相容性和抗氧化、抗腐蝕性能，也提高了芯片的可靠性；微孔陣列選用的聚酰亞胺生物相容性好，加工簡便；大量的微電極微孔陣列可實現(xiàn)大量細胞的同時融合，融合效率高；自動進樣和自動出樣減小對融合后細胞的物理損傷，提高其存活能力。


圖1基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置的外形示意圖。圖2基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置的結構分解示意圖。圖3微電極微孔陣列芯片的結構示意圖。圖4石英基底層的示意圖。圖5微電極陣列的示意圖。圖6微孔陣列層的示意圖。
圖7微流控蓋片的示意圖。圖8頂層電極的示意圖。
具體實施例方式以下結合附圖進一步說明本發(fā)明的結構及工作過程
參見圖1和圖2，本裝置由微電極微孔陣列芯片1和帶頂層電極3的微流控蓋片2組成。結合圖3、圖4、圖5和圖6可見，微電極微孔陣列芯片1的結構從下至上依次為石英基底層4、微電極陣列層5和多聚物微孔陣列層6。其中，微電極陣列層5是利用微加工技術(蒸發(fā)、濺射及光刻等工藝)在石英基底層4上加工獲得，微電極陣列層5可根據(jù)實驗所需的通量設計M X N的微電極陣列，微電極8的直徑為4-6微米的圓盤，微電極8間間距為40微米，各微電極之間采用寬度為2-4微米的引線9連接，微電極陣列的邊緣有一 2 X 4 mm的鍵合點10， 微電極8、引線9和鍵合點10的材質(zhì)一致，可選用金、鉬等導電性優(yōu)異，生物相容性良好，具有極強抗氧化、抗腐蝕能力的惰性金屬，厚度在0. 5-1微米間。微孔陣列層6可選用光敏聚酰亞胺在微電極陣列層表面通過光刻形成微孔陣列圖形，微孔陣列層6厚度根據(jù)目標細胞設定在8-15微米之間，微孔11的直徑也相應為8-15 微米，以便較好地控制在微孔11內(nèi)部細胞的單層單個排布，微孔11之間水平及垂直方向上間距均為40微米，微孔陣列層6上的微孔11與微電極陣列層5上微電極8 一一對應，為M X N的微孔陣列。微流控蓋片2上設置有進樣口 14和出樣口 15，其下表面制作有與微電極陣列區(qū)域面積一致的凹腔13，可以控制細胞緩沖液的進樣、出樣，以及在上述結構中的流動。進樣口 14、出樣口 15直徑為2mm，凹腔13的深度為40微米，以保證細胞的自由流動。微流控蓋片2 應選擇石英玻璃、硅片等材料。同時，該微流控蓋片2下表面(包括凹腔13)濺射一層金屬薄膜，形成頂層電極3。金屬薄膜同樣選用金、鉬等導電性優(yōu)異，生物相容性良好，具有極強抗氧化、抗腐蝕能力的惰性金屬，采用濺射、蒸發(fā)等工藝加工于微流控蓋片2上，厚度在0. 5-1 微米。頂層電極3邊緣即超出微電極微孔陣列芯片1的區(qū)域為頂層電極的鍵合點17。外界電信號分別加載于微電極陣列層5的鍵和點10與頂層電極3的鍵合點17上，由于微孔11 區(qū)域的體積相對于凹腔13而言較小，同時，底部的微電極8面積也小于頂層電極3面積，這樣將在微孔11及臨近微孔11頂部區(qū)域形成細胞排隊和融合所需的高強度電場分布。以上芯片裝置的組裝方法是將帶頂層電極的微流控蓋片2反扣與微電極微孔陣列芯片1后，使微電極8、微孔11陣列結構與凹腔13相吻合，通過石英基底層4、多聚物微孔陣列層6、微流控蓋片2上的的定位或固定孔7、12、16使用螺栓進行定位與固定。使用本裝置的電融合過程如下
通過微流控蓋片2上的進樣口 14進樣含有目標細胞A的細胞緩沖液，通過加載正弦排隊信號(Vp-p :2-10V，頻率0. l-3MHz)于微電極陣列層5的鍵合點10與頂層電極3的鍵合點17上，在微電極陣列5和頂層電極3之間形成一非均勻電場，由于微電極8尺度小，微電極8區(qū)域(微孔11內(nèi)部)電場強度高，在介電電泳效應及細胞自身重力作用下，細胞將流到每一個微孔11結構中，利用微流吹出凹腔13內(nèi)部多余的細胞，實現(xiàn)每個微孔11內(nèi)部單層單個細胞的排布；再注入含有目標細胞B的細胞緩沖液，并加載排隊信號(Vp-p :2-10V，頻率0. l-3MHz)，進而實現(xiàn)微孔11內(nèi)的目標細胞A與再次加載的目標細胞B之間的配對；再次加載融合信號(電壓5-60V，脈寬20-200ms，脈沖間隔0. l_10s，脈沖個數(shù):1_10)實現(xiàn)配對后目標細胞A與目標細胞B的融合，而非均與的電場分布將保證僅僅微孔內(nèi)的目標細胞A與再次加載的目標細胞B的一對一融合，避免了多細胞融合。最后注入PBS緩沖液，經(jīng)出樣孔15收集融合后細胞(AB)懸浮液。 本文中述及的微流控控制、非均勻電場控制等控制技術均是現(xiàn)有技術。其中提到的加載正弦排隊信號、排隊信號、融合信號等也是采用的現(xiàn)有技術，如可參見以下文獻曹毅，基于微電極陣列的高通量細胞電融合方法研究，重慶大學博士學位論文，2009 ；胡寧，高通量細胞電融合芯片及實驗研究，重慶大學博士學位論文，2010 ；等等。
權利要求
1.一種基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置，其特征在于它由微電極微孔陣列芯片和帶頂層電極的微流控蓋片組成；所述微電極微孔陣列芯片是采用微加工技術在石英基底層上從下至上依次加工微電極陣列層和多聚物微孔陣列層而構成；所述多聚物微孔陣列層上的微孔與微電極陣列層上的微電極一一對應；所述多聚物微孔陣列層的厚度略小于目標細胞直徑，以控制目標細胞在微孔內(nèi)部的單層排布；所述帶頂層電極的微流控蓋片上設有進樣口和出樣口，在微流控蓋片的下表面設有與微電極陣列層上的電極區(qū)域面積一致的凹腔，進樣口和出樣口位于凹腔的兩端，進行細胞懸浮液的進樣、通過和出樣；在微流控蓋片下表面濺射有一層金屬薄膜，形成頂層電極；所述帶頂層電極的微流控蓋片蓋在微電極微孔陣列芯片上，微電極微孔陣列芯片上的微電極和微孔陣列區(qū)域與微流控蓋片的凹腔相吻合；所述微電極陣列層和頂層電極均留出有與外界電信號連接的鍵合點，外界正弦電信號分別加載于微電極陣列層與頂層電極上，在微孔及微孔頂部形成一電場分布，使微孔內(nèi)部單層排布的目標細胞與上部凹腔中的通過的目標細胞形成配對，實現(xiàn)高效的一對一電融合。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置，其特征在于所述微電極為圓盤形，形成M X N的微電極陣列，各微電極之間采用引線連接，微電極陣列邊緣有鍵合點，微電極、引線、 鍵合點的材質(zhì)一致。
3.根據(jù)權利要求2所述的基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置， 其特征在于所述微電極的直徑為4-6微米，微電極間間距為40微米，各微電極之間的引線寬度為2-4微米，鍵合點面積為2 X 4 mm。
4.根據(jù)權利要求2所述的基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置， 其特征在于微電極、引線、鍵合點的材質(zhì)選用金、鉬等導電性優(yōu)異、生物相容性良好，具有極強抗氧化、抗腐蝕能力的惰性金屬。
5.根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置，其特征在于采用微電極陣列層是采用濺射、蒸發(fā)等工藝加工于石英基底層上，厚度在0. 5-1微米間。
6.根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置，其特征在于所述多聚物微孔陣列層選用光敏聚酰亞胺通過光刻形成微孔陣列圖形。
7.根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置，其特征在于多聚物微孔陣列層的厚度在8-15微米之間，微孔的直徑在8-15微米之間，以控制在微孔內(nèi)部目標細胞的單層單個排布。
8.根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置，其特征在于所述微流控蓋片的進樣口、出樣口直徑為2mm，凹腔的深度為40微米。
9.根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置，其特征在于所述頂層電極的金屬薄膜選用金、鉬等導電性優(yōu)異，生物相容性良好，具有極強抗氧化、抗腐蝕能力的惰性金屬，采用濺射、蒸發(fā)等工藝加工于微流控蓋片上， 厚度在0. 5-1微米。
10.根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置，其特征在于所述微流控蓋片選用石英玻璃、硅片材料制作。
全文摘要
一種基于微孔微電極陣列的高通量細胞電融合微流控芯片裝置，它由微電極微孔陣列芯片和帶頂層電極的微流控蓋片組成。本發(fā)明采用了MEMS加工工藝，在石英基底上，利用微電極陣列和多聚物微孔陣列共同構建微孔微電極陣列結構。微孔微電極陣列結構可較好地控制細胞間的配對，從而實現(xiàn)每個微孔中僅有一對細胞進行融合；陣列化的結構也可提高細胞融合的通量。構建本發(fā)明裝置所用的材料均具備良好的生物相容性及抗腐蝕性，保證了芯片的可靠性，也提高了細胞融合的安全性。本裝置可廣泛應用于遺傳學、動植物遠緣雜交育種、發(fā)育生物學、藥物篩選、單克隆抗體制備、哺乳動物克隆等領域。
文檔編號C12M1/42GK102296028SQ20111026566
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權日2011年9月8日
發(fā)明者朱祥佑, 胡寧, 錢詩智 申請人:嶺南大學校產(chǎn)學協(xié)力團