專利名稱：能產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶的費希新薩托菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)酸性β -甘露聚糖酶的菌株，屬于微生物和微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。特別是涉及一種費希新薩托菌及該菌在生產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甘露聚糖酶(Ε. C. 3. 2. 1. 78)，屬于半纖維素酶，能夠隨機(jī)的催化斷裂β _甘露糖苷鍵，從而對甘露聚糖以及半乳甘露聚糖進(jìn)行降解。近年來甘露聚糖酶被廣泛的應(yīng)用在各種生產(chǎn)領(lǐng)域中，如作為飼料添加劑應(yīng)用在飼料工業(yè)中，能夠起到降解植物種子和細(xì)胞壁的作用，從而使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)更容易與消化酶進(jìn)行接觸，進(jìn)而促進(jìn)動物生長、提高飼料的轉(zhuǎn)化率; 在石油開采中，作為壓裂液和增黏劑的瓜爾凝膠，使用后需要用甘露聚糖酶降解去除，從而使石油開采連續(xù)進(jìn)行。此外，甘露聚糖酶在造紙工業(yè)中可以作為生物漂白劑來漂白紙漿，在食品工業(yè)中可以作為甜味劑以及咖啡提取中起降低粘度的作用。另外，通過甘露聚糖酶轉(zhuǎn)化植物多糖產(chǎn)生的寡糖也有很多的益生功能，比如甘露聚糖酶降解甘露聚糖產(chǎn)生的甘露寡糖具有促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌的增殖，提高機(jī)體的抗氧化能力，降低糖尿病人的血糖水平，降低血脂和保護(hù)肝臟以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生理功能。到目前為止甘露聚糖酶共有四種來源，植物、真菌、細(xì)菌、軟體動物。到目前為止有很多關(guān)于真菌產(chǎn)甘露聚糖酶的報道，如草酸青霉(Penicillium oxalicum)、黑曲霉 (Aspergillus niger)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、蟲擬賭菌(Ceriporiopsis subvermispora)、齊整小核菌(klerotium rolfsii)。真菌來源的甘露聚糖酶一般為酸性甘露聚糖酶，即最適PH值處在酸性條件下，細(xì)菌來源的甘露聚糖酶則為堿性。國內(nèi)研究產(chǎn)酸性甘露聚糖酶最多的菌株是黑曲霉，而費希新薩托菌生產(chǎn)酸性甘露聚糖酶的研究還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一株能產(chǎn)酸性β -甘露聚糖酶的費希新薩托菌。本發(fā)明的第二個目的是提供費希新薩托菌在生產(chǎn)酸性甘露聚糖酶中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一株能產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶的費希新薩托菌(Neosartorya f ischeri) G5，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No. 4921，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期2011年6月1日。保藏號為CGMCC No. 4921的能產(chǎn)酸性β -甘露聚糖酶的費希新薩托菌 (Neosartorya f ischeri) G5在生產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶中的應(yīng)用。能產(chǎn)酸性β -甘露聚糖酶的費希新薩托菌(Neosartorya f ischeri) G5在生產(chǎn)酸性甘露聚糖酶中的應(yīng)用，其培養(yǎng)條件為溫度為60-80°C，培養(yǎng)基組成為 NaCl 0. 4-0. 7g/L，CaCl2O. 4-0. 7g/L，瓜爾膠 10_15g/L，蛋白胨 8_12g/L，酵母粉 4_6g/L， MgSO4O. 5-1. 0g/L, KH2PO4O. 5-1. 0g/L, pH 3. 0-5. 0。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明提供的能產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶的費希新薩托菌(Neosartorya fischeri)G5,是一株耐高溫，耐酸產(chǎn)酶性能良好的野生菌株，酸性β _甘露聚糖酶的產(chǎn)量為25-40U/ml。在溫度60-80°C，最適pH為3. 0 4. 0，其穩(wěn)定的性能適合工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明的一株能生產(chǎn)酸性β -甘露聚糖酶的費希新薩托菌(Neosartorya f ischeri)G5CGMCC No. 4921在瓜爾膠培養(yǎng)基上的菌體形態(tài)圖。圖2為G5發(fā)酵液粘度和pH隨時間的變化。圖3為G5發(fā)酵液還原糖含量和菌體干重隨時間的變化。圖4為甘露聚糖酶降解瓜爾膠產(chǎn)物的薄層色譜圖。圖5為溫度和pH對β -甘露聚糖酶的影響。圖6為不同離子和不同氮源對β -甘露聚糖酶的影響。圖7為炭源和氮源濃度對β -甘露聚糖酶的影響。圖8為G5發(fā)酵生產(chǎn)β -甘露聚糖酶響應(yīng)曲面。
具體實施例方式保藏號為CGMCC No. 4921的費希新薩托菌(Neosartorya fischeri)G5是從種植瓜爾豆的土壤中分離得到，培養(yǎng)基中瓜爾膠為唯一炭源。本發(fā)明的提供的費希新薩托菌生產(chǎn)酸性甘露聚糖酶的最佳發(fā)酵條件，是利用中心組合試驗的方法對費希新薩托菌G5發(fā)酵生產(chǎn)酸性β -甘露聚糖酶進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合 Design-Expert7. 16軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到的，在優(yōu)化的條件下本發(fā)明的費希新薩托菌G5 產(chǎn)甘露聚糖酶能力提高一倍。下面的實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不對本發(fā)明作任何限制。實施例1產(chǎn)β -甘露聚糖酶菌株的分離與鑒定1.菌株的分離(1)稱取IOg土壤樣品(從新疆種植瓜爾豆的土壤中取樣)，放入裝有90mL無菌水的250mL三角瓶中(帶玻璃珠)，靜置20min后置于200rpm振蕩培養(yǎng)箱中充分振蕩30min， 使細(xì)胞充分分散，制成菌懸液；(2)用5mL移液管吸取上述步驟(1)所得的菌懸液的上清液5mL于45mL無菌水中， 混合均勻后進(jìn)行10倍遞減稀釋；取10-4、10_5、10-6三個稀釋度的菌懸液各100 μ L，涂布于瓜爾膠固體培養(yǎng)基(瓜爾膠 5g, NH4Cl 5g，MgSO4 · 7H201g，ΚΗ2Ρ04，0· 5g · L-I ；K2HPO4 0. 5g， NaCl 0. 5g，瓊脂20g，加蒸餾水定容至lOOOmL，pH為7. 0)平板上，每個稀釋度進(jìn)行三次平行實驗，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直至長出菌落后，進(jìn)行菌落計數(shù)；(3)將上述步驟( 瓜爾膠培養(yǎng)基平板上分離得到的能利用瓜爾膠為炭源的菌， 通過平板劃線的方法分離純化，逐日觀察各菌株在瓜爾膠固體培養(yǎng)基平板上生長的情況， 挑選生長較好的菌株，然后轉(zhuǎn)接至瓜爾膠固體培養(yǎng)基，于4°C冰箱保藏；
(4)將上述步驟(3)所得的初篩菌株接種至瓜爾膠液體培養(yǎng)基(瓜爾膠5g，NH4Cl 5g, MgSO4 · 7H20 lg, ΚΗ2Ρ04，0· 5g · L-I ；K2HPO4 0. 5g, NaCl 0. 5g，加蒸餾水定容至 IOOOmL, PH為7.0), 37°C下200rpm振蕩培養(yǎng)24h后，發(fā)酵液離心得到粗酶液，用DNS法測得粗酶液降解瓜爾膠底物的還原糖含量，將篩選出的高產(chǎn)菌株(還原糖含量高)發(fā)酵液用20% (V/ V)甘油保存，將其命名為G5;(5)將上述步驟(4)篩選得到的菌株G5接種至瓜爾膠液體培養(yǎng)基中，37°C下 200rpm振蕩培養(yǎng)，觀察其發(fā)酵特性。實驗證明，瓜爾膠固體培養(yǎng)基或瓜爾膠液體培養(yǎng)基的pH也可以采用7. 1或7. 2。2.菌株的鑒定(1)在顯微鏡下分別通過革蘭氏染色法和水浸片法觀察細(xì)胞形態(tài)、大小以及細(xì)胞的繁殖分裂方式等情況。并取稀釋后菌液以平板涂布法接種至瓜爾膠固體培養(yǎng)基上，置于 37°C培養(yǎng)。觀察和記錄菌落性狀、大小、邊緣結(jié)構(gòu)、光澤、透明度、顏色和產(chǎn)色素等情況，G5在瓜爾膠培養(yǎng)基上的菌體形態(tài)為絮狀，淡綠色，產(chǎn)生大量乳白色至淡黃色的閉囊殼，子囊近球形。結(jié)果見圖1。(2)取處于對數(shù)生長期的液體發(fā)酵培養(yǎng)物1. 5ml于滅菌后的離心管中，5000r/min 離心5min，棄上清。液氮研磨后5000r/min離心5min，與_20°C冷凍，凍實，融化后挑取少量鏡檢。用試劑盒提取基因組DNA。對提取DNA進(jìn)行PCR，委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。(3)應(yīng)用BLASTN程序與GenBank、EMBL, DDBJ和PDB等數(shù)據(jù)庫中已知的D1/D2區(qū)基因保守區(qū)序列進(jìn)行相似性比較分析得知，本發(fā)明的G5菌與新薩托菌屬親緣關(guān)系較近。菌株G5與費希新薩托菌(Neosartorya fischeri)親緣關(guān)系最近，分支置信度達(dá)到96%，結(jié)合菌體形態(tài)觀察結(jié)果可認(rèn)為G5為一株費希新薩托菌(Neosartorya fischeri)。分析其性質(zhì)后命名為費希新薩托菌(Neosartorya fischeri)菌株G5，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No. 4921，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期2011年6月1日。下面將本發(fā)明的費希新薩托菌(Neosartorya fischeri)菌株G5CGMCC No. 4921 簡稱菌株G5。實施例2菌株G5發(fā)酵生產(chǎn)酸性β -甘露聚糖酶的發(fā)酵液參數(shù)對菌株G5發(fā)酵液從pH、粘度、菌體干重、還原糖含量、發(fā)酵產(chǎn)物幾個方面分析。(1)用接種環(huán)將菌株G5接種到裝有50ml瓜爾膠液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中在 37°C，轉(zhuǎn)速200r/min的條件下恒溫培養(yǎng)，然后取Iml培養(yǎng)液接種到100ml新的瓜爾膠液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中在37°C，轉(zhuǎn)速200r/min的條件下恒溫培養(yǎng)，做兩組平行實驗，每組接種8瓶，兩組平行實驗的時間間隔為12小時。(2)每隔6小時取樣(整瓶)分析發(fā)酵液的粘性，PH值，和還原糖濃度，菌體干重并繪制曲線。(3)用烏氏粘度計測發(fā)酵上清液的相對粘度，結(jié)果見圖2。前6小時即發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液粘度已下降85%，隨后發(fā)酵液粘度繼續(xù)下降，24小時發(fā)酵液粘度已和純水粘度相差無幾。 發(fā)酵液在前12小時迅速下降，并在M小時達(dá)到最低，幾乎與水相近，24小時后發(fā)酵液粘度略有波動。G5菌在M小時內(nèi)即可將IOOml含0. 5%瓜爾膠的發(fā)酵液完全降解。(4)用pHS-2C型pH計測定pH值，結(jié)果見圖2。發(fā)酵液的pH在0 M小時內(nèi)不斷下降，24小時后基本穩(wěn)定在2. 6左右，其中18 M小時下降迅速。(5)用DNS法還原糖含量。取發(fā)酵上清液0. 5ml，用蒸餾水稀釋至1ml，再加入Iml 的DNS試劑，沸水浴15min顯色，顯色后迅速冷卻，用蒸餾水定容至10ml，以空白液作對照， 在MOnm處測量吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖含量，結(jié)果見圖3。發(fā)酵液還原糖含量隨時間不斷上升，在27小時達(dá)到最大值后又迅速下降，在36小時后基本降到0。(6)菌體干重。將整瓶發(fā)酵液9000r/min離心5分鐘，沉淀用蒸餾水沖洗3次，置于40°C恒溫箱中烘干至兩次稱量不超過0. 02g，得菌體干重，結(jié)果見圖3。發(fā)酵液中菌體含量隨時間不斷增長，菌體繁殖旺盛，36小時后基本保持不變，菌體維持生長，50小時后略有下降，菌體開始出現(xiàn)衰老死亡。(7)用薄層色譜分析法，對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析。TLC展開劑:V正丁醇V異丙醇Visg V 水=7 5 2 4。顯色劑鈿1苯胺與4g 二苯胺溶于20ml丙酮，再加入20ml濃磷酸。 對菌株G5的發(fā)酵12h、18h、Mh、30h的上清液，以甘露糖、半乳糖為對照進(jìn)行薄層層析，結(jié)果如圖4。三條清晰的橫向色譜帶，且隨時間的增加，各條色譜帶越來越清晰，顏色越來越深。 由各條色譜帶的位置可以推斷，發(fā)酵產(chǎn)物中有單糖和寡糖；由色譜帶的顏色可以推斷，糖含量隨時間增加。實施例3、溫度、pH值、金屬離子對酸性β-甘露聚糖酶的影響(I)DNS法測定酶活。在0. 5ml含有0. 5 %瓜爾膠溶液(用0. 05mol/L Na2HPO4-O. 025mol/L檸檬酸緩沖液配制)中加入0. 5ml粗酶液(水浴在不同的反應(yīng)溫度下)，反應(yīng)IOmin后，再加入DNS試劑Iml，沸水浴15min，顯色，然后迅速冷卻，用蒸餾水定容至10ml，以空白液為對照，在MOnm處測定吸光度，計算還原糖量。根據(jù)單位時間還原糖的增加量及酶活力單位的定義計算出酶的活性。酶活力定義在本實驗條件下，一每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μ mol相當(dāng)于D_甘露糖的還原糖的酶量定義為一個甘露聚糖酶單位(U/ml)。(2) β-甘露聚糖酶的pH穩(wěn)定性實驗。將不同pH值(3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0) 的檸檬酸緩沖液配制的酶液與相應(yīng)PH的底物在37°C恒溫水浴條件下反應(yīng)10分鐘，測其酶活，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明pH在3 4之間時，酶活能維持在較高水平，而且，當(dāng)pH = 4時酶活達(dá)到最大，在堿性條件下G5 β -甘露聚糖酶活力極低。(3)在最佳的pH條件下，將反應(yīng)體系至于不同的水浴溫度(20°C、30°C、4(rC、 5o°c、6o°c、7(rc、8(rc、9(rc、)下反應(yīng)10分鐘，測其酶活，結(jié)果見圖5。最適反應(yīng)溫度為 70°C，40-80°C酶活力穩(wěn)定。(4)配制 0. lmol/L 的 MgS04、KCl、NaCl、CaCl2、MnS04、FeCl2、ZnCl2 溶液。各取 Iml, 與最佳PH下的酶液0. 5ml，最佳pH下的底物0. 5ml混合，在最佳溫度下反應(yīng)10min，DNS法測生成的還原糖量，計算酶活。結(jié)果見圖6，Mg2+，Mn2+，Si2+可以強(qiáng)烈抑制酶活；K+，Na+可以輕微抑制酶活；而Ca2+可以輕微激活β -甘露聚糖酶。實施例4、菌株G5生產(chǎn)酸性β -甘露聚糖酶最優(yōu)條件(1)首先考察氮源種類，炭源濃度和氮源濃度對酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖7。最佳氮源選為蛋白胨，最適濃度為 2% ；最佳炭源選為瓜爾膠，最適濃度為1.3%。
(2)選取可能影響甘露聚糖酶產(chǎn)量的八個因素，CaCl2、NaCl、MgS04、瓜爾膠、 KH2PO4、蛋白胨、酵母粉、pH。用Design-expert 7. 0進(jìn)行PB設(shè)計，設(shè)計結(jié)果見表1表IPB設(shè)計和實驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株能產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶的費希新薩托菌(Neosartorya fischeri)G5，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No. 4921。
2.能產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶的費希新薩托菌CGMCCNo. 4921在生產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述能產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶的費希新薩托菌CGMCCNo. 4921在生產(chǎn)酸性甘露聚糖酶中的應(yīng)用，其特征是培養(yǎng)條件為溫度為60-80°C，培養(yǎng)基組成為=NaClO. 4-0. 7g/L，CaCl2O. 4-0. 7g/L，瓜爾膠 10_15g/L，蛋白胨 8_12g/L，酵母粉 4_6g/L， MgSO4O. 5-1. Og/L, KH2PO4O. 5-1. Og/L, pH 3. 0-5. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶的費希新薩托菌及應(yīng)用，一株能產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶的費希新薩托菌(Neosartorya fischeri)G5，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.4921。本發(fā)明提供的能產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶的費希新薩托菌(Neosartorya fischeri)G5，是一株耐高溫，耐酸產(chǎn)酶性能良好的野生菌株，酸性β-甘露聚糖酶的產(chǎn)量為25-40U/ml。在溫度60-80℃，最適pH為3.0～4.0，其穩(wěn)定的性能適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/14GK102286384SQ20111026557
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者喬建軍, 關(guān)叢笑, 朱宏吉, 趙爽, 邵明洋 申請人:天津大學(xué)