專利名稱：基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物細胞電融合的裝置。具體地，本發(fā)明涉及提供細胞電融合的芯片。
背景技術(shù)：
細胞電融合技術(shù)自上世紀80年代起，因為其效率較高、操作簡便、對細胞無毒害， 便于觀察，適于儀器應用和規(guī)范操作等優(yōu)點，得到了快速發(fā)展和廣泛應用(參見43^934， April 27， 1982， Pohl; 441972， April 10， 1982， Pohl； 4578168， March 25， 1986， Hofman； 4695547， Sep 22， 1987， Hillard; 4699881， Oct 13， 1987， Matschke, et
β·1. ； ) O細胞電融合可以分為兩個主要階段細胞排隊和細胞融合。細胞排隊的原理在于生物細胞處于非均勻電場中時，被電場極化形成偶極子，該偶極子在非均勻電場作用中會受到特定的力而發(fā)生運動，即介電電泳 (dielectrophoresis).利用介電電泳可以控制細胞的運動，在細胞電融合過程中，利用介電電泳現(xiàn)象使細胞排列成串，壓緊相互接觸的細胞，完成細胞電融合過程所需的排隊和融合后壓緊。細胞融合的原理在于強電場作用會導致細胞膜穿孔，這種效應稱為細胞膜電致穿孔效應(electroporation)。在細胞電融合過程中利用電致穿孔效應，使兩接觸的細胞膜穿孔，從而使細胞間進行膜內(nèi)物質(zhì)交換，使細胞質(zhì)、膜融合，在一定強度的電場作用下的電穿孔是一種可逆穿孔，細胞膜會在減小或撤銷電場強度時回復原狀，產(chǎn)生細胞電融合過程的膜融合。傳統(tǒng)的細胞電融合系統(tǒng)通常都采用大型融合槽，其優(yōu)點在于(1)操作較為簡便， 采用大型融合槽降低了包括樣品進樣與出樣等步驟的難度；(2)加工簡便，大型融合槽的尺寸一般都在厘米量級，利用傳統(tǒng)的機械加工手段可以較為方便地加工出所需要的融合槽結(jié)構(gòu)；(3)融合量大，傳統(tǒng)的融合槽可以容納數(shù)毫升樣品，一次實驗即可獲得足夠的細胞進行后期篩選、培養(yǎng)等工作。但傳統(tǒng)的細胞電融合設(shè)備也存在一些缺點(1)由于融合槽中的電極間距較大， 要達到夠強度的細胞排隊、融合及壓緊信號，需要很高的外界驅(qū)動電壓，往往高達幾百上千伏，對系統(tǒng)的電氣安全性要求高，系統(tǒng)的成本也因此大為提高；(2)電極間的較大間距不利于對細胞的精確控制等。為解決這一問題，研究者將細胞電融合技術(shù)與MEMS加工技術(shù)相結(jié)合。MEMS技術(shù)的加工范圍通常在1 50 μ m，這與細胞的直徑范圍相當，所產(chǎn)生的微結(jié)構(gòu)能有效控制細胞。有多家研究機構(gòu)開始研究利用微流控芯片技術(shù)或者微電極陣列技術(shù)構(gòu)建生物芯片來實現(xiàn)細胞電融合操作。例如，美國MIT的研究人員提出了利用微流控芯片技術(shù)實現(xiàn)對細胞的精確控制，達到高效的細胞配對和融合(參見J. Voldman, A.M. Skelley, 0. Kirak, H. Suh,R. Jaenisch, Microfluidic control of cell pairing and fusion, Nat Methods, 2009)；國內(nèi)趙志強等研究人員也提出了利用MEMS技術(shù)構(gòu)建微電極陣列(參見中國專利 200610054121. X)，通過構(gòu)建微米量級間距的微電極陣列，實現(xiàn)在低電壓條件下的細胞電融合。日本研究者提出的利用一對微電極，通過流路控制細胞的流動，使細胞運動到微電極對位置區(qū)域后，利用電場作用使兩個細胞形成配對，再借助于電脈沖實現(xiàn)電融合(參見 Daniel T Chiu, A microfluidics platform for cell fusion， Current Opinion In Biotechnology,2001)。但上述芯片仍然存在一定的問題，如梁偉等人提出的金屬絲微電極陣列，其間距依然較大，電壓要求依然較高，同時，金屬絲的直徑較大不利于形成微電場細胞細胞配對與融合控制(參見CN86210174)；如美國MIT所研究的微流控芯片雖然較好的解決了細胞配對的問題，但該芯片兩電極間的間距較大，仍然需要較高的外界電壓才能夠?qū)崿F(xiàn)電融合。而趙志強提出的芯片所集成的微電極數(shù)量較少，不能實現(xiàn)高通量融合；微電極所產(chǎn)生的電場強度和電場梯度也比較弱，難以實現(xiàn)細胞的精確控制；所選擇的加工材料的抗腐蝕、抗氧化能力也較差；同時，由于未集成進出樣裝置，操作也較為不便(參見中國專利200610054121. X)。日本研究者提出利用微孔的方式實現(xiàn)兩個通道的分隔，進而實現(xiàn)不同細胞的獨立進樣完成細胞配對，但該方法對微孔的定位要求很高，無法進行大規(guī)模應用，同時，該方法依然采用距離較大的平板電極實現(xiàn)電融合，工作電壓高(M. Gel, Y. Kimura, 0. Kurosawa, H. Oana, H. Kotera, Μ. ffashizu, Dielectrophoretic cell trapping and parallel one-to-one fusion based on field constriction created by a micro-orifice array, Biomicrofluidics, 2010)。重慶大學胡寧等研究人員在上述芯片的基礎(chǔ)上也提出了包括三維微電極陣列(參見中國專利2007100^892. 2)，解決了一些問題，但仍存在進一步改進之處。該課題組提出的基于微小室陣列結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置的細胞配對是基于一個隨機原理進行的細胞配對與融合，雖然能夠達到兩個細胞配對的目地，但仍然無法精確實現(xiàn)AB細胞的配對與融合(參見中國專利200910191052. 0)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置，芯片上集成陣列化的微電極結(jié)構(gòu)，保證微電極的集成度和較好的融合效率，微電極貼附于多聚物微通道層上，避免傳統(tǒng)的齒狀突出電極結(jié)構(gòu)帶來的細胞堵塞問題；同時，借助頂層的變形膜結(jié)構(gòu)，利用氣壓控制柔性變形膜結(jié)構(gòu)的變形程度， 柔性膜在氣壓作用下凸出于微通道中，將微通道分隔成為兩微通道，實現(xiàn)不同細胞獨立進樣，解決細胞配對和多細胞融合的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置，其由表面體微電極陣列芯片與頂層變形膜結(jié)構(gòu)組成。所述表面體微電極陣列芯片通過微加工工藝制作，自下而上依次分為石英基底層和多聚物微通道層。在所述石英基底層上制作有底層梳狀微電極陣列，所述底層梳狀微電極陣列在石英基底層上以梳齒相對的形式對稱布置兩組，兩組間留有通道。所述多聚物微通道層的中間加工有上下開敞的微通道，微通道位置對應于兩組底層梳狀微電極陣列之間的通道，微通道的右端有兩個進樣孔，用于不同細胞的獨立進樣，左端為出樣孔，用于融合后細胞的出樣。在所述多聚物微通道層上制作有與底層梳狀微電極陣列形狀和位置均對應的頂層梳狀微電極陣列，并在多聚物微通道層的微通道的側(cè)壁上形成有側(cè)壁表面電極，側(cè)壁表面電極分別連接底層梳狀微電極陣列和頂層梳狀微電極陣列對應的每一對梳齒，使底層梳狀微電極陣列、側(cè)壁表面電極和頂層梳狀微電極陣列電氣聯(lián)通。同一側(cè)的所述底層梳狀微電極陣列和頂層梳狀微電極陣列向外延伸形成鍵合點，實現(xiàn)與外界控制電路的電氣連接。在上述的底層梳狀微電極陣列、側(cè)壁表面電極和頂層梳狀微電極陣列，組成了一個“三明治”結(jié)構(gòu)的微電極陣列結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中，所有的電極均為薄膜狀的表面電極結(jié)構(gòu)， 但三者共同形成的電極結(jié)構(gòu)又具備了體電極結(jié)構(gòu)的外形與功能，進行形成了所謂的表面體微電極陣列。所述變形膜結(jié)構(gòu)由柔性變形膜和氣壓調(diào)節(jié)裝置組成。柔性變形膜位于表面體微電極陣列芯片上，覆蓋所述微通道的整個區(qū)域。所述氣壓調(diào)節(jié)裝置上有進樣孔、出樣孔和進氣孔，進樣孔、出樣孔與多聚物微通道層上的進樣孔和出樣孔一一對應，在氣壓調(diào)節(jié)裝置內(nèi)還設(shè)有下方開敞的氣腔，氣腔與進氣孔，氣壓調(diào)節(jié)裝置覆蓋在變形膜上，氣腔由柔性變形膜封閉，其位置正對微通道區(qū)域，面積大于微通道區(qū)域面積，以保證能夠控制微電極陣列區(qū)域內(nèi)柔性變形膜的變形操作。所述柔性變形膜通過氣壓調(diào)節(jié)裝置的施加的氣壓可產(chǎn)生變形，向下凸進微通道中，形成隔壁，將微通道上半部分分隔開，形成左右兩條微通道，實現(xiàn)不同類細胞的獨立進樣與不同細胞間的配對與高效融合目地。進一步，所述底層梳狀微電極陣列、側(cè)壁表面電極和頂層梳狀微電極陣列厚度為 0. Γ0. 5 μ m,所述多聚物微通道層的厚度為20 30 μ m,微通道的寬度為40 60 μ m。所述的柔性變形膜的厚度為10-20 μ m,面積與表面體微電極陣列芯片一致，進而覆蓋整個微通道陣列結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)芯片整體的有效工作，材料可選用PDMS等柔軟具有良好彈性的多聚物材料。所述的氣壓調(diào)節(jié)裝置的進樣孔和出樣孔孔徑均為2mm ；氣腔的面積大于微電極陣列區(qū)域面積，氣腔的深度為1mm，進氣孔直徑為2mm。本發(fā)明具有如下優(yōu)點
本裝置可借助底層梳狀微電極陣列、側(cè)壁電極和頂層梳狀微電極陣列電氣聯(lián)通，結(jié)合多聚物微通道層組成的“三明治”結(jié)構(gòu)，在保證微電極的集成度和較好的融合效率的同時， 由于側(cè)壁電極和頂層梳狀微電極陣列是制作在多聚物微通道層上的，相當于與多聚物微通道層貼附，電極可以做得較薄，由此形成光滑的流路通道，其光滑的微通道流路結(jié)構(gòu)有利于細胞在微通道內(nèi)部的流動，降低了現(xiàn)有的具有鋸齒狀電極結(jié)構(gòu)的微通道易使細胞堵塞的可能，消除了以往的齒狀電極存在的突出電極影響微通道內(nèi)部細胞流動的弊端。同時，金質(zhì)的電極使微電極陣列結(jié)構(gòu)芯片具有良好的電導通特性，結(jié)合微電極梳齒間較小的間距可以保證低壓驅(qū)動條件下的高效融合。柔性變形膜與氣壓調(diào)節(jié)裝置的使用將能夠有效的控制柔性膜變形程度，進而在微通道中形成適宜的變形，將微通道分隔成兩部分，進而實現(xiàn)兩種細胞的獨立進樣，進而解決細胞配對的難題；同時，變形后的變形膜會改變微通道在垂直方向的形狀，并改變相應的電場分布情況，進而可結(jié)合介電電泳實現(xiàn)兩通道內(nèi)部不同細胞的一對一配對控制，并使細胞連接點獲得最高的細胞膜電位，進而可通過調(diào)控外界信號電壓使凸出點處細胞連接處融合，并避免其他區(qū)域發(fā)生多細胞融合。本芯片材料具有良好的生物相容性及抗腐蝕性能，這保證了芯片的可靠性，也提高了細胞融合的安全性。同時，芯片內(nèi)部集成了大量的微電極陣列，可實現(xiàn)大量細胞的同時融合，融合效率高。本芯片裝置主要使用范圍為動物、植物、微生物細胞的融合細胞制備，同時也可應用于電穿孔、電轉(zhuǎn)染等研究中，可廣泛應用于遺傳學、動植物遠緣雜交育種、發(fā)育生物學、藥物篩選、單克隆抗體制備、哺乳動物克隆等領(lǐng)域。


圖1基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置總體示意圖。圖2基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置主要功能模塊示意圖。圖3基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置組裝示意圖。圖4基于表面體微電極陣列結(jié)構(gòu)示意圖。圖5多聚物微通道層結(jié)構(gòu)示意圖。圖6柔性變形膜結(jié)構(gòu)示意圖。圖7氣壓調(diào)節(jié)裝置結(jié)構(gòu)示意圖。圖8a、圖8b、圖8c、圖8d、圖8e、圖8f是本芯片裝置的電融合過程示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖進一步說明本發(fā)明的結(jié)構(gòu)及工作方式
參見圖1、圖2和圖3，基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置由表面體微電極陣列芯片1，以及由柔性變形膜2和氣壓調(diào)節(jié)裝置3組成的變形膜結(jié)構(gòu)組成。表面體微電極陣列芯片1的具體結(jié)構(gòu)為在石英基底層4上通過微加工工藝制作一層底層梳狀微電極陣列7，底層梳狀微電極陣列7在石英基底層4上以梳齒相對的形式對稱布置兩組，兩組間留有通道。多聚物微通道層5通過軟光刻成型后固化于底層梳狀微電極陣列7之上，多聚物微通道層5上加工有上下開敞的微通道12，微通道12位置對應于兩組底層梳狀微電極陣列7之間的通道，微通道12的右端有兩個進樣孔11，用于不同細胞的獨立進樣，右端為出樣孔13，用于融合后細胞的出樣。同時，多聚物微通道層5上制作有與底層梳狀微電極陣列7形狀和位置均對應的頂層梳狀微電極陣列8，并在微通道12的側(cè)壁上形成有側(cè)壁表面電極9，側(cè)壁表面電極9分別連接底層梳狀微電極陣列7和頂層梳狀微電極陣列8對應的每一對梳齒，使底層梳狀微電極陣列7、側(cè)壁表面電極9和頂層梳狀微電極陣列8形成電氣聯(lián)通。同一側(cè)底層梳狀微電極陣列7和頂層梳狀微電極陣列8向芯片外延伸形成為鍵合點10，可通過金絲采用金絲鍵合工藝實現(xiàn)與外部控制電路的電氣連接，參見圖4。底層梳狀微電極陣列7、側(cè)壁表面電極9和頂層梳狀微電極陣列8厚度為0. 1-0. 5 μ m,材料選用金、鉬等具有良好生物相容性和抗氧化、抗腐蝕性的惰性金屬，多聚物微通道層5 的厚度為20-30 μ m，微通道12的寬度為40-60 μ m，進樣孔11和出樣孔13孔徑均為2mm。參見圖5、圖6和圖7，變形膜結(jié)構(gòu)由柔性變形膜2和氣壓調(diào)節(jié)裝置3組成。柔性變形膜2是一層厚度為10-20 μ m的柔性膜，面積與表面體微電極陣列芯片1 一致，進而覆蓋整個微通道12，保證裝置整體的有效工作，材料可選用PDMS等柔軟具有良好彈性的多聚物材料。該柔性變形膜上也加工有進樣孔14和出樣孔15與表面體微電極陣列芯片上的進樣孔11和出樣孔13—一對應。氣壓調(diào)節(jié)裝置3的功能在于利用氣壓調(diào)節(jié)柔性變形膜2的形狀，該裝置包括進樣孔16、出樣孔18、氣腔17和進氣孔19。進樣孔16和出樣孔18與基于表面體微電極陣列芯片上的進樣孔11和出樣孔13 —一對應，孔徑均為2mm。氣腔17開在氣壓調(diào)節(jié)裝置內(nèi)，下方開敞，氣腔與進氣孔連通。氣壓調(diào)節(jié)裝置3覆蓋在柔性變形膜上，氣腔由柔性變形膜封閉， 其位置正對微通道區(qū)域，氣腔17的面積大于微通道區(qū)域面積，以保證能夠控制微電極陣列區(qū)域內(nèi)柔性變形膜的變形操作。氣腔17的深度為1mm，進氣孔19直徑為2mm。本芯片裝置內(nèi)部細胞電融合過程如下
參見圖8a，通過進氣孔19注入空氣于氣腔17中，通過調(diào)節(jié)氣壓實現(xiàn)氣腔17下方的柔性變形膜2的變形程度，進而實現(xiàn)柔性變形膜2向下凸進于微通道12中，實現(xiàn)將表面體微電極陣列芯片1上的微通道12變成兩個通道(見圖8b);隨后，通過進樣孔16、14、11注入待融合的細胞緩沖液(分別含有目標細胞A和目標細胞B)，由于微通道12被柔性變形膜分隔為兩個獨立而又未完全斷開的通道，進而保證微通道12的兩個通道分別注入一種細胞(圖 8C中，左邊為目標細胞A，右邊為目標細胞B)；隨后，加載交流信號，由于變形后的變形膜2 會改變微通道12在垂直方向的形狀，使得變形區(qū)(凸出與微通道區(qū)域)的電場強度高于其他區(qū)域，在正向介電電泳效應的影響下，細胞會向變形區(qū)運動，進行固定于中央?yún)^(qū)，同時，由于通道A、通道B相互獨立且不完去阻斷，通道A和通道B中各自有1個細胞在中央?yún)^(qū)形成一對一的配對并建立細胞連接(圖8d)；隨后加載脈沖穿孔信號，同樣由于變形后的變形膜 2會改變微通道12在垂直方向的形狀，將使得變形膜凸出于微通道12的位置(也即是兩細胞連接處)會產(chǎn)生最高的膜電位，進而使得該區(qū)域的兩細胞連接處發(fā)生電穿孔和電融合的幾率最高，并能夠避免多細胞融合的發(fā)生(圖Se)。完成電融合過程后，釋放氣腔17中的氣體，使的柔性變形膜2復原，微通道12恢復為一個通道，目標細胞A和目標細胞B的融合細胞AB經(jīng)出樣孔18、15、/13收集(圖8f)。本文中，加載的交流信號、脈沖穿孔信號、電融合信號等的設(shè)計現(xiàn)有技術(shù)已有大量研究，如曹毅，基于微電極陣列的高通量細胞電融合方法研究，重慶大學博士學位論文， 2009 ；胡寧，高通量細胞電融合芯片及實驗研究，重慶大學博士學位論文，2010，等等。
權(quán)利要求
1.一種基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置，其特征在于其由表面體微電極陣列芯片與頂層變形膜結(jié)構(gòu)組成；所述表面體微電極陣列芯片通過微加工工藝制作，自下而上依次分為石英基底層和多聚物微通道層；在所述石英基底層上制作有底層梳狀微電極陣列，所述底層梳狀微電極陣列在石英基底層上以梳齒相對的形式對稱布置兩組，兩組間留有通道；所述多聚物微通道層的中間加工有上下開敞的微通道，微通道位置對應于兩組底層梳狀微電極陣列之間的通道，微通道的右端連通兩個進樣孔，用于不同細胞的獨立進樣，左端連通一個出樣孔，用于融合后細胞的出樣；在所述多聚物微通道層上制作有與底層梳狀微電極陣列形狀和位置均對應的頂層梳狀微電極陣列，并在多聚物微通道層的微通道的側(cè)壁上形成有側(cè)壁表面電極，側(cè)壁表面電極分別連接底層梳狀微電極陣列和頂層梳狀微電極陣列對應的每一對梳齒，使底層梳狀微電極陣列、側(cè)壁表面電極和頂層梳狀微電極陣列電氣聯(lián)通；同一側(cè)的所述底層梳狀微電極陣列和頂層梳狀微電極陣列向外延伸形成鍵合點，實現(xiàn)與外界控制電路的電氣連接；所述變形膜結(jié)構(gòu)由柔性變形膜和氣壓調(diào)節(jié)裝置組成； 柔性變形膜位于表面體微電極陣列芯片上，覆蓋所述微通道的整個區(qū)域； 所述氣壓調(diào)節(jié)裝置上有進樣孔、出樣孔和進氣孔，進樣孔、出樣孔與多聚物微通道層上的進樣孔和出樣孔一一對應，在氣壓調(diào)節(jié)裝置內(nèi)還設(shè)有下方開敞的氣腔，氣腔與進氣孔連通，氣壓調(diào)節(jié)裝置覆蓋在柔性變形膜上，氣腔由柔性變形膜封閉，其位置正對微通道區(qū)域， 面積大于微通道區(qū)域面積；所述柔性變形膜通過氣壓調(diào)節(jié)裝置的施加的氣壓可產(chǎn)生變形，向下凸進微通道中，形成隔壁，將微通道上半部分分隔開，形成左右兩條微通道，實現(xiàn)不同類細胞的獨立進樣與不同細胞間的配對。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置，其特征在于所述底層梳狀微電極陣列、側(cè)壁表面電極和頂層梳狀微電極陣列厚度為 0. 1 0. 5 μ m0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置，其特征在于所述多聚物微通道層的厚度為2(Γ30 μ m,微通道的寬度為4(Γ60 μ m,進樣孔和出樣孔孔徑為2mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置，其特征在于所述柔性變形膜的厚度為10-20 μ m，材料選用PDMS多聚物材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置，其特征在于所述氣壓調(diào)節(jié)裝置的氣腔的深度為1mm，進氣孔直徑為2mm。
全文摘要
一種基于表面體微電極陣列與變形膜結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片裝置，由表面體微電極陣列芯片與頂層變形膜結(jié)構(gòu)組成。表面體微電極陣列芯片分為石英基底層、微電極陣列層和多聚物微通道層。微電極陣列采用三明治結(jié)構(gòu)，貼附于多聚物微通道層上，避免傳統(tǒng)的齒狀突出電極結(jié)構(gòu)帶來的細胞堵塞問題，同時保證微電極的集成度和較好的融合效率。變形膜結(jié)構(gòu)由柔性變形膜和氣壓調(diào)節(jié)裝置組成；柔性變形膜覆蓋微通道，柔性變形膜通過氣壓調(diào)節(jié)裝置的施加的氣壓可產(chǎn)生變形，向下凸進微通道中，形成隔壁，將微通道分隔為兩條微通道，實現(xiàn)不同類細胞的獨立進樣與不同細胞間的配對。本裝置可廣泛應用于遺傳學、動植物遠緣雜交育種、發(fā)育生物學、藥物篩選、單克隆抗體制備、哺乳動物克隆等領(lǐng)域。
文檔編號C12M1/42GK102304475SQ20111026567
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者朱祥佑, 胡寧, 錢詩智 申請人:嶺南大學校產(chǎn)學協(xié)力團