專利名稱：一種細菌源降纖酶制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種以細菌源為提取物得到降纖酶的制備方法。
背景技術(shù)：
血栓是血管系統(tǒng)內(nèi)血液本身組成物形成的腫塊，由血栓造成管道閉塞所導致的許多病變都屬于血栓栓塞性疾病，如心肌梗塞、腦血栓、肺血栓、靜脈血栓塞等。隨著人類壽命的延長和飲食結(jié)構(gòu)的改變，血栓栓塞性病例也明顯增多，據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，全世界血塞性疾病患者不少于1 500萬人，血栓栓塞性疾病已成為當前危害人類健康，導致死亡率最高的疾病之一。目前，治療血栓栓塞性疾病最為可靠并且有效的手段之一是溶栓療法，即注射溶栓劑使血管再通?，F(xiàn)行臨床所用的溶栓劑主要是鏈激酶、尿激酶、葡激酶、人組織性纖維蛋白溶解酶原激活劑(tissue plasminogen activator，t_PA)、蝮蛇抗栓酶等，但鏈激酶、尿激酶、蝮蛇抗栓酶都有較大的副作用；t-PA雖與血栓基質(zhì)纖維蛋白有較強的特異親和力， 能在血栓局部高效地激活纖溶系統(tǒng)，但它在血液中半衰期很短，而且血漿中的纖溶酶原激活劑的抑制劑可快速抑制其活性。葡激酶對纖維蛋白也有很強的特異性，但由于產(chǎn)率低且該菌本身的致病性，限制了它的應(yīng)用。目前國際上已采用基因工程的方法對t-PA進行改造并生產(chǎn)出第三代溶栓藥物——t-PA的突變體和嵌合體，其療效有所改善，但是價格昂貴。因此，研制相對廉價、高效、快速、防止再栓塞及減低出血等不良反應(yīng)的新型溶栓藥物的需求迫切。自1987年日本學者Sumi等首先發(fā)現(xiàn)微生物纖溶酶(fibrinolytic enzyme)具有纖溶活性以來，微生物纖溶酶以其具有體內(nèi)半衰期長、成本低廉等其它溶栓劑所不具備的特點，受到各國科學家的廣泛關(guān)注和深入研究。從作用機理上劃分，微生物來源的溶栓劑可以分成兩類一類是纖溶酶原激活劑， 如鏈激酶、葡激酶，其作用原理是纖溶酶原激活劑能將纖溶酶原激活為纖溶酶，而具有絲氨酸蛋白酶活性的纖溶酶則能降解構(gòu)成血栓骨架的纖維蛋白，從而引起溶栓的作用；另一類是纖溶酶類物質(zhì)，其作用不通過激活纖溶酶原，而是直接降解血塊中的纖維蛋白，溶解血栓，這類物質(zhì)有來源于枯草芽孢桿菌的納豆激酶(nattokinase，NK)以及分別來源于芽孢桿菌、糞鏈球菌、鏈酶菌等的纖溶活性物質(zhì)。除早期發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)鏈激酶的β-溶血鏈球菌(Str印tococcus hemolytius)和產(chǎn)葡激酶的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)外，近年來，又陸續(xù)篩選出可產(chǎn)生纖溶酶活性的芽孢桿菌、放線菌、黃青霉菌、尖鐮胞菌、鐮胞菌、旋孢霉菌、海洋假單胞菌、藤黃微球菌等。但這些菌株中有的產(chǎn)酶量較低、有的自身存在致病性、有的菌株產(chǎn)生的降纖酶在臨床應(yīng)用后存在較大的副作用，這些因素在一定程度上制約了微生物纖溶酶的開發(fā)和應(yīng)用， 因而篩選出無致病性、易培養(yǎng)、產(chǎn)酶量高的菌株，并且摸索出成熟的工藝條件就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種糞腸球菌EF608菌株為提取物制備降纖酶的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種細菌源降纖酶制備方法，其關(guān)鍵在于將糞腸球菌 EF608菌株發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液離心去沉淀，上清液加固體硫酸銨至飽和度達60%-65%，鹽析組分經(jīng)透析濃縮，得粗提液。粗提物依次過苯基瓊脂糖凝膠FF疏水層析柱、DEAE-kphadex A-25離子交換層析柱和kpharose-肝素親和層析柱，得到高豐度纖溶活性峰，透析、冷凍干燥，得到純品即為細菌源降纖酶。從糞腸球菌菌株發(fā)酵液中分離純化出了一種分子量為 37. IKD的纖溶酶。具體按如下步驟進行
(1)以糞腸球菌EF608菌株為提取物，將糞腸球菌EF608菌株發(fā)酵培養(yǎng)；
(2)硫酸銨沉淀取發(fā)酵液，離心、棄沉淀，上清液中加入固體硫酸銨，使其硫酸銨飽和濃度達到60%-65%，鹽析組分經(jīng)透析濃縮，得粗提液；
(3)苯基瓊脂糖凝膠FF疏水層析將粗提物過苯基瓊脂糖凝膠FF疏水層析柱，用 50mmol/L Tris-HCl 和 1 mol/L (NH4)2SO4 的混合緩沖液，pH 為 7. 5 進行平衡，用 50mmol/L Tris -HClpH為7. 5的緩沖液洗脫；收集目的峰，透析，冷凍干燥，4°C保存；
(4)DEAE-Sephadex A-25離子交換層析將目的峰組分過DEAE-S^)hadex A-25離子交換層析柱，用 50mmol/L Tris-HClpH 為 7. 5 進行平衡，用 50mmol/L Tris-HClpH 為 7. 5 的 Buffer在0 0. 5 mol/L范圍內(nèi)逐漸增加NaCl提高鹽濃度，做線性梯度洗脫；對各峰的收集溶液隔管測定纖溶活性，收集有纖溶活性的目的峰，透析，冷凍干燥，4°C保存；
(5)Sepharose-肝素親和層析將目的峰組分過kpharose-肝素親和層析柱，用 50mmol/L Tris-HClpH為 7. 5 的 Buffer 進行平衡；用 50mmol/L Tris-HClpH為 7. 5 的 Buffer 在0 0. 5 mol/L范圍內(nèi)逐漸增加NaCl提高鹽濃度，做線性梯度洗脫；收集有纖溶活性的峰，透析、冷凍干燥，得到純品即為細菌源降纖酶。上述步驟(1)中發(fā)酵液的離心為8000 rpm離心lOmin。
上述糞腸球菌EF608菌株發(fā)酵培養(yǎng)具體分為兩個步驟
(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基以g/100mL計稱取葡萄糖l.Og，蛋白胨l.Og，酵母提取物 0. 5g, K2HPO4 · 3H20 1. 0g, NaCl 0. 2g, MgSO4 · 7H20 0. 02 g，調(diào) pH 至 7. 5，121 °C 高溫高壓滅菌20 min，于37°C、180 rpm恒溫培養(yǎng)12 16小時。(2)液體發(fā)酵培養(yǎng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基以g/100mL計稱取葡萄糖2. 0 g，蛋白胨0. 5 g，牛肉膏 0.5 g，酵母提取物 0.5 g，K2HPO4 · 3H20 1.0 g, NaCl 0.2 g，MgSO4 ·7Η20 0. 02g, 調(diào)PH至7.5，121°C高溫高壓滅菌20min;種子培養(yǎng)基按體積百分比6%接入裝液量為4升液體發(fā)酵培養(yǎng)基的20升發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為攪拌速度180 rpm,培養(yǎng)溫度為35、0°C， 培養(yǎng)時間1(Γ12小時。通過特定的培養(yǎng)基，最后所得到的細菌源降纖酶量更高。有益效果本發(fā)明制備方法首次從糞腸球菌菌株發(fā)酵液中分離純化出了一種分子量為37. IKD的纖溶酶，易于純化和批量制備，并且纖溶活性強，無毒性，是較為理想的纖溶酶制劑原料。


圖1為苯基瓊脂糖凝膠FF疏水層析圖譜； 圖2為DEAE-S印hadex A-25離子交換層析圖譜； 圖3為kpharose-肝素親和層析圖譜；
圖4為本發(fā)明產(chǎn)品纖溶酶的SDS-PAGE圖譜； 圖5為SDS-PAGE測定本發(fā)明纖溶酶對牛血纖維蛋白原的降解圖片。
具體實施例方式
實施例下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明 1、糞腸球菌EF608菌株降纖酶的制備
(1)菌種糞腸球菌EF608菌株
(2)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基以g/100mL計稱取葡萄糖1.0g，蛋白胨1. 0g，酵母提取物 0. 5g, K2HPO4 · 3H20 1. 0 g, NaCl 0. 2g, MgSO4 · 7H20 0. 02g，調(diào) pH 至 7. 5，121 °C 高溫高壓滅菌20 min。于37°C、180 rpm恒溫培養(yǎng)12小時。(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基以g/100mL計稱取葡萄糖2. 0 g，蛋白胨0. 5 g，牛肉膏 0.5 g，酵母提取物 0.5 g，K2HPO4 · 3H20 1.0 g, NaCl 0.2 g，MgSO4 ·7Η20 0. 02g, 調(diào)PH至7.5，121°C高溫高壓滅菌20min ；種子培養(yǎng)基MO ml接入裝液量為4升液體發(fā)酵培養(yǎng)基的20升發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為攪拌速度180 rpm，培養(yǎng)溫度為37 °C，培養(yǎng)時間12 小時。(4)硫酸銨沉淀取發(fā)酵液，4°C、8000 rpm離心lOmin，棄沉淀，上清液中加入固體硫酸銨，使其硫酸銨飽和濃度達到65%，鹽析組分經(jīng)透析濃縮，得粗提液。(5)苯基瓊脂糖凝膠FF疏水層析將粗提物過苯基瓊脂糖凝膠FF疏水層析柱 (2.001^20011)，用50讓01/1 Tris-HCl 和 1 mol/L (NH4) 2S04 的混合緩沖液，pH 為 7. 5 進行平衡，用50mmol/L Tris-HClpH為7. 5的緩沖液洗脫；檢測波長:280nm ；流速:lmL/min ；收集3ml/管；收集目的峰，透析，冷凍干燥，4°C保存。分離圖譜如圖1所示，洗脫得到2個峰，活性檢測發(fā)現(xiàn)第II峰為目的峰。(6) DEAE-Sephadex A-25離子交換層析將目的峰組分過DEAE-S印hadex A-25 離子交換層析柱(2. 0cmX20cm)，用 50mmol/L Tris-HClpH 為 7. 5 進行平衡，用 50mmol/L Tris-HClpH為7. 5的Buffer在0 0. 5 mol/L范圍內(nèi)逐漸增加NaCl提高鹽濃度，做線性梯度洗脫；檢測波長280nm ；流速lmL/min ；收集3ml/管；對各峰的收集溶液隔管測定纖溶活性，收集纖溶活性最強的峰，透析，冷凍干燥，4°C保存。分離圖譜如圖2所示，洗脫得到4個峰，活性檢測發(fā)現(xiàn)第IV峰活性最強。(7)Sepharose-肝素親和層析將上步所得活性最強組分過kpharose-肝素親和層析柱(2. OcmX 20cm)，用 50mmol/L Tris-HClpH 為 7. 5 的 Buffer 進行平衡；用 50mmol/L Tris-HClpH為7. 5的Buffer在0 0. 5 mol/L范圍內(nèi)逐漸增加NaCl提高鹽濃度，做線性梯度洗脫；檢測波長280nm ；流速lmL/min ；收集3ml/管；收集有纖溶活性的峰，透析、冷凍干燥，得到純品。
分離圖譜如圖3所示，洗脫得到2個峰，檢測發(fā)現(xiàn)第II峰具有降解纖維蛋白的活性。(8)電泳將纖溶酶純品做電泳，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為 12%。結(jié)果如圖4所示，經(jīng)上述純化步驟，樣品顯示為一條蛋白帶，分子量為37. 1KD，此為本發(fā)明的纖溶酶。2、本實施例纖溶酶生物活性測定 (1)纖溶酶纖溶活性證明
A.瓊脂糖一纖維蛋白平板法
稱取纖維蛋白原16. Omg溶解于SmL雙蒸水中，配制成纖維蛋白原溶液，于37 °C中水浴保溫；稱取0. 16g瓊脂粉加雙蒸水定容至SmL并煮化，待冷卻至50°C左右加入Iml含10 U凝血酶溶液和配置好的纖維蛋白原溶液，迅速搖勻后倒入直徑為9cm的平皿中，室溫平放30min，待平板凝固后置于4°C下冷藏備用。用直接5mm的打孔器在制備好的纖維蛋白平板上打孔，每孔加樣品20微升，置37 °C培養(yǎng)箱保溫18小時，即可看到溶解纖維蛋白形成的透明圈
B.電泳法
將本發(fā)明纖溶酶和牛血纖維蛋白原等體積混勻37°C反應(yīng)，用SDS--PAGE檢測纖溶酶降解牛血纖維蛋白原，降解圖譜見圖2 (從左至右泳道依次為牛血纖維蛋白原、本發(fā)明纖溶酶與纖維蛋白原混合后作用1511^11、301^11、601^11、1201^11、2401^11)。本發(fā)明降纖酶對牛血纖維蛋白原Aa鏈和Ββ鏈有較強的降解作用，對Y鏈無降解作用。(2)小鼠皮下出血毒性試驗
小鼠背部皮下注射本發(fā)明纖溶酶0. Iml/點，酶活力為400U/ml，2小時后剝皮，注射點皮下無淤血斑出現(xiàn)，顯示該纖溶酶無出血毒性。
權(quán)利要求
1.一種細菌源降纖酶制備方法，其特征在于將糞腸球菌EF608菌株發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液離心去沉淀，上清液加固體硫酸銨至飽和度達60%-65%，鹽析組分經(jīng)透析濃縮，得粗提液， 粗提物依次過苯基瓊脂糖凝膠FF疏水層析柱、DEAE-Si^phadex A-25離子交換層析柱和 S印harose-肝素親和層析柱，得到高豐度纖溶活性峰，透析、冷凍干燥，得到純品即為細菌源降纖酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種細菌源降纖酶制備方法，其特征在于具體按如下步驟進行(1)以糞腸球菌EF608菌株為提取物，將糞腸球菌EF608菌株發(fā)酵培養(yǎng)；(2)硫酸銨沉淀取發(fā)酵液，離心、棄沉淀，上清液中加入固體硫酸銨，使其硫酸銨飽和濃度達到60%-65%，鹽析組分經(jīng)透析濃縮，得粗提液；(3)苯基瓊脂糖凝膠FF疏水層析將粗提物過苯基瓊脂糖凝膠FF疏水層析柱，用 50mmol/L Tris-HCl 和 1 mol/L (NH4)2SO4 的混合緩沖液，pH 為 7. 5 進行平衡，用 50mmol/L Tris-HClpH為7. 5的緩沖液洗脫；收集目的峰，透析，冷凍干燥，4°C保存；(4)DEAE-Sephadex A-25離子交換層析將目的峰組分過DEAE-S^hadex A-25離子交換層析柱，用 50mmol/L Tris-HClpH 為 7. 5 進行平衡，用 50mmol/L Tris-HClpH 為 7. 5 的 Buffer在0 0. 5 mol/L范圍內(nèi)逐漸增加NaCl提高鹽濃度，做線性梯度洗脫；對各峰的收集溶液隔管測定纖溶活性，收集有纖溶活性的目的峰，透析，冷凍干燥，4°C保存；(5)Sepharose-肝素親和層析將目的峰組分過S印harose-肝素親和層析柱，用 50mmol/L Tris-HClpH為 7. 5 的 Buffer 進行平衡；用 50mmol/L Tris-HClpH為 7. 5 的 Buffer 在O 0. 5 mol/L范圍內(nèi)逐漸增加NaCl提高鹽濃度，做線性梯度洗脫；收集有纖溶活性的峰，透析、冷凍干燥，得到純品即為細菌源降纖酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種細菌源降纖酶制備方法，其特征在于所述步驟(1)中發(fā)酵液的離心為8000 rpm離心lOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種細菌源降纖酶制備方法，其特征在于所述糞腸球菌EF608 菌株發(fā)酵培養(yǎng)具體分為兩個步驟(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基以g/100mL計稱取葡萄糖l.Og，蛋白胨l.Og，酵母提取物 0. 5g, K2HPO4 · 3H20 1. 0g, NaCl 0. 2g, MgSO4 · 7H20 0. 02 g，調(diào) pH 至 7. 5，121 °C 高溫高壓滅菌20 min，于37°C、180 rpm恒溫培養(yǎng)12 16小時；(2)液體發(fā)酵培養(yǎng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基以g/100mL計稱取葡萄糖2.0g，蛋白胨0.5 g， 牛肉膏 0.5 g，酵母提取物 0.5 g，K2HPO4 · 3H20 1.0 g, NaCl 0.2 g, MgSO4 ‘ 7H20 0. 02g，調(diào) pH至7.5，121°C高溫高壓滅菌20min;種子培養(yǎng)基按體積百分比6%接入裝液量為4升液體發(fā)酵培養(yǎng)基的20升發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為攪拌速度180 rpm,培養(yǎng)溫度為35、0°C，培養(yǎng)時間10 12小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細菌源降纖酶制備方法，以糞腸球菌EF608菌株為提取物，將糞腸球菌EF608菌株發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液離心去沉淀，上清液加固體硫酸銨至飽和度達60%-65%，鹽析組分經(jīng)透析濃縮，得粗提液。粗提物依次過苯基瓊脂糖凝膠FF疏水層析柱、DEAE-SephadexA-25離子交換層析柱和Sepharose-肝素親和層析柱，得到高豐度纖溶活性峰，透析、冷凍干燥，得到純品即為細菌源降纖酶。本發(fā)明制備方法首次從糞腸球菌菌株發(fā)酵液中分離純化出了一種分子量為37.1KD的纖溶酶，易于純化和批量制備，并且纖溶活性強，無毒性，是較為理想的纖溶酶制劑原料。
文檔編號C12N9/68GK102304502SQ20111026614
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者余曉東, 和七一, 文浩平 申請人:重慶師范大學