專利名稱：從蛇毒中提取降纖酶及降纖酶水針制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從蛇毒中提取具有溶栓作用的降纖酶及降纖酶水針制劑的制備方法，尤其涉及一種采用單克隆抗體親和層析技術(shù)進(jìn)行高純度生物活性酶的提取方法和高穩(wěn)定性水針制劑的制備工藝。
背景技術(shù)：
降纖酶為蛋白水解酶，能溶解血栓，抑制血栓形成，改善微循環(huán)。在臨床上用于急性腦梗死，包括腦血栓、腦栓塞、短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)以及腦梗死再復(fù)發(fā)的預(yù)防；心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛以及心肌梗死再復(fù)發(fā)的預(yù)防；四肢血管病，包括股動(dòng)脈栓塞，血栓閉塞性脈管炎，雷諾氏??；還適用血液呈高黏狀態(tài)、高凝狀態(tài)、血栓前狀態(tài)；突發(fā)性耳聾；肺栓塞等癥。
從各種蛇毒中提取的具抗凝溶栓作用的蛇毒類凝血酶制劑，在國內(nèi)、外已廣泛使用多年。傳統(tǒng)的降纖酶分離純化采取多步柱層析，包括離子交換層析和分子篩凝膠層析，甚至采取高效液相制備等手段，這樣取得微量單組分的藥用酶是可行的，但是大量規(guī)?；a(chǎn)取得單一組分藥用酶類幾乎沒有可能，而且還存在所得制品純度低的問題。而采用多糖為配基的親和層析，制備工藝可達(dá)十幾毫克樣品，但必須采取多步驟操作才能得到單一組份。
目前，國外的蛇毒類凝血酶制劑均為水針劑，因受制劑水平的限制，處方中均含防腐劑成分以保持制劑的穩(wěn)定性，如Ancrod、Batroxobin、日本東菱克栓酶等；我國為保證長期保存過程中效價(jià)的穩(wěn)定性，均制成凍干粉針，降低了制品的比活性，同時(shí)也增大聚合體產(chǎn)生的可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了解決上述技術(shù)問題而提供的一種從蛇毒中提取降纖酶及降纖酶水針制劑的制備方法，它工藝簡單，適合規(guī)?；a(chǎn)，并可長期保存。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的從蛇毒中提取降纖酶的方法，它包括下述步驟1).單克隆抗體的制備將純化并定性的從蛇毒中提取的降纖酶(1g/L)與等體積的完全佐劑混合乳化后，給動(dòng)物免疫；然后用Koher方法取免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞，將所取的免疫動(dòng)物脾細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；將所得的細(xì)胞懸液與相同動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞按(8-15)∶1的比例混合，在30-80％聚乙二醇作用下融合得融合體；將融合體進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，首先篩出能分泌與預(yù)定抗原起反應(yīng)的單抗的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)而從中篩出有預(yù)定特異性的雜交瘤細(xì)胞，最終選出可供實(shí)際應(yīng)用且具有穩(wěn)定生長和功能特異的均一細(xì)胞克隆，以腹水法獲得單克隆抗體，純化后備用；2).降纖酶粗品的制備取蛇毒，將蛇毒經(jīng)離子交換層析法初步純化，得初步純化的降纖酶粗品，備用；3).抗體親和層析柱的制備3.1取瓊脂糖作為親和層析的載體，用適量的溴化氰活化該載體，得活化的瓊脂糖；3.2取已純化的單克隆抗體溶于硼酸緩沖液中，過濾后加入親和層析柱內(nèi)，然后加入活化的瓊脂糖，在5-20℃下攪拌反應(yīng)15-25小時(shí)，得具有特異親和能力的分離介質(zhì)；3.3裝柱即得到抗體親和層析柱，備用；4).降纖酶的制備
將經(jīng)離子交換層析法初步純化的降纖酶粗品逐漸加入到抗體親和層析柱中，待流出液在檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線后，改用親和層析洗脫液洗脫活性組分，收集洗脫峰，使被吸附的生物活性物質(zhì)從親和介質(zhì)上解吸下來，測(cè)定酶活性，冷凍干燥后即得純化的降纖酶成品。
一種降纖酶水針制劑的制備方法，它包括下述步驟取純化的降纖酶，將其加入到適量的注射用水中溶解，得溶解液，在每1000ml溶解液中加入5--20g氯化鈉穩(wěn)定劑，分裝，即得降纖酶水針制劑。
所述的降纖酶水針制劑的制備方法，它包括下述步驟取純化的降纖酶5000u，將其加入到1000ml適量的注射用水中溶解，得溶解液，在每1000ml溶解液中加入9--15g氯化鈉穩(wěn)定劑，無菌分裝成1000支制劑，每支含量5u，即得降纖酶水針制劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果本申請(qǐng)人首次將單克隆抗體親和層析技術(shù)應(yīng)用于降纖酶產(chǎn)品的純化，操作步驟簡單，所得制品純度高，一次處理蛇毒量大，每次可制備上百毫克降纖酶樣品。國內(nèi)該類產(chǎn)品生產(chǎn)采用多糖為配基的親和層析，制備工藝可達(dá)十幾毫克樣品，但必須采取多步驟操作才能得到單一組份。
抗體是指能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。它是機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞活化、增殖并分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的對(duì)該抗原有特異親和力的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。
由于免疫刺激物一般是含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體也是多種抗體的混合物，通常叫多克隆抗體。這種多抗原決定簇的多克隆抗體在抗原抗體反應(yīng)中會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，發(fā)生了分子生物學(xué)上的革命，出現(xiàn)了單克隆抗體。
單克隆抗體是將產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆技術(shù)，使融合的單一細(xì)胞形成單克隆細(xì)胞系。由單克隆細(xì)胞系產(chǎn)生的這種抗體是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的免疫細(xì)胞分泌的，由于該免疫細(xì)胞是單一的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞克隆(融合)產(chǎn)生的可無限傳代的細(xì)胞系，因而由此產(chǎn)生的抗體叫單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)由于具有高度的特異性、親和性及可工業(yè)化大量生產(chǎn)的特點(diǎn)，在醫(yī)療方面顯示出重要價(jià)值。
本發(fā)明將單克隆抗體作為一種生物技術(shù)手段，利用抗體和抗原的高親和性和高選擇性的特點(diǎn)，將單克隆抗體聯(lián)接到載體上，對(duì)目的物進(jìn)行特異性親和層析，即單克隆抗體親和層析技術(shù)。該技術(shù)可從生物毒素或生物材料中分離純化特定的蛋白質(zhì)或其它不易純化的物質(zhì)。
本發(fā)明采用的單克隆抗體親和層析與其它生物分離純化手段相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)·由于單克隆抗體的高度特異性，因而很少造成雜蛋白污染。
·單克隆抗體和與所分離的蛋白質(zhì)具有特異的親和力，因此可以在單一的蛋白峰中洗下所分離的蛋白質(zhì)，避免分離物的稀釋或變性。
·對(duì)所分離物的濃度要求低，即使該蛋白質(zhì)在原料中僅占很低的濃度，也可以得到較好地純化。
·適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
目前，國外的蛇毒類凝血酶制劑均為水針劑，我國現(xiàn)階段由于制劑水平的限制，為保證長期保存過程中效價(jià)的穩(wěn)定性，均制成凍干粉針，國外同類商品有Ancrod、日本東菱克栓酶等，國外開發(fā)蛇毒制劑較我國為早，其單組分類凝血酶的提純工藝也早就開始應(yīng)用，并且其制劑水平也明顯高于我國，目前國外同類產(chǎn)品的劑型多為注射液，但含防腐劑成分，長期使用對(duì)人身健康不利，本申請(qǐng)人水針劑型的研制成功，表明我國該產(chǎn)品的制劑水平與國際水平的接軌并超過同類產(chǎn)品。
經(jīng)室溫放置3年的穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明不加穩(wěn)定劑的降纖酶水針制劑，3年后的實(shí)際效價(jià)測(cè)定結(jié)果已遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，加入5--20g穩(wěn)定劑的降纖酶水針制劑，效價(jià)測(cè)定結(jié)果可以達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，隨著穩(wěn)定劑用量的加大，降纖酶水針制劑的效價(jià)越穩(wěn)定，加入20g以上的穩(wěn)定劑對(duì)實(shí)際效價(jià)測(cè)定與加入20g穩(wěn)定劑一致。其中以加入9-15g穩(wěn)定劑為最適范圍。
水針劑型的降纖酶與凍干粉針劑型及進(jìn)口水針制劑東菱克栓酶相比，優(yōu)勢(shì)明顯，對(duì)比結(jié)果如下表本發(fā)明降纖酶水針制劑與凍干粉針劑型及進(jìn)口水針制劑東菱克栓酶對(duì)比表

1.保降纖酶水針制劑在保存過程中，無多聚體的產(chǎn)生，更好的避免了過敏性反應(yīng)產(chǎn)生的可能性；2.避免了賦形劑對(duì)效價(jià)測(cè)定的影響及凍干過程的效價(jià)損失，降纖酶在凍干過程中損失約50％(凍干中投料量為160-200％)，這無形中降低了制品的比活性，增加了患者在使用產(chǎn)品過程中，對(duì)異體蛋白的加大注射劑量，同時(shí)也增大聚合體產(chǎn)生的可能性，相對(duì)容易產(chǎn)生大分子量蛋白的過敏反應(yīng)；3.水針劑型的降纖酶中高濃度氯化鈉的加入，是本品較加入叔丁醇等防腐劑的制劑具有更好的安全性與穩(wěn)定性，長期放置3年以上無降解產(chǎn)物與聚合物的產(chǎn)生；4.原料完全來源于白眉蝮蛇，降纖、溶栓作用緩和，毒性低，安全性更好。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一從蛇毒中提取降纖酶的方法包括下述步驟1).單克隆抗體的制備將純化并定性的從蛇毒中提取的降纖酶(1g/L)與等體積的弗氏佐劑混合乳化后，對(duì)7周齡的Balb/C小鼠皮下注射每次0.2ml，2周1次，共免疫3次；融合前3天以0.2ml靜脈注射；然后用Koher方法取免疫小鼠脾細(xì)胞，將所取的免疫小鼠脾細(xì)胞加入1640培養(yǎng)液，得細(xì)胞懸液；將所得的細(xì)胞懸液與鼠SP2/10骨髓瘤細(xì)胞按10∶1比例混合，在50％聚乙二醇作用下融合得融合體；將融合體進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，首先篩出能分泌與預(yù)定抗原起反應(yīng)的單抗的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)而從中篩出有預(yù)定特異性的雜交瘤細(xì)胞，最終選出可供實(shí)際應(yīng)用且具有穩(wěn)定生長和功能特異的均一細(xì)胞克隆，以腹水法獲得單克隆抗體，純化后備用；2).降纖酶粗品的制備取由白眉蝮蛇中提取的蛇毒，將蛇毒經(jīng)離子交換層析法初步純化，得初步純化的降纖酶粗品，備用；3).抗體親和層析柱的制備3.1以瓊脂糖4B作為親和層析的載體，用溴化氰活化該載體，得活化的瓊脂糖4B；3.2取100mg已純化的單克隆抗體溶于20ml硼酸緩沖液中，過濾，濾液加入親和層析柱內(nèi)，然后加入上述活化的瓊脂糖4B，在10℃下攪拌反應(yīng)18小時(shí)，得具有特異親和能力的分離介質(zhì)；3.3用10倍柱體積的pH10.2的硼酸緩沖液以5ml/min流速洗滌親和層析柱柱體，然后再依次用5倍柱體積的pH10.0、0.1mol/L的乙醇胺溶液及pH8.0、0.1mol/L的硼酸緩沖液充分洗滌，最后用pH7.4的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液平衡，即得到抗體親和層析柱，備用。該柱可重復(fù)使用200次以上，用20％的乙醇可長期保存；4).降纖酶的制備將經(jīng)離子交換層析法初步純化的降纖酶粗品逐漸加入到抗體親和層析柱中，經(jīng)上述硼酸緩沖液溶解，磷酸鹽緩沖液平衡后，利用抗體親和層析柱的具有特異親和能力的分離介質(zhì)的特異選擇性吸附生物活性物質(zhì)，由于雜質(zhì)與層析介質(zhì)沒有親和作用，故不能被吸附而洗脫除去；待流出液在檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線后，改用親和層析洗脫液(pH7.8，0.1％Tris-Hcl緩沖液)洗脫活性組分，收集洗脫峰，使被吸附的生物活性物質(zhì)從親和介質(zhì)上解吸下來，測(cè)定酶活性，冷凍干燥后即得純化的降纖酶成品；5).降纖酶水針制劑的制備取上述純化的降纖酶5000u，將其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入10g氯化鈉為穩(wěn)定劑，無菌分裝成1000支制劑，每支含量5u，實(shí)測(cè)效價(jià)4.94u。
本制劑室溫放置3年，測(cè)定效價(jià)4.82u。
實(shí)施例二從蛇毒中提取降纖酶的方法包括下述步驟1).單克隆抗體的制備將純化并定性的從蛇毒中提取的降纖酶(1g/L)與等體積的弗氏佐劑混合乳化后，對(duì)小鼠免疫；然后用Koher方法取上述免疫的脾細(xì)胞，將所取的脾細(xì)胞加入1640培養(yǎng)液，得細(xì)胞懸液；將所得的細(xì)胞懸液與SP2/10骨髓瘤細(xì)胞按8∶1比例混合，在80％聚乙二醇作用下融合得融合體；將融合體進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，首先篩出能分泌與預(yù)定抗原起反應(yīng)的單抗的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)而從中篩出有預(yù)定特異性的雜交瘤細(xì)胞，最終選出可供實(shí)際應(yīng)用且具有穩(wěn)定生長和功能特異的均一細(xì)胞克隆，以腹水法獲得單克隆抗體，純化后備用；2).降纖酶粗品的制備取由白眉蝮蛇中提取的蛇毒，將蛇毒經(jīng)離子交換層析法初步純化，得初步純化的降纖酶粗品，備用；3).抗體親和層析柱的制備3.1瓊脂糖4B作為親和層析的載體，用溴化氰活化該載體，得活化的瓊脂糖4B；3.2取100mg已純化的單克隆抗體溶于18ml硼酸緩沖液中，過濾，濾液加入親和層析柱內(nèi)，然后加入上述活化的瓊脂糖4B，在20℃下攪拌反應(yīng)小時(shí)，得具有特異親和能力的分離介質(zhì)；3.3用10倍柱體積的pH10.2的硼酸緩沖液以6ml/min流速洗滌親和層析柱柱體，然后再依次用5倍柱體積的pH10.0、0.1mol/L的乙醇胺溶液及pH8.0、0.1mol/L的硼酸緩沖液充分洗滌，最后用pH7.4的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液平衡，即得到抗體親和層析柱，備用，該柱可重復(fù)使用200次以上，用20％的乙醇可長期保存。
4).降纖酶的制備將經(jīng)離子交換層析法初步純化的降纖酶粗品逐漸加入到抗體親和層析柱中，經(jīng)上述硼酸緩沖液溶解，磷酸鹽緩沖液平衡后，利用抗體親和層析柱的具有特異親和能力的分離介質(zhì)的特異選擇性地吸附生物活性物質(zhì)，由于雜質(zhì)與層析介質(zhì)沒有親和作用，故不能被吸附而洗脫除去；待流出液在檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線后，改用親和層析洗脫液(pH7.8，0.1％Tris-Hcl緩沖液)洗脫活性組分，收集洗脫峰，使被吸附的生物活性物質(zhì)從親和介質(zhì)上解吸下來，測(cè)定酶活性，冷凍干燥后即得純化的降纖酶成品；5)、降纖酶水針制劑的制備取降纖酶5000u，將其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入9g氯化鈉為穩(wěn)定劑，無菌分裝成1000支制劑，每支含量5u，實(shí)測(cè)效價(jià)4.97u。
本制劑室溫放置3年，測(cè)定效價(jià)4.69u。
實(shí)施例三從蛇毒中提取降纖酶的方法包括下述步驟1).單克隆抗體的制備將純化并定性的從蛇毒中提取的降纖酶(1g/L)與等體積的弗氏佐劑混合乳化后，對(duì)小鼠免疫；然后用Koher方法取上述免疫的小鼠的脾細(xì)胞，將所取的免疫小鼠的脾細(xì)胞加入1640培養(yǎng)液，得細(xì)胞懸液；將所得的細(xì)胞懸液與小鼠SP2/10骨髓瘤細(xì)胞按15∶1比例混合，在30％聚乙二醇作用下融合得融合體；將融合體進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，首先篩出能分泌與預(yù)定抗原起反應(yīng)的單抗的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)而從中篩出有預(yù)定特異性的雜交瘤細(xì)胞，最終選出可供實(shí)際應(yīng)用且具有穩(wěn)定生長和功能特異的均一細(xì)胞克隆，以腹水法獲得單克隆抗體，純化后備用；2).降纖酶粗品的制備取由白眉蝮蛇中提取的蛇毒，將蛇毒經(jīng)離子交換層析法初步純化，得初步純化的降纖酶粗品，備用；3).抗體親和層析柱的制備3.1瓊脂糖4B作為親和層析的載體，用溴化氰活化該載體，得活化的瓊脂糖4B；3.2取100mg已純化的單克隆抗體溶于18ml硼酸緩沖液中，過濾，濾液加入親和層析柱內(nèi)，然后加入上述活化的瓊脂糖4B，在20℃下攪拌反應(yīng)小時(shí)，得具有特異親和能力的分離介質(zhì)；3.3用10倍柱體積的pH10.2的硼酸緩沖液以6ml/min流速洗滌親和層析柱柱體，然后再依次用5倍柱體積的pH10.0、0.1mol/L的乙醇胺溶液及pH8.0、0.1mol/L的硼酸緩沖液充分洗滌，最后用pH7.4的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液平衡，即得到抗體親和層析柱，備用。該柱可重復(fù)使用200次以上，用20％的乙醇可長期保存；4).降纖酶的制備將經(jīng)離子交換層析法初步純化的降纖酶粗品逐漸加入到抗體親和層析柱中，經(jīng)上述硼酸緩沖液溶解，磷酸鹽緩沖液平衡后，利用抗體親和層析柱的具有特異親和能力的分離介質(zhì)的特異選擇性地吸附生物活性物質(zhì)，由于雜質(zhì)與層析介質(zhì)沒有親和作用，故不能被吸附而洗脫除去；待流出液在檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線后，改用親和層析洗脫液(pH7.8，0.1％Tris-Hcl緩沖液)洗脫活性組分，收集洗脫峰，使被吸附的生物活性物質(zhì)從親和介質(zhì)上解吸下來，測(cè)定酶活性，冷凍干燥后即得純化的降纖酶成品。
5).降纖酶水針制劑的制備取降纖酶5000u，將其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入5g氯化鈉為穩(wěn)定劑，無菌分裝成1000支制劑，每支含量5u，實(shí)測(cè)效價(jià)4.89u。
本制劑室溫放置3年，測(cè)定效價(jià)4.28u。
實(shí)施例四降纖酶水針制劑的制備取降纖酶5000u，將其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入15g氯化鈉為穩(wěn)定劑，無菌分裝成1000支制劑，每支含量5u，實(shí)測(cè)效價(jià)4.92u。
本制劑室溫放置3年，測(cè)定效價(jià)4.93u。
實(shí)施例五降纖酶水針制劑的制備取降纖酶5000u，將其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入12g氯化鈉為穩(wěn)定劑，無菌分裝成1000支制劑，每支含量5u，實(shí)測(cè)效價(jià)4.91u。
本制劑室溫放置3年，測(cè)定效價(jià)4.88u。
實(shí)施例六降纖酶水針制劑的制備取降纖酶5000u，將其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入20g氯化鈉為穩(wěn)定劑，無菌分裝成1000支制劑，每支含量5u，實(shí)測(cè)效價(jià)4.99u。
本制劑室溫放置3年，測(cè)定效價(jià)4.96u。
權(quán)利要求
1.從蛇毒中提取降纖酶的制備方法，它包括下述步驟1).單克隆抗體的制備將純化并定性的從蛇毒中提取的降纖酶(1g/L)與等體積的完全佐劑混合乳化后，給動(dòng)物免疫；然后用Koher方法取免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞，將所取的免疫動(dòng)物脾細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；將所得的細(xì)胞懸液與相同動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞按(8-15)∶1的比例混合，在30-80％聚乙二醇作用下融合得融合體；將融合體進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，首先篩出能分泌與預(yù)定抗原起反應(yīng)的單抗的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)而從中篩出有預(yù)定特異性的雜交瘤細(xì)胞，最終選出可供實(shí)際應(yīng)用且具有穩(wěn)定生長和功能特異的均一細(xì)胞克隆，以腹水法獲得單克隆抗體，純化后備用；2).降纖酶粗品的制備取蛇毒，將蛇毒經(jīng)離子交換層析法初步純化，得初步純化的降纖酶粗品，備用；3).抗體親和層析柱的制備3.1 取瓊脂糖作為親和層析的載體，用適量的溴化氰活化該載體，得活化的瓊脂糖；3.2 取已純化的單克隆抗體溶于硼酸緩沖液中，過濾后加入親和層析柱內(nèi)，然后加入活化的瓊脂糖，在5-20℃下攪拌反應(yīng)15-25小時(shí)，得具有特異親和能力的分離介質(zhì)；3.3 裝柱即得到抗體親和層析柱，備用；4).降纖酶的制備將經(jīng)離子交換層析法初步純化的降纖酶粗品逐漸加入到抗體親和層析柱中，待流出液在檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線后，改用親和層析洗脫液洗脫活性組分，收集洗脫峰，使被吸附的生物活性物質(zhì)從親和介質(zhì)上解吸下來，測(cè)定酶活性，冷凍干燥后即得純化的降纖酶成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取降纖酶的制備方法，其特征在于所述的裝柱包括下述步驟用10倍柱體積的pH10.2的硼酸緩沖液以5～6ml/min流速洗滌親和層析柱柱體，然后再依次用5倍柱體積的pH10.0、0.1mol/L的乙醇胺溶液及pH8.0、0.1mol/L的硼酸緩沖液充分洗滌，最后用pH7.4的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液平衡。
3.一種降纖酶水針制劑的制備方法，它包括下述步驟取純化的降纖酶，將其加入到適量的注射用水中溶解，得溶解液，在每1000ml溶解液中加入5-20g氯化鈉穩(wěn)定劑，分裝，即得降纖酶水針制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的降纖酶水針制劑的制備方法，其特征在于取純化的降纖酶5000u，將其加入到1000ml適量的注射用水中溶解，得溶解液，在每1000ml溶解液中加入9--15g氯化鈉穩(wěn)定劑，無菌分裝成1000支制劑，每支含量5u，即得降纖酶水針制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從蛇毒中提取降纖酶及降纖酶水針制劑的制備方法，從蛇毒中提取降纖酶的制備方法，它包括下述步驟單克隆抗體的制備；降纖酶粗品的制備；抗體親和層析柱的制備；降纖酶的制備；降纖酶水針制劑的制備方法，它包括下述步驟取純化的降纖酶，將其加入到適量的注射用水中溶解，得溶解液，在每1000ml溶解液中加入5－20g氯化鈉穩(wěn)定劑，分裝，即得降纖酶水針制劑。本發(fā)明降纖酶制備工藝簡單，適合規(guī)?；a(chǎn)，水針制劑穩(wěn)定性高，并可長期保存。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1597945SQ200410021558
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月27日
發(fā)明者王光, 馬骉, 李莉 申請(qǐng)人:沈陽斯佳科技發(fā)展有限公司