專利名稱：一種從蛇毒中提取單一成分降纖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從蛇毒中提取具有降纖溶栓作用的降纖酶的方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛇毒中含有豐富的蛋白水解酶，主要有兩類，一類是蛇毒類凝血酶，在體外引起血液的凝固，在體內(nèi)卻是去纖抗凝的成分；另一類是蛇毒纖溶酶，可直接降解血纖維，大部分也能降解纖維蛋白原。蛇毒類凝血酶是研究較早、并已在臨床上廣泛應(yīng)用的一類酶。
蛇毒類凝血酶作為藥物用于治療血栓性疾病已有30多年的歷史，在臨床上主要用于腦梗塞、血栓閉塞性脈管炎、股動脈栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病。
天然蛇毒中提取的類凝血酶絕大多數(shù)為酸性蛋白質(zhì)，多采用陰離子交換柱進(jìn)行分離，并結(jié)合凝膠過濾、親和層析和反相液相色譜等方法純化。常用的陰離子交換劑有DEAE-葡聚糖凝膠、DEAE-纖維素、肝素-葡聚糖凝膠等。但離子交換法特異性不高，產(chǎn)品純度低。而親和層析具有專一性高，操作簡便，工藝周期短，收率高，純度好等特點(diǎn)，對分離某些不穩(wěn)定的高分子物質(zhì)，更具優(yōu)越性。親和層析用于從天然蛇毒中分離純化類凝血酶，主要運(yùn)用的是酶與競爭劑特異性相互作用的原理。國內(nèi)外雖有利用胰蛋白酶的抑制劑苯甲脒作為類凝血酶的抑制劑，進(jìn)行親和分離蛇毒類凝血酶的報道，但其分離柱條件、分離過程以及工藝技術(shù)參數(shù)或無具體描述，或描述較籠統(tǒng)，因而無法實(shí)施，從而很難達(dá)到理想的分離制備要求，取得單一成份產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；纳a(chǎn)目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從蛇毒中提取具有降纖溶栓作用的降纖酶的方法。取得比活力較高的單一成分產(chǎn)品降纖酶，使降纖酶的生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?。
本發(fā)明的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，步驟包括(1)蛇毒用緩沖液浸泡、溶解過夜，離心去除沉淀，得上清液；(2)蛇毒上清液經(jīng)親和柱層析，上樣結(jié)束后，用pH8.5～9.5含2.0～2.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液I進(jìn)行洗脫，至核酸蛋白檢測儀讀數(shù)達(dá)到基線后，再用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL和0.1～0.2M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液II洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得降纖酶粗提液；(3)降纖酶粗提液直接流經(jīng)脫鹽柱，去除苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)；(4)去除苯甲脒酸鹽的降纖酶粗提液用聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮，得降纖酶粗提液的濃縮液；(5)降纖酶粗提液的濃縮液經(jīng)分子篩柱層析，即得單一組份降纖酶；
上述提取分離的全過程均在3～6℃的低溫層析冷柜或冷室中進(jìn)行。
上述步驟(1)中所述的緩沖液是pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液。
上述步驟(2)中所述親和柱是苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)或苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)親和柱；上述步驟(2)中在緩沖液II洗脫前還需用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行過渡洗脫。
上述步驟(3)中所述的脫鹽柱是葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱；上述步驟(2)中的親和層析柱和步驟(3)中的脫鹽柱在樣品洗脫過程中是串聯(lián)在一起的。
上述步驟(4)中PEG2000包埋濃縮前的降纖酶粗提液還需用超純水透析至少三次，以進(jìn)一步除去殘存的苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)。
上述步驟(5)中所述的分子篩是丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)或丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl S100)層析用分子篩。
上述步驟(5)中層析用的緩沖液為pH6.5～7.5含0.05～0.15M NaCL的Tris-HCL緩沖液。
本發(fā)明的方法是以苯甲脒為配基的瓊脂糖凝膠親和介質(zhì)聯(lián)合葡聚糖凝膠G25脫鹽、丙烯葡聚糖凝膠S200或丙烯葡聚糖凝膠S100分子篩層析進(jìn)行單一成份降纖酶的純化提取方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)良效果如下1.本發(fā)明工藝設(shè)計合理，親和層析介質(zhì)易得，可重復(fù)使用100次以上；2.操作過程簡單，分離周期短，分離效果好，樣品純度高；3.一次處理蛇毒量大，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明降纖酶提取方法與其它親和層析提取方法的比較如下

具體實(shí)施方式
實(shí)施例1從蛇毒中提取降纖酶的方法包括下述步驟
1、取白眉蝮蛇毒30g，溶于200ml pH8.6含0.2M NaCL的Tris-HCL緩沖液中，于4℃冰箱中浸泡溶解，過夜，8000rpm離心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH8.6含0.2M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積，將上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min，上樣結(jié)束后柱子用200ml緩沖液平衡；3、用pH8.6含2.0M NaCL的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行洗脫，至核酸蛋白檢測儀讀數(shù)達(dá)到基線，改用200ml pH8.6含0.2M NaCL的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行過渡洗脫；4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接，用pH8.6含0.2M NaCL和0.12M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得降纖酶粗提液；5、降纖酶粗提液用超純水透析三次后，經(jīng)PEG20000包埋、濃縮至約3ml，上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm)，用pH6.8含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得到單一成份的降纖酶。檢測純度為98％，比活力為2860U/mg蛋白。
實(shí)施例2從蛇毒中提取降纖酶的方法包括下述步驟1、取尖吻蝮蛇毒50g，溶于300ml pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液中，于4℃冰箱中浸泡溶解，過夜，8000rpm離心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積，將上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min，上樣結(jié)束后柱子用200ml緩沖液平衡；3、用pH9.0含2.25M NaCL的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行洗脫，至核酸蛋白檢測儀讀數(shù)達(dá)到基線，改用200ml pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行過渡洗脫；4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接，用pH9.0含0.1M NaCL和0.15M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得降纖酶粗提液；5、降纖酶粗提液用超純水透析三次后，經(jīng)PEG20000包埋、濃縮至約5ml，上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.2含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得到單一成份的降纖酶。檢測純度為96％，比活力為2960U/mg蛋白。
實(shí)施例3從蛇毒中提取降纖酶的方法包括下述步驟1、取白眉蝮蛇毒或尖吻蝮蛇毒50g，溶于300ml pH9.0含0.3M NaCL的Tris-HCL緩沖液中，于4℃冰箱中浸泡溶解，過夜，8000rpm離心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積，將上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min，上樣結(jié)束后柱子用200ml緩沖液平衡；3、用pH9.0含2.25M NaCL的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行洗脫，至核酸蛋白檢測儀讀數(shù)達(dá)到基線，改用200ml pH9.0含0.3M NaCL的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行過渡洗脫；4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接，用pH9.0含0.3M NaCL和0.15M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得降纖酶粗提液；5、降纖酶粗提液用超純水透析三次后，經(jīng)PEG20000包埋、濃縮至約5ml，上丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl 100)分子篩層析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.4含0.1MNaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得到單一成份的降纖酶。檢測純度為97％，比活力為2910U/mg蛋白。
權(quán)利要求
1.從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，步驟包括(1)蛇毒用緩沖液浸泡、溶解過夜，離心去除沉淀，得上清液；(2)蛇毒上清液經(jīng)親和柱層析，上樣結(jié)束后，用pH8.5～9.5含2.0～2.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液I進(jìn)行洗脫，至核酸蛋白檢測儀讀數(shù)達(dá)到基線后，再用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL和0.1～0.2M苯甲脒鹽酸鹽的Tris-HCL緩沖液II洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得降纖酶粗提液；(3)降纖酶粗提液直接流經(jīng)脫鹽柱，去除苯甲脒鹽酸鹽；(4)去除苯甲脒酸鹽的降纖酶粗提液用聚乙二醇20000包埋、濃縮，得降纖酶粗提液的濃縮液；(5)降纖酶粗提液的濃縮液經(jīng)分子篩柱層析，即得單一組份降纖酶；上述提取分離的全過程均在3～6℃的低溫層析冷柜或冷室中進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(1)中所述的緩沖液是pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中所述親和柱是苯甲脒瓊脂糖凝膠6B或苯甲脒瓊脂糖凝膠4B親和柱；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中在緩沖液II洗脫前還需用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行過渡洗脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(3)中所述的脫鹽柱是葡聚糖凝膠G25脫鹽柱；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中的親和層析柱和步驟(3)中的脫鹽柱在樣品洗脫過程中是串聯(lián)在一起的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述(4)中聚乙二醇20000包埋濃縮前的降纖酶粗提液還需用超純水透析至少三次，以進(jìn)一步除去殘存的苯甲脒鹽酸鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(5)中所述的分子篩是丙烯葡聚糖凝膠S200或丙烯葡聚糖凝膠S100層析用分子篩。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(5)中層析用的緩沖液為pH6.5～7.5含0.05～0.15M NaCL的Tris-HCL緩沖液。
全文摘要
一種從蛇毒中提取具有降纖溶栓作用的降纖酶的方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。步驟包括如下蛇毒經(jīng)浸泡溶解、離心；上清液經(jīng)親和柱層析；洗脫液直接流經(jīng)葡聚糖凝膠G25脫鹽層析；含有效成分的洗脫液經(jīng)包埋、濃縮；濃縮樣品再經(jīng)分子篩層析，即可得到單一成分的降纖酶。本方法具有適合規(guī)?；a(chǎn)、操作簡便、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品純度高等特點(diǎn)。
文檔編號C12N9/68GK1807613SQ20061004204
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月18日
發(fā)明者王晶翼, 劉祿娟, 張潤平, 張明會, 于萍 申請人:齊魯制藥有限公司