專利名稱：物理改性后的眼鏡蛇蛇毒在制備治療免疫衰老和相關疾病藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物新用途技術領域，具體涉及一種物理改性后的眼鏡蛇蛇毒在制備治療免疫衰老和相關疾病藥物中的用途。
背景技術：
蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多種組分構成的復雜混合物。新鮮毒液呈蛋清樣粘稠液體，具有特殊的腥味。不同蛇種毒液色澤各異，中華眼鏡蛇蛇毒呈淡黃色。蛇毒的干物質(zhì)中90%以上是蛋白質(zhì)，是其毒性和其生物學活性的主要成分。中華眼鏡蛇蛇毒成分主要有眼鏡蛇蛇毒因子(I%-2%)、心臟毒素(又名細胞毒素40%-50%)、神經(jīng)毒素(10%)等其它類蛋白質(zhì)。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學認為眼鏡蛇及其毒性成分可通經(jīng)絡，祛風濕，并具有強身健體之功效。早在二十世紀初，人們就開始應用蛇毒來緩解惡性腫瘤疼痛、神經(jīng)痛和關節(jié)痛，隨后出現(xiàn)一系列關于蛇毒有類似嗎啡樣鎮(zhèn)痛作用的報道。隨著研究的不斷深入，現(xiàn)在，蛇毒及其制品已應用于臨床，除了鎮(zhèn)痛作用外，研究發(fā)現(xiàn)在抗風濕、抗腫瘤以及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面都有很好的療效。近年來又先后發(fā)現(xiàn)了蛇毒可以影響實驗動物的免疫功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種眼鏡蛇蛇毒在制備治療免疫衰老和相關疾病藥物中的應用，提供了一種治療因免疫衰老所引起的多器官組織損害性病變的新思路、新方法。為了解決現(xiàn)有技術中的這些問題，本發(fā)明提供的技術方案是一種眼鏡蛇蛇毒在制備治療免疫衰老和免疫衰老相關疾病藥物中的應用。優(yōu)選的，所述物理改性后的眼鏡蛇蛇毒是將天然眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性得到的，加熱變性時控制加熱溫度在100±5°C，加熱時間為5min lOmin。優(yōu)選的，所述天然眼鏡蛇蛇毒選自中華眼鏡蛇蛇毒或泰國眼鏡蛇蛇毒。優(yōu)選的，所述免疫衰老和相關疾病包括具有炎性病變或器官組織結構損傷的疾病。優(yōu)選的，所述物理改性后的眼鏡蛇蛇毒的給藥劑型選自口腔速溶藥膜、口服液、膠囊、涂劑、巴布劑、噴霧劑和注射劑。優(yōu)選的，所述藥物為物理改性后的眼鏡蛇蛇毒與其他藥物活性成分組成的復方制劑或物理改性后的眼鏡蛇蛇毒與藥用輔料形成的單方制劑。優(yōu)選的，所述復方制劑為物理改性后的眼鏡蛇蛇毒、未經(jīng)改性的天然眼鏡蛇毒與藥用輔料混合形成。本發(fā)明目的是提供改性中華眼鏡蛇蛇毒在制備治療免疫衰老引起或相關的以多器官組織炎性病變和結構損傷為主要病變特征的疾病藥物中的用途。本發(fā)明技術方案中天然眼鏡蛇蛇毒物理改性方法是將眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性，加熱溫度在100°C左右，加熱時間為5min IOmin后得到的。本發(fā)明中天然眼鏡蛇蛇毒為眼鏡蛇 總毒，將其物理改性后可用于制備治療與免疫衰老相關與以多器官組織炎性病變和結構損傷為主要病征疾病的藥物。優(yōu)選的，所述的眼鏡蛇蛇毒為中華眼鏡蛇總蛇毒。根據(jù)成份和藥效的相同性，所述天然眼鏡蛇蛇毒可以是泰國眼鏡蛇蛇毒和其它眼鏡蛇蛇毒。本發(fā)明經(jīng)動物實驗證實物理改性后的中華眼鏡蛇總毒在藥學上有效量(如小鼠10-3000 μ g/kg)范圍內(nèi)能有效減輕因免疫衰老與相關疾病中全身多種器官組織病變，具體作用包括減輕免疫器官脾臟、淋巴、胸腺的衰退、細胞損傷和結構異常，還能減輕心肌、肝臟，肺臟、腎臟及皮膚炎性病變和結構損傷，光鏡下可見正常衰老對象的器官組織內(nèi)部有結構異常，細胞破損、變性甚至死亡等病態(tài)表現(xiàn)，而經(jīng)物理改性后的中華眼鏡蛇總毒治療后上述表現(xiàn)皆有不同程度改善。從上可知，物理改性后的中華眼鏡蛇總毒治療不僅不影響衰老機體正常的生化功能而且可使異常生化功能轉向正常發(fā)展，而且能改善衰老相關的學習記憶能力下降，耐力素質(zhì)降低等現(xiàn)象，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透過口鼻粘膜和皮膚給藥等優(yōu)點。本發(fā)明通過中華眼鏡蛇總毒經(jīng)物理方法處理達到減毒增效目的，物理處理后的眼鏡蛇毒能夠治療免疫衰老相關的心肌和肝臟，肺臟、脾臟、淋巴、胸腺、腎臟及皮膚炎性病變和損傷，其療效超過未經(jīng)處理的眼鏡蛇毒或純化的神經(jīng)毒素(Cobratoxin)。所述藥物包括口服液、口腔速溶藥膜、膠囊、涂劑、巴布劑、噴霧劑和注射劑等，所述藥物還包括各種單方和復方制劑。中華眼鏡蛇蛇毒在臨床上已用于治療風濕和緩解惡性腫瘤疼痛、神經(jīng)痛和關節(jié)痛等，但都用純化的神經(jīng)毒素、多種蛇毒的混合制劑或眼鏡蛇毒和其它中藥的復方制劑。鑒于中華眼鏡蛇毒毒性比較大，蛇毒中的藥用成分主要是蛋白質(zhì)，其結構和生物活性可以被理化因素改變。蛇毒在用過氧化氫處理后，二硫鍵被打開，其毒性大大降低，但是鎮(zhèn)痛作用也幾乎消失，提示生物學活性被破壞。而蛋白質(zhì)加熱后可發(fā)生可逆性變性，變性后空間結構發(fā)生了改變，或部分大分子蛋白質(zhì)因加熱部分分解為小分子量蛋白質(zhì)。小鼠試驗證明這種加熱變性之后的蛇毒毒性明顯減少，而藥效增加。

經(jīng)長期研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)加熱變性的中華眼鏡蛇蛇毒能有效減輕因免疫衰老引起的全身多種器官組織病變，具體作用包括減輕心肌和肝臟，肺臟、脾臟、淋巴、胸腺、腎臟及皮膚炎性病變和結構損傷，光鏡下可見正常衰老對象的器官組織內(nèi)部有結構異常，細胞破損、變性甚至死亡等病態(tài)表現(xiàn)，而經(jīng)蛇毒治療后上述表現(xiàn)皆有不同程度改善。提示對免疫衰老相關的感染性疾病以及所伴有的器官組織損傷有很好的治療作用。這一發(fā)現(xiàn)，將對免疫衰老和相關疾病的研究和藥物開發(fā)產(chǎn)生重大的影響，并有臨床實用價值，為中華眼鏡蛇蛇毒開辟臨床新的用途。所述的眼鏡蛇總毒是在用去離子水溶解的情況下，加熱溫度為100°C左右(100±5°C)，時間在5min IOmin后得到的。相對于現(xiàn)有技術中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點是采用經(jīng)物理改性的中華眼鏡蛇總毒，毒性低而藥效高。中華眼鏡蛇蛇毒能減輕免疫衰老和相關疾病中多器官組織炎性病變程度，并且最終使其轉向正常水平發(fā)展。炎性病變多發(fā)在肝臟、肺臟、腎臟，而且很顯然中華眼鏡蛇毒能夠減輕肝臟、肺臟、腎臟的炎性病變程度，并使之向正常結構恢復。中華眼鏡蛇蛇毒不僅能減輕免疫衰老和相關疾病中多器官組織結構損傷并能逐漸恢復其正常結構和功能。具體作用包括減輕脾臟、淋巴、胸腺、心肌、肝臟，肺臟、腎臟及皮膚的結構損傷以及恢復以上器官組織正常的結構與功能。中華眼鏡蛇蛇毒能減緩免疫衰老和相關疾病中多器官組織的異常臟器體重變化。間接反應減輕器官組織損傷程度甚至可能使其恢復至正常結構。中華眼鏡蛇蛇毒不僅對免疫衰老和相關疾病原有的仍正常生理生化功能無影響，甚至能夠使免疫衰老致多器官組織異常生理生化功能向正常水平發(fā)展恢復。中華眼鏡蛇蛇毒能夠使免疫衰老相關的下降的學習記憶功能呈現(xiàn)不同程度的上升趨勢。中華眼鏡蛇蛇毒能夠使免疫衰老相關的減弱的抗疲勞能力既耐力素質(zhì)呈現(xiàn)不同程度增強趨勢。中華眼鏡蛇蛇毒不僅能夠使免疫衰老和相關疾病中皮膚毛發(fā)異?；謴偷秸Ｋ剑踔聊軆?yōu)越于正常水平。即毛發(fā)生長的濃密黑亮等程度皆顯著優(yōu)于正常毛發(fā)水平。中華眼鏡蛇蛇毒用量少，從10 3000 μ g/kg都有很好的治療免疫衰老和相關疾病的作用，經(jīng)換算人用劑量約為I 1000 μ g/kg。本發(fā)明公開了中華眼鏡蛇蛇毒在制備治療免疫衰老和相關疾病藥物中的用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)改性中華眼鏡蛇總毒在(10-3000 μ g/kg)范圍內(nèi)能有效減輕與免疫衰老相關的全身多種器官組織病變，具體作用包括減輕心肌和肝臟，肺臟、脾臟、淋巴、胸腺、腎臟及皮膚炎性病變和結構損傷，光鏡下可見正 常衰老對象的器官組織內(nèi)部有結構異常，細胞破損、變性甚至死亡等病態(tài)表現(xiàn)，而經(jīng)蛇毒治療后上述表現(xiàn)皆有不同程度改善。蛇毒治療不僅不影響衰老機體正常的生化功能而且可使異常生化功能轉向正常發(fā)展。改善免疫衰老相關的學習記憶能力下降，耐力素質(zhì)降低等現(xiàn)象。具有用量小、安全、可口服、可注射、可透過口鼻粘膜和皮膚給藥等優(yōu)點。


下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述圖1為中華眼鏡蛇蛇毒對免疫衰老和相關疾病中的腎，肺及肝炎的影響(病理)；圖2為中華眼鏡蛇蛇毒對免疫衰老和相關疾病中多器官組織結構損傷的影響(病理)；圖3為中華眼鏡蛇蛇毒對免疫衰老和相關疾病中多器官異常臟器系數(shù)的影響；圖4為中華眼鏡蛇蛇毒對免疫衰老和相關疾病中生化指標檢測的影響；圖5為中華眼鏡蛇蛇毒對免疫衰老和相關疾病中血常規(guī)影響；圖6為中華眼鏡蛇蛇毒對免疫衰老相關的下降的的學習記憶能力影響(Y迷宮)；圖7為中華眼鏡蛇蛇毒對免疫衰老相關下降的耐力素質(zhì)的影響(小鼠轉輪式疲勞儀)。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體實驗的條件做進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。實施例物理處理后的中華眼鏡蛇毒的動物藥效學實驗將C57BL/6小鼠(n=45)，雌性，體重16_18g，隨機分為3組(每組15只)生理鹽水對照組，中華眼鏡蛇蛇毒加熱(30 μ g/kg)，中華眼鏡蛇蛇毒加熱(100 μ g/kg)。灌胃給藥為期一年，給藥劑量在10-3000 μ g/kg, 一天一次。中華眼鏡蛇蛇毒為2011年購買自中國江西省鷹潭市余江縣彩虹養(yǎng)蛇場。將天然眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性得到的，力口熱變性時控制加熱溫度在100±5°C，加熱時間為5min IOmin得到物理改性后的中華眼鏡
蛇蛇毒。正常C57BL/6小鼠體內(nèi)I gG在20月齡前緩慢增加，IgG2b為高值，IgGl為低值。隨著C57BL/6小鼠年齡的增長，機體隨增齡而老化，器官功能衰退，免疫功能異常，疾病的發(fā)生機會增多。實驗結果如下圖1為中華眼鏡蛇蛇毒對該鼠的腎，肺及肝炎的影響(X 400 )。首先可見正常衰老鼠的腎臟，肺臟和肝臟都發(fā)生了較嚴重的炎癥，相同點是大量淋巴細胞浸潤主要在三個臟器的血管周圍，有部分正常衰老鼠還可以看到其腎臟內(nèi)血管腫脹，變形，周圍有組織細胞損傷，壞死。肺和肝也都是發(fā)生了血管極其周圍炎性浸潤且為彌漫性，且圍繞血管一圈附近有組織細胞損傷，壞死，胞核消失，有細胞碎片。而給藥之后的三種臟器卻只有輕微局部炎癥甚至無炎癥發(fā)生。具體的，圖1A中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)存在嚴重的腎臟內(nèi)血管及其周圍炎癥，腎小球數(shù)量嚴重減少；圖1B中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠則基本無炎癥反應，但腎小球數(shù)量偏少；圖1C中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠同樣基本無炎癥反應，腎小球數(shù)量基本正常；圖1D中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)不僅可見嚴重的肺臟炎癥，還有血管和肺泡結構破壞，肺泡壁和肺泡間隔增厚；圖1E中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠則基本無肺內(nèi)炎癥反應；圖1F中用蛇毒(100μ g/kg)灌胃小鼠同樣基本無炎癥反應，偶有輕度肺泡間隔充血；圖1G中正常衰老C57BL/6小鼠( 對照)可見嚴重的血管極其周圍炎癥，肝門靜脈於血，肝細胞結構損壞甚至死亡等；圖1H中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠基本無肝內(nèi)炎癥反應，輕度肝細胞變性或損壞；圖1I中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠同樣基本無肝臟炎癥反應。圖2為八種臟器病理圖(X400)。首先看心臟病理結果圖，正常對照的心肌纖維由于斷裂，消失，出現(xiàn)了大量心肌纖維裂隙而且裂隙顯著大于任一給藥組(無或只出現(xiàn)少量心肌纖維裂隙)，甚至蛇毒組(100 μ g/kg)已基本恢復至正常心肌。對照組的心肌纖維中大面積出現(xiàn)了淡灰色異物組織，有的甚至出現(xiàn)在心外膜間隙，使心外膜增厚。再看肺臟病理結果，該肺臟除血管壁極其周圍炎性浸潤，周圍組織細胞壞死外，還可見肺泡壁和肺間隔增厚，影響到肺泡功能，表現(xiàn)為機體呼吸功能障礙。同樣蛇毒給藥組的心臟和肺臟病理形態(tài)表現(xiàn)都大大優(yōu)于對照組，其中的較大劑量組更佳，接近于正常組織。圖2A中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)可見心肌纖維出現(xiàn)較大裂隙；圖2B中用蛇毒(30 μ g/kg)灌胃小鼠心肌纖維裂隙減少，基本趨向于正常；圖2C中用蛇毒(100μ g/kg)灌胃小鼠心肌纖維裂隙更少，結構基本正常；圖2D中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)存在嚴重的肺臟炎癥反應，肺泡壁和肺泡間隔增厚，且有間隔充血水腫；圖2E中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠肺泡極其周圍結構基本正常，偶有局部輕度肺淤血；圖2F中用蛇毒(100g/kg)灌胃小鼠肺臟結構基本正常。圖2G氣中的肝臟病理結果顯示，對照的肝有較嚴重的病態(tài)病理表現(xiàn)(X400)。圖中可見肝臟除炎癥外肝門靜脈周圍的肝細胞多數(shù)已變性，損傷甚至死亡，光鏡下可見細胞核固縮有的甚至消失，胞質(zhì)腫脹，已無正常結構。脾臟和淋巴與胸腺病理結果也表明，正常對照鼠的免疫器官都發(fā)生了嚴重的病變，首先是脾臟的紅髓和白髓界限已不清楚，而且脾臟被膜下周圍一圈白髓內(nèi)的淋巴細胞絕大多數(shù)發(fā)生了變性，壞死，胞核變小甚至消失，有很多細胞碎片存在，明顯出現(xiàn)大量巨噬細胞。圖2G中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)肝臟血管極其周圍炎癥而且有肝細胞空泡狀脂肪變性，損壞甚至死亡；圖2H中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠肝臟細胞腫脹現(xiàn)象有所改善，呈現(xiàn)較多肝細胞，胞核比對照有增大，肝血竇等結構也基本正常；圖21中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠肝臟結構基本正常；圖2J中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)被膜結構損壞，白髓內(nèi)淋巴細胞大量死亡，巨噬細胞大量存在吞噬死亡細胞，紅髓白髓界限模糊，脾臟正常結構消失；圖2K中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠脾臟結構基本正常，出現(xiàn)了動脈周圍淋巴鞘；圖2L中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠脾臟結構基本正常，出現(xiàn)了生發(fā)中心，紅髓白髓界限清晰。同時圖2Μ 的淋巴結和胸腺病理結果(X400)表明，正常衰老鼠的淋巴結皮質(zhì)和髓質(zhì)界限不清，被膜變薄甚至結構破壞，小梁，淋巴竇等結構近乎消失，甚至被膜下附近一圈淋巴細胞多數(shù)變性，損傷甚至壞死，細胞體積增大，胞核變小甚至消失，有細胞碎片大量存在及吞噬細胞碎片的巨噬細胞數(shù)量異常增加。本實驗中正常衰老小鼠的胸腺內(nèi)皮質(zhì)增力口，髓質(zhì)萎縮，幾乎無髓質(zhì)。圖2Μ中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)淋巴結被膜結構破壞，小梁及淋巴竇結構消失，皮質(zhì)髓質(zhì)界限不清，且皮質(zhì)內(nèi)大量淋巴細胞死亡，結構破壞，大量巨噬細胞出現(xiàn)吞噬死亡細胞；圖2Ν中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠淋巴結結構基本正常，皮質(zhì)髓質(zhì)界限清晰，小梁，淋巴竇結構出現(xiàn)；圖20中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠淋巴結皮質(zhì)髓質(zhì)界限清晰，有小梁，淋巴竇等結構；圖2P中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)胸腺皮質(zhì)內(nèi)淋巴細胞過度增生；圖2Q中用蛇毒(30 μ g/kg)灌胃小鼠胸腺皮質(zhì)內(nèi)淋巴細胞過度增生現(xiàn)象有所改善，髓質(zhì)面積開始擴大；圖2R中用蛇毒(100μ g/kg)灌胃小鼠的胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)結構基本正常。最后觀察圖2S Z中腎臟和皮膚病理結果(X400)。從腎臟病理可看出正常衰老鼠的腎臟結構嚴重破壞。腎小球數(shù)量急劇減少，視野內(nèi)只有少數(shù)腎小球，腎小球體積異常，結構破壞，提示有大量腎小球在處死前期已損傷，變性甚至消失。腎小管結構異常，管壁增厚，管腔狹窄，管壁細胞胞核固縮，胞體色淡，有變性甚至死亡現(xiàn)象(細胞碎片出現(xiàn))，而給藥組則呈劑量依賴性的表現(xiàn)出較好的腎臟結構。主要可觀察到腎臟的腎小球數(shù)量和大小逐漸向正常水平恢復甚至有多數(shù)結構已`基本正常；腎小管，血管等極其周圍也無炎癥發(fā)生且結構正常。重點是皮膚病理結果，實驗中發(fā)現(xiàn)正常衰老對象的皮膚內(nèi)毛囊與皮脂腺等結構皆異常。圖中對照鼠皮膚的毛囊周圍腺泡內(nèi)的細胞胞體極大，胞核固縮，有的甚至沒有胞核，全部為胞質(zhì)(大量小脂滴)。正常情況下，腺細胞體積小，數(shù)量多，只有少數(shù)屬成熟期(漸變大最終裂解釋放皮脂)，給藥組的毛囊結構較為正常，附屬皮脂腺，腺泡少，其內(nèi)變大成熟的腺細胞亦少，甚至沒有。而對照小鼠毛囊附屬腺泡不僅數(shù)量多且有大量成熟的腺細胞；同時皮脂分泌過旺，其內(nèi)有些成分對皮膚的毒性作用過強等，導致最終的中毒、枯萎、脫落。特別的是相比于對照鼠，給藥鼠皮膚組織成分少皮層薄，此屬老齡化正常病理表現(xiàn)。對照皮膚內(nèi)因大量腺泡，腺細胞的存在成為主體結構，以致視野內(nèi)盡是皮脂腺，脂肪細胞相比之下則因占有面積不多而不易在同一視野內(nèi)觀察到，甚至因很難觀察到而被忽略。圖2S中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)腎小球數(shù)量嚴重減少，腎小管結構異常，管壁增厚，管腔狹窄，管壁細胞有變性死亡現(xiàn)象；圖2T中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)存在嚴重的炎癥反應，腎小球和腎小管結構嚴重破壞，腎間質(zhì)充血；圖2U中用蛇毒(30 μ g/kg)灌胃小鼠腎小球略有增大但結構基本正常，腎小管管壁輕度增厚，絕多數(shù)腎小管管壁細胞狀態(tài)良好；圖2V中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠的腎小球和腎小管結構基本正常；圖2W中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)毛囊周圍皮脂腺過度增生；圖2X中正常衰老C57BL/6小鼠(對照)毛囊周圍皮脂腺過度增生壓迫毛囊，毛囊結構異常；圖Ti中用蛇毒(30 μ g/kg)灌胃小鼠毛囊結構基本正常，只是總體皮層較?。粓D22中用蛇毒(100μ g/kg)灌胃小鼠毛囊結構基本正常，皮層同樣較薄。圖3為中華眼鏡蛇蛇毒對免疫衰老相關的器官臟器指數(shù)的影響。因胸腺皮質(zhì)適應性增生所以胸腺質(zhì)量在正常衰老小鼠內(nèi)是增加的，但是經(jīng)蛇毒治療的小鼠其心肌，肝臟，脾臟，淋巴結，肺臟，腎臟，腦等器官的損傷都減輕或恢復至正常水平，沒有細胞的壞死或結構的損傷和或消失所以這些臟器的體重是相對大于正常衰老對照鼠，只有胸腺因適應性增生，經(jīng)治療后恢復至正常的結構，即皮質(zhì)髓質(zhì)界限分明，被膜，胸腺小體等結構都出現(xiàn)，皮質(zhì)不再異常增生，故胸腺臟器指數(shù)是下降的。圖3中A，B，C，D，E，F(xiàn)，G圖中，*表示與對照組(正常衰老C57BL/6組)比較，p〈0. 05，μ表示與對照組比較，p〈0. 01，表示與對照組比較，ρ〈0· 001。在給予中華眼鏡蛇蛇毒約Ilw時，各組小鼠之間皮膚毛發(fā)開始出現(xiàn)明顯差異。對照組毛發(fā)變稀，在頭面部、肩胛間、背部發(fā)現(xiàn)有脫毛現(xiàn)象，皮膚松弛，肌肉較無力，隨增齡而加重；相比之下，給蛇毒治療的兩組的黑色毛發(fā)依然狀態(tài)良好，甚至比該鼠原先的黑色更有光澤，皮膚彈性也是明顯優(yōu)于正常衰老對照組。接著在給藥19w時，正常衰老對象其脫毛現(xiàn)象愈加嚴重，脫毛部位面積顯著增加，但各個脫毛部位始終獨立存在并未有連接現(xiàn)象，既中間仍然有正常皮膚毛發(fā)；同時兩組蛇毒給藥組間也出現(xiàn)了差異，蛇毒(30μ g/kg)組雖然皮膚毛發(fā)總體評估仍優(yōu)于對照組但有少數(shù)動物開始出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象；蛇毒(100 μ g/kg)組則非常好的保持著其黑亮濃密的毛發(fā)健康生長，未見一例有脫毛等任意病態(tài)表現(xiàn)。隨著蛇毒的繼續(xù)給予，在給藥34周時，蛇毒的兩個治療組間情況又再次出現(xiàn)了反轉。首先，作為對照的正常衰老對象原先脫毛部位不再有擴大，既不再脫毛當然也并無毛發(fā)再生現(xiàn)象，該鼠在此時的特征表現(xiàn)是毛發(fā)顏色開始變化，出現(xiàn)大量灰白色糠秕狀鱗屑一類似頭皮屑，在全身皮膚上散在存在，尤其在脫毛區(qū)域更為集中存在，毛發(fā)干燥。同時小鼠體重較給藥組偏小顯著，瘦弱，活動量少，肌肉無力等。而兩組給藥組在這些方面比對照有明顯優(yōu)勢，總體顯得年輕活躍。重點是兩組間的脫毛現(xiàn)象在此時出現(xiàn)了反轉。小劑量蛇毒給藥組在此階段已基本恢復原先的正常毛發(fā)狀態(tài)，且毛發(fā)顏色黑亮，目測似乎比之前更濃密，活動也良好；只有個別未完全恢復，但其脫毛部位范圍明顯在縮小，表面呈黑點狀(新生毛發(fā)初始狀態(tài))，也就是該組小鼠的脫毛狀態(tài)經(jīng)蛇毒治療后已經(jīng)得到了很好的改善，基本恢復健康皮膚毛發(fā)和精神狀態(tài)。而大劑量組卻少數(shù)開始出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，但是毛發(fā)上不存在白色鱗屑，日后更發(fā)現(xiàn)有明顯的脫毛部位炎癥反應。該組狀態(tài)較小劑量組差，但仍優(yōu)于正常衰老對照，至少其毛發(fā)顏色黑亮，活動正常。在給藥12個月后處死小鼠，摘眼球取血，室溫靜置數(shù)小時，待看到EP管界面有明顯分層即有少量血清自然析出后，將血清在4°C，4000r/mi η離心10分鐘，將分離所得血清送醫(yī)院作血液生化和血常規(guī)檢查，所得結果見圖4及圖5。在圖4與圖5的各個復圖中，*表示與對照組(正常衰老C57BL/6組)比較，ρ〈0· 05, **表示與對照組比較，ρ〈0· 01, ***表示與對照組比較，Ρ〈0. 001。圖4為中華眼鏡蛇蛇毒對免 疫衰老和相關疾病中生化指標檢測的影響，由圖中可以看出中華眼鏡蛇蛇毒不僅對免疫衰老相關的正常生化功能無顯著影響(主要包括ALT、AST，血清鈉等)，甚至能夠使免疫衰老所致多器官組織異常生化功能(主要是白蛋白、球蛋白、A/G、血肌酐、血尿素氮，血鉀等)向正常水平發(fā)展恢復。因該正常衰老小鼠易產(chǎn)生免疫耐受，血清免疫球蛋白產(chǎn)量低，即球蛋白總量低，經(jīng)蛇毒治療后可使球蛋白總量增加，白蛋白下降，這也提示了蛇毒的確可能通過增加免疫球蛋白的量來達到治療作用，既解除該機體免疫耐受作用，逐漸恢復正常免疫應答，從而有球蛋白增加的生化結果，與前后推斷相呼應。圖5為中華眼鏡蛇蛇毒對免疫衰老與相關疾病中的血常規(guī)的影響。實驗中正常衰老對象白細胞計數(shù)偏低，其中尤以淋巴細胞計數(shù)偏低為主要原因，這與免疫衰老導致免疫功能缺陷緊密相關，經(jīng)過蛇毒治療后，這兩項指標逐漸向正?；謴停孕┝可叨局委煹玫降男Ч鼮轱@著,見圖5中的A和B。各組小鼠的日常活動的敏捷性，活躍度等及身體健康狀況也有明顯不同。給藥組在鼠籠內(nèi)活動頻繁而對照組相對較安靜；對照鼠在氣候變化(特別是潮濕陰冷天氣)時易得感冒，而給藥組身體素質(zhì)相對較好。試驗采用了 Y迷宮實驗來研究各組小鼠間的空間識別記憶能力差異。用小鼠轉輪式疲勞儀研究各組小鼠間抗疲勞即耐力素質(zhì)水平的差異。圖6為中華眼鏡蛇蛇毒對免疫衰老相關的下降的學習記憶能力的影響。本實驗中采用的是Y迷宮電刺激測試。具體方法每只小鼠先在迷宮中適應3-5min，然后開始正式實驗。每次電擊延時為3-5s，一般5s，直到小鼠的訓練過程中連續(xù)9次正確反應即為學會。在實驗前三天，每天訓練每只小鼠20次，即固定訓練次數(shù)法，記錄小鼠每天的正確次數(shù)，正確次數(shù)越多，說明學習能力越強。約3-4天絕大多數(shù)小鼠可達到學會標準，可淘汰個別過度活躍或過度遲鈍的類型。前期學習過程可根據(jù)各組小鼠學習天數(shù)或每日正確反應率統(tǒng)計后進行初步評價，結果見圖6 (A與B).接著進行記憶保持能力的檢測，以正確反應次數(shù)占總檢測次數(shù)的百分比表示記憶保持能力(正確反應的次數(shù)/總檢測次數(shù)X 100%)，此值越高說明記憶力越好。檢測時間點分別是在學習階段之后的連續(xù)三天，第一周，第三周，第九周。結果見圖6 (C與D)。由圖6 我們可得到如下結論用蛇毒治療的兩組小鼠的學習記憶能力皆顯著優(yōu)于正常衰老對照鼠，具體表現(xiàn)為蛇毒治療組學習的前三天的每日錯誤次數(shù)較少，正確反應率較高(相比于正常衰老對象)，而且差異顯著。三組小鼠在學習的第四日統(tǒng)一達到了學會標準，故此，從此日開始進行了記憶保持能力檢測實驗。得到的結果仍是蛇毒治療組的記憶保持能力要顯著高于正常衰老對照組，可從圖中的每日錯誤次數(shù)和正確反應率得到該結論。圖6在A，B，C，D四圖中，*表示與對照組(正常衰老C57BL/6組)比較，ρ〈0· 05, **表示與對照組比較，ρ〈0· 01,林*表示與對照組比較，ρ〈0· 001。圖7為中華眼鏡蛇蛇毒對運動耐力下降的影響。實驗中采用的儀器是YLS-10B小鼠轉輪式疲勞儀。實驗如下將實驗時間恒定在較統(tǒng)一的時間段下午一點到三點，前后都不可進行實驗。一天可進行兩次實驗。每次在各組隨機選取5只小鼠進通道奔跑，三組共15只小鼠，同時，各小鼠奔跑的通道也是隨機選擇的，以避免通道差異可能會產(chǎn)生的一些干擾作用。第一輪結束后擦洗儀器，待儀器干凈干燥后可對各組余下的共15只小鼠進行實驗。結束后如需重復實驗，則設定在最近一次實驗結束的第三天之后，由圖7我們得到結論給予蛇毒治療后，該小鼠的抗疲勞能力即耐力素質(zhì)顯著高于正常衰老對照組，不論是進行了總測試時間是35. 5分鐘或是60分鐘，蛇毒的兩個治療組小鼠的平均奔跑時間和奔跑距離都多于對照組，且差異顯著。圖7Α，B中，*表示與對照組(正常衰老C57BL/6組)比較ρ〈0. 05，#表示與對照組比較，p〈0. 01,***表示與對照組比較，ρ〈0. 001。各組C57BL/6鼠進行Y迷宮和小鼠轉輪式疲勞儀實驗時，已發(fā)生了不同程度的脂溢性脫毛。本實驗綜合多器官組織病理學觀察結果及器官重量，生化指標，以及學習記憶能力和運動耐力測試，得出如下結論眼鏡蛇蛇毒能夠有效減輕因免疫衰老與相關疾病的全身多種器官組織病變，具體作用包括減輕脾臟、淋巴和胸腺這些免疫器官的衰老性結構改變，還能改善心肌、肝臟，肺臟、腎臟及皮膚炎性病變和結構損傷。蛇毒治療能升高白細胞和淋巴細胞計數(shù)，降低白球比例。改善學習記憶和提高運動耐受能力。由此可以認為蛇毒通過減輕機體免疫衰老程度而最終起到了一定抗炎和減緩機體衰老的作用。綜上所述，經(jīng)試驗證實，物理改性后的中華眼鏡蛇毒口服給藥能減輕免疫衰老和相關疾病中多器官組織炎性病變程度，且最終使其向正常水平恢復。物理改性后的中華眼鏡蛇蛇毒口服給藥能減輕免疫衰老和相關疾病中的多器官組織結構損傷并逐漸恢復其正常結構和功能。具體作用包括減輕脾臟、淋巴、胸腺，以及心肌、肝臟，肺臟、腎臟和皮膚的結構損傷以及恢復以上器官組織正常的結構與功能。因炎性病變多發(fā)在肝臟、肺臟、腎臟，所以較明顯的是中華眼鏡蛇毒能夠減輕肝臟、肺臟、腎臟的炎性病變程度。物理改性后的中華眼鏡蛇蛇毒口服給藥能減緩免疫衰老和相關疾病中多器官組織的異常臟器系數(shù)變化。間接反應減輕器官組織損傷程度。物理改性后的中華眼鏡蛇蛇毒口服給藥不僅對免疫衰老和相關疾病中的正常血液生化功能無影響，甚至能使器官組織異常血液生化功能向正常水平發(fā)展恢復。物理改性后的中華眼鏡蛇蛇毒口服給藥能使衰老相關的下降的學習記憶功能不同程度地恢復到正常水平。物理改性后的中華眼鏡蛇蛇毒口服給藥能使衰老相關的降低的耐力水平不同程度地恢復到正常水平。物理改性后的中華眼鏡蛇蛇毒口服給藥不僅能夠使衰老相關疾病中異常皮膚毛發(fā)恢復到正常水平，甚至能優(yōu)越于正常水平。即毛發(fā)生長的濃密黑亮等程度皆顯著優(yōu)于正常毛發(fā)水平。上述實例只為說明本發(fā)明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾， 都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種物理改性后的眼鏡蛇蛇毒在制備治療免疫衰老和免疫衰老相關疾病藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述物理改性后的眼鏡蛇蛇毒是將天然眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性得到的，加熱變性時控制加熱溫度在100±5°C，加熱時間為5min IOmin。
3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述天然眼鏡蛇蛇毒選自中華眼鏡蛇蛇毒或泰國眼鏡蛇蛇毒。
4.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述免疫衰老相關疾病包括具有炎性病變或器官組織結構損傷的疾病。
5.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述物理改性后的眼鏡蛇蛇毒的給藥劑型選自口腔速溶藥膜、口服液、膠囊、涂劑、巴布劑、噴霧劑和注射劑。
6.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物為物理改性后的眼鏡蛇蛇毒與其他藥物活性成分組成的復方制劑或物理改性后的眼鏡蛇蛇毒與藥用輔料形成的單方制劑。
7.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述復方制劑為物理改性后的眼鏡蛇蛇毒、未經(jīng)改性的天然眼鏡蛇毒與藥用輔料混合形成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種眼鏡蛇蛇毒在制備治療免疫衰老和相關疾病藥物中的應用。本發(fā)明經(jīng)動物實驗證實物理改性后的中華眼鏡蛇總毒在(10-3000μg/kg)范圍內(nèi)能有效減輕因免疫衰老引起的全身多種器官組織病變，具體作用包括減輕心肌、肝臟、肺臟、脾臟、淋巴、胸腺、腎臟及皮膚炎性病變和結構損傷，光鏡下可見正常衰老小鼠的免疫器官及其它組織內(nèi)部有結構異常，細胞損傷、變性甚至死亡等病態(tài)表現(xiàn)，而經(jīng)蛇毒治療后免疫器官的退變明顯減輕，各主要臟器的結構皆有不同程度改善。蛇毒治療不僅不影響衰老機體正常的生化功能而且可使異常生化功能轉向正常發(fā)展。改善衰老引起的學習記憶能力下降，運動耐力降低等現(xiàn)象。具有用量小、安全、可口服、可注射、可透過口鼻粘膜和皮膚給藥等優(yōu)點。
文檔編號A61P39/06GK103040873SQ20121039312
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權日2012年10月17日
發(fā)明者秦正紅, 祝佳麗 申請人:蘇州人本藥業(yè)有限公司