專利名稱：一種蛇毒止血酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛇毒止血酶，屬于生化醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景-在國(guó)外Helleman等(Helleman， W. H.等，1976 J. Biol. Chem. ， 251: 1663.)用凝 膠層析和親和層折自巴西矛頭蝮(Bothr叩e jararaca )得到了蛇毒凝血酶 (Hemocoagulase、 R印tilase)，經(jīng)測(cè)定，該酶分子量為31000道爾頓，為單鏈，由230個(gè) 氨基酸組成。V.Klobusitzky(1936)首先發(fā)現(xiàn)并研制成止血?jiǎng)?R印tilase(含2個(gè)以上組 分)，并申請(qǐng)專利(參見R印tilase⑧使用說明書)，由瑞士巴塞爾素高大制藥廠生產(chǎn)，我國(guó) 每年進(jìn)口數(shù)百萬支R印tilase(我國(guó)俗稱為"立止血")，年銷值可達(dá)2-4億元(人民幣)。 我國(guó)蕭昌華先生(1990)即從我國(guó)特產(chǎn)尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇(湖南產(chǎn))毒中 經(jīng)陰離子交換、凝膠柱層，再經(jīng)蛋白純化儀純化得到97%以上的尖吻蝮蛇毒凝血酶I 、 II兩個(gè)同功酶純品，已獲兩項(xiàng)專利(證書號(hào)第164674、 164675)。尖吻蝮蛇毒凝血酶I 已獲國(guó)家一類新藥臨床試驗(yàn)批件(批件號(hào)2003L03431)現(xiàn)已進(jìn)入第二期臨床試驗(yàn)階段； 尖吻蝮蛇毒凝血酶II則未進(jìn)行進(jìn)一步研究。國(guó)內(nèi)還有些專利報(bào)道，但基本屬于這兩個(gè)同 功酶類。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種促、凝止血作用顯著的高純度單體止血?jiǎng)?蛇毒止血酶。本發(fā)明是從我國(guó)福建產(chǎn)尖吻吻蝮(Dienagkistrodon acutus)蛇毒中分離純化得 到的單體，經(jīng)檢測(cè)，該酶分子量為31000道爾頓，由兩個(gè)亞組成。經(jīng)氨基酸序列測(cè)定，a -鏈由135個(gè)氨基酸組成，e -鏈由126個(gè)氨基酸組成。蛇毒止血酶氨基酸序列為； 10 20 30 40 50a鏈DFNCPPGWSAY曙CYQVIKEPK腸匿RFCTEQADGGHLVSIESKGERP鏈GFCCPLRWSSYEGHCYLVVKEKKTWDDAEKFCTEQRKGGHLVSVHSREEA60 70 80 90 100a鏈DFVAQLVSQSIESVED訓(xùn)TGLRVQNKEKQCSTEWSDGSSVSYENLLELY 0鏈DFLVHLAYPILD—LSL濯GLSN—MWNDCKREWSDGTKLDFKSWAKTS110 120 130 135a鏈MRKCGALDRDTGF服WINLGCIQLNPFVCKFPPQCP鏈一DCLIGKTDG-DNQWLNLDCSKKHYFVCKFKL—本發(fā)明的蛇毒止血酶經(jīng)如下工藝步驟得到1、 尖吻蝮蛇毒用Tris-Hcl緩沖液溶解，離心分離，取上清液上柱，經(jīng)陰離子交換柱 層析，用Tris-Hcl緩沖液溶，NaCL直線梯度洗脫，能同時(shí)得到5個(gè)以上具類凝血酶 (Thrombin Like Enzemy)活性組分；2、 經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，將其中止血酶組分再經(jīng)兩種以上陰離子交換及凝膠柱層析純化 得精制止血酶溶液，經(jīng)HPLC色譜及毛細(xì)管電泳檢測(cè)，純度在98%，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝 膠電泳檢，本品由兩個(gè)亞基組成。其得率為6%， 1克蛇毒可生產(chǎn)成品1000支以上。3、 將精品止血酶溶液再經(jīng)脫鹽得止血酶原液；4、 將所得的止血酶原液再經(jīng)配方(加賦型劑、穩(wěn)定劑)、過濾、分裝、冷凍干燥、 壓蓋即得注射用止血酶成品。5、 鑒定止血酶的特征(1)蛇毒用Tris-Hcl pH 7.5-8.5緩沖液溶解，經(jīng)陰離子交換劑柱層析，用上述 緩沖液，Nacl直線梯度洗脫，能同時(shí)得到5個(gè)或以上粗分類凝血酶同功酶組分；(2) 將所得到的粗蛇毒止血酶再經(jīng)不同陰離子及凝膠柱層析純化，用上述緩沖 液，pH 7. 5-8. 5, Nacl 0-1. 0M直線梯度洗脫，純化得精制蛇毒止血酶溶液；(3) 該酶的特征鑒定A. 經(jīng)HPLC(正、反相)色譜檢測(cè)，本品相對(duì)含量為98%;B. 經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳能見兩條亞基蛋白帶，其分子量分別為16500道 爾頓和14500道爾頓；C.用4mg/ml濃度人(或牛)純血纖維蛋白原(或血漿)測(cè)定其酶活力，其比活力大 于100U/mg;經(jīng)蛋白測(cè)序，為兩個(gè)亞基，a-亞基(鏈)由135個(gè)氨基酸組成，e-亞基(鏈)由 126個(gè)氨基酸組成。6.與進(jìn)口止血藥一Reptilase (立止血)的比較研究將上述發(fā)明的蛇毒止血酶與進(jìn)口的止血?jiǎng)┮籖印tilase (立止血)進(jìn)行比較研究。 取正常家兔16只(雌、雄各半)，分為4組，每組4只，1、 3組為蛇毒止血酶， 劑量分別是l、 3U/kg體重劑量；2、 4組分別用R印tilase 1、 3 U/kg體重劑量作比較 試驗(yàn)。在用藥后分別于10、 20分鐘、1、 4、 7、 12、 24小時(shí)由兔耳靜脈取血測(cè)定全血 凝血時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明得到的蛇毒止血酶見效快(5-10分鐘即有顯著的促凝、止 血效應(yīng)，R印tilase則在20分時(shí)才有顯著作用)，且促凝作用顯著強(qiáng)于R印tilase。再經(jīng)正常大鼠創(chuàng)傷性出血的止血作用及家兔血小板減少兔創(chuàng)傷出血的止血作用試 驗(yàn)，結(jié)果表明0. 7U/kg體重劑量即有顯著的止血作用與Reptilase的作用無顯著差異， 表明本發(fā)明所得的蛇毒止血酶具有與R印tilase相同的臨床止血功能。在本發(fā)明的操作過程中，相分所得蛇毒止血酶和再純化的溶液用水是超純凈水， 溶解蛇毒的緩沖液是0. 05MTris-Hcl緩沖液；粗分所用陰離子是DEAE-S印hadex A-50, 粗分所用Nacl梯度為0-0.8;純化過程中三次以上柱層析所用填料為Q-s印harose、 S叩erde一 75、 S印hadex 75;三次以上柱層析所用Nacl梯度為0-0. 8M;全工序操作 過程在10土2。C的GMP環(huán)境中進(jìn)行。 本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了一種新的蛇毒止血酶，它是從福建產(chǎn)尖吻蝮蛇毒中分離純化得到的 單體，且具有見效快、作用強(qiáng)的特點(diǎn)，能應(yīng)用于臨床的各種出血疾病的預(yù)防和治療。
具體實(shí)施例方式以下敘述本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)于本發(fā)明只有說明作用而沒有限制 作用。實(shí)施例中所用蛇毒為發(fā)明內(nèi)容所述。實(shí)施例一，080818批蛇毒止血酶的生產(chǎn)將DEAE-S印hadex A-50-120 (Fluka Bichemika 84957) 30g用0. 05M pH 8.0 Tris-Hcl緩沖液浸泡12小時(shí)以上(換1-2次緩沖液)，裝柱(3X 110cm2),再用上述緩沖 液平衡；同時(shí)稱取2g福建產(chǎn)尖吻蝮蛇毒溶于上述緩液6ml中，溶解后經(jīng)5000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液上柱。將上述緩沖液注入儲(chǔ)存瓶及梯度瓶各1000ml,于儲(chǔ)存瓶中加入Nacl 48g并絞拌 溶解后連通梯度洗脫瓶，進(jìn)行Nacl 0-0. 8M直線梯度洗脫并用紫外自動(dòng)記錄儀監(jiān)測(cè)，洗 脫液用自動(dòng)部分收集器收集，每管6-8ml，每小時(shí)6-8管。按紫外自動(dòng)檢測(cè)儀所錄圖譜， 經(jīng)紫外分光光度計(jì)于280nm測(cè)定光吸收值，以管數(shù)為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)作圖，， 按峰將收集液合并得各粗分組分。對(duì)各粗分組分進(jìn)行凝血酶樣活力測(cè)定，對(duì)具有凝血酶活力較高的組分再經(jīng)聚丙烯 酰胺電泳以確定其止血酶組分，并用超濾器脫鹽并濃縮至20ml。然后再經(jīng)Q-S印hrose 柱(3X100cm2)層析，用Nacl 0-0.8M直線梯度洗脫并收集，按上法得所要的止血酶 組分。按上法濃縮至20ml，再經(jīng)S叩erdex S印hadex柱層分離，最后得純品20mg(以濃 縮液或凍干粉保存)。實(shí)例二， 080826批蛇毒止血酶的牛產(chǎn)將上例用DEAE-S印hadex A-50經(jīng)再生后裝柱(3. 5X110cm2),用0. 06M pH8. 2 Tris-Hcl緩沖液平衡6小時(shí)。同時(shí)稱取福建產(chǎn)尖吻蝮蛇毒2. 5g溶于8ml上述緩沖液中， 再經(jīng)5000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液上柱。將上述緩液于儲(chǔ)存瓶和梯度瓶各加上述緩液1200ml,儲(chǔ)存瓶則加入Nacl 52. 8g, 搖勻后連通梯度瓶，進(jìn)行Nacl 0-0. 8M直線梯度洗脫并用紫外自記錄儀監(jiān)測(cè)，洗脫液用 自動(dòng)部分收集，每管6-8ml，每小時(shí)6-8管。按紫外自動(dòng)檢測(cè)儀所錄圖譜，經(jīng)紫外分光 光度計(jì)于280nm測(cè)定光吸收值，以管數(shù)為橫座標(biāo)，光吸收值為樅座標(biāo)作圖，，按峰將收 集液合并得各粗分組分。 ，對(duì)各粗分組分進(jìn)行凝血酶樣活力測(cè)定，對(duì)具有凝血酶活力較高的組分再經(jīng)聚丙烯 酰胺電泳以確定其止血酶組分，并用超濾器脫鹽并濃縮至20ml。然后再經(jīng)Q-S印hrose 柱(3X100cm2)層析，用Nacl 0_0.8M直線梯度洗脫并收集，按上法得所要的止血酶 組分。按上法濃縮至20ml，再經(jīng)S叩erdex S印hadex柱層分離，最后得純品20mg(以濃 縮液或凍干粉保存)。對(duì)各粗分組分進(jìn)行凝血酶樣活力測(cè)定，對(duì)具有凝血酶活力較高的 組分再經(jīng)聚丙烯酰胺電泳以確定其止血酶組分，并用超濾器脫鹽并濃縮至20ml。然后 再經(jīng)Q-S印hrose柱(3X100cm2)層析，用Nacl 0-0. 8M直線梯度洗脫并收集，按上法 得所要的止血酶組分。按上法濃縮至20ml，再經(jīng)S叩erdex、 S印hadex柱層分離，最 后得純品26mg(以濃縮液或凍干粉保存)。本批產(chǎn)品經(jīng)HPLC(正、反相)檢測(cè)，其純度為98.6%，經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)，其純度為99.2"^;經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳見分子量為16500和14500的兩條色帶，未見任 何雜帶；經(jīng)酶活力測(cè)定其比活力為U0U/mg。最后經(jīng)配方(按每支1U加賦型劑和穩(wěn)定劑配制)、超濾分裝凍干壓蓋得注射用蛇 毒止血酶成品(每支1U) 3100支。<110〉〈120〉 <130〉一種蛇毒止血酶—ST25, txt SEQUENCE LISTING中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 一種蛇毒止血酶1<160> 2<170> Patentln version 3.4<210〉 1 . 〈211〉 135 〈212〉 PRT<213〉 Dienagkistrodon acutus 〈400〉 1Asp Phe Asn Cys Pro Pro Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Gin Tyr Cys Tyr15 丄O 15Gin Val lie Lys Glu Pro Lys Asn Trp Asp Asp Ala Glu Arg Phe Cys20 25 30Thr Glu Gin Ala Asp Gly Gly His Leu Val Ser lie Glu Ser Lys Gly35 40 45Glu Arg Asp Phe Val Ala Gin Leu Val Ser Gin Ser lie Glu Ser Val50 55 608一種蛇毒止血酶—ST25. txtGlu Asp His Val Trp Thr Gly Leu Arg Val Gin Asn Lys Glu Lys Gin65 70 7580Cys Ser Thr Glu Trp Ser Asp Gly Ser Ser Va] Ser Tyr Glu Asn Leu85 90 95Leu Glu Leu Tyr Met Arg Lys Cys Gly Ala Leu Asp Arg Asp Thr Gly100 105 110Phe His Lys Trp lie Asn Leu Gly Cys lie Gin Leu Asn Pro Phe Val115 120 125Cys Lys Phe Pro Pro Gin Cys 130 135〈210〉 2 <211> 126 〈212〉 PRT〈213> Diermgkistrodon acutus 〈400> 2Gly Phe Cys Cys Pro Leu Arg Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr15 10 15一種蛇毒止血酶一ST25. txtLeu Val Val Lys Glu Lys Lys Thr Trp Asp Asp Ala Glu Lys Phe Cys20 25 30Thr Glu Gin Arg Lys Gly Gly His Leu Val Ser Val His Ser Arg Glu35 40 45Glu Ala Asp Phe Leu Val His Leu Ala Tyr Pro lie Leu Asp Leu 50 55 60Leu lie Trp Met Gly Leu Ser Asn Met Trp Asn Asp Cys Lys Arg Glu65 70 7580Trp Ser Asp Gly Thr Lys L.eu Asp Phe Lys Ser Trp Ala Lys Thr85 90 95Asp Cys Leu lie Gly Lys Thr Asp Gly Asp Asn Gin Trp Leu Asn Leu100 105 110Asp Cys Ser Lys Lys His Tyr Phe Val Cys Lys Phe Lys Leu 115 120 12權(quán)利要求
1、一種蛇毒止血酶，其特征在于蛇毒止血酶是從我國(guó)福建產(chǎn)尖吻蝮蛇毒中分離純化得到的單體，該酶分子量為31000道爾頓，由兩個(gè)亞基組成；經(jīng)氨基酸序列測(cè)定，α-鏈由135個(gè)氨基酸殘基組成，β-鏈由126個(gè)氨基酸殘基組成；蛇毒止血酶氨基酸序列為； 10 2030 40 50α鏈DFNCPPGWSAYDQYCYQVIKEPKNWDDAERFCTEQADGGHLVSIESKGERβ鏈GFCCPLRWSSYEGHCYLVVKEKKTWDDAEKFCTEQRKGGHLVSVHSREEA 60 70 8090 100α鏈DFVAQLVSQSIESVEDHVWTGLRVQNKEKQCSTEWSDGSSVSYENLLELYβ鏈DFLVHLAYPILD-LSLIWMGLSN--MWNDCKREWSDGTKLDFKSWAKTS 110 120 130 135α鏈MRKCGALDRDTGFHKWINLGCIQLNPFVCKFPPQCβ鏈--DCLIGKTDG-DNQWLNLDCSKKHYFVCKFKL-。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛇毒止血酶，屬于生化醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的純度為98％以上的蛇毒止血酶是從尖吻蝮(Dienagkistrodon acutus)蛇毒中得到。該酶分子量為31000道爾頓，由兩個(gè)亞基組成；其中α-鏈由135個(gè)氨基酸殘基組成，β-鏈由126個(gè)氨基酸殘基組成。本發(fā)明提供了一種新的蛇毒止血酶，它是從福建產(chǎn)尖吻蝮蛇毒中分離純化得到的單體，具有見效快、作用強(qiáng)的特點(diǎn)，能應(yīng)用于臨床的各種出血疾病的預(yù)防和治療。
文檔編號(hào)C12N9/74GK101580826SQ20091009427
公開日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者仞 賴 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所