專利名稱：尖吻蝮蛇血凝酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種絲氨酸蛋白酶，具體地說是一種蛇毒血凝酶，本 發(fā)明還涉及其分離純化方法。
背景技術：
據囯內外文獻的報導，在蝮亞科(Crotalinae)蛇毒中多存在一 類與血液凝固相關的蛋白酶，通常稱之為"類凝血酶"(thrombin-like enzyme,簡稱TLC )。類凝血酶與凝血酶(thrombin)的作用相似，
可以使血漿中纖維蛋白原轉化為纖維蛋白而"凝固"。迄今已經發(fā)現 現已在30多種蛇毒中含有類凝血酶成分,并有20余種得到分離純化， 其中有10余種類凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到闡明。已發(fā)現 的TLC分子量多在29 ~ 45kD之間，大多數為酸性糖蛋白。
在以往已經發(fā)現的蛇毒TLC中，蛋白質一級結構多為單鏈。其 代表產品"立芷雪"(Reptilase)是由巴西矛頭蝮蛇(Bo&ra/w ) 蛇毒中分離出的凝血酶，該酶前體由255個氨基酸構成，N端有24 個氨基酸形成的引導肽，活性酶含231氨基酸,相對分子量39 43kD, 為單鏈糖蛋白。
近10年來的研究發(fā)現在蝮亞科蛇毒TLC中也存在雙鏈分子結 構，鏈間由二硫鍵連接。XinCheng等(中國科技大學)1999年報導 從五步蛇(jgh;^wfo" acWM)中分離到一種"類凝血酶"，命名為 "Agkisacutacin"。該蛋白由兩條肽鏈構成，a-亞基分子量15kD, (3 -亞基分子量14kD。 Agkisacutacin能夠水解纖維蛋白原中的oc鏈。肖 昌華(中科院昆明動物研究所)2004年從五步蛇(^gH^ra^" acW^ ) 中分離到兩種"類凝血酶"，均為雙鏈分子結構。凝血酶I的A亞基 含有132個氨基酸，分子量16kD; B亞基含有123個氨基酸，分子量14kD，酶比活性為160u/mg。凝血酶.II的A亞基含有122個氨 基酸，分子量15kD; B亞基含有120個氨基酸，分子量13kD,酶比 活性為70u/mg。該兩種TLC經藥理實驗證明均具有止血功效。
我國具有豐富的蛇毒研究資源，本發(fā)明人從我國的尖吻蝮蛇 C4gyb'Wro^ w acWw,俗稱五步蛇)的蛇毒中分離得到 一種高活性血凝 酶。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛇毒血凝酶，其是從尖吻蝮蛇蛇毒中 分離得到的一種類凝血酶。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種分離純化上述血凝酶的方法。
本發(fā)明血凝酶是從中國尖吻蟲復蛇(々A^r。(io" ac齒51 )蛇毒中分 離得到的高活性血凝酶。該酶具有如下特征①酶蛋白含252個氨基 酸，分子量為29.3 29.5kD，等電點pl為5.5。②由a、 (3兩個亞基構 成，亞基鏈間由七個二硫鍵連接。(Da亞基含129個氨基酸，分子量 為15kD，其氨基酸序列如SEQIDNo.l所示；P亞基含123個氨基酸， 分子量為14.5kD，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。④酶活性可被 苯甲基磺酰氟(PMSF)完全抑制，表明其是一種絲氨酸蛋白酶。⑤能 夠水解人纖維蛋白原(x鏈。
本發(fā)明還提供上述血凝酶的純化方法，其包括如下步驟
1) 、蛇毒預處理；
2) 、將預處理后的蛇毒溶液上經預平衡的DEAE - Sephrose FF 陰離子交換層析柱，用0.01MpH7.0~7.5的PBS洗柱，再用含0 1M NaCl的0.01M pH7.0 ~ 7.5的PBS分段洗脫，收集0.06M NaCl溶液
3) 、將上述洗脫液適當濃縮后透析或經多次稀釋超濾去除NaCl;
4) 、將透析后的溶液再次上經預平衡的DEAE - Sephrose FF層 析柱，用0.01M pH7.0 ~ 7.5的PBS洗柱，再用含0 1M NaCl的0.01M
5pH7.0~7.5的PBS分段洗脫，收集0.06MNaCl溶液洗脫液中的第二 個洗脫峰；
5 )、將上述洗脫液適當濃縮后用蒸餾水透析或釆用Sephadex-G25
柱脫鹽。
其中，步驟l)蛇毒預處理的方法是將蛇毒用適量預冷的0.01M pH7.0~7.5 PBS溶解，離心取上清液進行透析(透析袋截留分子量為 7,000D 10,000D)或釆用切向流超濾(超濾膜截留分子量為5,000D~ IO，OOOD)方法，將離心上清液反復多次稀釋、超濾濃縮。通過預處 理可以去除不溶的雜質以及小分子多肽，并降低溶液離子強度。
具體地說可通過如下步驟進行蛇毒的預處理稱取蛇毒若干克， 用蛇毒重量5 10倍體積預冷的0.01M pH7.0 ~ 7.5的PBS于4 8°C的 層析柜中攪拌溶解30 60分鐘，于4 8'C、 5,000 10,000g離心10 20 分鐘，將離心上清液傾入透析袋中，離心沉淀再次加入蛇毒重量5 10 倍體積預冷的PBS攪拌懸浮，再次離心。合并兩次離心上清液于透 析袋(截留分子量為7，000D 10,000D)中，在4 8。C層析柜中對0.01M pH7.0 ~ 7.5的PBS透析12 24小時，期間換液2 4次，以去除小分 子多肽和降低溶液離子強度。
如上所述，各透析步驟均可釆用切向流超濾(超濾膜截留分子量 為5,000~10000D)方法代替，通過PBS稀釋、超濾濃縮，再稀釋、 再超濾濃縮的方式以去除小分子多肽和脫鹽降低溶液離子強度。
其中，步驟2)和步驟4)可采用0.01MpH7.0~7.5的PBS預平 衡DEAE - Sephrose FF層析柱，然后上樣。
其中，步驟3)和步驟5)的目的均是去除溶液中存在的NaCl。 洗脫液濃縮方式為超濾濃縮。小體積濃縮液可直接進行透析；也可通 過PBS稀釋、超濾濃縮，再稀釋、再超濾濃縮的方式以濃縮蛋白， 脫去NaCl。最終被純化的酶濃縮液可直接釆用Sephadex-G25柱脫鹽。
除鹽后的溶液直接冷凍干燥，或加入凍干保護劑冷凍干燥。所述
6凍干保護劑可以是低分子右旋糖酐、或甘露醇、蔗糖、甘油、明膠或
人血白蛋白等等。冷凍保護劑的加入量為1%-5%(w/v)。
經本發(fā)明方法純化的血凝酶比活力不低于180u/mg蛋白，聚丙烯 酰胺凝膠電泳(PAGE) —條帶，還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(還 原SDS-PAGE)兩條帶；HPLC分析純度95%以上。以蛇毒原料重量 計，本法純化收得率為0.7%_0.8%。
本發(fā)明血凝酶具有良好的凝集活性，可制成各種止血藥物，例如 經適當稀釋到規(guī)定酶活單位，再添加凍干保護劑(低分子右旋糖酐 20或人血白蛋白等)，經病毒膜過濾，冷凍干燥制成醫(yī)用注射凍干粉 針，用于外科手術中止血，以及各種臨床出血癥狀。也可制成創(chuàng)傷外 用止血貼劑、粉劑或液體噴霧劑。


圖1顯示的是本發(fā)明血凝酶對人纖維蛋白原的水解作用，4h、 2h、、 lh、 0.5h:分別代表血凝酶水解人纖維蛋白原的時間；F:人纖 維蛋白原對照；M:蛋白質分子量標準物。
具體實施例方式
以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的 限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或 條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟 知的常規(guī)手段。
本發(fā)明中涉及到的百分號"％"，若未特別說明，是指質量百分 比；但溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指溶液100ml中含有溶質若
干克；液體之間的百分比，是指在2crc時容量的比例。本發(fā)明中類 似"用蛇毒重量io倍體積預冷的"表述，其中的重量和體積的單位 分別是g和ml。實施例1蛇毒血凝酶的純化
取30g尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批號20061001，廣西蛇毒研究所)， 用蛇毒重量IO倍體積預冷的0.01MpH7.4的PBS于4。C的層析柜中 攪拌溶解30分鐘，于4。C、 10000g離心IO分鐘，將離心上清液傾入 透析袋中，離心沉淀再次加入蛇毒重量IO倍體積預冷的PBS攪拌懸 浮，再次離心。合并兩次離心上清液于透析袋(截留分子量為7000D) 中，在4°C層析柜中對0.01M pH7.4的PBS透析24小時，期間換液3 次。將預處理后的蛇毒溶液上經0.01M pH7.4PBS預平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，用0.01M pH7.4PBS洗柱， 再分別用0.02M、 0.06M和l.OM NaCl的0.01M pH7.4的PBS分段 洗脫，收集0.06MNaCl溶液的洗脫峰；
經酶活測定(參照附錄①或Q方法)和電泳分析，目的物出現在 0.06MNaCl溶液的洗脫峰中，合并洗脫收集液，共得2220ml,釆用 Millipore Pellicon 2切向流超濾器(0.1M2cut off 5k膜)超濾濃縮至 200ml,將該200ml超濾濃縮液傾入透析袋(7000D)中，用5000ml 0.01MpH7.4的PBS于4'C透析24小時，期間更換溶液3次。將透析 后的酶溶液上經預平衡的DEAE - Sepharose Fast Flow陰離子交換層 析柱，用0.01M pH7.4磷酸緩沖液洗柱，再分別用0.02M、 0.04M、 0.06M和l.OM NaCl的0.01M pH7.4的PBS分段洗脫，收集0.06M NaCl溶液洗脫液的第二個洗脫峰，得洗脫液1050ml。經酶活測定確 認，PAGE檢查為一條帶，說明已經得到純化。釆用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(0.1M、utoff5k膜)超濾濃縮至135ml。將該135ml 濃縮液裝入透析袋中，對無離子水進行透析24小時，期間更換溶液 3次，每次5升。透析后體積為159ml，測定該溶液中總蛋白質含量 為240mg，測定酶比活力為195u/mg蛋白，最終收率0.8%。 HPLC 分析純度98.2%,還原SDS-PAGE為兩條帶，其分子量分別大致為 15kD和14.5kD。等電聚焦電泳測定該酶等電點pi為5.5。經DENOVO法氨基酸測序，這兩條帶的氨基酸序列分別如SEQ ID No.l和SEQ ID No.2所示。a亞基(SEQ ID No.l )含129個氨基 酸，僅按氨基酸計算分子量為14660.7Dalton; p亞基(SEQ ID No.2 ) 含123個氨基酸，僅按氨基酸計算分子量為14551.8Dalton。 a亞基和
P亞基均各含有7個半胱氨酸殘基。
實施例2蛇毒血凝酶的純化
取30g尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批號20061001，廣西蛇毒研究所)， 用300ml預冷的0.01M pH7.4的PBS于4。C的層析柜中攪拌溶解60 分鐘，于4。C、 lOOOOg離心15分鐘，將離心上清液傾入透析袋中， 離心沉淀再次加入300ml預冷的PBS攪拌懸浮，再次離心。合并兩 次離心上清液于透析袋(截留分子量為10000D)中，在4"C層析柜中對 0.01MpH7.4的PBS透析24小時，期間換液3次。
按與實施例1相同的方法，將經預處理的蛇毒溶液進行第一次 DEAE-Sephrose FF柱層析，經酶活測定和電泳分析目的物出現在 0.06MNaCl的洗脫峰中，合并洗脫收集液，共得2262ml，采用Millipore Pellicon2切向流超濾器(0.1M2cut off 5k膜)超濾濃縮至200ml，將 該200ml超濾濃縮液傾入透析袋(10,000D)中，用5000ml 0.01M pH7.4PBS于4。C透析24小時，期間更換溶液3次。透析后的酶液上 樣至DEAE-Sephrose FF柱中，按適實例l相同的方法進行第二次層 析。血凝酶出現在0.06MnaCl溶液洗脫液的第二個洗脫峰中，收集該 峰洗脫液得956ml。經酶活測定確認，PAGE檢查為一條帶，說明已 經得到純化。釆用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(0.1M2cutoff 5k 膜)超濾濃縮至192ml。將該192ml濃縮液上樣至Sephdex-G25柱上， 用無離子水洗柱脫鹽，收集洗脫峰322ml，該溶液直接冷凍干燥后收 獲總蛋白235mg，測定酶比活力為200u/mg蛋白，最終收率0.78%。 HPLC分析純度99。/。，色譜圖與實施例l相一致，還原SDS-PAGE 為兩條帶，其分子量分別大致為15kD和14.5kD。實施例3蛇毒血凝酶的純化
1、 稱取100克尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批號20061102),廣西蛇毒 研究所)用2000ml預冷的0.01M pH7.4的PBS于4-8。C的層析柜 中攪拌溶解60分鐘，4。C10000g離心20分鐘，將離心上清液傾入 一個3000ml燒杯中，釆用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(0.1M2 cutoff 8k膜)超濾濃縮至500ml,再加入預冷的1500ml 0.01MpH7.4 的PBS，再超濾至500ml。該超濾濃縮過程循環(huán)3次。
2、 向500ml超濾濃縮液中加入1500mlO.01MpH7.4PBS,按35 -40ml/min流速上樣至DEAE - Sephrose FF柱。
3、 上樣后，依次分別用0.02M、0.06M和1MNaCl的0.01MpH7.4 PBS進行洗脫，洗脫速度70-80ml/min。
4、 目的蛋白出現在0.06M NaCl溶液洗脫液中，洗脫峰共收集 6750ml。
5、 將收集液釆用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(0.1M2cut off 8k膜)超濾濃縮至500ml。
6、 向500ml超濾濃縮液中加入1500ml0.01MpH7.4的PBS，再 超濾至500ml。該超濾濃縮過程循環(huán)3次。
7、 向500ml超濾濃縮液中加入1500ml0.01MpH7.4的PBS,按 35 _ 40ml/min流速上樣至DEAE - Sephrose FF柱。
8、 上樣后，依次分別用0.02M、 0.04M、 0.06M和1MNaCl的 0.01M pH7.4 PBS各10升進行洗脫，洗脫速度70-80ml/min。
9、 經酶活測定確認目的蛋白出現在0.06M NaCl溶液洗脫液的第 二個洗脫峰中，該洗脫峰共收集3050ml。 PAGE檢查為一條帶，說明 已經得到純化。
10、 將3050ml收集液釆用Millipore Pellicon 2切向流超濾器 (0.1M2cutoff 8k膜)進行超濾濃縮至300ml。將該300ml濃縮液上
樣至Sephadex-G25柱上，用無離子水洗柱脫鹽，收集洗脫峰490ml。
10測定該溶液中總蛋白為752mg,比活力為183u/mg蛋白，最終收率為 0.75%。 HPLC純度達98.0。/。，色譜圖與實施例l相一致。
11、 按濾夜體積加入1%的低分子右旋糖苷20凍干保護劑后用 Millipore Viresolve NFP Filters OptiScale — 25病毒膜過濾。
12、 濾液直接分裝后進行冷凍干燥。
13、 凍干粉經PAGE檢查為一條帶，還原SDS-PAGE為兩條帶， 其分子量分別大致為15kD和14.5kD。
實施例4尖吻蝮蛇血凝酶的絲氨酸蛋白屬性實驗
將實施例2分離得到的血凝酶再經HPLC純化制備，獲得經三維 HPLC測定蛋白純度為100%的尖吻蝮蛇血凝酶溶液，酶活性為 10u/ml。
用生理鹽水配制1%的牛纖維蛋白原(Sigma公司)溶液。 用異丙醇溶解苯甲基磺酰氟(PMSF, Merck公司)，溶液濃度為 4mg/ml。
實驗操作步驟如下
(1) 取1。/。牛纖維蛋白原溶液2ml， 37。C下恒溫5分鐘。
(2) 取三支小試管，分別標注1#、 2#、 3#，每管加入200pl經蒸餾 水稀釋一倍的血凝酶溶液(5u/ml)。
(3) 分別向1#試管加入10|il蒸餾水，2#試管加入lO(il異丙醇，3# 試管加入10plPMSF,于37。C水洛保溫5分鐘。
(4) 按試管編號順序分別單獨進行凝集試驗觀察。向試管中加入恒 溫好的1。/。牛纖維蛋白原溶液200fi1,立即計時，同時輕輕搖動 混勻，于37"水洛中靜置，觀察試管中凝集反應的情況。以溶 液呈現完全凝固狀態(tài)時終止計時。
結果見表一
表一 、PMSF對凝集時間的影響
試管號1%纖維蛋白原血凝酶溶液凝集時間
11溶液5u/ml
1#200jal200|Jiow蒸餾水50秒
2#200)^1200pl10pl異丙醇50秒
3#200jil200)^1lOpl PMSF大于600秒
根據表一中的實驗結果，得出以下結論①100ppm濃度的PMSF
完全抑制了該血凝酶活性，證明該尖吻蝮蛇血凝酶為絲氨酸蛋白酶。 ②微量異丙醇對本凝集反應無影響。
實施例5尖吻蝮蛇血凝酶水解人纖維蛋白原實驗
用50mM Tris-HCl(pH7.4)緩沖液配制4mg/ml的人纖維蛋白原溶 液。分別向5支小試管中各加入0.5ml人纖維蛋白原溶液，分別按4 個不同水解保溫時間順序間隔向其中4管中加入經提取純化的1個活 性單位的血凝酶。37。C水洛保溫4、 2、 l和0.5小時，保溫后立即進 行SDS-PAGE電泳，觀察人纖維蛋白原的水解程度。另一支0.5ml 纖維蛋白原對照管同時于37匸水洛保溫4小時。
如圖1結果所示未經血凝酶水解的纖維蛋白原對照的電泳圖呈 現出三條帶，圖中F列從上至下分別為(x、 p、 Y亞基。纖維蛋白原在 血凝酶(l單位)作用0.5小時和1小時后，a亞基帶逐漸變淺，作 用于2小時和4小時后，(x亞基帶完全消失。該結果證實血凝酶有水 解纖維蛋白原oc亞基的作用。
附錄
尖吻蝮蛇血凝酶單位定義及活性測定方法
① 牛纖維蛋白原測定法取生理鹽水配制的1.0%牛纖維蛋白原(Sigma公司) 溶液lml置小試管中，37士0.5。C水洛保溫3分鐘，加入37士0.5。C預熱的待測酶溶 液lml,立即計時，纖維蛋白原溶液在120±30秒內振搖出現白色絮團，則該酶 溶液為lu/ml。
② 標準人血漿測定法取標準人血漿lml置小試管中，置37'C士0.5。C水浴中預熱 3分鐘，加入37士0.5。C預熱的待測酶溶液lml,立即計時，人血漿在60±20秒內振搖出現白色絮團，則該酶溶液為lu/ml。
注測定未知高酶活性溶液時需用無離子水進行稀釋，直至達到lu/ml用于測定; 其稀釋倍數即為每毫升原酶溶液中的酶活單位數。序列表
<110>北京方策方程醫(yī)藥科技有限公司
<120> 尖吻蝮蛇血凝酶
<130>
<150> 200810223433.8
<151> 2008-09-27
<160> 2
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1 <211> 129 <212> PRT
<213> Agkistrodon acutus <400> 1
Asp Cys Ser Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr Lys 15 10 15
Val Phe Lys Gin Ser Lys Thr Trp Ala Asp Ala Glu Ser Phe Cys
20 25 30
Thr Lys Gin Val Asn Gly Gly His Leu Val Ser Leu Glu Ser Ser
35 40 45
Gly Glu Ala Asp Phe Val Gly Gin Leu Leu Ala Gin Lys Leu Lys
50 55 60
Ser Ala Lys Leu His Val Trp Leu Gly Leu Arg Ala Gin Asn Lys
65 70 75
Glu Lys Gin Cys Ser Leu Gin Trp Ser Asp Gly Ser Ser Leu Ser
80 85 90
Tyr Glu Asn Trp Leu Glu Glu Glu Ser Lys Lys Cys Leu Gly Val
95 100 105
His Leu Glu Thr Gly Phe His Lys Trp Glu Asn Phe Tyr Cys Glu
110 115 120
Gin Gin A印Pro Phe Val Cys Glu Ala
125
〈210〉 2 <211> 123
14<212> PRT
<213> Agkistrodon acutus
<400> 2 Asp Cys Pro 1
Pro Phe Asn
Ser
Glu
Asp 5
Pro 20 Thr 35
Glu Glu Ala Asp Phe Val
Thr Lys Gin His
Trp Lys Gly
Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr 10
Tyr Gly Leu Asn Trp Gin
50
Phe Trp Phe 65
Asn Trp Gly His Val Lys Gly Leu
Ala Asp Ala Glu Asn Phe 25
Leu Val Ser Phe Gin Ser 40
Leu Ala Phe Gin Thr Phe 55
Ser Lys ILeu 70
Ala Glu Glu Ser
Trp Ser Asn Ala Ala Met Leu Lys 80
Val Tyr
Trp Asn Tyr Thr
Trp Arg Ser Leu
Phe Gin Ala
Tyr 95 Thr 110
Cys Cys
Gin
Asp
85
Phe Lys Ser Thr Asn Asn
100
Arg Met Leu Ala Asn Phe Val Cys 115
Lys
15
Cys
30
Thr
45
Asp
60
Cys
75
Trp
90
Lys
105
Glu
120
權利要求
1、尖吻蝮蛇血凝酶，該酶由α、β兩個亞基構成，亞基鏈間由七個二硫鍵連接，其中α亞基含129個氨基酸，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；β亞基含123個氨基酸，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2、 如權利要求1所述的尖吻蝮蛇血凝酶，其特征在于該酶是一 種絲氨酸蛋白酶，能夠水解人纖維蛋白原a鏈。
3、 含有權利要求l或2所述尖吻蝮蛇血凝酶的藥物。
4、 如權利要求3所述的藥物，其為凍干粉、止血貼劑或液體噴 霧劑。
5、 權利要求l或2所述血凝酶的純化方法，其包括如下步驟1) 、蛇毒預處理；2) 、將預處理后的蛇毒溶液上經預平衡的DEAE - Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，用0.01M pH7.0 ~ 7.5 PBS洗柱，再用含0~1M NaCl的0.01M pH7.0 ~ 7.5的PBS分段洗脫，收集0.06M NaCl溶液的洗脫峰；3) 、將上述洗脫液適當濃縮后透析或經反復稀釋超濾濃縮去除 NaCl;4) 、將透析后的溶液再次上經預平衡的DEAE _ Sepharose Fast Flow層析柱，用0.01MpH7.0~7.5的PBS洗柱，再用含0 lMNaCl 的0.01MpH7.0~7.5的PBS分段洗脫，收集0.06MNaCl溶液的第二 個洗脫峰；5) 、將上述收集洗脫液適當濃縮后用無離子水透析或經 Sephdex-G25柱去除NaCl。
6、 如權利要求5所述的方法，其中，步驟1)蛇毒預處理的方 法是將蛇毒用適量預冷的0.01M pH7.0~7.5的PBS溶解，離心取上 清液進行透析或經反復稀釋超濾濃縮。
7、 如權利要求6所述的方法，其特征在于其中步驟1)蛇毒預處理的方法是稱取蛇毒若干克，用蛇毒重量5~10倍體積預冷的 0.01MpH7.0~7.5的PBS于4 8'C的層析柜中攪拌溶解30~60分鐘， 于4 8。C 、 5,000~10,000g離心10 20分鐘，將離心上清液傾入透析袋， 離心沉淀再用蛇毒重量5 10倍體積預冷的PBS攪拌懸浮，再次離心， 合并兩次離心上清液于透析袋中，在層析柜中4 8。C對0.01MpH7.0 7.5的PBS透析12 24小時，期間更換溶液2 4次；或將蛇毒用10 20 倍體積預冷的0.01M pH7.0~7.5的PBS溶解后，用分子截留值為 5,000 10,000D的超濾膜經反復多次加入PBS進行稀釋超濾濃縮。
8、 如權利要求5所述的方法，其中，步驟2)和步驟4)釆用 O,OIM pH7.0 ~ 7.5的PBS預平衡DEAE - Sepharose Fast Flow層析 柱，然后上樣。
9、 如權利要求5所述的方法，其還包括將步驟5)除鹽后的溶 液直接冷凍干燥，或加入保護劑冷凍干燥。
10、 如權利要求5 9任一項所述的方法，其特征在于釆用分子截 留值為5,000 10,000D超濾膜的超濾濃縮方式降低目的蛋白洗脫溶液 體積，然后進行透析脫鹽；或釆用分子截留值為5,000 10,000D的超 濾膜將洗脫液經反復稀釋超濾脫鹽并濃縮蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種尖吻蝮蛇血凝酶，其是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離得到的一種高活性血凝酶，分子量29.3～29.5kD，等電點5.5。該酶由α、β兩個亞基構成，亞基鏈間由七個二硫鍵連接，其中α亞基具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，β亞基具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明尖吻蝮蛇血凝酶為絲氨酸蛋白酶，能夠水解人纖維蛋白原α鏈。本發(fā)明還提供了該酶的純化方法，包括通過預處理去除不溶物，再通過兩次陰離子交換柱層析，收集活性洗脫峰，經透析、超濾濃縮及脫鹽后即得高純度蛇毒血凝酶，其比活力不低于180u/mg蛋白，HPLC分析純度可達95％以上，以蛇毒原料重量計純化收得率為0.7％-0.8％。
文檔編號A61P7/04GK101560510SQ200910118800
公開日2009年10月21日 申請日期2009年3月16日 優(yōu)先權日2008年9月27日
發(fā)明者狄 孫, 王錫娟 申請人:北京方策方程醫(yī)藥科技有限公司