專利名稱：：神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白用于心血管疾病治療的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及預(yù)防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類各種心血管疾病、心血管紊亂的組合物和方法。更具體說，本發(fā)明提供了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段、或編碼該神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，或提高所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)在預(yù)防、治療或延緩哺乳動物各種心血管疾病及紊亂的組合物和方法。
背景技術(shù)：
：病毒性心肌炎(ViralMyocarditis)是因多種病毒侵犯心臟，引起局灶性或彌漫性心肌間質(zhì)炎性滲出和心肌纖維變性、壞死或溶解，伴有心包或心內(nèi)膜炎癥，導(dǎo)致心肌損傷，心功能障礙，心律失常和周身癥狀。病毒性心肌炎可發(fā)生于任何年齡，近年來發(fā)生率有增多的趨勢。其后遺癥為心律失常，心力衰竭，心源性休克，甚至猝死。若病程遷延不愈，導(dǎo)致心臟肥大，導(dǎo)致心肌永久性損害，并因免疫反應(yīng)逐漸發(fā)展為心肌病。病毒性心肌炎的臨床治療原則主要是改善心肌功能，修復(fù)損傷心肌，控制心力衰竭。病毒性心肌炎的臨床治療用藥包括抗生素、心肌保護(hù)劑、抗氧化劑如大劑量維生素C、維生素E、輔酶Q,o等以及營養(yǎng)心肌的藥物如能量合劑以加強(qiáng)心肌營養(yǎng)。但上述療效并不十分理想，尤其是針對心肌炎導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)及功能改變尚無療效肯定的治療措施。擴(kuò)張性(充血性)心肌病(Dilated(congestive)Cardiomyopathy,DCM)是原因不明的各種心肌疾病的最后結(jié)局，它是非風(fēng)濕性、非高血壓性、非冠狀動脈性的心肌結(jié)構(gòu)和功能的病理改變。擴(kuò)張性心肌病主要表現(xiàn)為心室高度擴(kuò)張和心肌收縮期泵功能障礙或充血性心力衰竭為特征。擴(kuò)張性心肌病的心肌輕度損傷常表現(xiàn)為細(xì)胞核及細(xì)胞器的肥大，重度損傷表現(xiàn)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變、細(xì)胞壞死，由此導(dǎo)致的纖維化。DCM的發(fā)病原因及機(jī)制均尚未闡明且因無有效的防治方法而預(yù)后極差。多數(shù)患者常因心力衰竭進(jìn)行性加重死亡或因心律失常而發(fā)生猝死。常規(guī)治療DCM除使用強(qiáng)心劑、利尿劑、ACEI等治療外，第三代鈣離子拮抗劑阿羅地平和第三代卩-受體阻滯劑如卡維地洛亦用于DCM的臨床治療。由于缺乏隨機(jī)、雙盲臨床試驗(yàn)證實(shí)，甲狀腺素和生長激素的療效有爭議。目前，仍無特效治療DCM藥物。左室減容手術(shù)雖能減小左心室內(nèi)徑，心功能暫時(shí)得以改善，而減容手術(shù)后因心衰加重，心律失常的死亡率較高，限制了左室減容手術(shù)在臨床上的應(yīng)用。動態(tài)心肌成形術(shù)雖然能改善患者心功能，但手術(shù)創(chuàng)傷大，病人不易耐受，僅作為心臟移植禁忌時(shí)的替代方法。心臟移植作為DCM的根本治療手段因缺乏供體心臟，費(fèi)用昂貴，術(shù)后感染以及移植后產(chǎn)生排異反應(yīng)而影響治療。因此，提供DCM特效治療的藥物是臨床所急需解決的問題。阿霉素(DoxorubicinorAdriamycin，ADM)屬蒽環(huán)類抗腫瘤藥，具有抗瘤譜廣、作用強(qiáng)等特點(diǎn)。在臨床上廣泛應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、膀胱癌、睪丸癌、甲狀腺癌、軟組織腫瘤、骨肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞癌、急性白血病和惡性淋巴瘤以及胃癌、肝癌、食管癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤的治療。其作用機(jī)制主要是ADM分子嵌入DNA而抑制核酸的合成。ADM為細(xì)胞周期非特異性藥，對S期作用最強(qiáng)，M、G1和G2期也有作用。有許多病例揭示無論是對轉(zhuǎn)移乳腺癌還是對術(shù)后乳腺癌的輔助化療，在單位時(shí)間內(nèi)，用較大劑量化療藥物方案能產(chǎn)生較好的有效率和較長的生存期。隨后，又有一些研究證實(shí)了高劑量和劑量強(qiáng)度的重要性，肯定了劑量和劑量強(qiáng)度與療效的關(guān)系。但ADM的毒性副作用，限制了其應(yīng)用。ADM的毒性包括骨髓抑制，約有6080%的患者在用藥后1015天，白細(xì)胞及血小板降低至最低水平，約21天恢復(fù)到正常水平。而消化道反應(yīng)主要有惡心、嘔吐、厭食、胃炎甚至饋瘍、口腔粘膜炎癥。同時(shí)，幾乎所有用藥者都發(fā)生不同程度的脫發(fā)，但停藥后，該反應(yīng)停止。限制高劑量ADM等蒽環(huán)類藥物在臨床應(yīng)用的主要原因是心臟毒性，ADM心臟毒性的作用機(jī)制主要是產(chǎn)生的氧自由基，由于ADM分5氧化還原反應(yīng)引起膜脂質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞損傷。氧自由基引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，損傷細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜，改變膜上蛋白質(zhì)的功能及酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，核酸、蛋白質(zhì)合成受抑制，能量代謝障礙，嚴(yán)重影響心肌的收縮和舒張功能。ADM在體內(nèi)積聚量過多時(shí)，由于ADM與心肌組織的親和力明顯高于其他組織，使心肌組織更容易受ADM的損害，產(chǎn)生心臟毒性。心臟毒性表現(xiàn)為急性及慢性毒性反應(yīng)兩種。急性反應(yīng)表現(xiàn)為心臟的各種功能性變化，如竇性心動過速、心律不齊、傳導(dǎo)阻滯及ST-T段的改變等。在ADM用藥早期易出現(xiàn)心律失常，急性心臟毒性還表現(xiàn)為左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)的減低，心搏量(SV)、心排出量(CO)、心排指數(shù)(CI)相應(yīng)減低，說明ADM對患者左心收縮功能以及左心泵功能均有抑制效應(yīng)。ADM導(dǎo)致慢性反應(yīng)表現(xiàn)為不可逆的充血性心力衰竭。一旦出現(xiàn)充血性心力衰竭，其病死率可達(dá)30%50%。這在一定程度上限制了ADM的大劑量、長期應(yīng)用，迫使癌癥患者中斷治療。如何在臨床使用ADM時(shí)不影響其化療效果同時(shí)減少其心臟毒性已有廣泛的研究。如適當(dāng)減少ADM的總量，并增加營養(yǎng)心肌如大量維生素C配合使用，經(jīng)常輸血、使用鐵離子螯合劑ICRF-187等保護(hù)心肌。然而，這些藥物在保護(hù)心肌的同時(shí)，對減少ADM的心臟毒性作用甚微。因此，需要預(yù)防、治療或延緩因使用ADM導(dǎo)致的心臟毒性作用，同時(shí)不影響其療效的藥物。許多病因可引起心力衰竭如冠狀動脈硬化、高血壓、炎癥引起心肌損傷導(dǎo)致難治愈的心臟疾病。這些因素導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的改變，最終使心室射血功能下降導(dǎo)致心力衰竭。心力衰竭是嚴(yán)重影響人類健康的疾病，其發(fā)病率及死亡率在全球都很高。在美國，心力衰竭每年住院率為30-40%,確診的心力衰竭患者5年死亡率，男性為60%，女性為45%;平均生存時(shí)間，男性為3.2.年，女性為5.4年，終末期的心力衰竭患者的生存率只有20%。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(neuregulin-l，NRG-1)又稱NeuDifferentiationFactor(NDF)或glialgrowthfactors(GGF)，是ErbB3、ErbB4的配體。用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因嚴(yán)重缺陷的小鼠胚胎的研究證明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對于心臟和神經(jīng)發(fā)育是必需的。然而，關(guān)于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白控制細(xì)胞分化和控制下游信號途徑的信息是有限的。在心臟發(fā)育的早期，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白和ErbB受體分別在心內(nèi)膜內(nèi)層和心肌層表達(dá)。這二層分開很寬，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白必須穿過二層細(xì)胞中的空間，再激活ErbB受體。激活心肌細(xì)胞中的這些受體促進(jìn)心肌細(xì)胞生長或遷移到心內(nèi)膜。WO00/37095發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白增強(qiáng)心肌細(xì)胞的分化，肌原纖維節(jié)和細(xì)胞骨架的組合與細(xì)胞間的粘合。WO00/37095發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白與它的細(xì)胞作用可能適用于探測，診斷與處理心臟疾病。WO00/37095提出神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白及其類似物在體外促進(jìn)心肌細(xì)胞分化，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維節(jié)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重建或細(xì)胞間粘合，識別能抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激心肌細(xì)胞分化的多肽或化合物，可應(yīng)用于治療心臟病和心力衰竭中。因此，需要更有效和(或)性價(jià)比更好有關(guān)NRG治療病毒性心肌炎、DCM、預(yù)防或治療藥物導(dǎo)致的心臟毒性如ADM，不影響其療效和心肌梗死的方案。本發(fā)明提供了上述需求的方法及應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容治療病毒性心肌炎或擴(kuò)張性(充血性)心肌病一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防、治療或延緩哺乳動物病毒性心肌炎或DCM方法，該方法包括對需要或希望預(yù)防、治療或延緩的哺乳動物施用有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)，從而預(yù)防、治療或延緩病毒性心肌炎或DCM。優(yōu)選地，在體內(nèi)施用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)。另一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包括有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)以及有效量的預(yù)防或治療病毒性心肌炎或DCM的藥物組成。另一方面，本發(fā)明還提供了預(yù)防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類病毒性心肌炎或DCM的藥物有效成分，該藥物有效成分包括有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)，從而預(yù)防、治療或延緩病毒性心肌炎或DCM。治療藥源性心臟毒性本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩因藥源性導(dǎo)致的心臟毒性的方法。具體說，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或降低藥源性心肌病心臟毒性的方法。本發(fā)明提供了一種預(yù)防、治療或延緩哺乳動物心臟毒性的方法，該方法包括對需要或希望預(yù)防、治療或延緩的哺乳動物在體內(nèi)施用有效量的預(yù)防、治療藥物和有效量的(i)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、或其功能片段;(ii)編碼該蛋白或功能片段的核酸；(iii)提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)，從而預(yù)防、治療或延緩藥源性心臟毒性的方法。本發(fā)明可預(yù)防、治療或延緩本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知心臟毒性明顯的臨床癥狀，包括但不限于急性或慢性心臟毒性。例如，本發(fā)明可預(yù)防、治療或延緩心動過速、心律失常、心力衰竭。在具體實(shí)施例中，急性心臟毒性的臨床癥狀，例如，竇性心動過速、心律不齊、傳導(dǎo)阻滯及ST-T段的改變，以及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)的減低，心搏量(SV)、心排出量(CO)、心排指數(shù)(CI)減低可以得到預(yù)防、治療或延緩。本發(fā)明可預(yù)防、治療或延緩心臟毒性導(dǎo)致左心室收縮及泵出功能下降。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩藥源性心臟毒性的方法。在具體實(shí)施例中，治療或預(yù)防性藥物產(chǎn)生的氧自由基導(dǎo)致心臟毒性。在另一具體實(shí)施例中，治療或預(yù)防性藥物增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)導(dǎo)致心臟毒性。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩抗腫瘤藥物導(dǎo)致心臟毒性的方法?？鼓[瘤藥物是蒽環(huán)類抗腫瘤藥。更具體說，抗腫瘤藥物是具有下列通式的化合物OOHORl為甲氧基或氫，R2，R3和R4為羥基或氫。蒽環(huán)類抗腫瘤藥包括但不限于下列如ADM、柔紅霉素、表阿霉素、去甲氧柔紅霉素、米托蒽醌、絲裂霉素、博萊霉素、環(huán)磷酰胺、氟脲嘧啶、放線菌素D、長春新堿。本發(fā)明提供了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白作為抗心臟毒性藥物可以預(yù)防、治療或延緩化療藥物如ADM單獨(dú)或與其它藥物聯(lián)合使用導(dǎo)致心臟中毒。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩抗精神病藥物導(dǎo)致心臟毒性的方法。抗精神病藥物可以是氯丙嗪、奮乃靜、三氟拉嗪。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩三環(huán)類抗抑郁病藥物導(dǎo)致心臟毒性的方法。三環(huán)類抗抑郁病藥物可以是氯丙咪嗪，阿米替林，多慮平。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩干擾素如干擾素-a或白細(xì)胞介素如白細(xì)胞介素-2導(dǎo)致心臟毒性的方法。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩抗感染藥物如吐根堿導(dǎo)致心臟毒性的方法。在本發(fā)明中使用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以是神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明方法使用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以是神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白a2或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2。在另一些實(shí)施例中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白片段是包含有SEQID:4的氨基酸序列的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2片段。本發(fā)明使用的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以是神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段。本發(fā)明方法可使用編碼該蛋白或功能片段的核酸，可使用任何可提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可單獨(dú)使用或與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑使用。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)可在使用預(yù)防、治療性藥物之前、同時(shí)或之后使用。在一些實(shí)施例中，在神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)存在的情況下，預(yù)防、治療性藥物的用量可高于其最大允許用量。在另一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了對需要或希望預(yù)防、治療或延緩的人類心臟毒性方法。優(yōu)選地，使用在患有惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、睪丸癌、甲狀腺癌、軟組織腫瘤、骨肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞癌、急性白血病和惡性淋巴瘤以及胃癌、肝癌、食管癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤的人類。治療心肌梗死本發(fā)明還提供了預(yù)防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心肌梗死的組合物，該組合物包括有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、或其功能片段、或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)以及有效量的預(yù)防或治療心肌梗死的藥物。本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒包括放置在容器的上述組合物和使用上述組合物預(yù)防、治療或延緩心肌梗死說明書。本發(fā)明提供了一種預(yù)防、治療或延緩哺乳動物心肌梗死方法，該方法包括對需要或希望預(yù)防、治療或延緩的哺乳動物尤其是人類施用有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、或其功能片段、或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)，從而預(yù)防、治療或延緩心肌梗死。藥物組合物安全劑量范圍一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防、治療或延緩哺乳動物疾病的藥物組合物，該藥物組合物包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段其a)安全劑量小于170U/kg，或b)有效療程總劑量小于3600U/kg。圖l.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白工程菌株構(gòu)建的技術(shù)路線。圖2.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的擴(kuò)增。泳道1是通過RT-PCR擴(kuò)增大小為183bp的目的片段，泳道2、3為DNAMarkers。圖3.PET22b質(zhì)粒物理圖譜。圖4.重組神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。泳道1、3為DNAMarkers，泳道2是酶切后神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白片段。圖5.高效表達(dá)工程菌鑒定。泳道lMarker;泳道2未誘導(dǎo)工程菌泳道3誘導(dǎo)后lh;泳道4誘導(dǎo)后2h;泳道5誘導(dǎo)后3h;泳道6誘導(dǎo)后4h;泳道7-9不同工程菌誘導(dǎo)后圖6.大鼠假手術(shù)組心肌組織病理切片，心肌組織無特殊病理學(xué)改變10(I)(lOxlO)。圖7.模型組可見大面積紅染區(qū)(10x10)。圖8.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白高劑量組(I)(20pg/kg)可見散在分布紅染心肌細(xì)胞(10x10)。圖9.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白中劑量組(I)(1(Vg/kg)可見片狀分布的紅染心肌細(xì)胞及纖維組織(10x10)。圖IO.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白低劑量組(I)(5pg/kg)可見片狀分布的紅染心肌細(xì)胞及纖維組織(10x10)。圖U,大鼠假手術(shù)組心肌組織病理切片，心肌組織無特殊病理學(xué)改變(II)(10x10)。圖12.模型組(II)(10x10)可見大面積紅染區(qū)。圖13.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白高劑量組(20嗎/kg)可見散在分布紅染心肌細(xì)胞(10x10)。圖14.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白中劑量組(II)(1(Hig/kg)可見片狀分布的紅染心肌細(xì)胞及纖維組織(10x10)。圖15.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白低劑量組(II)(5ng/kg)(10x10)可見片狀分布的紅染心肌細(xì)胞及纖維組織。圖16.rhNRG-l(3對模型動物心臟纖維化區(qū)域毛細(xì)血管增生的影響(I)(HE染色，50x)A:假手術(shù)組正常心肌結(jié)構(gòu)，無纖維化改變；B:模型組心肌纖維化明顯，可見少量毛細(xì)血管增生；C:rhNRG-l(3(20lag/kg)組心肌呈片狀纖維化，毛細(xì)血管增生明顯；D:rhNRG-l卩(1(^g/kg)組纖維化明顯，內(nèi)有較多毛細(xì)血管增生；E:rhNRG-l卩(5Mg/kg)組片狀纖維化，可見毛細(xì)血管增生。圖17.rhNRG-ip對模型動物心臟纖維化區(qū)域毛細(xì)血管增生的影響(II)(HE染色，50倍X)A:假手術(shù)組正常心肌結(jié)構(gòu)，無纖維化改變；B:模型組心肌纖維化明顯，可見少量毛細(xì)血管增生；C:rhNRG-ip(20ng/kg)組心肌呈片狀纖維化，毛細(xì)血管增生明顯；D:rhNRG-l卩(1(Vg/kg)組纖維化明顯，內(nèi)有較多毛細(xì)血管增生E:rhNRG-ip(5pg/kg)組片狀纖維化，可見毛細(xì)血管增生。圖18.ADM導(dǎo)致SD大鼠中毒性心^l炎心肌病理切片。A.對照組心肌病理評分0分，心肌細(xì)胞無萎縮及肥大，無空泡，橫紋清晰，心肌排列整齊，心內(nèi)膜、心外膜均無異常，血管和間質(zhì)無變化。B.模型組心肌病理評分3分，心肌大面積壞死溶解。圖19.rhNRG-ip對模型組動物存活率的影響。圖20.rhNRG-ip對模型組動物心肌結(jié)構(gòu)的影響。圖21.rhNRG-ip對病毒感染導(dǎo)致小鼠心肌損傷治療作用的病理切片。A.正常組；B.模型組；C安慰劑；D.高劑量組；E.中劑量組；F.低劑量組。圖22.rhNRG-ip對病毒感染導(dǎo)致小鼠心肌損傷治療作用的病理切片。A.正常組；B.模型組；C.安慰劑；D.高劑量組；E.中劑量組；F.低劑量組。圖23.rhNRG-ip不同用藥天數(shù)對病毒感染導(dǎo)致小鼠心肌損傷治療作用的病理切片。A.正常組；B.模型組；C.用藥3天；D.用藥5天；E.用藥7天。圖24.rhNRG-ip不同用藥天數(shù)對病毒感染導(dǎo)致小鼠心肌損傷治療作用的病理切片。A.正常組；B.模型組；C.用藥3天；D.用藥5天；E.用藥7天。具體實(shí)施例方式為清楚公開
發(fā)明內(nèi)容而不是限制發(fā)明，分以下小節(jié)詳細(xì)說明。A.釋義除另有定義，這里使用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員理解含義相同。所有專利文獻(xiàn)、專利申請文獻(xiàn)、公開的專利文獻(xiàn)和其它出版物均作為參考。如本節(jié)闡述的定義與上述參考文獻(xiàn)所述的定義不一致或相反時(shí)，以本節(jié)闡述的定義為準(zhǔn)。在此所用"一個(gè)"的意思是"至少一個(gè)"或"一個(gè)或多于一個(gè)"。在此所用"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白"(neuregulin)是包括可以激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3異源二聚體蛋白激酶的蛋白或多肽，例如神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白異構(gòu)體，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF結(jié)構(gòu)域，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體以及可以激活上述受體的任何神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白樣基因產(chǎn)物。典型的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的片段是具有和受體結(jié)合部位如包括EGF結(jié)構(gòu)域的人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2片斷，它能激活EGF受體家族的ErB受體，并調(diào)控多種生物反應(yīng)如刺激乳腺癌細(xì)胞分化和乳蛋白分泌；誘導(dǎo)神經(jīng)脊細(xì)胞分化為Schwann細(xì)胞；刺激骨胳肌細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿受體的合成；以及促進(jìn)心肌細(xì)胞存活和DNA合成。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白也包括替代保守氨基酸，但對抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用不變的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白變異體。合適的替代保守氨基酸是本領(lǐng)域的普通技術(shù)，在多肽的非功能區(qū)域的個(gè)別氨基酸的改變對其功能無影響在本領(lǐng)域已是共識(see，e.g.,Watson等.MolecularBiologyoftheGene,4thEdition,1987，TheBejacmin/CummingsPub.co.，p.224)。常見神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白和多肽，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白核酸包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白核酸和多聚核酸。在此所用"上皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域"或"EGF樣結(jié)構(gòu)域"是指由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼的結(jié)構(gòu)域多肽，結(jié)合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或由它們組成的二聚體。具有與EGF受體結(jié)合區(qū)域相同結(jié)構(gòu)域參見WO00/64400,Holmes等，Science,256:1205-1210(1992);U.S.PatentNos.5,530,109and5,716,930;Hijazi等，Int.J.Oncol.，13:1061-1067(1998);Chang等，Nature,387:509-512(1997);Carraway等，Nature,387:512-516(1997);Higashiyama等，J.Biochem.，122:675-680(1997);及WO97/09425。在此所用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白"功能衍生物或功能片段"是指神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的衍生物或功能片段或編碼這些衍生物或功能片段核酸，這些衍生物或功能片段對抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用不變。通常，這些衍生物或功能片段至少保留50%預(yù)防、治療或延緩抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用。更好的情況下，這些衍生物或功能片段至少保留60%，70%,80%,卯°/。,95°/。，99%或100%抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用。在此所用"提高神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量的物質(zhì)"是指可以提高神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯作用的物質(zhì)，或提高神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因翻譯后修飾作用的物質(zhì)和(或)提高NRG前體細(xì)胞通訊的物質(zhì)，或提高神經(jīng)'調(diào)節(jié)蛋白半衰期的物質(zhì)。在此所用"提高神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白功能的物質(zhì)"是指可以或提高神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用，或提高神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性或抗心肌梗死的作用的信號傳導(dǎo)途徑中配體靈敏度的物質(zhì),或降低神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白拮抗劑作用的物質(zhì)，但不包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白及其編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的核酸。在此所用"混合斷'是指兩種或兩種以上物質(zhì)。在此所用"組合物"是指兩種或兩種以上的物質(zhì)或化合物組成?？梢允侨芤?、懸浮劑、液體、粉劑、藥膏、水溶劑、非水溶劑或它們的混合在此所用"erb"指兩種癌基因，erbA和erbB，與骨髓成紅血細(xì)胞增多癥病毒相關(guān)(一種急性的轉(zhuǎn)化性逆轉(zhuǎn)錄病毒)。在此所用"用于治療特定疾病的化合物有效用量"是指足以改善或以某種方式減少與該疾病相關(guān)癥狀的用量。該用量可為單一劑量或根據(jù)療程確定的有效劑量。該用量可以治愈疾病，但通常是減輕病情。為減輕病情，可能需要連續(xù)服用。在此所用"心力衰竭"是指心功能異常，表現(xiàn)為心臟不能以組織代謝所需的速度供血。心力衰竭包括范圍廣泛的疾病狀態(tài)如充血性心力衰竭、心肌梗死、快速心律不齊、家族性肥大心肌病、缺血性心臟病、自發(fā)擴(kuò)張型心肌病、心肌炎。許多因素可導(dǎo)致心力衰竭包括缺血性、先天性、風(fēng)濕性或自發(fā)性。慢性心肌肥大是充血性心力衰竭和心臟停止跳動前的明顯的疾病狀態(tài)。在此所用"重組方法生產(chǎn)"是指用重組核酸方法的生產(chǎn)方法。本方法是以眾所周知的克隆核酸表達(dá)其所編碼蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)方法。在此所用"互補(bǔ)的"當(dāng)是指兩個(gè)核酸分子的核苷酸序列能雜交，優(yōu)選是低于25%，更優(yōu)選是低于15%，更加優(yōu)選是低于5%，最優(yōu)選是在相對核苷酸處不存在錯(cuò)誤配對。優(yōu)選在嚴(yán)格條件下，這兩個(gè)分子雜交。在此所用決定錯(cuò)誤配對百分率的"雜交的嚴(yán)格性"規(guī)定如下1)高嚴(yán)格性0.1xSSPE,0.1%SDS，65°C;2)中等嚴(yán)格性0.2xSSPE，0.1%SDS,5(TC;(也指適度嚴(yán)格性)3)低嚴(yán)格性1.0xSSPE,0.1%SDS，50°C;應(yīng)理解為使用對等的緩沖液、鹽和溫度，可以獲得相當(dāng)?shù)膰?yán)格性。14在此所用"載體(或質(zhì)粒)"是指用于將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)或復(fù)制的不連續(xù)元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知選擇及使用這些載體的技術(shù)。表達(dá)載體包括DNA表達(dá)載體，該載體有效與調(diào)控序列，例如啟動子區(qū)域連接在一起調(diào)控該DNA片段的表達(dá)。所以，一個(gè)表達(dá)載體是指重組DNA或RNA構(gòu)建物，例如質(zhì)粒、噬菌體、重組病毒或其它載體，當(dāng)它們導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，可使克隆的DNA表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體、能在真核細(xì)胞和(或)原核細(xì)胞中復(fù)制的載體以及保持游離態(tài)或整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的載體。在此所用"啟動子區(qū)域或啟動子元件"是指調(diào)控DNA或RNA轉(zhuǎn)錄并與其有效連接的DNA片段或RNA片段。啟動子區(qū)域是RNA聚合酶識別、結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的特定序列，這部分啟動子區(qū)域特指啟動子。同時(shí)，啟動子區(qū)域還包括調(diào)控RNA聚合酶識別、結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始活動的序列。這些序列可以對順式作用因子或?qū)Ψ词阶饔靡蜃幼鞒鲰憫?yīng)。根據(jù)調(diào)控性質(zhì)，啟動子可以是組成型或調(diào)控型。用于原核生物典型的啟動子包括噬菌體T7和T3啟動子和類似的啟動子。在此所用"有效連接和有效結(jié)合"是具有調(diào)控和效應(yīng)功能的DNA，如啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止位點(diǎn)及其它信號序列的核苷酸序列與功能的關(guān)系。例如，DNA和啟動子的有效連接是指DNA和啟動子間結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，RNA聚合酶能專一識別啟動子、結(jié)合和轉(zhuǎn)錄該段DNA，并從啟動子開始該段DNA轉(zhuǎn)錄。為優(yōu)化表達(dá)和(或)體外轉(zhuǎn)錄，有必要去掉、增加或改變克隆的5'不翻譯部分，以消除多余、潛在不適當(dāng)?shù)奶娲苑g(如起始)密碼子或其它不論是在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上干擾或減少表達(dá)的序列。而其它方法包括將核糖體結(jié)合位點(diǎn)共有序列緊接起始密碼子的5'插入，可增強(qiáng)表達(dá)(參見，Kozak.生物化學(xué)雜志(J.歷o/.Oze肌)1991;266:19867-19870)。這一糾正的愿望(或需要)可由經(jīng)驗(yàn)來決定。在此，通過服用特定的藥物組合物治療達(dá)到特定不適的癥狀"改善"是指任何的減輕，不管是永久還是暫時(shí)，持續(xù)還是短暫，可歸于或與服用藥物組合物有關(guān)系。在此所用"治療藥物"的意思是使任何傳統(tǒng)的藥物或本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的治療藥物，包括但不限于預(yù)防性或化療藥物。在此所用"治療有效用量"是指足以改善或以某種方式減少與疾病相關(guān)癥狀的用量。該用量可為單一劑量或根據(jù)療程確定的有效劑量。為減輕病情，可能需要連續(xù)服用。在此所用"使用"是指對治療目標(biāo)以任何方式使用藥物。在此所用"治療"的意思是使任何臨床癥狀、不適或疾病的癥狀得到改善或有益改變的方法。治療也包括任何藥物組合物的應(yīng)用。改善特定不適的癥狀是指任何的減輕，不管是永久還是暫時(shí)，可歸于或與服用藥物組合物有關(guān)系在此所用"腫瘤"是指不正常的新生長，包括良性和惡性腫瘤。不同于增生，在沒有原有刺激后，腫瘤仍會繼續(xù)增殖。在此所用"抗腫瘤藥劑"是指任何可用于用于預(yù)防腫瘤、癌癥發(fā)生或減輕腫瘤、癌癥嚴(yán)重程度的任何藥劑?？鼓[瘤藥劑包括，如抗血管生成劑、烷化劑、抗代謝劑、天然產(chǎn)品、鉑配位絡(luò)合物、蒽二酮、取代尿素、甲肼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、激素和拮抗劑、癌基因抑制劑、腫瘤抑制基因或蛋白、抗腫瘤基因抗體、抗腫瘤基因反義寡聚核苷酸。在此所用"抗精神病藥物"是指治療精神病的藥物?？咕癫∷幬锟梢允堑幌抻谌h(huán)吩噻嗪、噻噸、二苯西平、苯丁酮類、雜環(huán)族化合物、實(shí)驗(yàn)用苯甲酰胺。在此所用"三環(huán)類抗抑郁病藥物"是指治療抗抑郁病的藥物。三環(huán)類抗抑郁病藥物可以是但不限于抑制神經(jīng)末梢吸收去甲腎上腺素及5-羥色胺、在大腦促進(jìn)產(chǎn)生去甲腎上腺素功能。在此所用"抗感染藥物"是指治療感染的藥物?？垢腥舅幬锟梢允堑幌抻诳辜纳x感染、細(xì)菌性感染、微生物的感染。在此所用"安全劑量"是用于足以預(yù)防、治療或延緩哺乳動物疾病，但不引起副作用發(fā)生及不良反應(yīng)的藥物劑量。在此所用"心肌梗死"是冠狀動脈閉塞，血流中斷，使部分心肌因嚴(yán)重的持久性缺血而發(fā)生局部壞死。B.預(yù)防、治療或延緩病毒性心肌炎、擴(kuò)張性(充血性)心肌病方法本發(fā)明提供了一種預(yù)防、治療或延緩哺乳動物病毒性心肌炎、擴(kuò)16張型心肌病方法，該方法包括對需要或希望預(yù)防、治療或延緩的哺乳動物尤其是人類施用有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段、或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)，從而預(yù)防、治療或延緩病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病。本發(fā)明的方法能用于任何哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔子、貓、狗、豬、奶牛、牛、綿羊、山羊、馬、猴子和其它非人靈長類動物預(yù)防、治療或延緩哺乳動物病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于人類預(yù)防、治療或延緩哺乳動物病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病。任何適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸能用于本方法中。在特定的實(shí)施方案中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結(jié)合，產(chǎn)生抗病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病的作用。在另一特定的實(shí)施方案中，其中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以選自神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1的同義詞包括heregulin，GGF2及pl85erbB2的配體，參見WO00/64400、U.S.PatentNos.5,530,109、5,716,930。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白a2或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2均可用于本方法。優(yōu)選地，包含有SEQID:4的氨基酸序列神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2片段，用于本方法。在其他的實(shí)例方案中，在下述專利、專利申請和GenBank中的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段可用于本方法中。如，美國專利6,252,051、6,121,415(NRG3);6,087,323(神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白與pl85erbB2，pl85erbB3或pl85erbB4結(jié)合活性)；6，033，906(神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白作為選自pl85erbB2和pl80erbB4受體的配體)；US2002002276(嵌合型ErbB異源多聚體作為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白競爭性拮抗劑或拮抗劑)；WO01/81540(NRG-4);WO01/64877(NRG1);WO01/64876(NRG1AG1);WO01/58948(神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-P);WO01/26607(SMDF禾BGGF神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白拼接變異體)；WO00/70322(CRD-神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)；WO00/64400;W099/18976;WO98/02540(嵌合型ErbB異源多聚體作為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白競爭性拮抗劑或拮抗劑)；WO96/30403;W096/15812;BC017568(人，類似神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4);BC007675(人，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1);AF142632(Xenopuslaevis，富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-l);AFl9443917(RattusnorvegicusSMDF神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白a2a(Nrgl));AF194438(RattusnorvegicusSMDF神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-Pla(Nrgl));HS2NRG12(Homos叩iens可選擇拼接神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋2(NRG2));HS2NRG08(Homosapiens可選擇拼接神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋2(NRG2));HS2NRG07(Homosapiens可選擇拼接神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋2(NRG2));AF083067(Musmusculus神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋-4短同源體(Nrg4));AF076618(Xenopuslaevis神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白a-1);AF045656(Gallusgallus神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-P-2b);AF045655(Gallusgallus神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-P-2a);AF045654(Gallusgallus神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-P-la);MAU96612(Mesocricetusauratus神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)；AF010130(Musmusculus神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(NRG3)).公開的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，用于本方法中。優(yōu)選地，GenBankAccessionNo.NT—007995(gi:18570363)公開神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，用于本方法中。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩任何病毒性心肌炎的方法。例如，柯薩奇A及B組病毒，?？虏《?，脊髓灰質(zhì)炎病毒等。優(yōu)選，本發(fā)明的方法用于預(yù)防、治療或延緩柯薩奇B組(Coxsackie)病毒。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩病毒性心肌炎的臨床癥狀的方法。例如，心包或心內(nèi)膜炎癥可以得到預(yù)防、治療或延緩。還包括如心肌損傷、心功能障礙、心律失常、周身癥狀、心肌病等臨床癥狀可得到預(yù)防、治療或延緩。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩急性或慢性病毒性心肌炎的方法。優(yōu)選，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩急性病毒性心肌炎導(dǎo)致心律失常、心力衰竭、心源性休克的方法。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩病毒性心肌炎導(dǎo)致心臟肥大，永久性心肌損害的方法。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩DCM的各種臨床癥狀的方法。例如，心室肥大、心肌泵功能障礙或充血性心力衰竭等臨床癥狀可得到預(yù)防、治療或延緩。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可單獨(dú)使用，可選擇神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸與其它藥劑、載體或賦形劑聯(lián)合使用。18神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可在哺乳動物體內(nèi)直接使用，可選擇神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可在哺乳動物體外使用，如可針對細(xì)胞、組織、器官或在細(xì)胞、組織、器官使用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸后轉(zhuǎn)染哺乳動物。在一些實(shí)例方案中，可使用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段。在另一些實(shí)例方案中，可使用編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可單獨(dú)使用，可選擇神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸與其它預(yù)防、治療病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病的藥物聯(lián)合使用。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可在其它預(yù)防、治療病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病的藥物之前、同時(shí)、之后用。任何合適的預(yù)防、治療病毒性心肌炎藥物可用于本方法中。如預(yù)防、治療病毒性心肌炎、藥物包括抗生素如青霉素、心肌保護(hù)劑如?；撬?、抗氧化劑如維生素C、維生素E、輔酶Qu)以及營養(yǎng)心肌的藥物如能量合劑。任何合適的預(yù)防、治療DCM藥物可用于本方法中。如預(yù)防、治療DCM的藥物強(qiáng)心劑如地戈辛、西地蘭，利尿劑(GoodmanandGilman，sThePharmacologicalBasisofTherapeutics(她Ed.)，McGraw-Hill(1996)pp683-713),如碳酸酐酶抑制劑、袢利尿劑、排鉀利尿劑、保鉀利尿劑、噻嗪類鹽皮質(zhì)激素受體的拮抗劑等治療外，ACEI、鈣離子拮抗劑如阿羅地平和P-受體阻滯劑如卡維地洛可用于本方法中。C.預(yù)防、治療或延緩病毒性心肌炎、擴(kuò)張性(充血性)心肌病的藥物有效成分、試劑盒和組合物。一方面，本發(fā)明涉及預(yù)防、治療或延緩哺乳動物病毒性心肌炎、擴(kuò)張性(充血性)心肌病的組合物，該組合物包括有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)。在B小節(jié)中所述的任何合適的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可用于本發(fā)明的藥物組合物中。在特定的實(shí)施方案中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結(jié)合，產(chǎn)生抗病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病的作用。在另一特定的實(shí)施方案中，其中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以選自神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1包括heregulin，GGF2及pl85erbB2的配體，參見.WO00/64400、U.S.PatentNos.5,530,109、5，716,930.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白a2或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2均可用于本方法。優(yōu)選，包含有SEQID:4的氨基酸序列神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2片段，用于本組合物中。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸可以任何合適的劑量。例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸劑量可以從25嗎到2500嗎。另一方面，本發(fā)明還提供一種試劑盒。該試劑盒包括置于容器中上述的藥物組合物及用于預(yù)防、治療或延緩病毒性心肌炎、擴(kuò)張性(充血性)心肌病的該組合物使用說明書。另一方面，本發(fā)明包括一種組合物，該組合物包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段、或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)以及有效量的預(yù)防或治療病毒性心肌炎或DCM的藥物組成。在B小節(jié)中所述的任何合適的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可用于本發(fā)明的藥物組合物中。在特定的實(shí)施方案中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結(jié)合，產(chǎn)生抗病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病的作用。在另一特定的實(shí)施方案中，其中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以選自神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1同義詞包括heregulin，GGF2及pl85erbB2的配體，參見.WO00/64400、U.S.PatentNos.5,530,109、5,716,930.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白a2或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2均可用于本方法。優(yōu)選，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2片段，包含有SEQID:4的氨基酸序列用于本組合物中。任何合適的預(yù)防、治療病毒性心肌炎藥物可用于本方法中。如預(yù)防、治療病毒性心肌炎、藥物包括抗生素如青霉素、心肌保護(hù)劑如?；撬帷⒖寡趸瘎┤缇S生素C、維生素E、輔酶Qn)等以及營養(yǎng)心肌的藥物如能量合劑。任何合適的預(yù)防、治療DCM藥物可用于本方法中。如預(yù)防、治療DCM的藥物強(qiáng)心劑如地戈辛、西地蘭，利尿劑(Goodman和Gilman，sThePharmacologicalBasisofTherapeutics(9thEd.)，McGraw-Hill(1996)pp683-713),如碳酸酐酶抑制劑、拌利尿劑、排鉀利尿劑、保鉀利尿劑、噻嗪類、鹽皮質(zhì)激素受體的拮抗劑，ACEI、l丐離子拮抗劑如阿羅地平和卩-受體阻滯劑如卡維地洛可用于本方法中。本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒包括放置在容器的上述組合物和使用上述組合物預(yù)防、治療或延緩病毒性心肌炎、擴(kuò)張性(充血性)心肌病說明書。D.預(yù)防、治療或延緩心臟毒性的方法神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化，增強(qiáng)肌原纖維節(jié)和細(xì)胞骨架的組合與細(xì)胞間的粘合(WO00/37095)。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可適用于探測，診斷與治療心臟病。在本發(fā)明提供的方法中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可用作為心肌保護(hù)劑預(yù)防、治療或延緩因治療或預(yù)防性藥物導(dǎo)致心臟毒性的方法。本發(fā)明提供了一種預(yù)防、治療或延緩哺乳動物心臟毒性方法，該方法包括對需要或希望預(yù)防、治療或延緩的哺乳動物在體內(nèi)施用有效量的預(yù)防、治療的藥物和有效量的(i)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、或其功能片段;(ii)編碼該蛋白或功能片段的核酸;(iii)提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)，心臟毒性是使用預(yù)防或治療性藥物導(dǎo)致的。本發(fā)明的方法能用于任何哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔子、貓、狗、豬、奶牛、牛、綿羊、山羊、馬、猴子和其它非人的靈長類動物預(yù)防、治療或延緩哺乳動物心臟毒性。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于人類預(yù)防、治療或延緩哺乳動物的心臟毒性。1.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白任何合適的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可用于本發(fā)明的方法中。在一些的實(shí)施例中，本21發(fā)明使用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的片段是具有和受體結(jié)合部位如包括EGF結(jié)構(gòu)域的人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(32片斷，它能激活EGF受體家族的ErB受體，并調(diào)控多種生物反應(yīng)(如刺激乳腺癌細(xì)胞分化和乳蛋白分泌；誘導(dǎo)神經(jīng)脊細(xì)胞分化為Schwann細(xì)胞；刺激骨胳肌細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿受體的合成；以及促進(jìn)心肌細(xì)胞存活和DNA合成)。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的方式產(chǎn)生，包括但不限于重組技術(shù)、化學(xué)合成或兩者結(jié)合產(chǎn)生。優(yōu)選，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸通過重組技術(shù)產(chǎn)生e.g.,Watson"o/.M/ecw/。r歷o/ogyo/Gewe，4thEdition,page224，TheBenjamin/CummingsPub.Co.,1987)。替代保守氨基酸的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，但對抗心臟毒性的作用不變的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白變異體可用于本發(fā)明的方法中。在本領(lǐng)域已是共識，在多肽的非功能區(qū)域的個(gè)別氨基酸的改變對其功能無影響(see,e.g.,Watson等.M/ecw/ar5zb/ogyo/Gewe，4thEdition,1987，TheBejacmin/CummingsPub.co.,p.224)。編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸能以裸露DNA、復(fù)合DNA、cDNA、質(zhì)粒DNA、RNA或其它混合物形式作為基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的成分使用。在另一實(shí)施方案中，編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸包含于病毒載體中。任何適合于基因治療的病毒載體能聯(lián)合使用。例如，腺病毒載體(美國專利No.5，869，305)、猴病毒載體(美國專利No.5,962,274)、條件復(fù)制型人免疫缺陷型病毒載體(美國專利No.5，888，767)、反轉(zhuǎn)錄病毒、猿猴病毒-40、單純性皰疹病毒擴(kuò)增子載體和牛痘病毒載體。而且，這些基因能轉(zhuǎn)入非病毒載體系統(tǒng)，例如脂質(zhì)體，脂質(zhì)在凝聚過程中保護(hù)DNA或其它生物物質(zhì)不受氧化。在實(shí)施方案中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結(jié)合，產(chǎn)生抗心臟毒性的作用。在另一特定的實(shí)施方案中，其中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以選自神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1包括heregulin，GGF2及pl85erbB2的配體，參見WO00/64400、U.S.PatentNos.5,530,109、5,716,930.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白ct2或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2均可用于本方法。優(yōu)選，包含有SEQID:4的氨基酸序列神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白e2片段，用于本方法中。在其他的實(shí)例方案中，在下述專利、專利申請和GenBank中的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段可用于本方法中。如，美國專利6,252,051、6,121,415(NRG3);6，087，323(神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白與pl85erbB2，pl85erbB3或pl85erbB4結(jié)合活性)；6,033,906(神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白作為選自pl85erbB2禾卩pl80erbB4受體的配體);US2002002276(嵌合型ErbB異源多聚體作為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白競爭性拮抗劑或拮抗劑)；WO01/81540(NRG-4);WO01/64877(NRG1);WO01/64876(NRG1AG1);WO01/58948(神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-P);WO01/26607(SMDF和GGF神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白拼接變異體)；WOO(V70322(CRD-神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)；WO00/64400;W099/18976;WO98/02540(嵌合型ErbB異源多聚體作為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白競爭性拮抗劑或拮抗劑)；WO96/30403;WO96/15812;BC017568(人，類似神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4);BC0(T7675(人，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1);AF1422(Xenopuslaevis，富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-l);AF194439(RattusnorvegicusSMDF神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白a2a(Nrgl));AF194438(RattusnorvegicusSMDF神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-Pla(Nrgl));HS2NRG12(Homosapiens可選擇拼接神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋2(NRG2));HS2NRG08(Homosapiens可選擇拼接神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋2(NRG2));HS2NRG07(Homosapiens可選擇拼接神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋2(NRG2));AF083067(Musmusculus神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋-4短同源體(Nrg4));AF076618(Xenopuslaevis神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白a-1);AF045656(Gallusgallus神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-P-2b);AF045655(Gallusgallus神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-e-2a);AF045654(Gallusgallu神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-P-la);MAU96612(Mesocricetusauratus神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)；AF010130(Musmusculus神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(NRG3)).公開的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，用于本方法中。優(yōu)選地，GenBankAccessionNo.NT—007995(gi:18570363)公開神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，用于本方法中。2.預(yù)防或治療藥物本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩因藥源性導(dǎo)致的心臟毒性的方法。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提咼上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)可在使用預(yù)防、治療性藥物之前、同時(shí)或之后使用。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或延緩預(yù)防或治療藥物導(dǎo)致心臟毒性的方法。預(yù)防或治療藥物包括但不限于下列如抗精神病藥物、三環(huán)類抗抑郁病、干擾素、白細(xì)胞介素、抗感染藥物導(dǎo)致心臟毒性的方法。任何抗腫瘤藥物可用于本發(fā)明的方法中。優(yōu)選，抗腫瘤藥物具有下列通式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>Rl為甲氧基或氫，R2，R3和R4為羥基或氫。蒽環(huán)類抗腫瘤藥包括但不限于下列如ADM、柔紅霉素、表阿霉素、去甲氧柔紅霉素、米托蒽醌、絲裂霉素、博萊霉素、環(huán)磷酰胺、氟脲嘧啶、放線菌素D、長春新堿及其衍生物(參見Goodman&Gilman，s，ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,NinthEdition,pp.1264-1269，McGraw-Hill1996)。本發(fā)明方法中使用的另一些抗腫瘤藥包括包括在美國專利申請?zhí)?002/044919描述?？鼓[瘤藥包括但不限于下列如胞啶、阿糖腺苷、柔紅霉素、氨甲蝶呤(MTX)，氟嘧啶如5-氟尿嘧啶(5-FU)，羥基脲、6-巰基嘌呤、植物堿如長春新堿(VCR)，VP-16和長春堿(VLB)，烷基化物、順珀、氮芥、三胺、甲基芐肼、博萊霉素、絲裂霉素C、放線菌素D或酶如L-天(門)冬酰胺酶(參見Goodman&Gilman，s，ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,NinthEdition,pp.1227-1229)。任何抗精神病藥物可用于本發(fā)明?？咕癫∷幬锟梢允堑幌抻诼缺骸^乃靜、三氟拉嗪。其它抗精神病藥物可參見Goodman&Gilman，s，ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,NinthEdition,pp.400-420。任何三環(huán)類抗抑郁病藥物可用于本發(fā)明。三環(huán)類抗抑郁病藥物可以是但不限于氯丙咪嗪，阿米替林，多慮平。其它三環(huán)類抗抑郁病藥物可參見Goodman&Gilman，s，ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,NinthEdition,pp.431-434。任何干擾素優(yōu)選干擾素-a可用于本發(fā)明。在一些實(shí)施例中，干擾素是人干擾素-a。生產(chǎn)千擾素-a的方法可參見美國專利號6，005，075;5,834,235;5,503,828;和4,820,638。任何白細(xì)胞介素可用于本發(fā)明。優(yōu)選，如白細(xì)胞介素-2用于本發(fā)明。在一些實(shí)施例中，白細(xì)胞介素是白細(xì)胞介素-2。生產(chǎn)白細(xì)胞介素-2的方法可參見美國專利號5,834,441;5,795,777;5,419,899;and5，399，699。任何抗感染藥物可用于本發(fā)明。優(yōu)選，抗感染藥物是吐根堿。其它抗感染藥物可參見Goodman&Gilman，s，ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,NinthEdition,pp.965-1008。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可在哺乳動物體內(nèi)直接使用，可選擇神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可在哺乳動物體外使用，如可針對細(xì)胞、組織、器官或在細(xì)胞、組織、器官使用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸后轉(zhuǎn)染哺乳動物。E.治療心肌梗死一方面，本發(fā)明一種組合物，該組合物包括有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)以及有效量的預(yù)防或治療心肌梗死的藥物。優(yōu)選，該組合物還包括藥物學(xué)上可接受的載體或賦形劑。任何適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)調(diào)節(jié)蛋白能用于本組合物。在特定的實(shí)施方案中，25神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結(jié)合，產(chǎn)生抗心肌梗死的作用。在另一特定的實(shí)施方案中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以選自神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4。優(yōu)選，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白a2或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2均可用于本組合物。在另一實(shí)施例中，包含有SEQID:4的氨基酸序列的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2片段，用于本組合物。上述小節(jié)描述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可用于本組合物。任何適當(dāng)?shù)念A(yù)防、治療心肌梗死藥物能用于該組合物中。例如，預(yù)防、治療心肌梗死的藥物可以是ACEI、鈣離子拮抗劑、P阻滯劑、阿斯匹林、阿托品、硝化甘油、東莨菪堿及溶血栓藥?？梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)腁CEI，如卡托普利、雷米普利、福辛普利、賴諾普利、依那普利或喹那普利等。可以用任何適當(dāng)?shù)拟}離子拮抗劑如地爾硫萆?？梢杂萌魏芜m當(dāng)(3阻滯劑如阿替洛爾、美托洛爾、普萘洛爾或塞嗎洛爾等。可以用任何適當(dāng)?shù)娜苎ㄋ幦珂溂っ?、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、阿尼鏈菌酶。另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，該試劑盒包括置于容器中的所述的藥物組合物及其該組合物用于預(yù)防、治療和延緩心肌梗死使用說明。另一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防、治療或延緩哺乳動物心肌梗死方法，該方法包括對需要或希望預(yù)防、治療或延緩的哺乳動物尤其是人類施用有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、或其功能片段、或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)，從而預(yù)防、治療或延緩心肌梗死?？梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)纳窠?jīng)調(diào)節(jié)蛋白。例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結(jié)合，產(chǎn)生抗心肌梗死的作用。在另一特定的實(shí)施方案中，其中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以選自神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4。優(yōu)選，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白a2或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2均可用于本方法。優(yōu)選，包含有SEQID:4的氨基酸序列的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2片段用于本方法中。前述小節(jié)描述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可用于本方法。在另一實(shí)施方案中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)可拮抗心肌梗死的左心室舒張期最大內(nèi)徑(LVEDD)左心室收縮期最小內(nèi)徑(LVESD)的增加。在另一特定的實(shí)施方案中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)可拮抗心肌梗死的心室射血分?jǐn)?shù)(EF)降低。本發(fā)明的方法能用于任何哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔子、貓、狗、豬、奶牛、牛、綿羊、山羊、馬、猴子和其它非人的靈長類動物預(yù)防、治療或延緩哺乳動物心肌梗死。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于人類預(yù)防、治療或延緩哺乳動物心肌梗死。在本發(fā)明中，心肌梗死的臨床癥狀及并發(fā)癥可以得到預(yù)防、治療或延緩。例如，左心室擴(kuò)張、收縮功能下降、充盈壓增加可以得到預(yù)防、治療或延緩。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)可單獨(dú)使用。優(yōu)選，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑使用。在另一實(shí)施方案中，使用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段。在另一實(shí)施方案中，使用編碼該蛋白或功能片段的核酸。任何給藥途徑可以使用，優(yōu)選以靜脈途徑給藥。任何適當(dāng)?shù)目梢灶A(yù)防、治療或延緩心肌梗死藥物能用于本發(fā)明的方法中。例如，預(yù)防、治療心肌梗死的藥物可以是ACEI、鈣離子拮抗齊U、(3阻滯劑、阿斯匹林、阿托品、硝化甘油、東莨菪堿及溶血栓藥?？梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)腁CEI，如卡托普利、雷米普利、福辛普利、賴諾普利、依那普利或喹那普利等。可以用任何適當(dāng)?shù)拟}離子拮抗劑如地爾硫簞?？梢杂萌魏芜m當(dāng)卩阻滯劑如阿替洛爾、美托洛爾、普萘洛爾或塞嗎洛爾等?？梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)娜苎ㄋ幦珂溂っ?、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、阿尼鏈菌酶。在優(yōu)選的實(shí)施例中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)在體內(nèi)使用。F.安全劑量范圍27一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防、治療或延緩哺乳動物疾病的藥物組合物，該藥物組合物包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段其a)安全劑量小于170U/kg，或b)有效療程總劑量小于3600U/kg。本發(fā)明的藥物組合物可以合適的療程和(或)給藥方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物的用藥時(shí)間小于21天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以連續(xù)或非連續(xù)。本發(fā)明的藥物組合物可單獨(dú)使用。優(yōu)選，本發(fā)明的藥物組合物與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑使用?？梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)乃幬锝M合物。例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白通過與ErbB2-ErbB4受體結(jié)合，產(chǎn)生抗疾病的作用。在另一特定的實(shí)施方案中，其中本發(fā)明的藥物組合物可以選自神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4。優(yōu)選，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白Q2或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2。在另一特定的實(shí)施方案中，包含有SEQID:4的氨基酸序列的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白P2片段用于本發(fā)明的藥物組合物中?？捎们笆鲂」?jié)描述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。本發(fā)明的方法能用于任何哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔子、貓、狗、豬、奶牛、牛、綿羊、山羊、馬、猴子和其它非人的靈長類動物預(yù)防、治療或延緩哺乳動物心肌梗死。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于人類預(yù)防、治療或延緩哺乳動物疾病。本發(fā)明的藥物組合物可預(yù)防、治療或延緩哺乳動物疾病。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物可預(yù)防、治療或延緩心血管疾病如病毒性心肌炎、DCM、心臟毒性、心肌梗死等。在一優(yōu)選方案中，本的藥物組合物以靜脈途徑給藥。以下為典型的、快速、靈敏、高通量、定量測定NRG-1體外生物學(xué)活性的方法，采用利用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白與細(xì)胞表面ErbB3/ErbB4分子結(jié)合、間接介導(dǎo)ErbB2蛋白磷酸化的特性(參見MichaelD.Sadicketal.AlalyticalBiochemistry,1996,235,207-214)。根據(jù)實(shí)施例8.NRG-1體外活性測定方法，可以確定不同來源的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的生物學(xué)活性大小。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)確定激酶受體活化。該方法包括兩獨(dú)立的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板及Costar96孔酶標(biāo)檢測板。其一進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，配體激活、細(xì)胞裂解/受體溶液，另一進(jìn)行受體破獲及磷酸化。本檢測以乳腺癌MCF-7細(xì)胞，分析heregulin誘導(dǎo)ErbB2活性。膜蛋白溶解在Triton-X100細(xì)胞裂解液，受體用與ErbB3和ErbB4無交叉反應(yīng)的抗ErbB2抗體包被在ELISA孔。ELISA抗磷酸化水平確定受體磷酸化。HER2/neu基因編碼一具有酪氨酸蛋白激酶活性的穿膜蛋白p185，常與ErbB3或ErbB4形成異源二聚體，通過ErbB3或ErbB4與相應(yīng)配體(Neuregulin-1)的結(jié)合，激活HER2編碼的酪氨酸蛋白激酶，介導(dǎo)功能信號的傳遞。利用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能與細(xì)胞表面ErbB3/ErbB4分子結(jié)合、間接介導(dǎo)ErbB2蛋白磷酸化的特性，建立快速、靈敏、高通量、定量測定重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白體外生物學(xué)活性的方法。由于基因工程藥物多為蛋白質(zhì)、多肽，其活性由產(chǎn)品的氨基酸序列或空間結(jié)構(gòu)所形成的活性中心所決定。蛋白質(zhì)、多肽的活性效價(jià)和其絕對質(zhì)量不一致，所以不能按化學(xué)藥品用重量單位決定。而基因工程藥物生物學(xué)活性與藥效學(xué)基本一致，用特定的生物學(xué)活性建立特定的測定效價(jià)體系，定出其效價(jià)單位，因此，生物學(xué)活性測定是測量生物活性物質(zhì)效價(jià)的過程，是基因工程產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要組成部分，也是保證產(chǎn)品藥效的重要手段。為了準(zhǔn)確控制基因工程產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床用藥，制定生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)至為重要。本發(fā)明中能誘導(dǎo)50%最大反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的量在這里定義為一個(gè)活力單位(1U)，這樣，使不同批次的制品用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)校正。G.劑型、劑量以及給藥途徑神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸使用配方、劑量和給藥途徑，尤其作為藥物組合物時(shí)，可根據(jù)本
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所知的方法加以確定?？筛鶕?jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
普通技術(shù)人員所知的方法確定(參見AlfonsoR.Gennaro，雷明頓藥劑學(xué)科學(xué)與實(shí)踐(/eiw/"g組.r/zg5We"cea"d尸rflc"ceo/尸Aar則cy),Mack出版社，1997年4月；Banga，治療用多肽和蛋白的配方、加工和傳遞系統(tǒng)Z)e"W76^Wems)，1999;Hovgaard禾卩Frkjr，肽和蛋白制藥配方的發(fā)Taylor&Francis公司，2000;Lasic和Papahadjopoulos，月旨質(zhì)體的醫(yī)學(xué)應(yīng)用(MWca/ylpWc加'orao/Z^osomas)，ElsevierScience,1998;Jain,基因治療教程(7&c&ooyto/(7e"er/zerap;;)，Hogrefe&Huber出版社，1998;Seth,腺病毒基因治療的基本生物學(xué)(Afewov!'m^:Sosz'ctoGewe7Tzera/^)，15巻,LandesBioscience,1999;Wu-Pong禾口Rojanasakul,生物制藥的藥物設(shè)計(jì)和發(fā)展(5z'o//icirmaceM"ca/Z>wgjDes!'g"￡>eve/opmeW)，Humana出版社，1999;治療學(xué)上的血管發(fā)生Dole等，從基石出禾斗學(xué)至廿臨床(7T2era/ew"cy4"gz'ogewew's..Fraw5oy/c■SCetoC//m'c)，28巻，Springer-VerlagNewYork,1999)。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可配制成用于口服，直腸給藥，局部用藥，吸入用藥，口腔用藥(例如舌下)，注射用藥(例如，皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈用藥)，經(jīng)皮或其他適合的給藥途徑。在任何給定的情況下，最合適的給藥途徑取決于要治療性質(zhì)和嚴(yán)重程度以及所用的特定神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸的性質(zhì)。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，可單獨(dú)使用，選擇和優(yōu)選方式，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸與藥物治療上可接受的載體或者賦形劑共同使用。任何合適的藥物治療可以接受的載體或者賦形劑能用于本方法中(參見，AlfonsoR.Gennaro，雷明頓藥劑學(xué)科學(xué)與實(shí)踐(Wem/"gto"..77^iSWewceawd尸ra"/ceo/尸/2ar附flcy)，Mack出版社，1997年4月)。編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸能以裸露DNA、復(fù)合DNA、cDNA、質(zhì)粒DNA、RNA或其它混合物形式作為基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的成分使用。在另一實(shí)施方案中，編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸包含于病毒載體中。任何適合于基因治療的病毒載體能聯(lián)合使用。例如，腺病毒載體(美國專利No.5，869，305)、猴病毒載體(美國專利No.5,962，274)、條件復(fù)制型人免疫缺陷型病毒載體(美國專利No.5，888，767)、反轉(zhuǎn)錄病毒、猿猴病毒-40、單純性皰疹病毒擴(kuò)增子載體和牛痘病毒載體。而且，這些基因能轉(zhuǎn)入非病毒載體系統(tǒng)，例如脂質(zhì)體，脂質(zhì)在凝聚過程中保護(hù)DNA或其它生物物質(zhì)不受氧化。根據(jù)本發(fā)明，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或者編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，無論單獨(dú)或與其它藥劑、載體或賦形劑聯(lián)合使用可以任何給藥途徑，諸如海綿體內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、皮內(nèi)注射、口服或局部用藥。本方法可以單位劑量、一次用量針劑或備有防腐劑容器的多劑量使用。該配方可以采用懸濁液，溶液或油質(zhì)或水質(zhì)賦形劑的乳濁液形式，并且可包含懸浮劑、穩(wěn)定劑和(或)分散劑。例如，活性成分也可是粉狀，在使用前與適合的載體、無菌不含熱源的水或其他溶劑混合。本發(fā)明的局部用藥可以采用泡沫狀物、凝膠體、霜、藥膏、透皮藥膏或軟膏。用于本發(fā)明的藥物學(xué)上可接受的組合物和方法包括但不限于美國專利Nos.5,736,154、6,197,801Bl、5,741,511、5,886,039、5，941，868、6，258，374Bl和5，686，102中。用于治療、預(yù)防的藥物劑量大小將隨治療疾病的嚴(yán)重程度和給藥途徑變化。劑量和劑量頻率也將根據(jù)病人年齡、體重、狀況和反應(yīng)相適應(yīng)。主治醫(yī)生應(yīng)當(dāng)知道怎樣和何時(shí)由于藥物毒性或副作用終止、中斷或?qū)⒅委熣{(diào)整到低劑量。相反，醫(yī)生應(yīng)當(dāng)知道怎樣和何時(shí)由于臨床作用不足(排除毒性副效應(yīng))將治療調(diào)整到高水平。任何適合的給藥途徑可以使用。劑型包括片劑、錠劑、扁囊劑、分散劑、懸濁液、溶液、膠囊、藥膏和類似形態(tài)(參考，雷明頓藥物治療科學(xué))。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸可單獨(dú)使用或作為活性成分，根據(jù)傳統(tǒng)藥物混合技術(shù)形成緊密混合物與其它藥劑聯(lián)合使用，如P-環(huán)糊精和2-羥基-丙基-P-環(huán)糊精的藥物治療載體或賦形劑。載體根據(jù)可能的使用方式，局部或注射用藥，采取多種配制形式。在制備用于注射劑的組合物時(shí)，例如靜脈注射或靜脈輸液，制藥介質(zhì)可使用水、乙二醇、油、緩沖液、糖、防腐劑、脂質(zhì)體和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的介質(zhì)。注射組合物的實(shí)例包括但不限于，5y。w/v的葡萄糖、生理鹽溶液或其他溶液。無論單獨(dú)或是與其它藥劑聯(lián)合使用，待給藥的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸的總劑量可以在瓶含有體積從lmL到2000mL的靜脈注射液中使用。根據(jù)所用總劑量，稀釋液體積有所變化。本發(fā)明還提供了進(jìn)行本發(fā)明治療方案的試劑盒。該試劑盒包括置于一個(gè)或多個(gè)容器中的單獨(dú)或與其它藥劑聯(lián)合使用的藥物學(xué)上可接受形式的有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸。優(yōu)選的藥物形式是與無菌生理鹽水，葡萄糖溶液、緩沖液溶液或制藥上可以接受的其它無菌液聯(lián)合使用?？蛇x擇方式，該藥物組合物可用凍干或干燥方法產(chǎn)生；試劑盒可包括存于一個(gè)容器中的藥學(xué)上可接受的溶液、優(yōu)選無菌液，以形成復(fù)合物注射溶液。典型的藥學(xué)上可接受的溶液是生理鹽水和葡萄糖溶液。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含用于注射組合物的無菌包裝的注射針或注射器和(或)包裝的酒精襯墊。適合于醫(yī)生或病人使用本組合物的指示性說明包含在試劑盒中。H.實(shí)施例本發(fā)明的研究者發(fā)現(xiàn)重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(rhNRG-1PS177.Q237)可以修復(fù)損傷的心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)心肌細(xì)胞之間的連接，改善心肌功能，加強(qiáng)心肌生物學(xué)功能。以下研究揭示了發(fā)現(xiàn)重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(rhNRG-lj3sm.Q237)在體內(nèi)可有效治療各種心血管疾病如病毒性心肌炎或DCM、藥源性心臟毒性、心肌梗死，同時(shí)不影響正常動物血液動力學(xué)。實(shí)施例l.重組神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的制備圖1.人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白工程菌株的構(gòu)建設(shè)計(jì)方案的技術(shù)路線。人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因定位于染色體8P12，有13個(gè)外顯子結(jié)構(gòu)。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白|32片段由61個(gè)氨基酸組成，理論分子量為7055D,SDS-PAGE電泳表觀分子量為6500-7000D，等電點(diǎn)在6.5左右，無糖基化位點(diǎn)，含三個(gè)二硫鍵，適合用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。選用PET22b作為表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)過篩選得到髙表達(dá)重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的工程菌株。圖2.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的擴(kuò)增。從人5個(gè)月胚胎腦組織提取總RNA和mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，32以此為模板，進(jìn)行RT-PCR獲得目的基因。引物為P1,TCGAACATATGAGCCATCTTGTAAAATGTGCGG(SEQIDNO:1)andP2，TCG擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳，可見特異的183bp大小擴(kuò)增片段，與設(shè)計(jì)片段長度相符。泳道l是擴(kuò)增大小為183bp的目的片段，泳道2、3為DNAMarkers。圖3.PET22b質(zhì)粒物理圖譜圖4.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。用氯化鈣沉淀法將人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因克隆至PET22b表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建成重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)質(zhì)粒(PET22b-人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)，此蛋白在T7啟動子的驅(qū)動下，高效表達(dá)。表達(dá)基因N端從NdeI位點(diǎn)插入，C端有終止子緊接在最后一個(gè)氨基酸處，所得蛋白不與任何氨基酸形成融合蛋白。經(jīng)酶切切出約183bp的正確片段。轉(zhuǎn)化子經(jīng)酶切鑒定后，提取雙鏈DNA進(jìn)行核甘酸序列測定。結(jié)果證實(shí)，表達(dá)載體上的人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白序列完全正確。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白cDNA的順序?yàn)锳GCCATCTTGTAAAATGTGCGGAGAAGGAGAAAACTTTCTGTGTGAATGGAGGGGAGTGCTTCATGGTGAAAGACCTTTCAAACCCCTCGAGATACTTGTGCAAGTGCCCAAATGAGTTTACTGGTGATCGCTGCCAAAACTACGTAATGGCCAGCTTCTACAAGGCGGAGGAGCTGTACCAG(SEQIDNO:3)根據(jù)上述cDNA順序編碼的氨基酸順序?yàn)镾HLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ(SEQIDNO:4)圖5.高效表達(dá)工程菌鑒定。取經(jīng)PCR和酶切鑒定的工程菌克隆(BL21-PET22b-人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)，隨機(jī)挑選一系列單菌落接種于2mlLB-Amp液體培養(yǎng)基，置37'C、250rpm培養(yǎng)過夜，然后按一定比例接種于20mlLB-Amp培養(yǎng)液中，37'C培養(yǎng)至OD6oo達(dá)1.0時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)4h，收集菌體。破菌后收集包涵體，15%SDS-PAGE電泳、薄層掃描分析、Western-blotting鑒定，33經(jīng)反復(fù)篩選獲得一株穩(wěn)定高表達(dá)目的蛋白神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的工程菌(BL21-PET22b-人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)。該菌株表達(dá)的目的蛋白占菌體總蛋白的10%左右。經(jīng)高壓勻漿破菌后，目的蛋白以包涵體形式存在。工程菌在IPTG誘導(dǎo)4h后，菌體經(jīng)SDS-PAGE電泳，包涵體占菌體總蛋白20%左右；純化后的重組神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白比活性>5xl03EU/mg，表明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白工程菌株構(gòu)建成功。在篩選工程菌時(shí)進(jìn)行的SDS-PAGE、WesternBlot、生物學(xué)活性測定的基礎(chǔ)上，進(jìn)行人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白氨基酸組成分析、N-末端序列分析，表明所表達(dá)的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白氨基酸序列與設(shè)計(jì)相符。實(shí)施例2.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對冠狀動脈結(jié)扎所致大鼠心力衰竭的治療作用1摘要目的研究重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(rhNRG-l(3s，77.Q237)對冠狀動脈結(jié)扎所致大鼠心力衰竭的治療作用。方法大鼠開胸，用醫(yī)用無損傷縫合線，在左心耳和肺動脈圓錐之間結(jié)扎冠狀動脈前降支，建立大鼠心臟亞急性心力衰竭模型。通常在結(jié)扎后6天左右，大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)下降50%左右時(shí)，將模型動物隨機(jī)分組，設(shè)置模型組、受試藥組和假手術(shù)組即只開胸，不結(jié)扎冠狀動脈組。每組1013只，受試藥組設(shè)置3個(gè)劑量，分別為5、10、20ng/kg，尾靜脈注射，每天一次，連續(xù)10天。第6天給藥前進(jìn)行心功能(超聲)檢測，用藥結(jié)束后再次進(jìn)行心功能檢測，并解剖試驗(yàn)動物，稱心重、測心室壁厚度，進(jìn)行心臟病理學(xué)檢查以及血漿腎素-血管緊張素-醛固酮水平檢測等。結(jié)果較之模型組動物的射血分?jǐn)?shù)(50.2±8.4%)和縮短分?jǐn)?shù)值(22.4±4.6%)，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3個(gè)劑量，連續(xù)用藥5天，均能升高模型動物的射血分?jǐn)?shù)(71.1±12.0%、64.4±12.90/0、62.9±8.4%)和縮短分?jǐn)?shù)(36.9±9.7%、32.0±9.5%、30.3±6.1%)，20pg/kg、10嗎/kg與模型組比較，差異有顯著性(p<0.01)，并且20|ig/kg用藥組模型動物射血分?jǐn)?shù)的改變可維持用藥后35天左右(p<0.05);20ng/kg重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能明顯減小心肌缺血缺氧面積，增加纖維化病灶區(qū)毛細(xì)血管數(shù)(p〈0.05);20pg/kg、lOpg/kg重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能降低模型動物外周血中血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(AII)、腎素(PRA)、醛固酮(ALD)的水平，與模型組相比，差別有顯著性(p<0.01，p<0.05);連續(xù)用藥10天，以上各參數(shù)與連續(xù)用藥5天相比，無明顯變化(p>0.05)。結(jié)論一定劑量的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，連續(xù)靜脈注射5天，能有效治療冠狀動脈結(jié)扎所致大鼠的心力衰竭。2試驗(yàn)?zāi)康挠^察重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對冠狀動脈結(jié)扎所致大鼠心力衰竭的治療作用。3受試藥物重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，上海澤生科技開發(fā)有限公司研制，批號200110006-2;濃度500嗎/支;效價(jià)測定5000u/支;純度>95%(HPLC陽C8)。4實(shí)驗(yàn)動物4.1品系、來源、合格證號SD大鼠，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號中科院動管會003號；4.2體重、性別200~220g，雄性。5試劑、儀器5.l心臟超聲心動檢測儀，HewlettPackardsonos5500，探頭型號S12;5.2六導(dǎo)電生理記錄儀，SMUP-C-6型，上海醫(yī)科大學(xué)生理教研室研制；5.3精密電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；5.4動靜脈留置針，20G，中美合資溫州華利醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；5.5微型游標(biāo)卡尺，哈爾濱量具刃具廠；5.6Y放射免疫計(jì)數(shù)器，GC-1200，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司，中佳光電儀器分公司；5.7腎素、血管緊張素檢測試劑盒，AI:北京北方生物技術(shù)研究所，批號0210;All:北京北方生物技術(shù)研究所，批號0208;ALD:35北京北方生物技術(shù)研究所，批號0208;5,8脫毛劑，8%硫化鈉，廣東西隴化工廠，批號010622;5.9鹽酸氯胺酮注射液，上海中西藥業(yè)股份有限公司，批號20010401。6實(shí)驗(yàn)方法6.l實(shí)驗(yàn)組別實(shí)驗(yàn)設(shè)置假手術(shù)組、模型組、受試藥組。假手術(shù)組(n=10)，即開胸，但不結(jié)扎冠脈；模型組(陰性對照組)(n-12):即注射制劑配方賦形劑(10mMPB，0.2%人血清白蛋白，5%甘露醇)；受試藥組(n=13):重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白組，3個(gè)劑量，每個(gè)劑量分設(shè)2組，一組作為用藥后長期觀察。6.2受試藥物劑量設(shè)置及藥物配制、給藥途徑、給藥次數(shù)、給藥濃度和容積參考受試藥預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置高、中、低三個(gè)劑量組，分別為20!ig/kg、10嗎/kg、5嗎/kg。用制劑配方緩沖液(10mMPB，0.2%人血白蛋白，5%甘露醇)稀釋受試藥物至所需濃度；受試藥組和模型組給藥途徑均為大鼠尾靜脈注射，每天一次(qd)，連續(xù)給藥5天。第6天給藥前行心功能(超聲)檢測后，再連續(xù)給藥5天。每次給藥容積為0.4ml/100g體重。6.3試驗(yàn)方法6.3.1大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎致心力衰竭動物模型的建立大鼠腹腔注射氯胺酮100mg/kg麻醉后，仰臥固定于鼠板，頸部及胸部去毛后用新潔爾滅消毒。頸部做正中切口，鈍性分離頸前肌肉找到氣管，用18G動靜脈留置針于第3-5氣管軟骨間穿入氣管后，退出針芯，將塑料套管推入氣管內(nèi)l-2cm，固定后以備接小動物呼吸機(jī)(潮氣量約20ml，頻率80次/分鐘)。胸部左前皮膚切開后，鈍性分離胸部肌肉，暴露第4、5肋骨，用彎頭紋式止血鉗從肋間穿透胸壁，分離肋骨下組織后剪斷第4肋，接通開啟呼吸機(jī)，暴露心臟，觀察肺充氣及心跳情況，撕開心包，將上部脂肪墊上翻，充分暴露左心耳和肺動脈圓錐，于二者之間用6/0醫(yī)用無損傷縫合線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，可看到結(jié)扎后病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病區(qū)(約8mmx8mm)局部呈現(xiàn)紫色，膨突，活動明顯減弱，然后縫合胸壁，堵住呼吸機(jī)回氣口使肺充盈后，用力擠壓胸部以排氣，再縫合胸部肌肉和皮膚。觀察呼吸情況，看到有自主呼吸后去除呼吸機(jī)，放回籠內(nèi)詞養(yǎng)。假手術(shù)組開胸后撕開心包，不結(jié)扎冠狀動脈。術(shù)后6天左右，對手術(shù)大鼠進(jìn)行心超檢測，選用EF值下降到50。/。左右的大鼠，按EF值重新隨機(jī)分組，使每組EF值均為50。/。左右，開始給藥。6.3.2藥效試驗(yàn)將EF值為50%左右的模型動物隨機(jī)分組，分別為模型組(陰性對照組)，3個(gè)劑量的受試藥組，每組1213只。受試藥組和模型組給藥途徑均為尾靜脈注射，每天一次(qd)，連續(xù)給藥5天。第6天給藥前行心臟超聲檢測后，再連續(xù)給藥5天。每次給藥容積為0.4ml/100g體重。用藥結(jié)束后再次進(jìn)行心超檢測，并解剖試驗(yàn)動物，稱心重，測心室壁厚度，進(jìn)行心臟病理檢查，收集外周血，分離血漿，進(jìn)行腎素-血管緊張素-醛固酮含量測定。另留存不同組別的受試動物，進(jìn)行長期觀測。6.3.3觀測指標(biāo)6.3.3.l心功能檢測分別于大鼠結(jié)扎后用藥前、用藥第6天、11天(共3次)，氯胺酮麻醉狀態(tài)下，進(jìn)行心臟超聲心動圖檢測，主要指標(biāo)包括EF:心室射血分?jǐn)?shù)，反應(yīng)心室射血功能；FS:心室短軸縮短率，反應(yīng)心室收縮功能；LVDd:左心室舒張期最大內(nèi)徑(cm);LVDs:左心室收縮期最小內(nèi)徑(cm)。376.3.3.2血漿腎素-血管緊張素-醛固酮含量檢測委托復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院同位素室進(jìn)行。大鼠頸動脈放血，按試劑盒要求留取血漿，-2(rc凍存。用放免法檢測腎素活性(PRA)、血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(AII)、醛固酮(ALD)含量。6.3.3.3心肌病理組織切片委托上海市疑難病理會診中心王炳森教授進(jìn)行。大鼠心臟經(jīng)10%福爾馬林液固定后，沿心臟長軸3等分切取心肌，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，對各組動物心臟纖維化區(qū)域面積進(jìn)行圖像分析，并計(jì)數(shù)纖維化病灶內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)(計(jì)量單位個(gè)/mm2);Nagar-oslen染色，觀察各組心肌缺血缺氧區(qū)域大小。7數(shù)據(jù)處理所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。8實(shí)驗(yàn)結(jié)果8.l重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對大鼠缺血心臟功能的影響用藥5天進(jìn)行心超檢測的結(jié)果顯示，模型組EF值(50.2±8.4%)和FS值(22.4±4.6%)明顯低于假手術(shù)組EF(91.1±2.4%)和FS(57.3±3.9%)，兩者比較具有顯著性差異(PO.Ol)。用藥組(20、10、5jig/kg)的EF值(71.1±12.0%、64.3土12.8%、62.9±8.4%)及FS值(36.9±9.7%、32.0土9.5%、30.3±6.1%)均明顯回升，與模型組比較具有顯著性差異(PO.Ol)。用藥IO天后再次心超檢測的結(jié)果顯示，模型組EF值(42.7i6.4n/。)和FS值(18.3±3.2%)仍明顯低于假手術(shù)組EF(95.0±2.8%)和FS(65.3±6.8%)，具有顯著性差異(P<0.01)。而用藥組(20、10、5ng/kg)EF值(75.7±10.8%、61.4±15.0%、59.2±12.4%)禾口FS值(41.3±11.0%、30.3±10.4%、28.4±8.6%、)仍保持較高水平，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.01)，但與用藥5天相比無顯著性差異(p>0.05)。兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表16。用藥5天，停藥后35天觀察模型動物和受試藥組大鼠心臟EF值變化，結(jié)果顯示，20jig/kg的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白用藥組大鼠心臟EF值持續(xù)穩(wěn)定在較高水平，與模型組比較，差別有顯著性(p<0.05)(表7)。表1大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎致心力衰竭模型動物用藥前心功能測量組別LVDdLVDsEFFS假手術(shù)組(11=6)0.572±0.033*0.258±0.046**89.5±4.4**55.2±5.8**模型組(n:12)0.705±0.1170.558±0.11948.3±10.321.3±5.6神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白組20pg/kg(i^l3)0.73O土O.1080.575±0.11949.3±11.421.7±6.4神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白組l(Hig/kg(n=13)0.709±0.0990.555±0.10249.5±11.022.1±6.1神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白組5ng/kg(n-13)0.761±0.0750.596±0.09249.3±10.622.0±5.9與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01表2大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎致心力衰竭模型動物用藥5天后心功能測量參數(shù)組別給藥方案LVDdLVDsEFFS假手術(shù)組(n-6)Wqdx5~~0.549±0.046**模型組(n=12)ivqdx50.79±0.080.234±0.027**9U±2.4**57.3±3.9**0.61±0.0950.24±8.4122.43±4.62神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白.20ng/kg(n=13)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10ng/kg(n=13)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白.ivqdx50.70±0.07**0.46±0.09**71.07±11.99**36.88±9.66**ivqdx50.71±0.05*0.51±0.09**64.35±12.85**32.01±9.54**5一g(n-n)ivqdx50.73±0.05*0.54±0.09*62.90±8.39**30.32±6.11**與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01表3大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎致心力衰竭模型動物用藥10天后心功能測量參數(shù)組別給藥方案LVDdLVDsEFFS假手術(shù)組(n=6)模型組(n=10)ivqdx100.8±0.11ivqdx100.466±0.041**0.159±0.036**95.0±2.8**65.3±6.8**0.7±0.1142.7±6.3618.3±3.19紐蘭格20嗎/kg(n.ivqdx100.6±0.12**0.5±0.14**75.7±10.78**41.3±10.98**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10一g(n,神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白5pg/kg(n,ivqdx100.7士0.07"0.51±0.14**61.4±15**30.3±10.36**ivqdx100.72±0.10*0.55±0.12*59.2±12.37**28.4±8.62**與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01表4大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎致心力衰竭模型動物用藥前心功能測量組別LVDdLVDsEFFS假手術(shù)組(n-6)0.544±0.071*0.215±0.053**93±2.9**60.8±5.2**模型組(n-12)0.66±0.100.52±0.1146.98±14.1720.85±7.38神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白20ng/kg(n=12)0.74±0.120.56±0.1152.29±12.8723.89±7.28神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10pg/kg(n=12)0，64±0.110.49±0.1151.67±11.9223.27±6.73神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白5ng/kg(n=12)0.66±0.110.51±0.1250.8U12.5522.83±6.92與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01表5.大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎致心力衰竭模型動物用藥5天后心功能測量參數(shù)組別給藥方案LVDdLVDsEFFS假手術(shù)組(n-6)iv0.5530.21593.161.4qdx5士0.063"士0.052"±3.9**±6.2**模型組(n-10)iv0.870.7438.0016.35qdx5±0.11±0.14±12.36±5,55神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白i.v0.680.4665.4734.2320嗎/kg(n=9)qdx5±0.17**±20.48**±15.42**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iv0.720.5456.5126.5310ng/kg(n=12)qdx5±0.13**±0.14**±12,68**±8.48**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iv0.740.5856.7628,355嗎/kg(n-10)qdx5±0.11*±16.10"±10.64**與模型組相比,*p<0.05，"p<0.01表6大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎致心力衰竭模型動物用藥10天后心功能測量參數(shù)組別給藥方案LVDdLVDsEFFS假手術(shù)組(n=6)模型組(n=10)iv0.5390.20493.862.210qd±0.015**±0.017**±1.6**±3.6**iv0.810.6936.1315.1810qd±0.13±0.13±10.10±5.0140<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*與模型組比較，p<0.05;**與模型組比較，p<0.018.2重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型大鼠心肌病理組織學(xué)的影響8.2，l重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型大鼠缺血心肌缺血缺氧程度的影響Nagar-oslen染色，正常心肌著色淺，呈黃色，缺血缺氧區(qū)域著色深，呈紅色。用該方法可以分析心肌缺血缺氧的變化并進(jìn)行定性或半定量比較。各試驗(yàn)組動物病理組織學(xué)改變詳見圖1~10。模型組心肌組織著色深，大片心肌染成紅色，而假手術(shù)組呈均一的黃色，沒有紅染區(qū)；重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白20嗎/kg組，紅染心肌細(xì)胞僅呈點(diǎn)狀分布；10pg/kg、5lig/kg組，紅染組織呈片狀分布，表明重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能減輕心肌缺血、缺氧程度。8.2.2重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型大鼠缺血心肌纖維化區(qū)域毛細(xì)血管再生的影響應(yīng)用Leica圖像分析系統(tǒng)檢測各實(shí)驗(yàn)組心肌組織毛細(xì)血管數(shù)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白用藥組模型動物的心肌纖維化病灶區(qū)毛細(xì)血管數(shù)增加，20嗎/kg組與模型組比較有顯著性差異(P<0.01)，10|ag/kg、5ng/kg組與模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明高劑量(20pg/kg)的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能促進(jìn)冠脈結(jié)扎后大鼠心肌纖維化病灶區(qū)毛細(xì)血管增生(詳見表8，圖ll，12)。表8重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物心肌纖維化區(qū)域毛細(xì)血管再生的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>**與模型組相比，P<0.018.3重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物血漿腎素-血管緊張素-醛固酮水平的影響用放射免疫法測定不同試驗(yàn)組動物血漿腎素(PRA)、血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(All)、醛固酮(ALD)水平。結(jié)果顯示模型組PRA、AI、AII、ALD分別為3.506士1.78ng/ml.h、10.655±1.18ng/ml、1366息577.33pg/ml、1.738±0.34ng/ml，與假手術(shù)組(分別為1,315±0.96ng/ml.h、8.125±1.57ng/ml、564.37±273.56pg/ml、1.113±0.45ng/ml)相比，含量顯著升高，差別具有顯著性(PO.05)。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白20、10嗎/kg組模型動物血漿AI(7.40±12.15、7.65±1.40ng/ml)、All(641.47±283.86、468.58±165.10pg/ml)水平顯著降低，與模型組比較，差別有顯著性(PO.01);PRA(1,337±1.09、1.075±1.50ng/ml.h)、ALD(1.02士0.27、1.26±0.38ng/ml)水平亦顯著下降，與模型組比較差異具有顯著性(P<0.05)。但與假手術(shù)組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)。表明一定劑量的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(20、10ng/kg)能降低冠狀動脈結(jié)扎大鼠血液中PRA、AI、AII、ALD含量(詳見表9)。表9不同實(shí)驗(yàn)組模型動物血漿腎素(PRA)、血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(AII)、醛固酮(ALD)水平組別給藥方案Al(ng/ml)AH(Pg/ml)ALD(ng/ml)PRA(ng/mrh)假手術(shù)iv8.125564.3701.1131.315n=6qdxlO±1.573*±273.56*±0.447*±0.96*模型組(n=6)iv10.6551366.381.7383.506qdxlO±1.178±577.33±0.337±1.78神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iv7.400641.471.0181.33720pg/kg(n=6)qdxlO±2.15**±283,86*±0.266**±1.09*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iv7.654468.5831.2641.07510pg/kg(n=6)qdxlO±1.399**±165.1**±0.382*±1.5*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iv10.036807.3041.4724.0325(ag/kg(n=6)qdxlO±2.283±333.46±0.413±1.81與模型組比較，*p<0.05，**p<0.019結(jié)論較之模型對照動物的射血分?jǐn)?shù)(50.2±8，4%)和縮短分?jǐn)?shù)值(22.4士4.6%)，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3個(gè)劑量，連續(xù)用藥5天，均能升高模型動物的射血分?jǐn)?shù)(71.1±12.0%、64.4±12.9%、62.9±8.4%)禾口縮短分?jǐn)?shù)(36.9±9.7%、32.0±9.50/o、30.3±6.1%)，20fig/kg、10|ig/kg與模型組比較，差異有顯著性(p<0.01)，并且20pg/kg用藥組模型動物射血分?jǐn)?shù)的改變可維持用藥后35天左右(p<0.05);20pg/kg重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能明顯減小心肌缺血缺氧面積，增加纖維化病灶區(qū)毛細(xì)血管數(shù)(p<0.05);20ng/kg、10|ag/kg重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能降低模型動物外周血中血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(AII)、腎素(PRA)、醛固酮(ALD)的水平，與模型組相比，差別有顯著性(p〈0.01，p<0.05)。連續(xù)用藥10天，以上各參數(shù)與連續(xù)用藥5天相比，無明顯變化(pX).05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，一定劑量的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，連續(xù)靜脈注射5天，能有效治療冠狀動脈結(jié)扎所致的大鼠心力衰竭。實(shí)施例3.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對阿霉素致SD大鼠心力衰竭的治療作用1摘要目的觀察重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對阿霉素致大鼠中毒性心肌炎的治療作用。方法選用SD大鼠，3.3mg/kg阿霉素尾靜脈注射，每周一43次，連續(xù)4次，建立阿霉素致SD大鼠中毒性心肌炎模型。受試藥重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白設(shè)置3個(gè)劑量組，分別為10、20、4(Vg/kg，靜脈注射，每天一次(qd)，連續(xù)10天。試驗(yàn)期間觀測模型動物的存活率；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，監(jiān)測模型動物的血流動力學(xué)指標(biāo)，測心重/體重比，心肌組織進(jìn)行病理學(xué)檢查并進(jìn)行血清肌鈣蛋白T(cTnT)水平測定。結(jié)果較之模型組15%的動物存活率，40、20、10昭/kg3個(gè)劑量的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白均顯著提高模型動物的存活率，分別達(dá)到85%，90%和60%;高、中、低3個(gè)劑量受試藥模型動物的dp/dt、-dp/dt、LVPmax值明顯提高，dp/dt分別為5954±689，6107±418，4875±636，-dp/dt分別為-4794±954，-4323±457，-3672±884,LVPmax分別為165.7±22.7，156.1±17.7，145±15.2，與模型組相比，差異均具有顯著性(p〈0細(xì))，而且40，20嗎/kg用藥組dp/dt、-dp/dt、LVPmax值與10ng/kg組相比，差別亦有顯著性(p<0.05)，并表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)依賴性；40、20、10嗎/kg3個(gè)劑量的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白均能有效減輕模型動物心肌損傷程度，降低血清中肌鈣蛋白T(cTnT)含量，分別為0.025±0.011，0.031±0.006，0.074±0.024，與模型組0.205±0.072相比，差別有顯著性(p〈0.01)。結(jié)論重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能有效治療阿霉素致大鼠的中毒性心肌損害。2試驗(yàn)?zāi)康挠^察重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對阿霉素致大鼠中毒性心肌炎的治療作用。3受試藥物重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，上海澤生科技開發(fā)有限公司提供。批號200110006-2，規(guī)格500嗎/支。效價(jià)測定5000u/支;純度>95%(HPLC-C8)。4實(shí)驗(yàn)動物SD大鼠復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號為醫(yī)動字第02-22-11。體重為250土30g，雄性。動物隨機(jī)分組，每組20只，分籠詞養(yǎng)。動物室溫度1822flC，相對濕度5070%。445試劑、儀器六導(dǎo)生理記錄儀(復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室研制，型號SMUP-C-6)換能器(日本光電工業(yè)株式會社，NIHONKOHDEN，型號TP-400T)電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀(2010型)羅氏診斷有限公司，批號158468)電子精密天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，Max:610gcH).01g)微型四用游標(biāo)卡尺(0-70mm)(哈爾濱量具刃具廠，0.05mm)動靜脈留置針(中美合資溫州華麗醫(yī)療器械有限公司)血清肌鈣蛋白檢測試劑盒(BehringDignosticInc.)6實(shí)驗(yàn)方法6.l實(shí)驗(yàn)組別實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組，模型組及受試藥組。模型組(陰性對照組)阿霉素，汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)明治醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)(批號000201，有效期2003.2)。受試藥組重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白組。6.2受試藥物劑量設(shè)置及藥物配制、給藥途徑、給藥次數(shù)、給藥濃度和容積受試藥設(shè)3個(gè)劑量組，分別為10、20、40嗎/kg劑量組。用lml注射用水溶解后，再用賦形劑調(diào)整到所需濃度。賦形劑主成分5%注射用甘露醇，0.2%注射人血白蛋白，10mM磷酸鹽緩沖液，由上海澤生科技開發(fā)有限公司提供。試驗(yàn)用藥臨用前配制。第一次注射阿霉素24h內(nèi)，尾靜脈注射重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，qdx10。根據(jù)體重調(diào)整劑量，給藥容積0.2ml/100g。6.3試驗(yàn)方法6.3.l動物心衰模型制作方法參照《新藥臨床前研究指導(dǎo)原則》，3.3mg/kg阿霉素尾靜脈注射，每周一次，連續(xù)注射4次，建立阿霉素致大鼠中毒性心肌炎模型。6.3.2藥效試驗(yàn)第一次注射阿霉素24h內(nèi)，尾靜脈注射重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，qdx10。試驗(yàn)期間，動態(tài)檢測動物的存活率，至第五周，監(jiān)測心功能指標(biāo)(左室內(nèi)壓最大上升速率，dt/dpmax，左室內(nèi)壓最大下降速率，-dp/dt，左室收縮末壓LVPmax，左室舒張末壓LVPmin)。取心臟組織，切片觀察心肌組織的病理變化。6.3.3觀察指標(biāo)6.3.3.l存活率每周記錄動物的存活情況，并計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組存活率。存活率(％)=存活動物數(shù)/實(shí)驗(yàn)動物數(shù)xl00%。6.3.3.2心重/體重比，心臟組織病理切片開胸剪取心臟(注意保留心房)，吸紙吸干后稱重，計(jì)算心重/體重比；在心臟垂直位1/2處測量外周直徑；將左心室中部橫向切開，測量左室游離壁的最大厚度；用10%福爾馬林固定心臟，常規(guī)石蠟包埋切片后HE染色，光鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)，給出病理評分。病理評分標(biāo)準(zhǔn)0級正常心肌結(jié)構(gòu)，心肌細(xì)胞無萎縮與肥大，無空泡，橫紋清晰；心肌排列整齊；心內(nèi)、外膜均無異常；血管和間質(zhì)無變化。1級散在的單個(gè)心肌細(xì)胞表現(xiàn)為局部肌漿溶解和空泡，而鄰近的心肌細(xì)胞仍正常。2級小至中等范圍的成簇心肌細(xì)胞表現(xiàn)有萎縮、肌漿溶解和空泡，可見小灶性心肌細(xì)胞壞死。3級大范圍彌漫性心肌細(xì)胞萎縮、肌漿溶解或空泡，有較明顯的壞死。根據(jù)情況，可在1至2級，2至3級之間評分，如1.5、2.5等。6.3.3.3血流動力學(xué)指標(biāo)測定動物麻醉狀態(tài)下，用六導(dǎo)生理記錄儀記錄頸動脈壓、室內(nèi)壓、dp/dt等血流動力學(xué)指標(biāo)。主要步驟分離右側(cè)頸總動脈，結(jié)扎其遠(yuǎn)心端，用動脈夾阻斷其近心端，在兩端之間用20G動靜脈留置針穿入頸總動脈，取出金屬針芯，放掉動脈夾，將留置針?biāo)芰咸坠芟蛐耐迫脒m當(dāng)深度，留置10分鐘，觀察生理記錄儀顯示的波形，待穩(wěn)定后記錄頸動脈壓，再將套管進(jìn)一步插入左心室，留置15分鐘，待其穩(wěn)定后記錄dp/dt，-dp/dt，LVPmax，LVPmin等數(shù)值。6.3.3.4血清肌f!蛋白T(cTnT)水平檢測采集動脈血2ml，收取血清，-20\:凍存。委托中山醫(yī)院檢驗(yàn)科用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清cTnT含量。7數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)資料以X土SD表示。組間差異用單因素方差分析。8試驗(yàn)結(jié)果8.1阿霉素可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生中毒性心肌炎并心力衰竭見表IO，圖13。阿霉素3.3mg/kg，每周一次，連續(xù)4次靜脈給藥，五周后，SD動物存活率為15。/。，存活大鼠心功能明顯受損，其dp/dt、-dp/dt、LVPmax、LVPmin分別為正常的43%，47%，58%，37%，心肌組織病理評分為2.33土0.26，相對病變率為100%，血清cTnT值明顯升高，達(dá)0,2ng/ml。表明成功建立了阿霉素致大鼠中毒性心肌炎并致心力衰竭模型。表10阿霉素誘導(dǎo)SD大鼠中毒性心肌炎模型各項(xiàng)檢測指標(biāo)模型組動物存活率(％)心肌組織病理評分dp/dt(mmHg/s)-dp/dtLVPmax(mmHg)LVPmincTnT(ng/ml)心重/體重6235±423-45卯±1003181.4±15.4-27.1+10.22.33±0.26*2674±446**-2141+596**106.1+21.2左室壁厚度(mm)1.88±0.151.73±0.16心臟周長(mm)31.0±1.130.6±0.1n=20，X土SD，與正常組比較，方差分析，*p<0.05~~**/;<0.0018.2重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物存活率的影響結(jié)果表明，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3個(gè)劑量，都明顯降低模型動物的死亡率，20pg/kg劑量組模型動物存活率高達(dá)卯％(p〈o.on(圖14)。8.3重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物心功能的影響用藥后，各受試藥組動物的dp/dt、LVPmax均有升高。用SPSS軟件，經(jīng)單因素方差分析，組間比較，受試藥組(40、20、10pg/kg)動物的dp/dt、-dp/dt明顯高于模型組(/><0.001)，與對照組比較差別無顯著性(P>0.05)。40、20昭/kg受試組明顯高于10嗎/kg組(尸<0.01);受試藥組(40、20、10嗎/kg)動物的LVPmax也明顯高于模型組(P<0.001)，而且各用藥組之間的差異亦有顯著性(P<0.05)。表明重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能有效改善模型動物的心功能且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。二次試驗(yàn)結(jié)果一致，詳見表ll，12。表ll重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物心功能參數(shù)的影響(I)+dp/dt-dp/dtLVPmaxLWmin組別給藥方案(mmHg/s)(mmHg/s)(mmHg)(mmHg)正常對照組(n=8)6235±423**-45卯±畫**181.4±15.4**-27.1±10.2**模型組(n=6)ivqdxlOd2674±446-2141±596106.1±21.2-10±4.7神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白40pg/kg(n=8)ivqdxlOd5954±689**-4794±954**165.7±22.7**-27.4±10**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白20pg/kg(n=8)ivqdxlOd6107±418**-4323±457**156.1±17.7**-26.9±9.7**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10|ag/kg(n=8)ivqdxlOd4875±636**-3672±884"145±15.2**-24.5±9.6**與模型組相比，*p<0.05:**p<0.001表12重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物心功能參數(shù)的影響(II)+dp/dt-dp/dtLVPmaxLVPmin組別給藥方案(mmHg/s)(mmHg/s)(mmHg)(mmHg)正常組(n-8)5872±342**-4626±896**159±25**-22.7±12*模型組(n=8)ivqdxlOd2675±359-2137±334103.9±11.5-11.3±5.448神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(n-7)40嗎/kgivqdxlOd604R461**-4529±274**166.3±12.4**-22.2±11.4*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(n-7)20|ig/kgivqdxlOd5833±416**-4345±807**157.7±12**-26.6±7,4*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(n-8)10(ig/kgivqdxlOd4956±352**-3626±1056**158.2±22.9**-22.4±18與模型組相比，*p<0.05;**p<0.0018.4重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物心肌組織結(jié)構(gòu)的影響重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白明顯降低模型動物心肌細(xì)胞損害程度，病理評分明顯降低，與模型組相比，差別有顯著性(p<0.01，p<0.05)。二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表13，14，圖15。表13重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物心肌組織病理變化的影響iH給藥方案病理評分正常組(n-6)0.00±0.00**模型組(n=6)ivqdxlOd2.33±0.26神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白40pg/kg(n=6)ivqdxlOd0.33±0.41**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白20ng/kg(n=6)ivqdxlOdU7±0.93*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10pg/kg(n=6)ivqdxlOd1.83±0.41*與模型組相比，*p<0.05;**p<0.0114重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物心肌組織病理變化的影響組別給藥方案病理評分正常組(n-6)o±o"模型組(n=6)ivqdxlOd2.75±0.274神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白40|ag/kg(n=6)ivqdxlO0.583±0.204**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白20嗎/kg(n=6)ivqdxlOd1.667±0.931*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10^ig/kg(n=6)ivqdxlOd2.167士0.516111與模型組相比，*p<0.05;**p<0.018.5重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物血清cTnT的影響用藥后，各組動物血清中cTnT含量明顯降低，高、中、低受試藥組動物血清中cTnT明顯低于模型組(P<0.001)。二次試驗(yàn)結(jié)果一致，見表15，16。表15重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物血清cTnT的影響(I)組別給藥方案cTnT(ng/ml)正常組(n-5)0週±0扁**模型組(n=6)ivqdxlOd0.205±0.072神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白40pg/kg(n=6)ivqdxlOd0.025±0.011**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白20嗎/kg(n=6)ivqdxlOd0.031±0馬**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10嗎/kg(『6)ivqdxlOd0.074±0.024"與模型組相比，**p<0.001表16重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物血清cTnT的影響(II)組別給藥方案cTnl(ng/ml)正常組(11=6)0.433±0.079**模型組(『6)ivqdxlOd20.525±20.638神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白40|ag/kg(n=6)ivqdxlO0.874±0.108"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白20嗎/kg(n=6)ivqdxlOd1.677±0.589**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10嗎/kg(n-6)ivqdxlOd8.342±13.537**與模型組相比，**p<0.0018.6重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物心臟大小的影響試驗(yàn)結(jié)果詳見表17，18。受試藥組模型動物心臟的物理參數(shù)沒有明顯改變，各組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。表17重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物心臟大小的影響(I)組別給藥方案心重/體重左室壁厚度(mm)正常組(11=20)0.0032±0.00022.01±0.07**模型組(n=6)ivqdxlOdO扁l士O細(xì)l1.717土0.154神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白40ng/kg(n=蜂vqdxlOd0.003l士0扁21.813±0.12神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白20ng/kg(n=:18)ivqdxlOd0扁2士0扁11.789±0.133神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10pg/kg(n==13)ivqdxlOd0扁01士0細(xì)21.773±0.115與模型組相比，**p<0.01表18重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物心臟大小的影響(II)組別給藥方案心重/體重左室壁厚度(mm)正常組(n-20)0屈10±0.0002.19±0.2**模型組(n=10)ivqdxlOd0.00298±0.0002.065±0.17神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白40嗎/kg(n=18)ivqdxlO0,00297±0細(xì)2.06±0.2神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白20pg/kg(n=19)ivqdxlOd0扁03士0細(xì)2.15±0.24神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10pg/kgg(n-16)ivqdxlOd0屈07士0細(xì)2.18±0.2150與模型組相比，**p<0.019結(jié)論較之模型組15%的動物存活率，40、20、10pg/kg3個(gè)劑量的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白均顯著提高模型動物的存活率，分別達(dá)到85%，90%和60%;高、中、低3個(gè)劑量受試藥模型動物的dp/dt、-dp/dt、LVPmax值明顯提高，dp/dt分別為5954±689，6107±418，4875±636，-dp/dt分別為畫4794土954,-4323±457，畫3672土884，LVPmax分別為165.7±22.7，156.1±17.7，145±15.2，與模型組相比，差異均具有顯著性(p<0.001)，而且40，20(ig/kg用藥組dp/dt、-dp/dt、LVPmax值與10嗎/kgd組相比，差別亦有顯著性(p<0.05)，表現(xiàn)為一定的劑量效應(yīng)依賴性；40、20、lOp^kg3的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白均能有效減輕模型動物心肌損傷程度，降低血清中肌轉(zhuǎn)蛋白(cTnT)含量，分別為0.025士0.011，0，031土0.006，0.074±0.024，與模型組0,205土0.072相比，差別有顯著性(p<0.01)。試驗(yàn)結(jié)果表明重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白通過改善受損的心肌組織，減少cTnT的血清釋放及心肌纖維的壞死，增強(qiáng)心臟收縮功能，減少動物死亡率，有效治療阿霉素所致大鼠的中毒性心肌損傷。實(shí)施例4.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染致小鼠急性心肌損傷的治療作用本實(shí)驗(yàn)旨在研究重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(rhNRG-lPs,Q2")對病毒感染致小鼠急性心肌損傷的治療作用。實(shí)驗(yàn)包括二部分。第一部分旨在觀測重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒性心肌炎小鼠模型動物存活率、心臟功能和心肌組織病理變化、血清肌鈣蛋白(CTnI)水平等影響，確定最佳有效劑量；第二部分為重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不同用藥時(shí)間對上述指標(biāo)的具體影響，旨在確定最佳用藥時(shí)間。結(jié)果表明，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kg，連續(xù)靜脈注射5天，可減輕心臟組織的病理變化，降低血清中cTnl的濃度，改善心臟功能，提高模型動物的存活率，有效治療病毒感染所致小鼠的急性心肌損傷。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染致小鼠急性心肌損傷的治療作用1摘要51目的觀察重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒(CoxsackieB3)感染致小鼠急性心肌損傷的治療作用。方法小鼠腹腔注射柯薩奇B3病毒(CVB3)建立病毒感染致急性小鼠急性心肌炎模型。模型動物隨機(jī)分組，設(shè)置正常對照、模型組、受試藥組。每組20只。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白設(shè)置3個(gè)濃度，分別為30、15、7.5jig/kg，同一天開始尾靜脈注射，連續(xù)5天。試驗(yàn)期間，觀察模型動物存活率。第七天進(jìn)行心功能(心超)檢測，第八天處死小鼠，取血清進(jìn)行肌l丐蛋白I(cTnI)水平檢測，心臟病理組織學(xué)檢査等。結(jié)果重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30嗎/kg，15嗎/kg組EF值(90.2±2.5%，86.0±2.9%)，F(xiàn)S值(55.7±2.1%，50.7±4,3%)均明顯升高，與模型組比較有顯著性差異(PO.Ol)，LVDd值(0.187±0.006，0.189±0.008)和LVDs值(0.085±0.009,0.099±0.027)均顯著低于模型組(0.208±0.015，0.142±0扁)，P<0.05;重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能減輕模型動物心肌病理損害程度，有效降低模型動物血清中肌鈣蛋白(cTnl)水平，30fig/kg劑量組(7.98±6.07ng/ml)、15jig/kg劑量組cTnl(19.43±10.76ng/ml)明顯低于模型組(44.44±12.39ng/ml)，兩者相比，差別有顯著性(PO.OOl，PO.05);與模型組動物50%的存活率相比，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30)ag/kg組可顯著提高模型動物的存活率，達(dá)80%，p<0.05。結(jié)論一定劑量的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，能有效治療病毒感染致小鼠的急性心肌損傷。2試驗(yàn)?zāi)康挠^察重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染致小鼠急性心肌損傷的治療作用，確定最佳有效劑量。3受試藥物重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，上海澤生科技開發(fā)有限公司研制，批號200110006-2;濃度500ng/支；效價(jià)5000u;純度>95%(HPLC-C8)。4實(shí)驗(yàn)動物4.1品系、來源、合格證號4周齡純種BALB/C小鼠，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供，合格證號醫(yī)動字第22-9號。4.2體重、性別1012g，雄性。4.3每組動物數(shù)實(shí)驗(yàn)組每組20只，正常對照組為10只。5病毒柯薩奇B3病毒(CoxsackieVirusB3，CVB3)，Nancy株，由衛(wèi)生部病毒性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海市心血管研究所)提供。6材料、儀器6.1心臟超聲檢測儀，HewlettPackardsonos5500;探頭型號S12;6.2Immuno-AssaySystemOpusPlus,購自BehringDiagnosticInc.用于檢測血清中心肌鈣蛋白I(cTnl)，批號CTE8;6.3精密電子天平，KERN822;6.4注射用水，湛江安度斯生物有限公司，10x5ml，批號0112180;6.5脫毛劑，8%硫化鈉，廣東西隴化工廠，批號010622。7實(shí)驗(yàn)方法7.1實(shí)驗(yàn)組別實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常小鼠對照組、模型組、受試藥組、空白對照組。正常小鼠對照組(n=10);模型組即陰性對照組(n=20):給予制劑配方緩沖液(10mMPB，0.2%人血白蛋白，5%甘露醇)；受試藥組(n=20):重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白高、中、低3個(gè)劑量組；空白對照組(n=20):小鼠腹腔接種無CVB3的凍融細(xì)胞上清液，0.2ml/只；7.2受試藥物劑量設(shè)置及藥物配制、給藥途徑、給藥次數(shù)、給藥濃度和容積參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白設(shè)置高、中、低三個(gè)劑量組，分別為30pg/kg、15jig/kg、7.5pg/kg。用制劑配方緩沖液U0mMPB，0.2%人血白蛋白，5%甘露醇)稀釋受試藥物至所需濃度；受試藥組和模型組給藥均為小鼠尾靜脈注射，每天一次(qd)，連續(xù)給藥5天。每次給藥容積為0.2ml/只。537.3試驗(yàn)方法7.3.l小鼠急性病毒性心肌炎動物模型的建立由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院提供100xTCIDso的CVB3病毒，腹腔注射0.2ml/只，造成心肌炎模型。小鼠將于隨后的一周內(nèi)逐步出現(xiàn)豎毛、脫毛、消瘦、呆滯、死亡等表現(xiàn)，到第8天時(shí)死亡將近一半。7.3.2藥效試驗(yàn)于小鼠腹腔感染病毒當(dāng)天開始尾靜脈給藥，連續(xù)5天。試驗(yàn)期間，觀察動物的存活率，試驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行心臟超聲，心肌病理組織學(xué)檢查，血清肌鈣蛋白檢測。7.3.3觀測指標(biāo)7.3.3.l小鼠心功能檢測于注射病毒后第7天，將小鼠胸部脫毛，用優(yōu)力舒膠帶固定小鼠于特制的固定架上，用S12高頻探頭進(jìn)行心臟超聲心動圖檢測，主要指標(biāo)包括EF:左室射血分?jǐn)?shù)，反應(yīng)左心室射血功能的主要指標(biāo)；FS:左室縮短分?jǐn)?shù)，反應(yīng)左心室收縮功能的指標(biāo)；LVDd:左心室舒張期最大內(nèi)徑(cm);LVDs:左心室收縮期最小內(nèi)徑(cm);7.3.3.2小鼠血清中肌鈣蛋白I(cTnl)的檢測通過檢測血清中cTnl的釋放量來判斷心肌細(xì)胞損傷程度，比傳統(tǒng)的CK、LDH、AST等指標(biāo)具有高特異性、高敏感性等優(yōu)點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用檢測血清中cTnl的含量，作為反映心肌細(xì)胞損傷程度的客觀指標(biāo)。注射病毒后第8天，小鼠稱重后，眼眶取血，分離血清，-20'。冰箱凍存，用發(fā)光法測定血清cTnl。7.3.3.3小鼠心肌病理檢査委托復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病理教研室進(jìn)行。將存活小鼠頸椎脫臼致死，無菌開胸摘出心臟，稱重后，將心肌浸入福爾馬林液固定，石蠟包埋、連續(xù)切片，進(jìn)行病理學(xué)組織學(xué)檢査，觀察心肌細(xì)胞炎癥細(xì)胞浸潤、變性、壞死等病理改變。參考新藥評審指導(dǎo)原則，病理評分標(biāo)準(zhǔn)如下:0分病變面積為0%;1分病變面積為25%;2分病變面積為50%;3分病變面積為75%;4分病變面積為100%;介于兩者之間的可根據(jù)病變面積給予相應(yīng)的評分，如病變面積為80%評為3.2分。7.3.3.4小鼠存活率觀察試驗(yàn)期間，觀測不同用藥組模型動物的死亡情況。8數(shù)據(jù)處理所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)資料配對t檢驗(yàn)。9結(jié)果9.1重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染小鼠心功能的影響結(jié)果顯示，模型組EF值(67.1±9.9%)禾卩FS值(32.0±7.2%)均顯著低于正常值(EF，92.5±2.3%/FS，59.2±3.1%),p<0.05。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30嗎/kg、15|ag/kg組EF值(90.2±2.5%，86.0±2.9%)，F(xiàn)S值(55.7±2.1%，50.7±4.3%)有明顯升高，與模型組比較有顯著性差異(PO.Ol)。7.5嗎/kg組EF/FS與模型組比較無顯著性差異(PX).05)。模型組LVDd值(0.208士0.015cm)和LVDs值(0.142土0.020cm)均顯著高于正常對照組(LVDd，0.179士0.007cm/LVDs，0.073土0.006cm),兩者比較均有顯著性差異(PO.01)。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30嗎/kg、15嗎/kg組LVDd值和LVDs值均顯著低于模型組(P0.05)，7.5嗎/kg組與模型組相比則無顯著性差異(PX).05)。2次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果詳見表19，20。表19病毒感染小鼠用藥5天后心功能測量參數(shù)組別給藥方案LVDd(cm)LVDs(cm)EF(%)FS(%)正常對照0.1790.07392.559.2±0.007"±0.006"±2.3**±3.1**模型組iv0.2080.14267.132.0qdx5±0.015±0.020±9.9±7.2神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iv0.1870.08590.255.730|ag/kgqdx5±0.006"±0.009"±2.5**±2.1**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iv0.1890.09981.344.515嗎/kgqdx5±0扁*±0.027*±6.28*±8.27*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iv0.1910.11478.141.77.5pg/kgqdx5±0.012±0.028±9.3±9.6以上數(shù)據(jù)每組11=6，經(jīng)SPSSone-wayanova分析，與模型組比較，*P<0.05**P<0.01表20病毒感染小鼠用藥5天后心功能測量參數(shù)組別給藥方案LVDd(cm)LVDs(cm)EF(%)FS(%)正常對照0.189±0.008"0.069±0.006"94.5±0.56"63.7±3.01**模型組iv0.2320.15963.130.3qdx5±0.023±0.031±18.47±10.75神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iv0.1960.09487.751.830pg/kgqdx5±0.011**±0.011**±3.76"±5.24**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iv0.2010.11481.644.915嗎/kgqdx;5±0.011*±0.018*±4.59*±5.68*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iv0.2130.13371.935.77.5|xg/kgqdx5±0.009±0.015±6.69±5.60n=6，SPSSone-wayanova分析，與模型組比較，AP〈0.05**P<0.019.2重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染小鼠血清cTnI的影響結(jié)果顯示，模型組cTnI均值(44.44±12.39ng/ml)顯著高于正常對照組(3.28±4.5511§/1111)，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30嗎/kg劑量組(7.98±6.07ng/ml)明顯低于模型組(P<0.001)，15嗎/kg劑量組(19.43±10.76ng/ml)與模型組相比，差異亦有顯著性(P<0.05)，7.5嗎/kg劑量組(29.05±17.06ng/ml)與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2次試驗(yàn)結(jié)果詳見表21，22。表21重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染小鼠血清cTnl(ng/ml)含量的影56響組別給藥方案cTnl(ng/ml)(Mean士SD)正常對照組3.28±4.55**模型組ivqdx544.44±12.39神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kgivqdx57.98±6.07**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白15pg/kgivqdx519.43±10.76*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白7.5pg/kgivqdx529.05±I7.06空白對照組3.75±2.36"n=10，SPSS軟件Nonparametrictests(Independentsamplestests)分析，與模型組比較，*P<0.05**P<0.01表22重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染小鼠血清cTnl(ng/ml)含量的影響(II)組別給藥方案cTnl(ng/ml)(Mean±SD)正常對照組0.19±0.06**模型組ivqdx534.05±16.50神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kgivqdx50.54±0.53**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白15pg/kgivqdx515.59±14.94*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白7.5^g/kgivqdx526.85±15.20空白對照組0.14±0.03**n=10，經(jīng)SPSS軟件Nonparametrictests(Independentsamplestests)分析，與模型組比較，*P<0.05**P<0.019.3重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染小鼠心肌病理損傷的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組心肌病理評分為o.o士o.oo，模型組心肌病理評分(2.22±0.97)，兩者比較具有顯著性差異(PO.Ol)。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白高劑量組與中劑量組病理評分均顯著下降(分別為0.56士0.47，0.73±0.58)，與模型組比較具有顯著性差異(PO.Ol)，低劑量組與模型組相比無顯著性差異(PX).05)。2次試驗(yàn)結(jié)果詳見表23，24和圖16，17。表23重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染小鼠心肌病理變化的影響(I)組另ij給藥方案病理評分(Mean±SD)正常對照組(n=10)0條0.00"模型組(n=10)ivqdx52.22±0.9757神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kg(n=17)ivqdx50.56±0,47**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白15嗎/kg(n=13)ivqdx50.73±0.58**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白7.5(ig/kg(n=10)ivqdx51.52±0.74空白對照組(n-10)0.00±0.00**以上數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件Nonparametrictests(Independentsamplestests)分析，與模型組比較，*P<0.05**P<0.01表24重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染小鼠心肌病理變化的影響組另IJ給藥方案病理評分(Mean±SD)正常對照組(n=10)o,oo士o.oo**模型組(n=10)ivqdx52.03±1.44神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30^ig/kg(n=:17)ivqdx50.23±0.26**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白15pg/kg(n=:13)ivqdx50.57±0.58**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白7.5ng/kg(n:=10)ivqdx51.34±1.16空白對照組(n=10)O條O.OO以上數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟j牛Nonparametrictests(Independentsamplestests)分析，與模型組比較，*P<0.05**P<0.019.4重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染小鼠存活率的影響2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表25，26。注射病毒后一周，模型組小鼠存活率為50%和55%，使用重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白后分別上升為85%及80%(30嗎/kg)和70%、65%(15昭/kg)。表25重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染小鼠存活率的影響給藥存活動物數(shù)(相對存活率％)方案第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天處死正常對照1010101010101010**100(n=10)100%100%100%100o/o100%100%100%%模型組iv2020201817141110(n=20)qdx5100%100%100%90%85%70%55%50%神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30嗎/kgiv2020202020181716*(n=20)qdx5100%100%100%100%100%■85%80%神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白15pg/kgiv2020202019171413(n=20)qdx5100%100%100%100%95%85%70%65%58神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白5pg/kgiv2020201918151310(n=20)qdx5100%100%100%95%90%75%65%50%2020202020202020**100100%100%100%100%100%100%100%%SPSS軟件，SurvivalLifeTables分析，與模型組比較，*P<0.05"P<0.01表26重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染小鼠存活率的影響空白對照組(n=20)組別給藥存活動物數(shù)(相對存活率％)方案第l天第2天第3天第4天第5天第6天第7天處死正常對照1010101010101010**(n=10)100%100%100%100%100%100%100%100%模型組(n=20)20ivqdx54100%20100%20100%1890%1575%1365%1050%1050%神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kg20ivqdx5^100%20202019181717*(n=20)100%酵/o100%95%90%85%85%神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白15pg/kg20ivqdx54100%20201918161313(n=20)100%100%95%90%80%65%65%神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白7.5嗎/kg20ivqdx54100%20201817141110(n=20)100%100%卯％85%70%55%50%空白對照組2020202020202020**(n=20)100%100%100%100%100%100%100%100%**P<0.019結(jié)論重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30jig/kg、15嗎/kg組EF值(90,2±2.5%,86.0±2.9%)，F(xiàn)S值(55.7士2.1%，50.7±4.3%)均明顯升高，與模型組比較有顯著性差異(P〈0.01),LVDd值(0.187±0.006，0.189±0.008)和LVDs值(0.085±0.009,0.099±0.027)均顯著低于模型組(0.208±0.015，0.142±0.020)，P〈0.05;重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能減輕模型動物心肌病理損害程度，有效降低模型動物血清中肌鈣蛋白I(cTnl)水平，30|ag/kg劑量組(7.98±6.07ng/ml)、15嗎/kg劑量組cTnI(19.43±10.76ng/ml)明顯低于模型組(44.44±12.39ng/ml)，兩者相比，差別有顯著性(P<0.001，P<0.05);與模型組動物50%的存活率相比，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)59蛋白3(Hig/kg組可顯著提高模型動物的存活率，達(dá)80%，p<0.05。試驗(yàn)結(jié)果表明重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能在30嗎/kg的劑量水平，能有效治療病毒感染致小鼠的急性心肌損傷。實(shí)施例5.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染致小鼠急性心肌損傷的療效觀察1摘要目的明確重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白治療病毒感染致小鼠急性心肌損傷的有效用藥時(shí)間。方法小鼠腹腔注射柯薩奇B3病毒(CVB3)建立病毒感染致動物急性心肌損傷模型。模型動物隨機(jī)分組，設(shè)置正常對照、模型組、受試藥組。每組20只。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30嗎/kg，同一天開始尾靜脈注射，分別連續(xù)3、5禾卩7天。試驗(yàn)期間，觀察模型動物存活率，第七天心超檢測，第八天處死小鼠，取血清檢測cTnl水平，心臟病理組織學(xué)檢査等。結(jié)果重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30jig/kg，連續(xù)靜脈注射3天、5天和7天，均能提高模型動物的EF/FS值，5天與7天用藥組EF/FS值(86.8±4.4%/51.9±5.8%，87.0±3,3%/51.8±5.1%)與模型組EF/FS值(66.5土5.6/31.8士3.7)相比，均有顯著性差異(P吼01)，5天與7天用藥組LVDs值均顯著下降(分別為0.090±0.011，0.092土0.012cm)，與模型組比較(0.133土0.012)均有顯著性差異(P〈0.01);重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能減輕模型動物心肌病理損害程度，有效降低模型動物血清中肌鈣蛋白I(cTnl)水平，5天用藥組(1.06±1.32ng/ml)、7天用藥組cTnl(1.05士1.2ng/ml)明顯低于模型組(23.54士16.96ng/ml)，P<0.01;與模型組動物50%的存活率相比，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白連續(xù)靜脈注射5天和7天，可顯著提高模型動物的存活率，達(dá)85%，p<0.05。結(jié)論重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30[ig/kg連續(xù)給藥5天，可有效治療病毒感染致小鼠急性心肌損傷。2目的明確重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白治療病毒感染致小鼠急性心肌損傷的有效用藥時(shí)間。3受試藥物重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，上海澤生科技開發(fā)有限公司研制，批號-200110006-2;濃度500嗎/支；效價(jià)測定.，5000u;純度>95%(HPLC曙C8)。4實(shí)驗(yàn)動物4.1品系、來源、合格證號4周齡純種BALB/C小鼠，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)部提供，合格證號醫(yī)動字第22-9號。4.2體重、性別每鼠13~15g，雄性。4.3每組動物數(shù)模型組20只，正常組10只。5病毒同前部分。6材料、儀器同前部分。7實(shí)驗(yàn)方法7.1實(shí)驗(yàn)組別實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常小鼠對照組、模型組、受試藥組。正常小鼠對照組(n-10);模型組(n-20):注射制劑配方緩沖液；受試藥組重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3(Hig/kg,分連續(xù)3、5、7天三個(gè)不同療程的給藥組，每組20只動物；7.2受試藥物劑量設(shè)置及藥物配制、給藥途徑、給藥次數(shù)、給藥濃度和容積重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3(Hig/kg，用制劑配方緩沖液(10mMPB，0.2%HAS，5%甘露醇)稀釋受試藥物至所需濃度；受試藥分成3個(gè)給藥組，分別為每天連續(xù)靜脈注射3天、5天和7天，每次給藥容積為0.2ml/只；模型組給藥為小鼠尾靜脈注射制劑配方緩沖液，每天一次(qd)，連續(xù)給藥7天。每次給藥容積為0.2ml/只；7.3試驗(yàn)方法7.3.l小鼠急性病毒性心肌炎動物模型的建立由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院提供100xTCID5o的CVB3病毒，腹腔注射0.2ml/只，造成急性心肌炎模型。小鼠將于隨后的一周內(nèi)逐步出現(xiàn)豎毛、脫毛、消瘦、呆滯、死亡等表現(xiàn)，到第8天時(shí)死亡將近一半。7.3.2藥效試驗(yàn)61同前部分。7.3.3觀測指標(biāo)同前部分。8數(shù)據(jù)處理所得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)t檢驗(yàn)或方差分析。9結(jié)果9.l重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白用藥3、5、7天對病毒感染小鼠心功能的影響結(jié)果顯示，模型組EF/FS值(66.5±5.6%/31.8±3.7%)明顯低于正常組(93.5±0.9°/。/68.1±1.3%)，兩者比較具有顯著性差異(PO.Ol)。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白5天組與7天組EF/FS值(86.8±4.4%/51.9±5.8%，87.0±3.3%/51.8±5.1%)，與模型組比較均有顯著性差異(P〈0.01)。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白用藥3天組EF值也有回升(73.1±6.6%)，但與模型組相比，差異無顯著性(P>0.05)。模型組LVDs值(0.133士0.012cm)高于正常組(0.059士0.006cm)，兩者比較有顯著性差異(P〈0.01)。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白5天組、7天組LVDs值均顯著下降(分別為0.090±0.011，0.092土0.012cm)，與模型組比較均有顯著性差異(PO.01)。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3天組LVDs值(0.123士0.012cm)與模型組比較則無顯著性差異(PX).05)。2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表27，28。表27重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不同用藥天數(shù)對病毒感染小鼠心功能參數(shù)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>以上每組數(shù)據(jù)n=6，經(jīng)SPSSone-wayanova分析，與模型組比較，*P<0.05**P<0，01表28重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不同用藥天數(shù)對病毒感染小鼠心功能參數(shù)的影響(II)組別給藥方案LVDd(cm)LVDs(cm)EF(%)FS(%)正常對照模型組ivqdx神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kg神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30ng:/kg神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30ng/kgivqdx3ivqdxivqdx70.189"O扁"卯9"57.5"±0.008±0.007±2.6±3.50.2060,12675.439.0±0.008±0.006±5.2±4.30.2110.12181.043.9±0.016±0.016±5.4±5.10.1990.100*85.8**50.0**±0.000±0.014±4.205±6.3500.1940.092**87.283**52.367**±0.017±0.008±1.694±1.847以上每組數(shù)據(jù)n=6，經(jīng)SPSSone-wayanova分析，與模型組比較，*P<0.05**P<0.019.2重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對病毒感染小鼠血清cTnl的影響結(jié)果顯示，正常組cTnl均值為0.12i0.03ng/ml，模型組cTnl均值明顯增高為23.54±16.96ng/ml，二者比較具有顯著性差異(PO.Ol)。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白5天組與7天組cTnl值均顯著下降(分別為1.06士1.32ng/ml，1.05±1.20ng/ml)，與模型組比較均具有顯著性差異(P<0.01),用藥3天組與模型組比較無顯著性差異(PX).05)。二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別詳見表29，30。表29重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不同用藥天數(shù)對病毒感染小鼠血清cTnl(ng/ml)的影響組別(n=9)給藥方案cTnl(ng/ml)(Mean土SD)正常對照0.12±0.03**模型組ivqdx723.54±16.96神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30ng/kgivqdx313.37±9.53神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30|xg/kgivqdx51.06±1.32**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30嗎/kgivqdx71.05±1.20"SPSS軟件Nonparametrictests(Independentsamplestests)分析，與模200910118522.0型組比較，*P<0.05**P<0.01表30重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不同用藥天數(shù)對病毒感染小鼠血清cTnl(ng/ml)的影響組別(n=8)給藥方案cTnl(ng/ml)(Mean士SD)正常對照0.15±0.03**模型組ivqdx730.13±21.75神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30嗎/kgivqdx312.32±18.36神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kgivqdx50.44±0.24"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kgivqdx70.51±0.28**SPSS，No叩arametrictests(Independentsamplestests)分析，與模型組比較，*P<0.05**P<0.019.3重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不同用藥天數(shù)對病毒感染小鼠心肌病理損傷的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組病理評分為o.o士o.oo，模型組病理評分升高(1.44±U9)，二者比較有顯著性差異(PO.Ol)。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白5天組與7天組病理評分明顯下降(分別為0.11±0.14，0.13±0.13)，與模型組比較均有顯著性差異(P〈0.01)。用藥3天組心肌細(xì)胞損傷亦有改善(0.33±0.155)，與模型組比較有顯著性差異，但與用藥5天組比較，5天組心肌細(xì)胞改善明顯好于3天組，二者比較具有顯著性差異(P〈0.01)。而5天組與7天組病理評分無顯著性差異(PX).05)。二批實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似(詳見表31，32，圖18，19)。表31重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不同用藥天數(shù)對病毒感染小鼠心肌病理變化的影響組另lj給藥方案病理評分(Mean士SD)正常對照O.OO士O.OO**模型組ivqdx71.44±1.19神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30嗎/kgivqdx30.33±0.155*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30嗎/kgivqdx50.11士0.140"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30^g/kgivqdx70.13士0.132"n=10，SPSS,Nonparametrictests(Independentsamplestests)分析,與模型組比較，*P<0.05**P<0.01表32重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不同用藥天數(shù)對病毒感染小鼠心肌病理變64化的影響組別(n-10)給藥方案病理評分(Mean士SD)正常對照O.OO土O.OO**模型組ivqdx71.86±1.20神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kgivqdx30.55±0.476*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30|ag/kgivqdx50.17±0.157**神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kgivqdx70.19±0.168"n=10，經(jīng)SPSS軟件Nonparametrictests(Independentsamplestests)分析，與模型組比較，*P<0.05**P<0.019.4重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不同用藥天數(shù)對病毒感染小鼠存活率的影響結(jié)果見表33，34。2次實(shí)驗(yàn)，模型組小鼠存活率分別為50%和60%，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白5天組與7天組均上升為85%和90%，與模型組相比差別有顯著性，p<0.05。3天組存活率上升為65%和75%，但與模型組相比，差別無顯著性(p>0.05)。表33重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不同用藥天數(shù)對病毒感染小鼠存活率的影響(I)組別給藥存活動物數(shù)(相對存活率％)方案第l天第2天第3天第4天第5天第6天第7天處死正常對照n=10模型組n=20神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kgn=20神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30^ig/kg:n=20神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30jag/kgn=20ivqdx7Ivqdx3ivqdx5ivqdx71010101010101010**100%100%100%100%100%100%100%100%2020201816131010100%100%100%90%80%65%50%50%2020201918161413100%100%100%95%90%80%70%65%2020202019191817*100%100%100%100%95%95%90%85%,2020202020191917*100%100%100%100%100%90%900/o85%SPSS軟件，SurvivalLifeTables分析，與模型組比較，*P<0.05**P<0.01表34重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不同用藥天數(shù)對病毒感染小鼠存活率的影響(II)組別給藥存活動物數(shù)(相對存活率％)65方案第l天第2天第3天第4天第5天第6天第7天處死正常對照1010101010101010**n=10100%100%100%100%100%100%100%100%模型組.，，ivqdx7n=2020100%20100%20畫％1890%1785%1470%1260%1260%神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30|ag/kg.」，ivqdx3n=202020202019161515100%100%100%100%95%80%75%75%神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30pg/kg.」civqdx5n=202020202019191818*100%100%100%100%95%95%90%90%神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30嗎/kg.」，ivqdx7n=202020202020191818*100%100%100%100%100%95%90%90%SPSS,SurvivalLifeTables分析，與模型組比較，*P<0.05**P<0，0110結(jié)論重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30iig/kg，連續(xù)靜脈注射3天、5天和7天，均能提高模型動物的EF/FS值，5天與7天用藥組EF/FS值(86.8士4.4。/0/51.9±5.8%，87.0±3.3%/51,8士5.1%)，與模型組EF/FS值(66.5±5.6/31.8±3.7)相比，均有顯著性差異(PO.Ol)，5天與7天用藥組LVDs值均顯著下降(分別為0.090±0.011，0,092土0,012cm)，與模型組比較(0.133±0.012)均有顯著性差異(PO.01);重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能減輕模型動物心肌病理損害程度，有效降低模型動物血清中肌鈣蛋白(cTnl)水平，5天用藥組U.06±1.32ng/ml)、7天用藥組cTnl(1.05±1.2ng/ml)明顯低于模型組(23.54士16.96ng/ml)，P〈0,01;與模型組動物50%的存活率相比，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白連續(xù)靜脈注射5天和7天，可顯著提高模型動物的存活率，達(dá)85%，p<0.05。試驗(yàn)結(jié)果表明重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白30(ag/kg連續(xù)給藥5天可有效治療病毒感染致小鼠急性心肌損傷。實(shí)施例6.重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對下腔靜脈縮窄致犬充血性心力衰竭的治療作用1摘要目的觀察重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對下腔靜脈縮窄(TIVCC)所致犬充血性心力衰竭的治療效果。方法經(jīng)胸縮窄犬下腔靜脈約50%后1周左右，心超檢測EF值下降約20。/?；蛐臅?；輸出量減少20%，表明已建立了穩(wěn)定的低心排、充血性心衰動物模型。隨后動物隨機(jī)分組，每組6條犬，每天靜脈注射重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，設(shè)置3個(gè)劑量組，分別為l、3、10嗎/kg，連續(xù)5天。給藥結(jié)束后進(jìn)行心功能(心臟超聲)檢測，并分別經(jīng)頸靜脈和頸動脈插管分析模型動物血流動力學(xué)各項(xiàng)參數(shù)的改變。結(jié)果3個(gè)劑量的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(1、3、10pg/kg)，連續(xù)用藥5天，均能升高模型動物的EF/FS值和心輸出量(CO)，用藥前后以及與模型組相比，差別均有顯著性(p<0.05，p<0.01);1、3、10|ig/kg重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能有效提高動物左心dp/dt，與模型組相比差別均具有顯著性(p<0.01)，能有效提高模型動物的LVPmax,降低LVPmin值，與模型組相比，p<0.05,而對右心室的作用不很明顯。結(jié)論重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能有效治療下腔靜脈縮窄致犬的充血性心力衰竭。2目的明確重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對下腔靜脈縮窄所致犬充血性心衰的治療效果。3受試樣品重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白成品，上海澤生科技開發(fā)有限公司研制，批號200110006-2，濃度500嗎/支；效價(jià)5000u/支，純度>95%(HPLC-C8)。4實(shí)驗(yàn)動物4.1品系、來源、合格證號雜種犬，由復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院提供,經(jīng)復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部檢疫合格。4.2體重、性別13~18kg，雄性。4.3動物數(shù)每組6條。5材料、儀器5.1心臟超聲心動儀，HewlettPackardsonos5500;探頭型號:S4;5，2注射用水，購自湛江安度斯生物有限公司，10x5ml,批號0112180;5.3髙頻電刀，上海滬通電子儀器廠，GD350-D;5.4心電圖記錄儀，NihonKohdenECG-6511;5.5監(jiān)護(hù)電極，加拿大Ludlow公司，型號MT-200;5.6生理記錄儀，上醫(yī)大醫(yī)療器械研究中心，SMUP-B;5.7電動呼吸器，上海醫(yī)療器械四廠，SC-3;5.8三腔球囊漂浮導(dǎo)管，EdwardsU4F7。6實(shí)驗(yàn)方法6.1實(shí)驗(yàn)組別實(shí)驗(yàn)設(shè)置假手術(shù)組、模型組和受試藥組。假手術(shù)組(n=6):僅開胸不縮窄下腔靜脈。模型組(n=6):建立心衰模型后，注射制劑緩沖液。受試藥組建立心衰模型后，注射重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。6.2受試藥物劑量設(shè)置、配制方法及給藥方案受試藥重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白高、中、低3個(gè)劑量組，分別為1、3、10pg/kg，用制劑緩沖液(賦形劑)稀釋至所需濃度，靜脈注射，每天一次，連續(xù)5天。模型組靜脈注射制劑緩沖液，每天一次，連續(xù)5天。給藥容積均為0.8ml/kg體重。6.3試驗(yàn)方法6.3.1犬下腔靜脈縮窄致心衰動物模型的建立經(jīng)外周靜脈推注3M戊巴比妥鈉(30mg/kg)，使犬麻醉后氣管插管。無菌條件下經(jīng)右胸4~5肋間打開胸腔，測量距右心房3cm處的下腔靜脈周長。選擇周長相當(dāng)于其1/3-1/2的硬質(zhì)短管，用7號絲線將短管與下腔靜脈一同結(jié)扎，抽出短管，充分止血后關(guān)閉胸腔。飼養(yǎng)約1周后，根據(jù)腹水形成多少等情況，進(jìn)行心超檢測，當(dāng)發(fā)現(xiàn)EF下降約20n/?；蜃笮臄U(kuò)大約20%，確定已建立了穩(wěn)定的低排充血性心衰動物模型。隨后每天靜脈給藥，連續(xù)5天。假手術(shù)組僅開胸，不進(jìn)行下腔靜脈縮窄。6.3.2藥效試驗(yàn)確認(rèn)動物模型建立后，按照動物分組和給藥方案進(jìn)行試驗(yàn)。6.3.3觀測指標(biāo)6.3.3.l心功能檢測分別于手術(shù)前、用藥前和用藥5天后，在犬麻醉狀態(tài)下進(jìn)行心臟功能指標(biāo)檢測。主要指標(biāo)包括EF(EjectiveFraction):心室射血分?jǐn)?shù)，系指心室舒張末期(EDV)和收縮末期容積(ESV)之差與心室舒張末期(EDV)的比值，是反應(yīng)心泵功能尤其收縮功能的常用指標(biāo)；FS:心室縮短分?jǐn)?shù)，是反應(yīng)心室收縮功能的指標(biāo)；CO:心輸出量，每分鐘射出的血液量。6.3.3.2血流動力學(xué)指標(biāo)檢測分別于手術(shù)前、用藥前以及給藥5天后，在犬麻醉狀態(tài)下，經(jīng)右側(cè)頸靜脈插入7F三腔球囊漂浮導(dǎo)管，記錄右房壓、右室壓、肺動脈壓及肺動脈楔壓。再經(jīng)左側(cè)頸動脈插入6F三腔球囊漂浮導(dǎo)管，用生理記錄儀記錄主動脈壓，左室壓等指標(biāo)，主要指標(biāo)包括LVPmax、LVPmin、+dp/dt、-dp/dt。7數(shù)據(jù)處理所得數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行配對資料t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)。8結(jié)果8.1重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對TIVCC犬心功能的影響8.1.1重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對TIVCC犬左心EF/FS值的影響通過超聲檢測顯示，模型組動物縮窄前EF和FS值分別為82.3±1.6%和49.2±2.6%，手術(shù)后分別降到59.1±7.3%和29.3±3.9%，縮窄前后相比差異有顯著性(P<0.01、P<0.05)，5天后EF和FS值繼續(xù)維持在55.5±10.9%和28.5±6.6%水平，表明我們建立的下腔靜脈縮窄致犬充血性心力衰竭模型成立而且比較穩(wěn)定。重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白用藥后，3個(gè)劑量組模型動物左心室的EF和FS值均被明顯提高，低劑量組(l嗎/kg)的EF和FS值分別由57.7±10.9和30.6±8.0提高至70.4±8.4和39.7±5.7，用藥前后比較差異有顯著性(P<0.05)，同時(shí)與模型組比較差別也有顯著性(P<0.05)。同樣，中、高劑量組模型動物左心室EF/FS值也被明顯提高，給藥前后以及與模型組比較，差別均具有顯著性(p<0.01)，結(jié)果詳見表35。表35重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對TIVCC犬左室EF/FS的影響^FS(%)EF(%)組別_手術(shù)前給藥前給藥后手術(shù)前給藥前給藥后假手術(shù)51.7±2.247.4±1.3"50.3土2,2"~~84.1±1.481.4±1.1"83.1±1.6*模型組49.2±2.629.3±3.928.5±6.682.3±1.659.U7.355.5±10.9神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10|ag/kg5O.5±3.327.7±5.641.5±3.廣"82.9±2.655.8±10.074.7士3.2"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3嗎/kg51.7±2.929.9±6.442.4±4.4"AA84.7±2.858.0±8.374.7±4.6*'69神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白Ipg/kg50.8±4.030.6±8.039.7士5.7"82.8±3.057.7±10.970.4±8.4*n=6，夫與模型組相比P〈0.05;"與模型組相比P《0.01;~~▲用藥前后相比P<0.05▲▲用藥前后相比P<0，018.1.2重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對TIVCC犬心輸出量(CO)的影響表36結(jié)果顯示，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能明顯提高模型動物的心輸出量，l嗎/kg用藥組動物心輸出量由2.4±0.5增加至3.7±0.8，用藥前后相比差別有顯著性(p<0,05)，同時(shí)與模型組動物相比，差別也有顯著性(p<0.05)。3、10lag/kg劑量組的CO變化則更加明顯(p<0.01)。對心率變化的檢測結(jié)果顯示，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對模型動物的心率影響不大(結(jié)果未顯示)。表36重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對TIVCC犬心輸出量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>=6*與模型組相比P<0.05;**與模型組相比P〈0.01;▲與用藥前相比P<0.05▲▲與用藥前相比P<0.018.2重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對TIVCC犬血流動力學(xué)的影響采用漂浮導(dǎo)管技術(shù)檢測模型動物左右心室dp/dt和收縮/舒張末壓變化。結(jié)果顯示，1、3、10pg/kg重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能有效提高動物左心dp/dt，與模型組相比差別均具有顯著性(p<0.05);有效提高模型動物的LVPmax，降低LVPmin值，與模型組相比，p<0.05;重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對左心-dp/dt和右心室土dp/dt及心室末壓影響不大，結(jié)果詳見表37，38。表38重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對TIVCC犬左室dp/dt的影響組別L(+dp/dt)(mmHg/s)L(-dp/dt)(mmHg/s)假手術(shù)組5088.99±982.87"-3233.39±923.82模型組2017,75±295.25-2384.94±1062.31神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10pg/kg5104.88±1332.05**陽3658.34土1390.97神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3嗎/kg5000.45±1535.88**-3249.52±973.32神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白l嗎/kg4024±1006635.63**-2933±613.441=6，*與模型組相比P<0.05;**與模型組相比P〈0.01變39重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對TIVCC犬左室LVPmax/LVPmin的影響組別LVPmax(mmHg)LVPmin(mmHg)假手術(shù)組145.04±15.17**-0.03±6.48模型組95.07±11.622.42±2.86神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白10嗎/kg122.87±17.37*-0.69±1.05*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3pg/kg114.68士17.12511-1.12±1.34*神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白l嗎/kg102.12±12.420.59±3.05n=6，六與模型組相比PO.05;**與模型組相比P<0.0110結(jié)論3個(gè)劑量的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(1、3、10嗎/kg)，連續(xù)用藥5天，均能升高模型動物的EF/FS值和心輸出量(CO),用藥前后以及與模型組相比，差別均有顯著性(p<0.05，p〈0.01);1、3、10pg/kg重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能有效提高動物左心dp/dt，與模型組相比差別均具有顯著性(p<0.05)，能有效提高模型動物的LVPmax，降低LVPmin值，與模型組相比，p<0.05，而對右心室的作用不很明顯。結(jié)果表明重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能有效治療下腔靜脈縮窄致犬的充血性心力衰竭。實(shí)施例7.NRG-1長期毒性試驗(yàn)1.試驗(yàn)?zāi)康挠^察恒河猴靜脈注射重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白三周，停藥后繼續(xù)觀察三周，了解對機(jī)體產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及嚴(yán)重程度，毒性反應(yīng)的靶器官及其損害的可逆性，確定無毒性反應(yīng)劑量，為臨床擬定人用安全劑量提供參考。2.受試藥物2.1名稱重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2.2批號:2002100242.3提供單位上海澤生科技開發(fā)有限公司2.4含量3.75mg/ml。2.5比活性1.12xl04u/mg。2.6性狀無色透明溶液。2.7保存條件4t:保存。2.8賦形齊IJ:0.15MNaCl，10mM磷酸鈉鹽，pH6.0。2.9配制方法用生理鹽水稀釋至所需濃度。3.動物3.1動物品系恒河猴3.2動物來源安徽省利辛縣大李集獼猴養(yǎng)殖場，合格證號皖發(fā)馴繁2002-6號。3.3動物接收時(shí)間2002年3.4體重給藥開始時(shí)2.6-5.9kg。3.5性別雌雄各半。3.6動物數(shù)共24只。3.7動物標(biāo)識采用胸牌標(biāo)記。3.8詞養(yǎng)條件單籠飼養(yǎng)，用市售猴用顆粒飼料(上海仕林科學(xué)技術(shù)有限公司提供)喂養(yǎng)。每日喂二次，每次100克，每日喂水果100克左右。動物房溫度2025。C，相對濕度5070%，每天光照12hr。3.9適應(yīng)環(huán)境時(shí)間給藥前適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)25天。4.劑量4.1劑量設(shè)置對照組OU/Tcg/d(注射等容量的賦形劑)低劑量組84U/kg/d(相當(dāng)于猴等效劑量2倍)中劑量組168U/kg/d(相當(dāng)于猴等效劑量4倍)高劑量組840U/kg/d(相當(dāng)于猴等效劑量20倍)4.2劑量設(shè)置依據(jù)重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白臨床擬用適應(yīng)癥為心力衰竭的治療。小鼠藥效模型為嗜心性柯薩奇B3病毒致心肌炎模型，劑量為84，168，840U/kg(相當(dāng)于猴21，42，84U/kg)，連續(xù)靜脈注射給藥5天，病理評分分別為1.5，0.7，0.56(病理評分標(biāo)準(zhǔn)為0分病變面積為0%，l分病72變面積為25%，2分病變面積為50%，3分病變面積為75%，4分病變面積為100%)。故小鼠168，840U/kg劑量可明顯減輕心臟的損傷。臨床擬給藥途徑為靜脈注射，臨床擬用方案為每天給藥一次，連續(xù)給藥3-5天。以猴等效劑量"U/kg為明顯有效劑量，擬定猴長期毒性劑量為動物有效劑量的2，4，20倍。5.給藥期限每天給藥一次，連續(xù)給藥3周。6.恢復(fù)期限3周。7.給藥容量1.0ml/kg體重。8.給藥途徑緩慢靜脈注射，與臨床擬用途徑一致。9.試驗(yàn)方法試驗(yàn)動物購入前經(jīng)腸蟲清驅(qū)腸寄生蟲，進(jìn)行結(jié)核菌素試驗(yàn)，經(jīng)適應(yīng)環(huán)境并進(jìn)行血液學(xué)、血清生化、尿液及心電圖等檢查二次，確定為健康動物(雌性須未孕)作為受試動物。按體重和性別隨機(jī)分為4組，每組6只，雌雄各半。給藥容量1.0ml/kg體重，每周給藥前稱一次體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥容量，給藥三周后24小時(shí)和恢復(fù)期3周結(jié)束時(shí)各組分別處死2/3和1/3動物(雌、雄猴各2只和1只)，進(jìn)行系統(tǒng)尸解、臟器稱重，計(jì)算臟器系數(shù)并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。給藥10天及解剖前采血進(jìn)行各項(xiàng)血液及生化等指標(biāo)檢査，并采骨髓作涂片檢查。9.1試劑9丄1血清生化試劑Trace進(jìn)口生化試劑9丄2血液學(xué)測定試劑9丄3抗體檢測主要試劑①包被液NaHCO30.293g，Na2CO30.159g，溶于100ml水中。②底物緩沖液pH5.0，檸檬酸1.02g，Na2HP04'12H203.68g溶于水中。③洗液0.01MPBS力Q1:2000Tween-20④封閉液脫脂奶粉5g，溶于100ml，pH7.4的0.01MPBS中。⑤HRP標(biāo)記兔抗猴二抗美國Sigma公司產(chǎn)品，批號A-2054。⑥Tween-20:進(jìn)口分裝，上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司提供。⑦四甲基鄰苯胺(TMB):進(jìn)口分裝，上海華美生物工程公司提供。73H2S04:分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。9.2儀器Hitachi-7060型自動生化分析儀RocheHaematologyVet型血球計(jì)數(shù)儀550型酶標(biāo)儀美國BIO-RAD產(chǎn)品Heraeus低溫離心機(jī)，德國Heraeus公司HewlettPackardsonos5500型心臟超聲儀，S4探頭。9.3血液學(xué)和生化檢測方法見下表血液學(xué)試驗(yàn)方法試驗(yàn)名稱測定方法WBC白細(xì)胞儀器分析RBC紅細(xì)胞儀器分析PLT血小板儀器分析Ht紅細(xì)胞壓積儀器分析Hb血紅蛋白儀器分析MCV紅細(xì)胞平均體積儀器分析MCH紅細(xì)胞平均血紅蛋白儀器分析MCHC紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度儀器分析Ret網(wǎng)織紅細(xì)胞煌焦油藍(lán)法DC白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)瑞氏染色CT凝血時(shí)間玻片法血清生化試驗(yàn)方法試驗(yàn)名稱測定方法ALT/GPT丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶IFCCw/oP-5-PAST/GOT天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶IFCCw/oP-5-PALP堿性磷酸酶Tris/CarbLDH乳酸脫氫酶L—P酶法CPK肌酸磷酸激酶NAC酶法BUN尿素氮Urease國GLDH-KineticCRE肌酐Jaffe-Kinetic74GLU葡萄糖OxidaseT-Bil總膽紅素二甲亞砜法T-CHO總膽固醇EnzymaticTP總蛋白BiuretALB白蛋白溴甲酚綠法K+鉀電極法Na+鈉電極法CI-氯電極法P+++/PHOS無機(jī)磷Phosphomolybdate-UVCa++媽鄰甲酚酞絡(luò)合酮法Mg++鎂Calmagite絡(luò)合指示法9.4抗體檢測方法包被抗原用包被緩沖液稀釋重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白至6嗎/ml，以100一/孔加至96孔酶標(biāo)板內(nèi)，37'C，lhr。封閉洗板5次，用洗滌液配5%脫脂奶粉，以20(Vl/孔加至板內(nèi)，置37。C，2hr。稀釋待檢血清用樣品稀釋液稀釋樣品，濃度為1:100。加樣將封閉好的酶標(biāo)板洗板3次，加入待檢血清，100^1/孔，37aC，lhr。加酶標(biāo)抗體洗板5次，加入1:1000稀釋HRP標(biāo)記的兔抗猴免疫球蛋白，100^1/孔，37°C，lhr。底物洗板5次。加入新鮮配制的底物工作液，10(Hil/孔，37'C，10min。終止加入2NH2S04，50joI/孔，終止反應(yīng)。OD值檢測用酶標(biāo)儀檢測，測定波長450nm。結(jié)果判斷檢測樣品OD值大于陰性對照2.1倍以上(1:1000稀釋)作為陽性結(jié)果。10.觀察指標(biāo)和測定指標(biāo)的時(shí)間10.1死亡情況每天觀察12次，如有動物死亡，記錄死亡時(shí)間。10.2—般征狀包括外觀、體征、行為活動，籠子表面粘血或滲出物，皮毛光澤度等一般征狀。每天觀察12次。10.3體重每周給藥前稱一次體重。10.4體溫給藥第1、3和5天測給藥前和給藥后1小時(shí)的體溫。10.5攝食量-每天每只猴加顆粒飼料200g，另給水果100g,計(jì)算每天每只猴的食物消耗量。10.6心電圖檢査-分別在給藥前測二次，給藥開始后第10天、給藥結(jié)束時(shí)及停藥恢復(fù)期末測定各導(dǎo)聯(lián)心電圖，計(jì)算P-R、QRS、QT、HR、ST值。10.7心臟B超檢查給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束解剖前1天，擬解剖動物用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈注射麻醉后，用心臟B超測定動物室間隔厚度(IVS)，左室后壁厚度(PW),左室舒張末容積(LVDd)，左室收縮末容積(LVDs)，射血分?jǐn)?shù)(EF)，縮短分?jǐn)?shù)(Fs)，二尖瓣血流峰值(MV)，主動脈瓣血流峰值(AV)，心率(HR)。10.8血液學(xué)指標(biāo)給藥前測二次，給藥開始后第10天、給藥結(jié)束時(shí)及停藥3周恢復(fù)期末解剖前一天，經(jīng)隱靜脈采血0.5ml，用3.8。/。EDTA抗凝，測定以下指標(biāo)紅細(xì)胞數(shù)(RBC)，網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)(Ret)，血紅蛋白(Hb)，白細(xì)胞總數(shù)(WBC)與分類(DC)包括中性(N)、嗜酸(E)、淋巴(L)與單核(M)，血小板數(shù)(PLT)，凝血時(shí)間(CT)、紅細(xì)胞壓積(Ht)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)。10.9血清生化指標(biāo)給藥前測二次，給藥開始后第10天、給藥結(jié)束時(shí)及恢復(fù)期3周解剖前一天，由隱靜脈采血5ml，離心后取血清，測定天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CPK)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、血清總膽紅素(T-Bil)、肌酐(CRE)、總膽固醇(T-CHO)、鈉(Na+)、鉀(K+)、氯(Cl-)、鈣(Ca+十)、鎂(Mg+十)、磷(P+++)。10.10尿常規(guī)檢查給藥前測二次，給藥開始后第10天、給藥結(jié)束時(shí)及恢復(fù)期3周解剖前，取尿樣，檢測白細(xì)胞、亞硝酸鹽、酸堿度(pH值)、尿蛋白、尿糖、酮體、尿膽原、尿膽紅素及血紅蛋白。10.11糞便檢查給藥前檢查糞便蟲卵及隱血。給藥開始后第10天、給藥結(jié)束時(shí)及恢復(fù)期3周各進(jìn)行一次糞隱血檢查。10.12眼底檢查于解剖前將動物麻醉用檢眼鏡檢查眼底。10.13臟器系數(shù)給藥3周后24小時(shí)和停藥恢復(fù)期結(jié)束時(shí)各組分別處死2/3和1/3動物(雌、雄猴各2只和l只)，進(jìn)行尸解。解剖時(shí)取心、腦、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、淋巴結(jié)、甲狀腺、睪丸或子宮、卵巢或前列腺稱重并計(jì)算各自的臟器系數(shù)。10.14病理組織學(xué)檢査取心(左心室前壁、右心室、室間隔、左心房、右心房)、肝、脾、肺、腦、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、腎、膀胱、腎上腺、垂體、甲狀腺、胸腺、胰、睪丸、前列腺、卵巢、子宮、淋巴結(jié)(頸、腸系膜)和注射局部的血管和皮下組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。10.15骨髓檢查解剖前，動物麻醉后從股骨采取骨髓，涂片、染色，光鏡下鏡檢巨系、粒系、紅系、淋巴和漿細(xì)胞以及其它類型細(xì)胞，每只動物以四象限及中央部共5x100個(gè)有核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分類，計(jì)算GE比值，并進(jìn)行攝片。10.16血清抗神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白抗體的檢測給藥開始后第1、2、3周及恢復(fù)期結(jié)束時(shí)檢測血清中抗神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白抗體，一旦抗體呈陽性且為中和抗體即停止給藥。10.17數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析方法各劑量給藥組與對照組的數(shù)據(jù)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。11.試驗(yàn)結(jié)果7711.1死亡情況試驗(yàn)期間未出現(xiàn)與給受試物有關(guān)的動物死亡。給藥3周結(jié)束時(shí)，動物麻醉后迸行心臟B超檢查，對照組8弁雄猴因麻醉過度，于計(jì)劃解剖前夜死亡；恢復(fù)期3周結(jié)束時(shí)，動物麻醉后進(jìn)行心臟B超檢査前，發(fā)現(xiàn)對照及低劑量組各有1只動物(5#，6#)心率明顯減慢(20-30次/min)，系麻醉過度表現(xiàn)，故提前l(fā)天解剖。11.2—般征狀給藥第2天高劑量組1只雄猴于靜脈注射后30min出現(xiàn)嘔吐。給藥第2-7天期間中、高劑量組各有1只動物于靜脈注射后20-30min內(nèi)出現(xiàn)嘔吐。給藥一周后各給藥組均有部分動物出現(xiàn)流涎，其中高劑量組出現(xiàn)的例數(shù)明顯多于其它給藥組；低劑量組僅1只動物于給藥第9天出現(xiàn)1次流涎。高劑量組動物給藥2周后出現(xiàn)豎毛、皮毛無光澤、活動減少、厭食。給藥第3天開始給藥局部皮膚及血管出現(xiàn)輕度蒼白，變硬，進(jìn)行性加重，呈明顯劑量依賴關(guān)系。高劑量組21#動物給藥第3周開始出現(xiàn)稀便，呈淡黃色，無明顯規(guī)律。對照組動物給藥期間及停藥恢復(fù)期無任何異常表現(xiàn)。11.3體重變化給藥期間各組動物體重與對照組相比無顯著性差異(P>0.05，)；各組動物給藥前后自身對照，高劑量組動物體重明顯下降(pO.Ol)。11.4體溫給藥第1、3和5天測給藥前和給藥后1小時(shí)的體溫，給藥前后均無明顯差異。11.5攝食量中、高劑量組動物給藥l周后，陸續(xù)有明顯剩食，攝食量為50150g不等。對照組及低劑量組動物試驗(yàn)期間未出現(xiàn)剩食?；謴?fù)期所有動物均無剩食。11.6心電圖檢査結(jié)果給藥3周各給藥組心率明顯減慢，與對照組相比p0.05,pO.Ol，同時(shí)P-R、QRS、QT間期也相應(yīng)延長，以低、中劑量組較為明顯；中、高劑量組RV1電壓較高，低、中劑量組SV1加深，各給藥組RV3電壓較高。(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。其它個(gè)別參數(shù)于不同檢測時(shí)間78的數(shù)值略有波動，但均在正常范圍內(nèi)。11.7心臟B超檢查結(jié)果給藥3周及恢復(fù)3周結(jié)束時(shí)，心臟B超檢查，對照組及各給藥組各參數(shù)均無明顯差異(p>0.05)11.8血液學(xué)檢查結(jié)果整個(gè)試驗(yàn)期間除個(gè)別參數(shù)在正常范圍內(nèi)波動外，未見明顯異常變化。11.9血清生化檢查結(jié)果整個(gè)試驗(yàn)期間除個(gè)別參數(shù)在正常范圍內(nèi)波動外，未見明顯異常變化(見表1417)。11.10尿常規(guī)檢査結(jié)果給藥前、給藥開始后第10天、第3周及恢復(fù)期3周解剖前進(jìn)行尿液檢查，對照組及各給藥組均有個(gè)別動物尿蛋白含量增加，酮體呈陽性，無規(guī)律性。對照組及各給藥組均有個(gè)別動物有一過性紅細(xì)胞增加。未見其它明顯異常。11.11糞便檢查結(jié)果所有動物給藥前、給藥開始后第10天、第3周及恢復(fù)期3周解剖前進(jìn)行糞便潛血試驗(yàn)均為陰性，無蟲卵或寄生蟲。11.12眼底檢查結(jié)果給藥3周及恢復(fù)期3周解剖前，各組動物眼底檢査未發(fā)現(xiàn)明顯異常。11.13系統(tǒng)解剖給藥3周，中劑量組2#雄猴及23#、24#雌猴心包內(nèi)見少量積液；高劑量組1#、11#雄猴及21#雌猴心包內(nèi)見積液，各抽出約2-3ml，澄清，色微黃；高劑量組1#及21#動物腦內(nèi)蛛網(wǎng)膜下腔見腦積水，各抽出約l-2ml，澄清，色微黃；21#動物腹腔內(nèi)有積液，大腸粘膜面見出血點(diǎn)，并見小灶性潰瘍。高劑量組22#雌猴，肺葉見充血、出血灶。8#猴解剖時(shí)已死亡，尸檢肺部呈明顯充血和片狀出血，其余未見明顯異常?；謴?fù)期3周結(jié)束時(shí)，高劑量組雌雄各1只動物(10#，14#)腦內(nèi)蛛網(wǎng)膜下腔見腦積水，分別抽出0.5ml和3ml;因麻醉過度提前解剖動物未見明顯異常。其余臟器未見明顯異常。上述積液進(jìn)行體液常規(guī)檢査均為漏出液。11.14臟器重量及其系數(shù)解剖時(shí)，主要臟器稱重并計(jì)算臟器系數(shù)。各臟器重量未見與給受試物有關(guān)的異常變化。11.15病理組織學(xué)檢查結(jié)果-給藥3周，高劑量組1#、11#雄猴及21#雌猴心臟心房和心室心肌纖維見彌漫性空泡樣變性，心內(nèi)膜及外膜則未見明顯異常。另外，11#及21#猴軟腦膜下見血管充血、輕度水腫；2W動物結(jié)腸部分粘膜壞死、粘膜及漿膜明顯水腫、并有炎癥細(xì)胞浸潤。對照組8#解剖時(shí)已死亡動物肺臟肺泡隔增厚、充血，片狀出血，部分肺泡內(nèi)充滿水腫液，腎臟、胃、大腸、小腸及胰腺組織部分自溶。其余未見異常。恢復(fù)期3周結(jié)束時(shí)，高劑量組14#雌猴心肌纖維見輕度空泡樣變性，軟腦膜下見血管充血。因麻醉過度提前解剖動物未見明顯異常。各給藥組注射部位血管除出血性改變外，未見明顯的刺激反應(yīng)。結(jié)論給藥組部分動物心臟心包積液和腦積液的大體改變及其組織學(xué)檢查結(jié)果與給受試物相關(guān)。其余一些動物臟器見散在、偶發(fā)的病變，如肺臟及胃腸道炎性反應(yīng)等，多系動物的自發(fā)性病變。11.16骨髓檢查結(jié)果給藥3周及恢復(fù)期3周猴麻醉后，解剖前，從右側(cè)髖骨采取骨髓、涂片、染色，光鏡下鏡檢巨系、粒系、紅系、淋巴和漿細(xì)胞以及其它類型細(xì)胞，每只動物以四象限及中央部共5x100個(gè)有核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分類，計(jì)算GE比值，并進(jìn)行顯微攝影。.結(jié)果各組動物粒、紅、巨三系細(xì)胞均正常增生，粒紅比值正常，未見異常病理細(xì)胞，未引起骨髓毒性病理損害。)。11.17血清抗神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白抗體檢査結(jié)果-給藥開始后第1、2、3周及恢復(fù)期3周結(jié)束時(shí)檢測血清中抗人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白抗體，各給藥組均為陰性。12.討論:以84，168，840U/kg劑量給恒河猴連續(xù)靜脈注射重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3周(相當(dāng)于猴等效劑量2，4,20倍)，以賦形劑作對照，停藥后繼續(xù)觀察3周。試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)期間未出現(xiàn)與給受試物有關(guān)的動物死亡。給藥1周后各給藥組均有部分動物出現(xiàn)嘔吐、惡心、流涎。高劑量組動物給藥2周后出現(xiàn)豎毛、皮毛無光澤、活動減少、厭食；給藥局部皮膚及血管出現(xiàn)輕度蒼白，變硬。對照組動物給藥期間及停藥恢復(fù)期無任何異常表現(xiàn)。高劑量組動物給藥3周時(shí)體重明顯降低。攝食量明顯減少。所有動物給藥前后體溫?zé)o明顯變化。血液學(xué)檢査、血清生化檢査及尿、糞常規(guī)檢査均未見明顯的毒理學(xué)變化。心電圖檢查在給藥3周時(shí)，各給藥組心率明顯減慢，可能與該受試物的藥理作用有關(guān)。此外，VI，V3的心電圖R波和S波的改變可能與動物胸導(dǎo)聯(lián)差異有關(guān)。心臟超聲檢査未見明顯異常，病理學(xué)檢査也未發(fā)現(xiàn)心肌肥厚性變化。眼底檢査未發(fā)現(xiàn)異常變化。骨髓涂片檢查未見明顯毒性病理改變。給藥3周后大體解剖，發(fā)現(xiàn)中、高劑量組各有3只動物有明顯心包積液，各可抽取2-3ml漏出液不等；高劑量組還發(fā)現(xiàn)2只動物蛛網(wǎng)膜下腔有腦積水，抽得漏出性積液l-2ml。停藥3周解剖時(shí)，高劑量組2只動物蛛網(wǎng)膜下腔有腦積水，分別抽得漏出性積液約0.5及3ml。病理組織學(xué)檢查上述高劑量組有心包積液動物的心肌纖維呈彌漫性空泡樣變性，有腦積液動物軟腦膜下見血管充血、輕度水腫，均與給受試物有關(guān)?？贵w檢測為陰性。動物出現(xiàn)的上述嘔吐、惡心、厭食等胃腸道癥狀，進(jìn)而可導(dǎo)致高劑量組體重下降，可能與受試物在動物胃腸道的分布與消除有關(guān)。動物出現(xiàn)的流涎，給藥局部皮膚蒼白、變硬及心包積液、腦積液等征狀，表明中、高劑量組重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可使恒河猴出現(xiàn)毛細(xì)血管滲漏綜合征，進(jìn)而導(dǎo)致軟腦膜下充血水腫。3周恢復(fù)期未完全恢復(fù)。此外，動物出現(xiàn)的心率減慢、高劑量組動物心肌纖維空泡樣變性均與給藥物有關(guān)。實(shí)施例S.NRG-l體外活性測定(激酶受體活化的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))1實(shí)驗(yàn)原理HER2/neu基因編碼一具有酪氨酸蛋白激酶活性的穿膜蛋白p185，常與ErbB3或ErbB4形成異源二聚體，通過ErbB3或ErbB4與相應(yīng)配體(Neuregulin-l)的結(jié)合，激活HER2編碼的酪氨酸蛋白激酶，介導(dǎo)功能信號的傳遞。我們利用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白能與細(xì)胞表面ErbB3/ErbB4分子結(jié)合、間接介導(dǎo)ErbB2蛋白磷酸化的特性，建立快速、靈敏、高通量、定量測定重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白體外生物學(xué)活性的方法。2試驗(yàn)材料2.196孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司)；Costar96孔酶標(biāo)檢測板。2.2人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)，引自美國ATCC，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在37°C、5%0)2條件下培養(yǎng)。2.3DMEM培養(yǎng)基稱取一定量的DMEM，定量至相應(yīng)的體積，加入3.7g/LNaHC02，0.1g/L谷氨酰胺，5.5g/LHEPES。2.4基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，胰島素9mg/L，4。C保存。2.5無菌PBS(0.01M，pH7.4)2.60.5%胰酶用無Ca2+、Mg2+離子的PBS配制。2.7抗ErbB2單克隆抗體，包被緩沖液，洗液選用澤生公司研制的鼠抗人ErbB2細(xì)胞外功能域H4單克隆抗體，與ErbB3和ErbB4無交叉反應(yīng)。包被緩沖液pH9.60.05M碳酸鹽緩沖液洗液0.01MPBS+0.05%Tween-202.8辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人磷酸化蛋白酶單抗(anti-P-tyr畫HRP)2.9底物、底物緩沖液底物(TMB):2mg/mlTMB(用無水乙醇配制)82底物緩沖液.'0.2M擰檬酸+0.MNa2HPO4(pH5.0)工作用底物底物緩沖液9ml+TMBlml+3%H202lOul(即配即用)2.10終止液2NH2S04。2.11細(xì)胞裂解液150mMNaCl+50mMHepes+l%Triton-X100+2mM釩酸鈉(sodiumorthovanadate)+0.01%硫柳汞(thimerosol)。臨用前每25ml加一片混合蛋白酶抑制劑(Tabletten，Proteasen-Inhibitoren-Cocktail)2.12標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品3試驗(yàn)步驟第1天進(jìn)行3.1項(xiàng)，第2天進(jìn)行3.2~3.3項(xiàng)，第3天進(jìn)行3.43.12項(xiàng)；其中3.1和3.2項(xiàng)各步驟應(yīng)于無菌條件下進(jìn)行。3.1接種細(xì)胞擴(kuò)增至一定數(shù)量的MCF-7細(xì)胞，用無菌PBS液清洗后，用0.25%胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5xl04/孔，100jal/孔，于37。C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。3.2細(xì)胞饑餓吸凈96孔板中的培養(yǎng)基，用37r溫育后的PBS清洗每個(gè)孔，然后加入10(Hi1DMEM培養(yǎng)基(不含牛血清和胰島素)，再置37'C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。3.3包被用包被緩沖液稀釋抗ErbB2細(xì)胞外功能域H4抗體至6pg/ml，以50pl/孔加至96孔酶標(biāo)板內(nèi)，置4。C過夜(16~18小時(shí))。3.4稀釋工作參考品和待測樣品溶液取工作參考品、待測樣品分別用DMEM培養(yǎng)基(不含小牛血清和胰島素)稀釋至2pg/ml，再作3倍梯度稀釋，共做9個(gè)稀釋度。3.5細(xì)胞磷酸化將饑餓后的96孔板細(xì)胞培養(yǎng)基吸凈，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品，10(Hil/孔，每種濃度設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置陰性對照(即DMEM培養(yǎng)基空白對照)。37'C作用20min。3.6細(xì)胞裂解迅速吸去樣品并用PBS洗滌一遍，每孔加入lOOpl細(xì)胞裂解液，置4'C冰箱裂解30min。冰浴條件下水平搖動至貼壁細(xì)胞完全脫落，4。C，15000rpm離心15min。3.7封閉酶標(biāo)檢測板洗板5次。用洗滌液配5%脫脂奶粉，以200^1/孔加至板內(nèi)，置37°C2h。3.8加樣將封閉好的酶標(biāo)板洗板3次后，加入標(biāo)準(zhǔn)和待檢樣品的細(xì)胞裂解液，90[il/孔。同時(shí)設(shè)置陰性對照。置37'C，lh。3.9加酶標(biāo)抗體洗板5次，用洗液l:500(根據(jù)產(chǎn)品使用說明和使用時(shí)間決定)稀釋HRP酶聯(lián)鼠抗磷酸化酪氨酸蛋白抗體，以100)il/孔加至板內(nèi)，置37°Clh。3.10底物顯色洗板5次。以lOOiil/孔加入臨時(shí)配制的底物工作液，置37°C，10min。3.11終止以50ki1/孔加入2nh2s04終止反應(yīng)。3.12讀od值酶標(biāo)儀上比色，測定波長450nm，參比波長655nm，記錄測定結(jié)果。4結(jié)果計(jì)算用重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白蛋白濃度對相應(yīng)的OD值作圖，用直線回歸法進(jìn)行分析，分別計(jì)算各待檢樣品的半效劑量。5所需試劑配方1.DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基胎牛血清100ml胰島素9.2mg加于1L的DMEM培養(yǎng)基中混勻即可。2.細(xì)胞裂解液NaCl4.38gHEPES5,96g釩酸鈉0.368g硫柳汞0.05gTriton-X1005mL溶于500mLH20中3.包被液(pH9.6)NaHC030.293gNa2C030.159g溶于100mLH2O中。4，100mL底物緩沖液(pH5.0)檸檬酸1.02gNa2HP04.12H203.68g溶于H;jO中。5.封閉液(5%脫脂奶粉)脫脂奶粉5g溶于100mLpH7.4的0.01MPBS中。6.0.01MPBS(pH7.4)Na2HP04.12H202.9014gNaH2P04.4H200.2964gNaCl8.5g溶于1000mLH2O中。7.0.01MPBS-T(PH7.4)在2000ML0,01MPBS力BlmlTween20混勻8.2mg/ml四甲基鄰苯胺(TMB)TMB20mg溶于10mL無水乙醇中。9.20xPBS(1000ML)Na2HP04.12H2058gNaH2P04,4H205.9gNaCl170g溶于1000mLH2O中。85<110〉上海澤生科技開發(fā)有限公司<120〉神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白用于心血管疾病治療的方法和組合物<130>CPCNZ42655D3<140〉<141>2003-5-15<150>PCT/CN02/00349<151>2002-5-24<歸2<170〉FastSEQforWindowsVersion4.0<210〉1<211〉183<212>DNA<213>智人(homosapiens)<婦1agccatcttgtaaaatgtgcggagaaggagaaaactttctgtgtgaatggaggggagtgc60ttcatggtgaaagacctttcaaacccctcgagatacttgtgcaagtgcccaaatgagttt120actggtgatcgctgccaaaactacgtaatggcgagcttctacaaggcggaggagctgtac180cag183<210〉2<211〉61<212〉PRT<213〉智人(homosapiens)<2SerHisLeuValLysCysAlaGluLysGluLysThrPheCysVal10MetValLysAsp25ProAsnGluPhe40SerPheTyrLys5515LeuSerAsnProSer30ThrGlyAspArgCys45AlaGluGluLeuTyr60權(quán)利要求1.NRG蛋白或其功能片段、或編碼NRG蛋白或其功能片段的核酸、或提高NRG蛋白或其功能片段產(chǎn)量和/或功能的物質(zhì)在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用來預(yù)防、治療或延緩哺乳動物的心臟疾病，其中所述心臟疾病是心肌梗死、心臟毒性、病毒性心肌炎或擴(kuò)張型心肌??；其中還包括使用預(yù)防、治療心肌梗死的藥物。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中預(yù)防、治療心肌梗死的藥物選自ACEI、鈣離子拮抗劑、(3-受體阻滯劑、阿斯匹林、阿托品、硝化甘油、東莨菪堿及溶血栓藥。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中Acm藥物選自卡托普利、雷米普利、福辛普利、賴諾普利、依那普利或喹那普利。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中鈣離子抬抗劑是地爾硫卓。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中P-受體阻滯劑選自阿替洛爾、美托洛爾、普萘洛爾或塞嗎洛爾等。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中溶血栓藥選自鏈激酶、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、阿尼鏈菌酶。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段，或編碼該蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和/或功能的物質(zhì)是體內(nèi)使用。8.NRG蛋白或其功能片段、或編碼NRG蛋白或其功能片段的核酸、或提高NRG蛋白或其功能片段產(chǎn)量和/或功能的物質(zhì)在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用來預(yù)防、治療或延緩哺乳動物的心臟疾病，其中所述心臟疾病是心肌梗死、心臟毒性、病毒性心肌炎或擴(kuò)張型心肌?。黄渲羞M(jìn)一步包括使用預(yù)防或治療病毒性心肌炎或擴(kuò)張型心肌病的藥物。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中預(yù)防或治療病毒性心肌炎的藥物選自抗生素、心肌保護(hù)劑、抗氧化劑、營養(yǎng)心肌的藥物。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中抗生素是青霉素。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中心肌保護(hù)劑為牛黃酸。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中抗氧化劑選自維生素C、維生素E、輔酶Qu)。13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中營養(yǎng)心肌為能量合劑。14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中預(yù)防或治療擴(kuò)張型心肌病的藥物選自強(qiáng)心劑、利尿劑、ACEI、鈣離子拮抗劑、卩-受體阻滯劑。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中強(qiáng)心劑為地高辛、西地蘭。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中利尿劑選自碳酸酐酶抑制劑、袢利尿劑、排鉀利尿劑、保鉀利尿劑、鹽皮質(zhì)激素受體的拮抗劑。17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中鈣離子拮抗劑為阿羅地平。18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中(3-受體阻滯劑為卡維地洛。全文摘要本發(fā)明涉及預(yù)防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類各種心血管疾病、心血管紊亂的組合物和方法。更具體說，本發(fā)明提供了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段、或編碼該神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其功能片段的核酸，或提高所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量和(或)功能的物質(zhì)在預(yù)防、治療或延緩哺乳動物各種心血管疾病及紊亂的組合物和方法。文檔編號A61K38/00GK101491670SQ20091011852公開日2009年7月29日申請日期2003年5月15日優(yōu)先權(quán)日2002年5月24日發(fā)明者周明東申請人:上海澤生科技開發(fā)有限公司