專利名稱：工程化生物神經(jīng)移植物的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域，更具體地涉及軸突導(dǎo)向移植物的制備及其用于修復(fù)受損神經(jīng)的用途。背景神經(jīng)是封閉的纜繩樣的軸突束。神經(jīng)提供沿著每個軸突傳輸?shù)碾娀瘜W(xué)神經(jīng)脈沖的共同路徑。每個神經(jīng)含有許多軸突。每個軸突由稱為神經(jīng)內(nèi)膜的結(jié)締組織層包圍。軸突一起束集成稱為神經(jīng)束的群組，每個神經(jīng)束包裹在稱為神經(jīng)束膜的結(jié)締組織層中。最后，整個神經(jīng)包裹在稱為神經(jīng)外膜的結(jié)締組織層中。當(dāng)神經(jīng)軸突被切斷時(shí)，仍然與細(xì)胞體連接的末端被標(biāo)記為近端節(jié)段，而另一末端被稱為遠(yuǎn)端節(jié)段。周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中的神經(jīng)再生通過軸突芽進(jìn)行，軸突芽在近端殘余部分形成并且生長至其到達(dá)遠(yuǎn)端殘余部分為止。芽的生長通過從施萬(Schwann)細(xì)胞(神經(jīng)膜細(xì)胞)分泌的趨化因子來控制。只要細(xì)胞體是完整的，近端軸突就能夠再生，并且其與神經(jīng)內(nèi)膜通道中的施萬細(xì)胞進(jìn)行接觸。人軸突生長速率在小神經(jīng)中可達(dá)到2毫米/天，在大神經(jīng)中可達(dá)到5毫米/天。然而，遠(yuǎn)端節(jié)段在受損傷后的數(shù)小時(shí)內(nèi)經(jīng)歷沃勒變性(Walleriandegeneration);軸突和髓磷脂發(fā)生變性，但是神經(jīng)內(nèi)膜保持不變。在再生后期，剩余神經(jīng)內(nèi)膜管引導(dǎo)軸突生長回到正確靶標(biāo)。在沃勒變性期間，施萬細(xì)胞沿著神經(jīng)內(nèi)膜管長成有序的多個列，從而產(chǎn)生保護(hù)和維持神經(jīng)內(nèi)膜通道的賓格內(nèi)氏帶(band of Bungner ;boB)。另外，巨噬細(xì)胞和施萬細(xì)胞釋放增強(qiáng)再生長的神經(jīng)營養(yǎng)因子。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面是多細(xì)胞構(gòu)建體。所述構(gòu)建體包括多細(xì)胞區(qū)域，所述多細(xì)胞區(qū)域具有多個彼此粘附的活細(xì)胞以形成細(xì)長移植物，以便恢復(fù)切斷神經(jīng)的末端之間的神經(jīng)連接。多個無細(xì)胞通道在移植物的內(nèi)部軸向延伸。本發(fā)明的另一個方面是細(xì)長三維結(jié)構(gòu)。所述結(jié)構(gòu)包括多個工程化多細(xì)胞體。每個多細(xì)胞體包括多個彼此粘附的活細(xì)胞。所述結(jié)構(gòu)還包括多個離散填充體。每個填充體包括抵抗細(xì)胞從所述多細(xì)胞體遷移和向內(nèi)生長至所述填充體中的生物相容性材料。所述多細(xì)胞體以使得每個多細(xì)胞體接觸至少一個其它多細(xì)胞體的方式來布置，并且所述填充體經(jīng)過安放和布置以便形成多個在所述結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。本發(fā)明的另一個方面是細(xì)長三維結(jié)構(gòu)。所述結(jié)構(gòu)包括多個不受神經(jīng)支配的多細(xì)胞體。每個多細(xì)胞體包括多個彼此粘附的活細(xì)胞。所述結(jié)構(gòu)包括多個離散填充體。每個填充體包括抵抗細(xì)胞從所述多細(xì)胞體遷移和向內(nèi)生長至所述填充體中的生物相容性材料。所述多細(xì)胞體以使得每個多細(xì)胞體接觸至少一個其它多細(xì)胞體的方式來布置，并且所述填充體經(jīng)過安放和布置以便形成多個在所述結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。本發(fā)明的另一個方面是細(xì)長三維結(jié)構(gòu)。所述結(jié)構(gòu)包括多個多細(xì)胞體。每個多細(xì)胞體包括組織培養(yǎng)基和多個彼此粘附的活細(xì)胞。所述結(jié)構(gòu)包括多個離散填充體。每個填充體包括抵抗細(xì)胞從所述多細(xì)胞體遷移和向內(nèi)生長至所述填充體中的生物相容性材料。所述多細(xì)胞體以使得每個多細(xì)胞體接觸至少一個其它多細(xì)胞體的方式來布置，并且所述填充體經(jīng)過安放和布置以便形成多個在所述結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。本發(fā)明的另一個方面是一種軸突導(dǎo)向移植物，所述移植物在被移植到具有神經(jīng)系統(tǒng)的活有機(jī)體中并且被安放在切斷神經(jīng)的末端之間的間隙中時(shí)通過促進(jìn)再生軸突生長穿過所述移植物來恢復(fù)神經(jīng)功能。所述移植物包括細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其包含多個活細(xì)胞和多個在細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的離散的無細(xì)胞通道。在另一個方面，本發(fā)明包括一種軸突導(dǎo)向移植物，所述移植物在被移植到具有神 經(jīng)系統(tǒng)的活有機(jī)體中并且被安放在切斷神經(jīng)的末端之間的間隙中時(shí)通過促進(jìn)再生軸突生長穿過所述移植物來恢復(fù)神經(jīng)功能。軸突導(dǎo)向移植物包括由多個活細(xì)胞制成的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)?；罴?xì)胞包括施萬細(xì)胞。所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)是工程化組織，不是自體移植物，是不受神經(jīng)支配的，和/或包括組織培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一個方面是一種軸突導(dǎo)向移植物，所述移植物在被移植到具有神經(jīng)系統(tǒng)的活有機(jī)體中并且被安放在切斷神經(jīng)的末端之間的間隙中時(shí)通過促進(jìn)再生軸突生長穿過所述移植物來恢復(fù)神經(jīng)功能。所述移植物包括包含多個活細(xì)胞的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)。所述三維結(jié)構(gòu)包括外側(cè)部分和中央部分，所述中央部分在所述外側(cè)部分的相反末端之間軸向延伸，以使得所述外圍部分圍繞所述中央部分。所述中央部分的活細(xì)胞群包含的施萬細(xì)胞的百分比高于所述外側(cè)部分的活細(xì)胞群中的施萬細(xì)胞的百分比。所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)是工程化組織，不是自體移植物，是不受神經(jīng)支配的，和/或包括組織培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一個方面是一種軸突導(dǎo)向移植物，所述移植物在被移植到具有神經(jīng)系統(tǒng)的活有機(jī)體中并且被安放在切斷神經(jīng)的末端之間的間隙中時(shí)通過促進(jìn)再生軸突生長穿過所述移植物來恢復(fù)神經(jīng)功能。所述移植物包括包含多個活細(xì)胞的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)。多個活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞。至少一個無細(xì)胞通道在細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸。至少一個填充體處于無細(xì)胞通道中。至少一個填充體包括瓊脂糖。至少一些所述施萬細(xì)胞沿著所述無細(xì)胞通道與所述填充體相鄰安置。本發(fā)明的另一個方面是包括多個彼此粘附的活細(xì)胞的多細(xì)胞體。多個活細(xì)胞包括第一類型的活細(xì)胞和第二類型的活細(xì)胞。第一類型的活細(xì)胞是施萬細(xì)胞，并且施萬細(xì)胞占多個活細(xì)胞的約O. 1%至約20%。本發(fā)明的另一個方面是包括多個彼此粘附的活細(xì)胞的多細(xì)胞體。多個活細(xì)胞包括第一類型的活細(xì)胞和第二類型的活細(xì)胞。第一類型的活細(xì)胞是骨髓干細(xì)胞，并且骨髓干細(xì)胞占多個活細(xì)胞的約90%。本發(fā)明的另一個方面是三維結(jié)構(gòu)。所述三維結(jié)構(gòu)包括多個細(xì)長的多細(xì)胞體。每個多細(xì)胞體包括多個彼此粘附的活細(xì)胞。所述多細(xì)胞體具有相反的軸向末端。多細(xì)胞體以三維方式布置，其中多細(xì)胞體相對于彼此具有并排的取向，并且一個多細(xì)胞體的至少一個末端與一個相鄰多細(xì)胞體的相應(yīng)末端軸向偏置。本發(fā)明的另一個方面是制備具有以施萬細(xì)胞填充的多個軸向通道的多細(xì)胞構(gòu)建體的方法。所述方法包括以下步驟I)制備多種類型的細(xì)胞粘團(tuán)，所述細(xì)胞粘團(tuán)在選定的活細(xì)胞當(dāng)中具有不同濃度的施萬細(xì)胞，2)使每個細(xì)胞粘團(tuán)成形為細(xì)長的形狀，3)將成形的細(xì)胞粘團(tuán)在受控環(huán)境中孵育以使得細(xì)胞彼此粘附以便形成細(xì)長的多細(xì)胞桿，4)制備具有與多細(xì)胞桿相似大小的無細(xì)胞填充桿或支承桿 5)根據(jù)一定的方式來布置多個多細(xì)胞桿和無細(xì)胞桿，所述方式使得每個多細(xì)胞桿接觸至少一個其它多細(xì)胞桿，并且使得具有較低濃度施萬細(xì)胞的多細(xì)胞桿放置在周圍層中，而具有較高濃度施萬細(xì)胞的多細(xì)胞桿放置在中心，以及6)使多細(xì)胞桿與至少一個其它多細(xì)胞桿融合以便形成所需構(gòu)建體。在某些實(shí)施方案中，本文公開三維神經(jīng)移植物構(gòu)建體，其包含(a)多個第一工程化多細(xì)胞體，其中多個第一工程化多細(xì)胞體中的每個工程化多細(xì)胞體包括多個第一活細(xì)胞；(b)多個第二工程化多細(xì)胞體，其中多個第二工程化多細(xì)胞體中的每個工程化多細(xì)胞體包括多個第二活細(xì)胞；和(C)多個離散填充體，其中多個離散填充體中的每個離散填充體包括抵抗多個第一活細(xì)胞或第二活細(xì)胞遷移和向內(nèi)生長的生物相容性材料；其中多個離散填充體形成多個在三維結(jié)構(gòu)的第一末端與第二末端之間縱向延伸的無細(xì)胞通道。在一些實(shí)施方案中，多個第一活細(xì)胞和多個第二活細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬細(xì)胞或其任意組合。在一些實(shí)施方案中，多個第一活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，多個第二活細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，多個第一工程化多細(xì)胞體集聚在多個無細(xì)胞通道的周圍。在一些實(shí)施方案中，多個第二工程化多細(xì)胞體集聚在移植物的外周。在一些實(shí)施方案中，填充體包含瓊脂糖。在某些實(shí)施方案中，本文公開槽形生物結(jié)構(gòu)，其包含(a)多個第一活細(xì)胞；(b)多個第二活細(xì)胞；和(C)多個無細(xì)胞通道；其中多個無細(xì)胞通道在三維結(jié)構(gòu)的第一末端與第二末端之間縱向延伸。在一些實(shí)施方案中，無細(xì)胞通道是中空的。在一些實(shí)施方案中，無細(xì)胞通道以填充體填充或部分地填充。在一些實(shí)施方案中，多個第一活細(xì)胞和多個第二活細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬細(xì)胞或其任意組合。在一些實(shí)施方案中，多個第一活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，多個第二活細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，多個第一活細(xì)胞集聚在多個無細(xì)胞通道的周圍。在一些實(shí)施方案中，多個第二活細(xì)胞集聚在移植物的外周。在某些實(shí)施方案中，本文公開的是本文所公開槽形生物結(jié)構(gòu)用于重新接合受損軸突的近端和遠(yuǎn)端殘余部分的用途。在某些實(shí)施方案中，本文公開的是本文所公開槽形生物結(jié)構(gòu)用于制備重新接合受損軸突的近端和遠(yuǎn)端殘余部分的神經(jīng)移植物的用途。其它目的和特征將部分顯而易見并且在下文中部分地指出。附圖簡述
圖I是由多細(xì)胞體和填充體組裝的三維結(jié)構(gòu)的一個實(shí)施方案的透視圖；圖IA是由多細(xì)胞體組裝的三維結(jié)構(gòu)的另一個實(shí)施方案的透視圖；圖2示出多個多細(xì)胞體和填充體根據(jù)預(yù)定方式彼此上下堆疊以便形成圖I中示出的三維結(jié)構(gòu)的順序的一個實(shí)施方案。圖2A示出多個多細(xì)胞體和填充體根據(jù)預(yù)定方式彼此上下堆疊以便形成三維結(jié)構(gòu)的順序的另一個實(shí)施方案；圖2B示出以圖2A中示出的順序制備的三維結(jié)構(gòu)成熟為軸突導(dǎo)向移植物的順序；
圖2C是根據(jù)圖2A示出的順序制備的三維構(gòu)建體的俯視圖，所述三維構(gòu)建體在構(gòu)建體的末端堆疊有額外的填充體以便獲得額外穩(wěn)定性。圖3A-3D示出制備多細(xì)胞體的方法的一個實(shí)施方案；圖4A — 4C示出制備適用于制備多細(xì)胞體的模型的方法的一個實(shí)施方案；圖5是軸突導(dǎo)向移植物的一個實(shí)施方案的示意性透視圖，其中移植物的一部分已經(jīng)被去除以顯示其內(nèi)部特征；圖6是軸突導(dǎo)向移植物的一個實(shí)施方案的照片；圖7是根據(jù)本文所述方法工程化的軸突導(dǎo)向移植物的一個實(shí)施方案的橫切片的照片，其中施萬細(xì)胞已經(jīng)過熒光標(biāo)記；圖8和9是顯示在植入根據(jù)本文所述方法工程化度軸突導(dǎo)向移植物之后的大鼠的手術(shù)區(qū)域的照片。

圖10是在植入大鼠體內(nèi)之后三周收獲的含有根據(jù)本文所述方法工程化的軸突導(dǎo)向移植物的一個實(shí)施方案的神經(jīng)節(jié)段的照片；圖11包括從圖10中顯示的神經(jīng)節(jié)段獲取的橫切片的一組組織學(xué)照片，其中切片分別沿著線AA、BB、CC、DD和EE來獲取，并且圖11左列中的照片經(jīng)過設(shè)定大小以便顯示移植物的整個橫截面，并且在左列中的照片的右側(cè)是左列中的照片中的各種特征的放大照片;圖12包括將根據(jù)本文所述方法工程化的軸突導(dǎo)向移植物植入大鼠體內(nèi)三周之后從近端原生神經(jīng)(左)和遠(yuǎn)端原生神經(jīng)(右)獲取的橫切片的兩個組織學(xué)照片；以及圖13是示出植入單獨(dú)膠原導(dǎo)管(圖(a))或用根據(jù)本文所述方法工程化的軸突導(dǎo)向移植物填充的膠原導(dǎo)管(圖(b)) 12周之后，從大鼠切除的神經(jīng)節(jié)段的總體形態(tài)的照片。相應(yīng)的參考字符指示整個圖中的相應(yīng)部件。詳述本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)以引用的方式整體并入。每年，僅在美國就要進(jìn)行200，000例以上的周圍神經(jīng)手術(shù)。通常，這些手術(shù)需要移植物以便橋接一個或多個切斷神經(jīng)。神經(jīng)的自發(fā)再生通常限于兩個末端之間不超過3cm的間隙。修復(fù)破裂的神經(jīng)是一個嚴(yán)峻的臨床難題，因?yàn)樯窠?jīng)必須朝向其靶標(biāo)重新生長或再生。在一些情況下，可使用通過顯微手術(shù)進(jìn)行的直接端對端重接，但是使用此技術(shù)受到神經(jīng)可拉長程度的限制(通常僅超出其原始長度約10%)。當(dāng)前用于修復(fù)間隙超過約3cm的破裂的技術(shù)是使用從患者體內(nèi)的另一個位置收獲的移植物(即，自體移植物)。然而，自體移植物可需要多個手術(shù)步驟并且可產(chǎn)生進(jìn)一步創(chuàng)傷，引起供體部位發(fā)病，由于神經(jīng)與移植物之間的錯配而導(dǎo)致異常的神經(jīng)再生，并且可能最終未能充分地恢復(fù)神經(jīng)功能。此外，即使當(dāng)需要修復(fù)的切斷神經(jīng)是運(yùn)動神經(jīng)時(shí)，也通常使用感覺神經(jīng)來進(jìn)行自體移植，因?yàn)榕c去除運(yùn)動神經(jīng)相比,從供體部位去除感覺神經(jīng)導(dǎo)致較小的發(fā)病率(去除感覺神經(jīng)只導(dǎo)致感覺損失，而不導(dǎo)致運(yùn)動功能損失)。然而，運(yùn)動神經(jīng)中的神經(jīng)束比感覺神經(jīng)中的神經(jīng)束顯著更大。因此，將感覺神經(jīng)移植至運(yùn)動神經(jīng)中的間隙內(nèi)會在原生運(yùn)動神經(jīng)部分與已經(jīng)植入的感覺神經(jīng)部分之間產(chǎn)生架構(gòu)方面的錯配。此架構(gòu)方面的錯配被認(rèn)為至少部分地造成可伴隨自體移植物而發(fā)生的異常的神經(jīng)再生。已經(jīng)引入另一種途徑作為修復(fù)廣泛神經(jīng)損傷的替代方案，其依賴于使用天然或人工導(dǎo)管對截段末端進(jìn)行套接(entubulating)來引導(dǎo)再生長。套接技術(shù)可橋接較短神經(jīng)缺陷而沒有與收獲自體神經(jīng)移植物相關(guān)的發(fā)病，但是修復(fù)結(jié)果隨著導(dǎo)管材料的不同而不同。套接材料可為合成的或天然的(例如，膠原)，或同種的(即，同種異體移植物；例如，使用脫細(xì)胞的人尸體神經(jīng)的同種異體移植物)。在修復(fù)周圍神經(jīng)中使用組織工程技術(shù)提供了用于規(guī)避與自體移植物、同種異體移植物和套接技術(shù)相關(guān)的問題的有前景的解決方案。然而，盡管存在一些科技進(jìn) 步，但是將生物工程結(jié)構(gòu)應(yīng)用于修復(fù)患者的受損神經(jīng)仍然是很有限的。一些研究顯示縱向定向的圓柱形結(jié)構(gòu)通過模仿神經(jīng)內(nèi)架構(gòu)而有助于軸突生長。其它研究顯示在某些人工導(dǎo)管中施萬細(xì)胞的存在可改善神經(jīng)再生，但是不足以實(shí)現(xiàn)通過自體移植物所觀察到的恢復(fù)水平。此外，軸突生長可由于現(xiàn)有人工導(dǎo)管移植物中包含的植入支架所觸發(fā)的炎癥和免疫學(xué)反應(yīng)而被削弱。最近，已在發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中開發(fā)出新的組織工程技術(shù)“生物打印”，其用于制備具有所需形狀的三維生物構(gòu)建體。生物打印技術(shù)描述于美國專利申請第10/590，446號(公開為美國專利申請公布第2008/0070304號)中，并且進(jìn)一步描述于國際專利申請第PCT/US2009/048530號(公開為W02010/008905)和相應(yīng)的美國專利申請第12/491，228號(公開為美國專利申請公布第2010/0041134號)。美國專利申請公布第2008/0070304號和第2010/0041134號以及PCT公布第W02010/008905號均以引用的方式整體并入本文。生物打印技術(shù)涉及在方法中使用具有多個活細(xì)胞的工程化多細(xì)胞體，所述方法包括以預(yù)定方式布置多細(xì)胞體并且使其融合以形成工程化組織。生物打印通常是可在沒有任何支架材料的情況下產(chǎn)生界限分明的結(jié)構(gòu)特征的自動快速原型設(shè)計(jì)方法?！吧锎蛴　奔夹g(shù)展示了制備三維組織的前景。提供了用于制備生物工程軸突導(dǎo)向移植物的新的結(jié)構(gòu)和方法。具體地說，提供新穎的工程化生物軸突導(dǎo)向移植物，其能夠在神經(jīng)再生過程中充當(dāng)導(dǎo)向?qū)Ч堋Ｋ鲆浦参镞m合于促進(jìn)軸突生長穿過導(dǎo)向物。所述技術(shù)涉及使用多細(xì)胞體作為構(gòu)件，其可用于組裝可通過成熟成為所需的工程化軸突導(dǎo)向移植物的三維構(gòu)建體。每個多細(xì)胞體包括多個彼此充分粘附的活細(xì)胞以使得多細(xì)胞體可作為單一對象加以操作(例如，撿起和移動)。多細(xì)胞體可與一個或多個填充體(例如，包含抵抗細(xì)胞從所述多細(xì)胞體遷移和向內(nèi)生長至所述填充體中的生物相容性材料的填充體)結(jié)合使用以便組裝可通過成熟成為細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體，所述三維結(jié)構(gòu)具有多個在所述結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。填充體可容易地從工程化成熟組織的外部去除并且，如果需要的話，還可從內(nèi)部(例如，從無細(xì)胞通道)去除。在某些情況下，可能有利的是在一個或多個填充體保留于移植物中的同時(shí)植入移植物。為了形成本文所述的軸突導(dǎo)向移植物，使用多細(xì)胞體和填充體來形成三維細(xì)長結(jié)構(gòu)，其具有多個在所述結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。當(dāng)將軸突導(dǎo)向移植物植入人或其它動物中的神經(jīng)損傷部位(例如，切斷神經(jīng)的末端之間的間隙中)時(shí)，來自近端原生神經(jīng)的軸突生長穿過軸突導(dǎo)向移植物并且進(jìn)入神經(jīng)結(jié)構(gòu)的遠(yuǎn)端。支持神經(jīng)發(fā)育和再生的施萬細(xì)胞填充軸突導(dǎo)向移植物中的無細(xì)胞通道與多細(xì)胞區(qū)域之間的界面的至少部分，這被認(rèn)為可促進(jìn)軸突生長穿過移植物。不受任何特定理論的束縛，由施萬細(xì)胞和/或受損神經(jīng)中的橫斷軸突釋放的神經(jīng)營養(yǎng)因子可促進(jìn)來自近端原生神經(jīng)的軸突生長穿過移植物并且進(jìn)入神經(jīng)的遠(yuǎn)端。已經(jīng)提供使用本發(fā)明的材料和方法來制備三維生物工程化組織的方法的總體概述，現(xiàn)在更詳細(xì)地描述此類方法和材料。多細(xì)朐體
所述技術(shù)涉及使用多細(xì)胞體作為構(gòu)件，其可用于組裝可通過成熟成為所需的工程化軸突導(dǎo)向移植物的三維構(gòu)建體(圖I和2)。多細(xì)胞體、其在組織工程中的一般用途，和其在制備生物工程血管中的用途詳細(xì)地描述于美國專利申請第12/491，228號(公開為美國專利公布第2010/0041134號)中，該申請以引用的方式整體并入。具體地說，多細(xì)胞體描述于美國專利公布第2010/0041134號通篇中，例如段落
、
和
—
,并且在美國專利公布第2010/0041134號的圖1A-1C中示出。簡單地說，每個多細(xì)胞體包括多個彼此充分粘附的活細(xì)胞以使得多細(xì)胞體可作為單一對象加以操作(例如，撿起和移動)。多細(xì)胞體的粘附力適當(dāng)?shù)刈阋允顾龆嗉?xì)胞體自我支承(例如，在工作面上或在包括多個多細(xì)胞體的組裝體中)歷時(shí)足以使得活細(xì)胞能夠粘附至鄰接的多細(xì)胞體的活細(xì)胞的一段時(shí)間。撿起和移動呈自支承多細(xì)胞體形式的多個活細(xì)胞的能力提供了組裝許多不同三維構(gòu)建體的靈活性。例如，多細(xì)胞體可與一個或多個填充體(例如，包含抵抗細(xì)胞從多細(xì)胞體遷移和向內(nèi)生長至所述填充體中并且可抵抗細(xì)胞粘附至填充體的生物相容性材料的填充體)結(jié)合使用以便組裝可通過成熟成為細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體，所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)具有多個在所述結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。多細(xì)胞體和填充體也可用于組裝通過成熟成為具有其它形狀的工程化組織的構(gòu)建體。此夕卜，因?yàn)槎嗉?xì)胞體是自支承的，所以不需要將多細(xì)胞體埋置于支承凝膠或支架中。替代地，“在空氣中打印(print in air) ”或在低粘度組織培養(yǎng)基中操作的能力有助于以確保多細(xì)胞體彼此直接接觸的方式來布置多細(xì)胞體。多細(xì)胞體之間的較好的接觸可促進(jìn)多細(xì)胞體在成熟期間有效和可靠的融合。另外，填充體可容易地從工程化成熟組織的外部去除并且，如果需要的話，還可從內(nèi)部(例如，管狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)腔或無細(xì)胞通道)去除。另外，本文所述的方法使用細(xì)長的(例如，大致桿形或桿形)多細(xì)胞體作為工程化軸突導(dǎo)向移植物的構(gòu)件。因?yàn)榧?xì)長的多細(xì)胞體已經(jīng)在沿著多細(xì)胞體的縱軸的顯著長度內(nèi)彼此粘附，所以多細(xì)胞體的融合更可靠并且可在更少的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)。此外，細(xì)長的多細(xì)胞體可以并排鄰接的關(guān)系加以布置以便沿著具有實(shí)質(zhì)性長度的接觸區(qū)域建立多細(xì)胞體之間的接觸。這可促進(jìn)鄰接的多細(xì)胞體彼此快速和可靠的融合。雖然本申請的圖中示出的多細(xì)胞體是圓柱形桿，但是應(yīng)理解多細(xì)胞體的形狀可在本發(fā)明的廣泛范圍內(nèi)變化。每個多細(xì)胞體包括多個彼此粘附的活細(xì)胞以使得在生物工程處理，例如組織或器官工程期間，細(xì)胞一起以易于處理和操作的粘彈性稠度和足夠完整性來形成所需三維(3-D)形狀。足夠完整性是指多細(xì)胞體在后續(xù)操作期間能夠保持其物理形狀和維持細(xì)胞的生命力，所述物理形狀并非剛性的，而是具有粘彈性稠度。多細(xì)胞體可由一種或多種預(yù)先選擇的細(xì)胞類型組成。用于形成可用來構(gòu)成軸突導(dǎo)向移植物的多細(xì)胞體的細(xì)胞可有利地包含通常存在于神經(jīng)系統(tǒng)組織中的一種或多種細(xì)胞類型(例如，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞例如施萬細(xì)胞，另外存在或不存在衛(wèi)星神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)。用于形成多細(xì)胞體的細(xì)胞還可有利地包含表現(xiàn)出一種或多種抗炎性質(zhì)的一種或多種細(xì)胞類型(例如，骨髓干細(xì)胞(BMSC)或間充質(zhì)干細(xì)胞)。將表現(xiàn)出抗炎性質(zhì)的細(xì)胞并入多細(xì)胞體中可減輕通過其它類型的神經(jīng)移植物在植入部位所觀察到的炎癥。炎癥可促進(jìn)瘢痕組織形成并且可阻礙軸突向內(nèi)生長至移植物中，因而對于神經(jīng)功能的最佳恢復(fù)而言是不合需要的?？蛇m當(dāng)?shù)赜糜谛纬啥嗉?xì)胞體的其它細(xì)胞類型包括但不限于毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。多細(xì)胞體可為同型細(xì)胞的或異型細(xì)胞的。在同型細(xì)胞多細(xì)胞體中，多個活細(xì)胞包括單一細(xì)胞類型的多個活細(xì)胞。同型細(xì)胞多細(xì)胞體中的幾乎所有活細(xì)胞是單一細(xì)胞類型的細(xì)胞，其易于對較低含量的雜質(zhì)產(chǎn)生某種程度的耐受性，包括對于包含同型細(xì)胞多細(xì)胞體的構(gòu)建體的成熟僅僅具有可以忽略的影響的相對較小數(shù)量的不同細(xì)胞類型的細(xì)胞。相比之
下，異型細(xì)胞多細(xì)胞體包括顯著數(shù)量的一種以上細(xì)胞類型的細(xì)胞。例如，多細(xì)胞體可包含第一類型的多個活細(xì)胞和第二類型的多個活細(xì)胞(等)，第二細(xì)胞類型不同于第一細(xì)胞類型。異型細(xì)胞多細(xì)胞體還可包括第一細(xì)胞類型的多個細(xì)胞、第二細(xì)胞類型的多個細(xì)胞，和第三細(xì)胞類型的多個細(xì)胞，其中第一、第二和第三細(xì)胞類型中的每一種不同于第一、第二和第三細(xì)胞類型中的其它類型。異型細(xì)胞體中的活細(xì)胞可保持未分選或可在融合過程期間“分選出”(例如，自組裝)以便形成工程化組織的特定內(nèi)部結(jié)構(gòu)。細(xì)胞的分選與差異粘附假說(DifferentialAdhesion Hypothesis ；DAH)的預(yù)測一致。DAH解釋了細(xì)胞群在由組分細(xì)胞之間的粘附和內(nèi)聚相互作用產(chǎn)生的組織表面和界面張力方面的液體樣行為。通常，細(xì)胞可基于細(xì)胞粘附強(qiáng)度的差異來分選。例如，與分選至多細(xì)胞體外部的細(xì)胞相比，分選至異型細(xì)胞多細(xì)胞體內(nèi)部的細(xì)胞類型通常具有更強(qiáng)的粘附強(qiáng)度(因而具有更高的表面張力)。為了形成軸突導(dǎo)向移植物，在一些實(shí)施方案中，可使用同型細(xì)胞和異型細(xì)胞多細(xì)胞體的組合。例如，其中第一類型的細(xì)胞是施萬細(xì)胞并且第二類型的細(xì)胞是BMSC(或另一種具有抗炎性質(zhì)的細(xì)胞類型)的異型細(xì)胞多細(xì)胞體可與其中多個活細(xì)胞是BMSC (或另一種具有抗炎性質(zhì)的細(xì)胞類型)的同型細(xì)胞多細(xì)胞體一起使用以便形成軸突導(dǎo)向移植物。在其中第一類型的細(xì)胞是施萬細(xì)胞并且第二類型的細(xì)胞是BMSC(或另一種具有抗炎性質(zhì)的細(xì)胞類型)的異型細(xì)胞多細(xì)胞體中，施萬細(xì)胞適當(dāng)?shù)卣级嗉?xì)胞體中的多個活細(xì)胞的約O. 1%至約20%(v/v),更適當(dāng)?shù)卣级嗉?xì)胞體中的多個活細(xì)胞的約1%至約15%(v/v),并且更適當(dāng)?shù)卣级嗉?xì)胞體中的多個活細(xì)胞的約3%至約10%(v/v)，并且甚至更適當(dāng)?shù)卣级嗉?xì)胞體中的多個活細(xì)胞的約5%至約10%(v/v)。例如，施萬細(xì)胞適當(dāng)?shù)卣级嗉?xì)胞體中的多個活細(xì)胞的約10%(v/v)。多細(xì)胞體中的多個活細(xì)胞的其余部分可為BMSC、BMSC與一種或多種其它細(xì)胞類型的組合，或任何其它合適的細(xì)胞類型。作為另外的實(shí)例，軸突導(dǎo)向移植物可使用具有相對較高百分比的施萬細(xì)胞的第一類型異型細(xì)胞多細(xì)胞體，和具有相對較低百分比的施萬細(xì)胞的第二類型異型細(xì)胞多細(xì)胞體來構(gòu)建。在此情況下，在具有相對較高百分比的施萬細(xì)胞的異型細(xì)胞多細(xì)胞體中，施萬細(xì)胞適當(dāng)?shù)卣级嗉?xì)胞體中的多個活細(xì)胞的約O. 1%至約20%(v/v)，更適當(dāng)?shù)卣级嗉?xì)胞體中的多個活細(xì)胞的約1%至約15%(v/v)，并且更適當(dāng)?shù)卣级嗉?xì)胞體中的多個活細(xì)胞的約3%至約10%(v/v)，并且甚至更適當(dāng)?shù)卣级嗉?xì)胞體中的多個活細(xì)胞的約5%至約10%(v/v)。例如，在具有相對較高百分比的施萬細(xì)胞的多細(xì)胞體中，施萬細(xì)胞適當(dāng)?shù)卣级鄠€活細(xì)胞的約10%(v/v)。具有相對較低百分比的施萬細(xì)胞的異型細(xì)胞多細(xì)胞體可基本上沒有施萬細(xì)胞或所包含的施萬細(xì)胞的百分比可低于具有相對較高百分比的施萬細(xì)胞的異型細(xì)胞多細(xì)胞體中的施萬細(xì)胞的百分比。用于制備多細(xì)胞體的細(xì)胞可為來自非自體來源的細(xì)胞或來自自體來源的細(xì)胞。當(dāng)使用來自自體來源的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞可從具有待修復(fù)的神經(jīng)損傷的個體中收獲，在組織培養(yǎng)中擴(kuò)增，和用于制備多細(xì)胞體。例如，在多細(xì)胞體包含施萬細(xì)胞和/或骨髓干細(xì)胞的實(shí)施方案中，這些細(xì)胞可從具有需要修復(fù)的神經(jīng)損傷的人類或其它動物中收獲并且可用于制備多細(xì)胞體。例如，施萬細(xì)胞可在切除受損神經(jīng)或另一手術(shù)步驟期間通過活檢來收獲。或者，嗅鞘細(xì)胞或毛囊干細(xì)胞可從具有需要修復(fù)的神經(jīng)損傷的人類或動物中收獲并且分化成施萬細(xì)胞。BMSC可從患者的骨髓中，使用本領(lǐng)域中已知的各種工序，例如通過骨髓抽吸或骨髓活 檢(例如，使用骨髓活檢槍)來收獲。然后，收獲的施萬細(xì)胞和BMSC可在組織培養(yǎng)中擴(kuò)增以便產(chǎn)生用于制備多細(xì)胞體的足夠數(shù)量的細(xì)胞。在一些情況下，除了多個細(xì)胞以外，多細(xì)胞體適當(dāng)?shù)匕ㄒ环N或多種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組分或一種或多種ECM組分的一種或多種衍生物。例如，多細(xì)胞體可含有各種ECM蛋白質(zhì)(例如，明膠、纖維蛋白原、纖維蛋白、膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白和/或蛋白多糖)。ECM組分或ECM組分的衍生物可添加至用于形成多細(xì)胞體的細(xì)胞粘團(tuán)中，如下文進(jìn)一步詳細(xì)討論。添加至細(xì)胞粘團(tuán)的ECM組分或ECM組分的衍生物可從人類或動物來源純化,或通過本領(lǐng)域中已知的重組方法產(chǎn)生。或者,ECM組分或ECM組分的衍生物可由多細(xì)胞體中的細(xì)胞自然地分泌，或用于制備多細(xì)胞體的細(xì)胞可通過本領(lǐng)域中已知的任何合適方法來基因操縱以便改變一種或多種ECM組分或ECM組分的衍生物和/或一種或多種細(xì)胞粘附分子或細(xì)胞-基質(zhì)粘附分子(例如，選擇蛋白、整聯(lián)蛋白、免疫球蛋白和鈣粘著蛋白)的表達(dá)水平。ECM組分或ECM組分的衍生物可促進(jìn)多細(xì)胞體中的細(xì)胞的粘附。例如，明膠和/或纖維蛋白原可適當(dāng)?shù)靥砑又劣糜谛纬啥嗉?xì)胞體的細(xì)胞粘團(tuán)。然后，纖維蛋白原可通過添加凝血酶來轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。在一些情況下，多細(xì)胞體適當(dāng)?shù)匕ńM織培養(yǎng)基。組織培養(yǎng)基可為任何生理相容培養(yǎng)基并且通常根據(jù)所涉及的細(xì)胞類型來選擇，如本領(lǐng)域中熟知。組織培養(yǎng)基可包含例如例如糖和氨基酸的基本營養(yǎng)素、生長因子、抗生素(將污染減少到最低限度)等。此外，多細(xì)胞體可適當(dāng)?shù)貫椴皇苌窠?jīng)支配的(即，其基本上不含神經(jīng)元)或非軟骨性的，或同時(shí)為不受神經(jīng)支配的和非軟骨性的。多細(xì)胞體可被描述為“工程化”多細(xì)胞體，因?yàn)槠渑c在無人構(gòu)思指導(dǎo)下產(chǎn)生的生物結(jié)構(gòu)不同。換句話說，多細(xì)胞體是合成的，或非天然存在的。多細(xì)胞體可具有本發(fā)明范圍內(nèi)的各種大小和形狀。例如，多細(xì)胞體可適當(dāng)?shù)鼐哂屑?xì)長的形狀，并且更適當(dāng)?shù)乜蔀榇笾聢A柱形(例如，大致桿形)。多細(xì)胞體通常具有與美國專利公布第2010/0041134號的段落
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中所述相同的尺寸和特征。用于制備軸突導(dǎo)向移植物的多細(xì)胞體的長度適當(dāng)?shù)貫橹辽偌sI厘米、更適當(dāng)?shù)貫橹辽偌s2厘米，并且更適當(dāng)?shù)貫橹辽偌s3厘米。用于制備軸突導(dǎo)向移植物的多細(xì)胞體的長度適當(dāng)?shù)匦∮诩s7厘米、更適當(dāng)?shù)匦∮诩s6厘米，并且更適當(dāng)?shù)匦∮诩s5厘米。因此，例如，多細(xì)胞體的長度適當(dāng)?shù)卦诩sI厘米至約7厘米的范圍內(nèi)，更適當(dāng)?shù)卦诩s2厘米至約6厘米的范圍內(nèi)，并且更適當(dāng)?shù)卦诩s3厘米至約5厘米的范圍內(nèi)。雖然圖I和2中示出的多細(xì)胞體I為大致圓柱形并且具有大致圓形的橫截面，但是具有不同大小和形狀的多細(xì)胞體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，多細(xì)胞體可為細(xì)長的形狀(例如，圓柱形形狀)，具有正方形、長方形、三角形或本發(fā)明范圍內(nèi)的其它非圓形橫截面形狀。同樣地，在本發(fā)明范圍內(nèi)，多細(xì)胞體可通常具有球形，非細(xì)長圓柱形形狀或立方體形狀。制備多細(xì)胞體的方法制備多細(xì)胞體的方法描述于美國專利申請公布第2010/0041134號的段落-
中，并且在該公布的圖3A —3D、4A —4D、5A —5C和6A —6C中示出。用 于構(gòu)建本文所述的軸突導(dǎo)向移植物的多細(xì)胞體通常以相同的方式來制備。 簡單地說，存在用于制備本發(fā)明范圍內(nèi)的具有上述特征的多細(xì)胞體的各種方法。例如，多細(xì)胞體可由含有多個活細(xì)胞或具有所需細(xì)胞密度和粘度的細(xì)胞粘團(tuán)制成。細(xì)胞粘團(tuán)可成形為所需形狀并且通過成熟(例如，孵育)形成多細(xì)胞體。在另一個實(shí)例中，細(xì)長的多細(xì)胞體通過將包括多個活細(xì)胞的細(xì)胞粘團(tuán)成形為細(xì)長的形狀來產(chǎn)生。細(xì)胞粘團(tuán)在受控環(huán)境中孵育以使得細(xì)胞彼此粘附以便形成細(xì)長的多細(xì)胞體。在另一個實(shí)例中，通過將包括多個活細(xì)胞的細(xì)胞粘團(tuán)在將細(xì)胞粘團(tuán)保持成三維形狀的裝置中成形來制備多細(xì)胞體。細(xì)胞粘團(tuán)在受控環(huán)境中孵育，同時(shí)將其保持成三維形狀歷時(shí)足以制備多細(xì)胞體的一段時(shí)間，所述多細(xì)胞體具有在平坦表面上自支承的足夠粘附力，如上所述。細(xì)胞粘團(tuán)可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^以下步驟來提供(A)將細(xì)胞或細(xì)胞集合體(細(xì)胞或細(xì)胞集合體可包括單一細(xì)胞類型或兩種或兩種以上不同細(xì)胞類型)與細(xì)胞培養(yǎng)基(例如，以預(yù)先確定的比率)混合以便產(chǎn)生細(xì)胞懸液，并且(B)壓實(shí)細(xì)胞混合物以便產(chǎn)生具有所需細(xì)胞密度和粘度的細(xì)胞粘團(tuán)。壓實(shí)可通過許多方法來實(shí)現(xiàn)，例如通過將由細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的特定細(xì)胞懸液濃縮以便實(shí)現(xiàn)細(xì)胞粘團(tuán)所需的期望細(xì)胞濃度(密度)、粘度和稠度。例如，可將來自細(xì)胞培養(yǎng)物的相對較稀的細(xì)胞懸液離心一定時(shí)間以實(shí)現(xiàn)球團(tuán)中允許在模型中成形的細(xì)胞濃度。正切流動過濾(“TFF”)是濃縮或壓實(shí)細(xì)胞的另一種合適的方法。化合物也可與細(xì)胞懸液組合以便提供所需的擠出性質(zhì)?？捎糜诒景l(fā)明中的合適化合物的一些實(shí)例包括膠原、水凝膠、基質(zhì)膠、納米纖維、自組裝納米纖維、明膠、纖維蛋白原等。因此，在這些方法中使用的細(xì)胞粘團(tuán)適當(dāng)?shù)赝ㄟ^將多個活細(xì)胞與組織培養(yǎng)基混合，并且壓實(shí)活細(xì)胞(例如，通過尚心)來制備。如果在細(xì)胞粘團(tuán)中包括一種或多種ECM組分，或一種或多種ECM組分的一種或多種衍生物(如下文進(jìn)一步詳細(xì)討論)，則細(xì)胞球團(tuán)可適當(dāng)?shù)刂貞矣诤蠩CM組分或ECM衍生物的一種或多種生理可接受的緩沖液中。進(jìn)一步加工所需的細(xì)胞粘團(tuán)的細(xì)胞密度可隨著細(xì)胞類型而變化。細(xì)胞之間的相互作用決定細(xì)胞粘團(tuán)的性質(zhì)，并且不同細(xì)胞類型具有細(xì)胞密度和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用之間的不同關(guān)系。可對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)先處理以便在將細(xì)胞粘團(tuán)成形之前增加細(xì)胞相互作用。例如，細(xì)胞可在離心之后在離心管內(nèi)孵育以便在將細(xì)胞粘團(tuán)成形之前增強(qiáng)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。在本發(fā)明下可使用將細(xì)胞粘團(tuán)成形的各種方法。例如可對細(xì)胞粘團(tuán)進(jìn)行操縱、手動模塑或擠壓(例如，在濃縮/壓實(shí)之后)以便實(shí)現(xiàn)所需形狀。例如，可將細(xì)胞粘團(tuán)吸收(例如，抽吸)至預(yù)成型儀器，例如微量吸移管(例如，毛細(xì)吸移管)中，所述儀器將細(xì)胞粘團(tuán)成形以便適形于儀器的內(nèi)表面。微量吸移管(例如，毛細(xì)吸移管)的橫截面形狀可為圓形、正方形、長方形、三角形或其它非圓形橫截面形狀。細(xì)胞粘團(tuán)也可通過將其沉積至預(yù)成型模型，例如塑料模型、金屬模型或凝膠模型中來成形。此外，離心澆注或連續(xù)澆注可用于將細(xì)胞粘團(tuán)成形。在所述方法的一個實(shí)例中，成形包括將細(xì)胞粘團(tuán)保持于成形裝置中以使得細(xì)胞在成形裝置中部分地彼此粘附。例如，如圖3A中示出，可將細(xì)胞粘團(tuán)55抽吸至成形裝置51(例如，毛細(xì)吸移管)中并且在成形裝置中保持一段成熟期(本文中也稱為培育期)(圖3B)以使得細(xì)胞至少部分地彼此粘附。如果細(xì)胞能夠在第一成形裝置51中實(shí)現(xiàn)足夠的粘附，則多細(xì)胞體I可在僅具有單一成熟步驟(例如，單一孵育步驟)的方法中產(chǎn)生。例如，所述方法適當(dāng)?shù)匕▽⒓?xì)胞粘團(tuán)55在單一成形裝置51中成形和將成形的細(xì)胞粘團(tuán)在單一受控環(huán)境中孵育以使得細(xì)胞彼此粘附以形成多細(xì)胞體。如果是這種情況，成形裝置51 (例如，毛細(xì)吸移管)可適當(dāng)?shù)貫樯锎蛴C(jī)或可進(jìn)行操作以便自動地將多細(xì)胞體設(shè)置成三維構(gòu)建體的類似設(shè)備的打印頭的一部分，如以下更詳細(xì)描述。將ECM組分或ECM組分的衍生物，·例如明膠和/或纖維蛋白原并入細(xì)胞粘團(tuán)中可有助于在單一成熟步驟中產(chǎn)生多細(xì)胞體，因?yàn)榇祟惤M分可促進(jìn)多細(xì)胞體的總體粘附性。然而，細(xì)胞可保持于成形裝置例如毛細(xì)吸移管中的時(shí)間量是受到一定的限制，所述成形裝置在細(xì)胞生存力受到影響之前使得細(xì)胞僅可獲得有限的氧氣和/或營養(yǎng)素。如果細(xì)胞不能在成形裝置51中保留足夠長以便實(shí)現(xiàn)所需粘附力的成熟期，則部分粘附的細(xì)胞粘團(tuán)55適當(dāng)?shù)貜某尚窝b置(例如，毛細(xì)吸移管)轉(zhuǎn)移至第二成形裝置301 (例如，模型)，所述第二成形裝置301使得可在將細(xì)胞保留于第二成形裝置中歷經(jīng)額外成熟期的同時(shí)將營養(yǎng)素和/或氧氣供應(yīng)給細(xì)胞。使得可向細(xì)胞供應(yīng)營養(yǎng)素和氧氣的合適成形裝置301和制備所述模型的方法的一個實(shí)例在圖4A-4C中示出。此成形裝置是用于產(chǎn)生多個多細(xì)胞體(例如，基本上相同的多細(xì)胞體)的模型301。模型301包括生物相容性基底303，其由抵抗細(xì)胞遷移和向內(nèi)生長至基底中和抵抗細(xì)胞粘附至基底的材料制成。模型301可由阻止細(xì)胞生長或遷移至模型中或粘附至模型的任何材料制成。例如，基底303可適當(dāng)?shù)赜商胤? (PTFE)、不銹鋼、透明質(zhì)酸、瓊脂糖、瓊脂、聚乙二醇、玻璃、金屬、塑料或凝膠材料(例如，瓊脂糖凝膠或其它水凝膠)和類似材料制成。將基底303成形為容納包含具有相對較低粘附力的多個細(xì)胞的組合物(例如，來自第一成形裝置51)并且將組合物在成熟期期間保持成所需三維形狀中，在此期間細(xì)胞粘附力增加以形成相對于成熟期之前的組合物具有更大粘附力的多細(xì)胞體，例如具有如上所述多細(xì)胞體的任何特征的多細(xì)胞體。還適當(dāng)?shù)貥?gòu)造模型301以使得可將組織培養(yǎng)基供應(yīng)至細(xì)胞粘團(tuán)55 (例如，通過將組織培養(yǎng)基分配至模型頂部)。例如，如圖3C和3D中示出，多個細(xì)長溝槽305形成于基底303中。模型301的細(xì)長溝槽305通常具有如美國專利申請公布第2010/0041134號的段落
中所描述相同的尺寸和特征。在本發(fā)明范圍內(nèi)存在制備合適模型的各種方法。例如，圖4A-4C示出通常標(biāo)示為201的工具的一個實(shí)施方案，其可用于制備適合于制備如上所述的多細(xì)胞體的模型。通常，工具201的一部分被構(gòu)造為模型301的在第二成熟期期間保持部分粘附的細(xì)胞粘團(tuán)的一部分的負(fù)版。例如，工具201適當(dāng)?shù)匕ū倔w203和從本體伸出的多個凸出部205。每個凸出部205經(jīng)過適當(dāng)?shù)卦O(shè)定大小和成形以形成模型基底中的將細(xì)胞粘團(tuán)55保持于適當(dāng)形狀中的凹陷或接收區(qū)域，以使得在模型中由凸出部形成的凹陷/接收區(qū)域中的細(xì)胞從成形的細(xì)胞粘團(tuán)的外表面開始沒有一個超過約300微米。關(guān)于工具的此實(shí)施方案的進(jìn)一步細(xì)節(jié)提供于美國專利申請公布第2010/0041134號的段落
和圖5A — 5C中。為了制備模型301，將細(xì)胞培養(yǎng)皿221適當(dāng)?shù)匾钥晒袒蚰坛赡z的液體223來填充，如圖4A示出。例如，液體可為瓊脂糖溶液223。將工具201放置于細(xì)胞培養(yǎng)皿221的頂部(圖4B)以使得唇緣211位于細(xì)胞培養(yǎng)皿的邊緣225并且凸出部205(例如，鰭狀物)從工具201的底部207延伸至液體223中。使液體223凝固以形成圍繞凸出部205 (例如，鰭狀物)的遠(yuǎn)端的固體或凝膠基底。然后，將工具201從細(xì)胞培養(yǎng)皿中拎起以便將工具201與新制備的模型301分離(圖4C)。因此，如果使用第二成形裝置，部分粘附的細(xì)胞粘團(tuán)55適當(dāng)?shù)貜牡谝怀尚窝b置51 (例如，毛細(xì)吸移管)轉(zhuǎn)移至第二成形裝置(例如，圖4C中示出的模型301)。部分粘附的細(xì)胞粘團(tuán)55可通過第一成形裝置51 (例如，毛細(xì)吸移管)轉(zhuǎn)移至模型301的溝槽305中。因此，所述方法包括將部分粘附的細(xì)胞粘團(tuán)55轉(zhuǎn)移至第二成形裝置301，并且將部分 粘附的細(xì)胞粘團(tuán)保持于第二成形裝置中以便形成多細(xì)胞體。在模型301與保持于其中的細(xì)胞粘團(tuán)55在受控環(huán)境中一起孵育以使得細(xì)胞粘團(tuán)中的細(xì)胞進(jìn)一步彼此粘附以形成多細(xì)胞體I的成熟期之后，細(xì)胞的粘附力足夠強(qiáng)以使得由此產(chǎn)生的多細(xì)胞體I可用毛細(xì)吸移管或其它儀器來撿起。毛細(xì)吸移管51 (現(xiàn)在含有從模型301中的溝槽305中撿起的成熟多細(xì)胞體I)可適當(dāng)?shù)貫樯锎蛴C(jī)或可進(jìn)行操作以便自動地將多細(xì)胞體設(shè)置成三維構(gòu)建體的類似設(shè)備的打印頭的一部分，如以下更詳細(xì)描述。因此，在制備多細(xì)胞體I的方法的一個實(shí)例中，成形包括將細(xì)胞粘團(tuán)55保持于第一成形裝置51中以使得細(xì)胞在第一成形裝置中部分地彼此粘附，將部分粘附的細(xì)胞粘團(tuán)轉(zhuǎn)移至第二成形裝置301，并且將部分粘附的細(xì)胞粘團(tuán)保持于第二成形裝置中以形成多細(xì)胞體I。然而，在一些實(shí)施方案中，例如在將明膠和/或纖維蛋白原添加至細(xì)胞粘團(tuán)時(shí)，細(xì)胞可在第一成形裝置51中充分粘附以便形成多細(xì)胞體，并且將細(xì)胞粘團(tuán)55轉(zhuǎn)移至第二成形裝置301并將細(xì)胞粘團(tuán)保持于第二成形裝置中的步驟可為不必要的。第一成形裝置51可適當(dāng)?shù)匕?xì)吸移管并且第二成形裝置可包括在將細(xì)胞保持于第二成形裝置中的同時(shí)使得營養(yǎng)素和氧氣可被供應(yīng)給細(xì)胞的裝置，例如以上描述的模型 301。多細(xì)胞體的橫截面形狀和大小與用于制備多細(xì)胞體的第一成形裝置以及任選地第二成形裝置的橫截面形狀和大小基本上相對應(yīng)，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇具有合適橫截面形狀、橫截面面積、直徑和長度的合適成形裝置，該成形裝置適于形成具有上述橫截面形狀、橫截面面積、直徑和長度的多細(xì)胞體。如以上討論，多種細(xì)胞類型可用于形成本發(fā)明的多細(xì)胞體。因此，均為人類和動物體細(xì)胞的一種或多種類型的細(xì)胞或細(xì)胞集合體，包括例如以上列出的所有細(xì)胞類型，可用作產(chǎn)生細(xì)胞粘團(tuán)的起始材料。例如，可使用例如施萬細(xì)胞、BMSC、間充質(zhì)干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞?？蓪碜暂S突導(dǎo)向移植物的預(yù)期接受者的自體細(xì)胞的樣品(例如如上所述通過活檢獲得)進(jìn)行培養(yǎng)以便產(chǎn)生用于制備多細(xì)胞體的足夠數(shù)量的細(xì)胞?；蛘撸蓪碜苑亲泽w供體的細(xì)胞或來自一種或多種確立細(xì)胞系的細(xì)胞的樣品進(jìn)行培養(yǎng)以便產(chǎn)生用于制備多細(xì)胞體的足夠數(shù)量的細(xì)胞。由來自預(yù)期接受者的自體細(xì)胞制成的多細(xì)胞體可有利地用于避免接受者對于移植組織的宿主炎癥反應(yīng)或其它急性或慢性排斥反應(yīng)。如以上提及，多細(xì)胞體可為同型細(xì)胞的或異型細(xì)胞的。為了制備同型細(xì)胞多細(xì)胞體，細(xì)胞粘團(tuán)適當(dāng)?shù)貫橥图?xì)胞的。用于產(chǎn)生同型細(xì)胞多細(xì)胞體的細(xì)胞粘團(tuán)中的幾乎所有活細(xì)胞是單ー細(xì)胞類型的細(xì)胞(例如，骨髄干細(xì)胞)，其易于對較低水平的雜質(zhì)產(chǎn)生某種程度的耐受性，包括對于構(gòu)建體(包括由此類細(xì)胞粘團(tuán)制成的同型細(xì)胞多細(xì)胞體)的成熟僅僅具有可以忽略的影響的相對較小數(shù)量的不同細(xì)胞類型的細(xì)胞。為了制備轉(zhuǎn)而用于制備軸突導(dǎo)向移植物的同型細(xì)胞多細(xì)胞體，細(xì)胞粘團(tuán)中的多個活細(xì)胞可適當(dāng)?shù)貫锽MSC。另ー方面，為了制備異型細(xì)胞多細(xì)胞體，細(xì)胞粘團(tuán)適當(dāng)?shù)匕@著數(shù)量的ー種以上細(xì)胞類型的細(xì)胞(即，細(xì)胞粘團(tuán)為異型細(xì)胞的)。例如，細(xì)胞粘團(tuán)可包含第一類型的多個活細(xì)胞和第二類型的多個活細(xì)胞，第二細(xì)胞類型不同于第一細(xì)胞類型。在另ー個實(shí)例中，細(xì)胞粘團(tuán)可包含第一細(xì)胞類型的多個活細(xì)胞、第二細(xì)胞類型的多個活細(xì)胞和第三細(xì)胞類型的 多個活細(xì)胞。因此，如果細(xì)胞粘團(tuán)用于制備進(jìn)而用于制備軸突導(dǎo)向移植物的異型細(xì)胞多細(xì)胞體，細(xì)胞粘團(tuán)中的多個活細(xì)胞可適當(dāng)?shù)匕▋煞N或兩種以上選自施萬細(xì)胞、BMSC、間充質(zhì)干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞類型。例如，多個活細(xì)胞可包括BMSC和施萬細(xì)胞。此類異型細(xì)胞多細(xì)胞體可適當(dāng)?shù)嘏c由BMSC組成的同型細(xì)胞多細(xì)胞體組合使用以便構(gòu)建軸突導(dǎo)向移植物，如在下文更詳細(xì)地描述。如上文更詳細(xì)地描述，在使用異型細(xì)胞的細(xì)胞粘團(tuán)來產(chǎn)生多細(xì)胞體吋，活細(xì)胞可在成熟和粘附過程期間基于細(xì)胞粘附強(qiáng)度的差異而“分選出”，并且可恢復(fù)其生理構(gòu)造。除了多個活細(xì)胞以外，ー種或多種ECM組分或ー種或多種ECM組分的ー種或多種衍生物(例如，明膠、纖維蛋白原、膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、弾性蛋白和/或蛋白多糖)可適當(dāng)?shù)匕诩?xì)胞粘團(tuán)中以便將這些物質(zhì)并入多細(xì)胞體中，如以上提及。添加至細(xì)胞粘團(tuán)的ECM組分或ECM組分的衍生物可從人類或動物來源純化，或通過本領(lǐng)域中已知的重組方法產(chǎn)生。將ECM組分或ECM組分的衍生物添加至細(xì)胞粘團(tuán)可促進(jìn)多細(xì)胞體中的細(xì)胞的粘附。例如，可將明膠和/或纖維蛋白原添加至細(xì)胞粘團(tuán)。更具體地說，10-30%明膠溶液和10-80mg/ml纖維蛋白原溶液可與多個活細(xì)胞混合以便形成含有明膠和纖維蛋白原的細(xì)胞懸液。然后，可將細(xì)胞懸液壓實(shí)(例如，通過離心)以便形成細(xì)胞粘團(tuán)。然后，由此方法形成的細(xì)胞粘團(tuán)可在受控環(huán)境下成形和孵育以使得細(xì)胞彼此粘附以便形成多細(xì)胞體。纖維蛋白原可通過添加凝血酶而轉(zhuǎn)化為纖維蛋白(例如，在打印エ藝期間)。當(dāng)例如明膠和纖維蛋白原的ECM組分或ECM組分的衍生物包含在細(xì)胞粘團(tuán)中吋，成形步驟適當(dāng)?shù)匕▽⒓?xì)胞粘團(tuán)保持在単一成形裝置中以便形成多細(xì)胞體，并且孵育步驟適當(dāng)?shù)匕ㄔ趨g一受控環(huán)境下孵育成形的細(xì)胞粘團(tuán)以使得細(xì)胞彼此粘附以便形成多細(xì)胞體。本發(fā)明還提供制備以所需三維形狀形成的包含多個細(xì)胞或細(xì)胞集合體的多細(xì)胞體的方法。本發(fā)明制備方法通常包括以下步驟1)提供含有多個預(yù)先選擇的細(xì)胞或細(xì)胞集合體(例如，具有所需細(xì)胞密度和粘度)的細(xì)胞粘團(tuán)，2)將細(xì)胞粘團(tuán)成形(例如，獲得所需形狀)，并且3)通過成熟來形成多細(xì)胞體。上述的形成步驟可通過ー個或多個步驟實(shí)現(xiàn)以便確保多細(xì)胞體(例如，細(xì)胞單元)的粘附性。在某些方法中，在初始成熟時(shí)，細(xì)胞粘團(tuán)可部分地穩(wěn)定化，或部分地硬化以便形成具有允許進(jìn)一歩操作的足夠完整性的多細(xì)胞體。根據(jù)ー個實(shí)施方案，形成步驟可包括兩個分步驟:A)將細(xì)胞粘團(tuán)保持在成形裝置，例如微量吸移管(例如，毛細(xì)吸移管)中歷經(jīng)第一段時(shí)間(例如，一段預(yù)先確定的時(shí)間)以便初始成熟，和B)將成形的細(xì)胞粘團(tuán)沉積于保持裝置例如模型中歷經(jīng)第二段時(shí)間(例如，一段預(yù)先確定的時(shí)間)以便進(jìn)一歩成熟，其中保持裝置由能夠阻止細(xì)胞生長或遷移至其中或粘附至其上的材料制成。初始成熟向細(xì)胞粘團(tuán)提供了在進(jìn)ー步成熟過程中的操作期間保持完整的足夠穩(wěn)定性。各種方法可用于促進(jìn)進(jìn)ー步成熟過程。在一個實(shí)施方案中，將細(xì)胞粘團(tuán)可在約37°C下孵育一段時(shí)間(可取決于細(xì)胞類型)以便促進(jìn)粘附。替代地或額外地，細(xì)胞粘團(tuán)可在含有促進(jìn)粘附的因子和/或離子的細(xì)胞培養(yǎng)基的存在下加以保持。例如，在圓柱形形狀的細(xì)胞粘團(tuán)在微量吸移管(例如，毛細(xì)吸移管)中孵育(即，初始成熟過程)直到細(xì)胞的粘附カ使得可將圓柱體在不斷裂的情況下從微量吸移管中擠 出之后，然后細(xì)胞粘團(tuán)可在進(jìn)ー步成熟過程中與培養(yǎng)基一起進(jìn)ー步孵育和培養(yǎng)，從而促進(jìn)所需形狀的保持。填充體本發(fā)明還提供填充體，其可與以上描述的多細(xì)胞體組合使用以便形成所需三維工程化生物組織。填充體詳細(xì)地描述于美國專利申請公布第2010/0041134號的段落一
中。簡單地說，本發(fā)明還提供與作為用于構(gòu)建生物構(gòu)建體的構(gòu)件的多細(xì)胞體組合使用的填充體，其中填充體用于界定沒有多細(xì)胞體的所需三維生物構(gòu)建體的范圍(例如，界定多細(xì)胞構(gòu)建體中的無細(xì)胞通道)。填充體適當(dāng)?shù)貫榫哂蓄A(yù)先確定的形狀的物體，其由能夠阻止至少ー些類型的細(xì)胞生長或遷移至其中或粘附至其上的無細(xì)胞材料制成。在一些實(shí)施方案中，填充體由具有以下功能的材料(例如，瓊脂糖)制成阻止大多數(shù)細(xì)胞類型遷移至填充體中但是可保留在成熟的軸突導(dǎo)向移植物的無細(xì)胞通道中的適當(dāng)位置并且使得軸突可從近端神經(jīng)結(jié)構(gòu)生長至軸突導(dǎo)向移植物中并且穿過軸突導(dǎo)向移植物。填充體材料適當(dāng)?shù)貙τ跔I養(yǎng)介質(zhì)(本文中也稱為組織培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)基)為可滲透性的。例如，填充體材料適當(dāng)?shù)貫檫x自由以下組成的組的生物相容性凝膠材料瓊脂糖、透明質(zhì)酸、聚こニ醇和瓊脂，或其它水凝膠或非凝膠柔性生物相容性材料。用于構(gòu)建特定三維生物エ程化組織的所有填充體可適當(dāng)?shù)赜上嗤牧弦约跋嗤瑵舛鹊南嗤牧闲纬伞＠?，填充體可適當(dāng)?shù)赜蓾舛葹榧s0. 5%至約4. 5%的瓊脂糖制成，更適當(dāng)?shù)乜捎蓾舛葹榧sI. 5%至約4%的瓊脂糖制成，并且更適當(dāng)?shù)乜捎蓾舛葹榧s2%的瓊脂糖制成。作為另ー個實(shí)例，填充體可適當(dāng)?shù)赜刹煌牧匣虿煌瑵舛鹊南嗤牧闲纬伞＠?，形成?nèi)腔的填充體可由4%瓊脂糖制成，而用于構(gòu)建所需三維生物工程化組織的其余填充體可由2%瓊脂糖制成。填充體可采用與相應(yīng)多細(xì)胞體的形狀或大小一致的任何形狀或大小，其中圓柱形形狀為優(yōu)選的。在一些實(shí)施方案中，填充體的形狀和大小與用于構(gòu)建所需三維生物工程化組織的多細(xì)胞體的形狀和大小基本上一致。因此，例如，填充體可適當(dāng)?shù)鼐哂腥缟详P(guān)于多細(xì)胞體I所述的任何形狀。例如，填充體和多細(xì)胞體可為大致圓柱形的(例如，大致桿形)并且具有具備基本上相同直徑的大致圓形橫截面(如圖I所示)。雖然圖I和2中示出的填充體I是大致圓柱形的并且具有大致圓形橫截面，但是具有不同大小和形狀的填充體也在本發(fā)明范圍內(nèi)，只要填充體和多細(xì)胞體可根據(jù)一定的方式進(jìn)行布置，該方式使得在多細(xì)胞體彼此融合時(shí)可形成所需三維生物工程化組織。例如，填充體可為大致圓柱形的(例如，大致桿形)并且多細(xì)胞體可為大致球形的(如美國專利申請公布第2010/0041134號的圖8和12中示出)。此外，填充體和多細(xì)胞體可同時(shí)為細(xì)長的和大致圓柱形的，但是具有不同長度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到存在許多可對不同大小和形狀的填充體和多細(xì)胞體可加以組合以便形成所需三維生物工程化組織的方法。填充體適當(dāng)?shù)厥褂妹绹鴮＠暾埞嫉?010/0041134號的段落
至
中描述的方法來制備。三維結(jié)構(gòu)如上所述的多細(xì)胞體和填充體可根據(jù)本發(fā)明的方法使用以便制備三維生物工程化組織，例如軸突導(dǎo)向神經(jīng)移植物。簡單地說，多個多細(xì)胞體和多個填充體根據(jù)使得每個多 細(xì)胞體接觸(i)另ー個多細(xì)胞體或(ii)填充體中的至少ー個的方式來加以布置。然后，通過成熟過程使多細(xì)胞體與至少ー個其它多細(xì)胞體融合以便形成適用于神經(jīng)恢復(fù)エ序的エ程化三維生物組織移植物。然后，填充體可與融合的多細(xì)胞體分離以便獲得工程化組織移植物，但是在一些實(shí)施方案中，移植物可包括ー個或多個通過植入保留在適當(dāng)位置的填充體。通常標(biāo)示為101的本發(fā)明的三維結(jié)構(gòu)的一個實(shí)施方案在圖I和2中示出。結(jié)構(gòu)101包括多個細(xì)長的多細(xì)胞體I，其每ー個適當(dāng)?shù)嘏c如上所述的細(xì)長的多細(xì)胞體I相同。例如，每個細(xì)長的多細(xì)胞體I適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)如上所述用于產(chǎn)生可在空氣中打印的自支承多細(xì)胞組織體的方法來制備。多細(xì)胞體I以使得每個多細(xì)胞體接觸至少ー個其它多細(xì)胞體的方式來加以布置。至少ー個多細(xì)胞體I沿著具有實(shí)質(zhì)性長度的接觸區(qū)域而接觸另ー個多細(xì)胞體。多細(xì)胞體之間在實(shí)質(zhì)性長度內(nèi)的這種接觸更詳細(xì)地描述于美國專利申請公布第2010/0041134號的段落
中并且在所述公布的圖IC中示出。例如，在圖I和2的布置中，每個多細(xì)胞體I在具有實(shí)質(zhì)性長度的接觸區(qū)域內(nèi)接觸至少ー個(例如，兩個)其它多細(xì)胞體。處于并排鄰接的關(guān)系中的鄰接的細(xì)長的多細(xì)胞體之間的接觸區(qū)域適當(dāng)?shù)鼐哂兄辽偌sI厘米的長度。接觸區(qū)域的長度可與多細(xì)胞體I的長度相對應(yīng)，所述多細(xì)胞體的長度適當(dāng)?shù)嘏c所需移植物的長度大約相等。雖然在圖I和2中，多細(xì)胞體I彼此接觸，但是在此初始成熟階段，多細(xì)胞體未彼此粘附。結(jié)構(gòu)101還包括一個或多個填充體5，其每ー個適當(dāng)?shù)嘏c如上所述的填充體相同。例如，圖I和2中的結(jié)構(gòu)包括多個離散填充體5。填充體5以一定方式與多細(xì)胞體一起布置以使得每個填充體接觸至少ー個多細(xì)胞體I或另ー個填充體。圖I和2中的多細(xì)胞體I和填充體5經(jīng)過布置以便在結(jié)構(gòu)101中形成多個空間17，所述空間17未被多細(xì)胞體占據(jù)，并且也未被填充體占據(jù)。空間17可適當(dāng)?shù)睾薪M織培養(yǎng)基，其可通過將組織培養(yǎng)基傾倒至多細(xì)胞體I和填充體5的頂部來添加至結(jié)構(gòu)101。因此，空間17可促進(jìn)將營養(yǎng)素和/或氧氣供應(yīng)至多細(xì)胞體I中的細(xì)胞(例如，在成熟期間)。所述結(jié)構(gòu)中的至少ー些多細(xì)胞體I是如上所述的含有施萬細(xì)胞的異型細(xì)胞體。例如，異型細(xì)胞體適當(dāng)?shù)匕ㄊ┤f細(xì)胞以及具有一種或多種抗炎性質(zhì)的不同細(xì)胞類型的細(xì)胞，例如骨髄干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞。含有施萬細(xì)胞的異型細(xì)胞體形成標(biāo)示為I"的第一組多細(xì)胞體。所述結(jié)構(gòu)中的多細(xì)胞體還包括標(biāo)示為I’的第二組多細(xì)胞體，其中細(xì)胞，即施萬細(xì)胞的百分比小于第一組多細(xì)胞體中的細(xì)胞，即施萬細(xì)胞的百分比。例如，第二組I’中的多細(xì)胞體可為同型細(xì)胞體(例如，實(shí)質(zhì)上只含有BMSC)或異型細(xì)胞體(例如，包括BMSC和相對較低數(shù)量的施萬細(xì)胞)。第二組I’中的至少ー些多細(xì)胞體I (例如，具有一些或沒有施萬細(xì)胞的多細(xì)胞體)經(jīng)過布置以便形成管樣結(jié)構(gòu)31的外層。至少ー個填充體5和第一組I"的至少ー個多細(xì)胞體(例如，具有相對較高百分比的施萬細(xì)胞的多細(xì)胞體)處于管樣結(jié)構(gòu)31的外層的內(nèi)部并且基本上由形成管樣結(jié)構(gòu)的外層的多細(xì)胞體包 圍。例如，圖I和2中的多細(xì)胞體I’以六邊形構(gòu)造進(jìn)行布置以便形成包圍三個填充體5和三個含有施萬細(xì)胞的多細(xì)胞體I"的管樣結(jié)構(gòu)31。六邊形構(gòu)造中的每個多細(xì)胞體I’處于與至少兩個鄰近的細(xì)長的多細(xì)胞體I并排鄰接的關(guān)系中。在此布置中，管樣結(jié)構(gòu)31內(nèi)部的一個或多個填充體5經(jīng)過安放以便形成多個在結(jié)構(gòu)101內(nèi)延伸的無細(xì)胞通道。填充體5適當(dāng)?shù)胤乐辜?xì)胞從多細(xì)胞體I遷移和向內(nèi)生長至在管樣結(jié)構(gòu)31內(nèi)延伸的細(xì)長的空間中，所述空間根據(jù)以下描述的方法在結(jié)構(gòu)成熟之后變?yōu)闊o細(xì)胞通道。通常，可經(jīng)由成熟來產(chǎn)生包括多個活細(xì)胞的工程化管狀組織的多細(xì)胞體I的任何布置可被認(rèn)為是管樣結(jié)構(gòu)，不論管樣結(jié)構(gòu)內(nèi)部是否有填充體。根據(jù)前述顯而易見的是管樣結(jié)構(gòu)可由于以下事實(shí)而不同于管狀結(jié)構(gòu)鄰接的多細(xì)胞體在此成熟階段尚未彼此粘附以致于可將物體推入形成管樣結(jié)構(gòu)的兩個鄰接的多細(xì)胞體之間的空間內(nèi)。圖IA示出通常稱為101"的三維結(jié)構(gòu)的另ー個實(shí)施方案。除所提及以外，此結(jié)構(gòu)101"與如上所述并且在圖I中示出的結(jié)構(gòu)101相同。此結(jié)構(gòu)101"在管樣結(jié)構(gòu)31內(nèi)不包括任何填充體5。替代地，管樣結(jié)構(gòu)實(shí)質(zhì)上以含有施萬細(xì)胞的多細(xì)胞體I"填充。制備三維結(jié)構(gòu)的方法存在使用如上所述的多細(xì)胞體，包括與填充體5結(jié)合的細(xì)長的多細(xì)胞體I來制備本發(fā)明范圍內(nèi)的如上所述的三維生物構(gòu)建體的許多不同方法。例如，ー種方法通常涉及根據(jù)使得每個多細(xì)胞體接觸至少ー個其它多細(xì)胞體的方式來布置多個細(xì)長的多細(xì)胞體1，然后使得至少ー個(例如，所有)多細(xì)胞體融合至至少ー個其它多細(xì)胞體以便產(chǎn)生所需三維生物工程化組織?？墒褂迷S多方法來以預(yù)先確定的方式遞送多細(xì)胞體以便制備所需三維結(jié)構(gòu)。例如，多細(xì)胞體可手動地放置以便彼此或與填充體接觸，通過從吸移管、噴嘴或針中擠出而沉積于適當(dāng)位置，或通過自動化機(jī)器安放以便接觸。例如，使用ー種或多種工具(可適當(dāng)?shù)匕ㄈ缟纤龅牡谝怀尚窝b置51、如上所述的將多細(xì)胞體從模型301中取出的毛細(xì)吸移管，和/或不同工具)來撿起多細(xì)胞體(例如，將其從如上所述的模型301中取出)。所述工具將多細(xì)胞體運(yùn)輸至三維構(gòu)建體正進(jìn)行組裝(例如圖2示出)的組裝區(qū)(例如，玻璃表面)并且相對于已經(jīng)運(yùn)輸至組裝區(qū)并且放置于正進(jìn)行組裝的構(gòu)建體中的任何其它多細(xì)胞體和任何填充體將多細(xì)胞體分配或以其它方式放置在適當(dāng)?shù)奈恢?。在將每個多細(xì)胞體I放置在其適當(dāng)位置之后，適當(dāng)?shù)刂貜?fù)所述過程以便將另ー個多細(xì)胞體或填充體添加至構(gòu)建體(例如，通過將其放置在已經(jīng)放置于構(gòu)建體中的多細(xì)胞體旁)。如果正進(jìn)行組裝的構(gòu)建體包括一個或多個填充體，那么每當(dāng)需要填充體時(shí)，適當(dāng)?shù)厥褂昧愆`種工具(未顯示，但是可與成形裝置51或毛細(xì)吸移管類似)來撿起填充體5 (或制備填充體，如上所述)，將填充體傳輸至組裝區(qū)，并且將填充體分配或以其它方式放置在其位于正進(jìn)行組裝的構(gòu)建體中的適當(dāng)位置。用于將多細(xì)胞體傳輸至組裝區(qū)的工具適當(dāng)?shù)赜缮锎蛴C(jī)或可進(jìn)行操作以便以所需方式布置多細(xì)胞體和填充體的其它自動設(shè)備的打印頭來承載。例如，一種合適生物打印機(jī)公開于美國專利申請公布第2004/0253365號中，該申請據(jù)此以引用的方式并入。Novogen的MMX生物打印機(jī)是合適生物打印機(jī)的ー個商業(yè)實(shí)施方案。組織工程領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可用于將多細(xì)胞體(和填充體(如果使用))布置成合適構(gòu)建體的其它合適生物打印機(jī)和類似設(shè)備。用于將填充體傳輸至組裝區(qū)的工具適當(dāng)?shù)貫樯锎蛴C(jī)的另ー個頭部的一部分。生物打印機(jī)可具有多個頭部和/或用于傳輸多細(xì)胞體和填充體的各種工具可依序加載至ー個或多個生物打印機(jī)頭部中。雖然可能需要使用生物打印機(jī)或自動地組裝構(gòu)建體的類似設(shè)備，但是在本發(fā)明范圍內(nèi)，本文所述的方法可手動進(jìn)行(例如，使用一個或多個毛細(xì)吸移管)。如圖2中指示，將多細(xì)胞體I適當(dāng)?shù)胤胖?例如，堆疊)于ー個或多個填充體5的頂部。多細(xì)胞體I適當(dāng)?shù)叵噜徲谄渌嗉?xì)胞體和/或填充體5來放置。因此，多細(xì)胞體I未被推入或埋置于任何填充體5中。這可被稱為“在空氣中打印”，因?yàn)槎嗉?xì)胞體未分配至凝膠或液體中。一旦構(gòu)建體的組裝完成，就將組織培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)貎A倒至構(gòu)建體頂部。組織培養(yǎng)基
可進(jìn)入多細(xì)胞體與填充體之間的空間17以便支承多細(xì)胞體中的細(xì)胞。其它填充體(未顯示)可堆疊于圖2中示出的結(jié)構(gòu)周圍以便在將結(jié)構(gòu)進(jìn)行孵育和使其成熟時(shí)提供進(jìn)ー步支承以便有助于將填充體和多細(xì)胞體相對于彼此保持在適當(dāng)?shù)奈恢弥?。圖2A和2B示出制備與圖2中的結(jié)構(gòu)101基本上類似的結(jié)構(gòu)的方法，不同之處在于管狀構(gòu)建體內(nèi)部的填充體和多細(xì)胞體I"的長度比形成管樣結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞體的長度稍短。這在結(jié)構(gòu)的相反末端處產(chǎn)生凹陷區(qū)域43。額外的填充體5(圖2C)堆疊于結(jié)構(gòu)周圍并且延伸至結(jié)構(gòu)末端的凹陷43中以使得一些多細(xì)胞體與間隙或接合處相重疊，在所述間隙或接合處ー個填充體或多細(xì)胞體的末端銜接另一個填充體或多細(xì)胞體的末端。具體地說，如圖2C中示出，多細(xì)胞體I"和填充體5的凹陷末端45與形成管樣結(jié)構(gòu)31的多細(xì)胞體I’的末端49軸向偏置。一些填充體5的末端47延伸至凹陷43中并且銜接形成凹陷的填充體和多細(xì)胞體I"的凹陷末端45。形成外部管樣結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞體I’具有與銜接末端45，47重疊的足夠長度。這使得三維結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。凹陷末端的填充體在構(gòu)建構(gòu)建體時(shí)提供支承。由此結(jié)構(gòu)形成的移植物的末端使得外科醫(yī)生可在不觸摸移植物本身的情況下正確地放置移植物，并且還可提供將移植物連接至原生神經(jīng)結(jié)構(gòu)末端的邊界?；蛘?，移植物的末端可在植入之前被切斷。三維構(gòu)建體中的多細(xì)胞體可彼此融合以便產(chǎn)生生物工程化組織?！叭诤稀笔侵膏徑亩嗉?xì)胞體的細(xì)胞直接通過細(xì)胞表面蛋白質(zhì)之間的相互作用，或間接地通過細(xì)胞與ECM組分或ECM組分的衍生物的相互作用而變得彼此粘附。在融合之后，將包圍構(gòu)建體的任何填充體適當(dāng)?shù)嘏c工程化組織分離。在包括管樣結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體的情況下，例如，管外部的任何填充體可加以去除(例如，通過將其從形成管樣構(gòu)建體的管狀結(jié)構(gòu)剝離)。管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部的填充體5可適當(dāng)?shù)乇Ａ粼谶m當(dāng)位置。在其它情況下，填充體5可在成熟之后和植入之前從三維構(gòu)建體去除，如下文進(jìn)ー步討論。如果填充體5加以去除，這可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^將其從管狀結(jié)構(gòu)的敞開末端拉出而完成。另外，如果填充體5在成熟之后從結(jié)構(gòu)去除，填充體5可適當(dāng)?shù)赜扇嵝圆牧现瞥?如果需要的話)以便有助于將填充體從結(jié)構(gòu)拉出。另ー種選擇是用可在融合之后溶解(例如，通過溫度變化、光或其它刺激)的材料來制備填充體5。
本發(fā)明進(jìn)一歩提供另ー種對具有3-D形狀的生物構(gòu)建體，例如組織(例如，軸突導(dǎo)向移植物)進(jìn)行工程化的方法，所述方法使用多細(xì)胞體通過根據(jù)預(yù)先確定的3-D方式將多個多細(xì)胞體進(jìn)一步遞送至預(yù)先選擇的接收環(huán)境中，使得細(xì)胞單元可融合至所需生物構(gòu)建體中來進(jìn)行。發(fā)生融合的兩種或兩種以上多細(xì)胞體可為相同或不同的形狀和大小，并且可含有相同或不同的細(xì)胞類型。多細(xì)胞體可以許多方法應(yīng)用于生物構(gòu)建體工程化中。例如，可產(chǎn)生構(gòu)成所需結(jié)構(gòu)的上半部和下半部的兩個不同形狀的多細(xì)胞體，并且可使其接觸并進(jìn)行融合?；蛘?，多個多細(xì)胞體可與填充體組合進(jìn)行組裝并且使其融合成所需形狀。根據(jù)ー個實(shí)施方案，在多細(xì)胞體與填充體一起使用時(shí)，工程化方法可包括以下步驟:A)根據(jù)預(yù)先確定的方式對與多個填充體預(yù)定組合的多個多細(xì)胞體進(jìn)行遞送以便形成分層的構(gòu)建體，其中多細(xì)胞體和填充體是鄰近的，B)將分層的構(gòu)建體沉積至預(yù)先選擇的受控環(huán)境中以便成熟，由此使多細(xì)胞體彼此融合以便產(chǎn)生融合的構(gòu)建體，以及C) 將填充體從融合的構(gòu)建體去除以便產(chǎn)生所需生物構(gòu)建體。用于修復(fù)受損神經(jīng)的軸突導(dǎo)向移植物圖5示出通常標(biāo)示為1001的多細(xì)胞構(gòu)建體(例如，軸突導(dǎo)向移植物)的ー個實(shí)例，其根據(jù)本發(fā)明方法來工程化。如所示出，構(gòu)建體包括包含中央部分1005和周圍部分1003的細(xì)長的多細(xì)胞區(qū)域。多細(xì)胞區(qū)域的每個部分1003，1005包括多個彼此粘附的活細(xì)胞以使得多細(xì)胞區(qū)域形成適用于恢復(fù)受損神經(jīng)的神經(jīng)功能的細(xì)長移植物1001。如下文更詳細(xì)地解釋，移植物1001適合于在移植物植入具有神經(jīng)系統(tǒng)的活有機(jī)體中并且安放在切斷神經(jīng)的末端之間的間隙中(例如，其中神經(jīng)因外傷性損傷而切斷和/或由準(zhǔn)備進(jìn)行神經(jīng)恢復(fù)エ序的健康護(hù)理醫(yī)生來切除)中時(shí)促進(jìn)再生軸突生長穿過移植物。移植物1001是廣義上的管狀結(jié)構(gòu)。然而，在本發(fā)明的廣泛范圍內(nèi)，移植物不必具有任何特定橫截面形狀并且不需要具有任何中空部分。多細(xì)胞區(qū)域包括以上結(jié)合多細(xì)胞體的描述所述的相同類型的細(xì)胞。例如，多細(xì)胞區(qū)域適當(dāng)?shù)匕ㄟx自由以下組成的組的細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髄干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬細(xì)胞和其組合。在另ー個實(shí)例中，多細(xì)胞區(qū)域的細(xì)胞包括具有ー種或多種抗炎性質(zhì)的細(xì)胞，例如骨髓干細(xì)胞。在另ー個實(shí)例中，多細(xì)胞區(qū)域中的細(xì)胞包括施萬細(xì)胞。在另ー個實(shí)例中，多細(xì)胞區(qū)域中的細(xì)胞包括骨髄干細(xì)胞和施萬細(xì)胞的組合。當(dāng)多細(xì)胞區(qū)域包括施萬細(xì)胞時(shí)，施萬細(xì)胞的數(shù)量適當(dāng)?shù)卦诙嗉?xì)胞區(qū)域中的細(xì)胞總數(shù)的約0. 1%(v/v)至約20%(v/v)范圍內(nèi)，更適當(dāng)?shù)卦诩s1%(v/v)至約15%(v/v)范圍時(shí),并且更適當(dāng)?shù)卦诩s3%(v/v)至約10(v/v)%范圍內(nèi)，并且更適當(dāng)?shù)貫榧s5%(v/v)至約10%(v/v)。另外，在多細(xì)胞區(qū)域包括施萬細(xì)胞時(shí)，多細(xì)胞區(qū)域中的其它活細(xì)胞可適當(dāng)?shù)鼗旧嫌晒求l干細(xì)胞組成。然而，應(yīng)理解除以上敘述的特定實(shí)例中闡明的細(xì)胞類型組合以外的細(xì)胞類型的各種組合可存在于本發(fā)明的廣泛范圍內(nèi)的移植物的多細(xì)胞區(qū)域中。在圖5中示出的實(shí)施方案中，至少ー個無細(xì)胞通道1007在多細(xì)胞區(qū)域形成的結(jié)構(gòu)的相反末端之間軸向延伸穿過移植物1001的內(nèi)部。更具體地說，在圖5中，多個離散的無細(xì)胞通道1007在多細(xì)胞區(qū)域形成的結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸穿過移植物1001。無細(xì)胞通道1007的數(shù)量可在本發(fā)明的廣泛范圍內(nèi)變化。例如，適當(dāng)?shù)赜?個至7個無細(xì)胞通道，并且更適當(dāng)?shù)赜?個至5個無細(xì)胞通道。在另ー個實(shí)例中，有至少三個無細(xì)胞通道。例如，圖5中示出的移植物1001恰好具有三個無細(xì)胞通道1007。無細(xì)胞通道1007適當(dāng)?shù)匾恢毖由齑┻^移植物1001以使得在植入移植物時(shí)，每個通道可實(shí)質(zhì)上在相対的近端和遠(yuǎn)端神經(jīng)殘端之間一直連續(xù)地延伸。然而，無細(xì)胞通道的長度可比本發(fā)明范圍內(nèi)的移植物的總長度稍短。例如，移植物的外部周圍部分1003可例如通過使用圖2A和2B中概述的方法而變得比中央部分1005(包括中央部分中的無細(xì)胞通道)稍微更長。如果需要的話，可將具有更長外圍部分的末端移植物切斷以便準(zhǔn)備將移植物植入。如以上提及，在本發(fā)明范圍內(nèi)，還可在末端參差不齊時(shí)將移植物植入。無細(xì)胞通道1007適當(dāng)?shù)匾圆⑴湃∠虿贾貌⑶彝ㄟ^多細(xì)胞區(qū)域的細(xì)胞而彼此分隔，如圖5中示出。例如，無細(xì)胞通道10 07適當(dāng)?shù)鼗旧媳舜似叫?。此外，無細(xì)胞通道1007適當(dāng)?shù)赜啥嗉?xì)胞區(qū)域的部分來彼此隔開。無細(xì)胞通道1007還適當(dāng)?shù)鼐鶆虻乇舜烁糸_。多細(xì)胞區(qū)域的處于通道之間的部分的厚度取決于通道數(shù)量和通道直徑而變化。其具有支承無細(xì)胞通道的富含施萬細(xì)胞的村里的足夠厚度。無細(xì)胞通道1007適當(dāng)?shù)赜商畛潴w5形成。無細(xì)胞通道1007的尺寸可適當(dāng)?shù)嘏c如上所述的填充體的尺寸基本上相同?；蛘?，無細(xì)胞通道1007可具有與填充體5不同的長度。例如，兩個(或更多個)填充體可首尾相連放置以便產(chǎn)生一個比個別填充體更長的無細(xì)胞通道。在某些情況下，填充體5可在植入受損神經(jīng)部位之前從移植物1001去除。如果去除填充體5，無細(xì)胞通道1007在植入移植物1001時(shí)為空的，并且形成中空的軸突導(dǎo)向物，其引導(dǎo)軸突從近端神經(jīng)殘余部分生長穿過移植物到達(dá)遠(yuǎn)端神經(jīng)殘余部分。在其它情況下，一個或多個填充體5可保持于三維構(gòu)建體/移植物1001中并且與移植物的其余部分一起植入受損神經(jīng)部位。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在填充體5由瓊脂糖制成并且保持于用于植入的軸突導(dǎo)向成熟移植物的無細(xì)胞通道中的適當(dāng)位置時(shí)，來自近端神經(jīng)結(jié)構(gòu)的軸突生長進(jìn)入軸突導(dǎo)向移植物并且穿過軸突導(dǎo)向移植物。在這種情況下，填充體5還向移植物1001提供額外的機(jī)械完整性，并且在植入之前或之后對移植物進(jìn)行壓實(shí)的情況下有助于防止無細(xì)胞通道1007塌陷。施萬細(xì)胞適當(dāng)?shù)靥畛湟浦参?001的無細(xì)胞通道1007和多細(xì)胞區(qū)域之間的界面的至少一部分。具體地說，至少ー些施萬細(xì)胞適當(dāng)?shù)匦纬蔁o細(xì)胞通道1007的富含施萬細(xì)胞的村里，其用于支持軸突向內(nèi)生長。如5中示出，移植物具有具備較高百分比的施萬細(xì)胞的中央部分1005和圍繞中央部分并且具有較低百分比的施萬細(xì)胞的周圍部分1003。雖然周圍部分1003和中央部分1005之間的界限在圖5的示意圖中示出為明顯的界限，但是應(yīng)認(rèn)識到移植物的多細(xì)胞部分在實(shí)踐中并非如此明顯，而是存在從富含施萬細(xì)胞的中央部分到具有相對較少或沒有施萬細(xì)胞的周圍部分的逐漸過渡。移植物1001的富含施萬細(xì)胞的中央部分1005通常與含有較高百分比的施萬細(xì)胞的多細(xì)胞填充體I"形成的區(qū)域?qū)?yīng)。移植物1001的中央部分1005中的施萬細(xì)胞的總體百分比與如上所述的含有施萬細(xì)胞的多細(xì)胞體I"中的施萬細(xì)胞的百分比大約相等。在由多細(xì)胞體I’，I"和填充體5形成的三維構(gòu)建體101的成熟期間，一些施萬細(xì)胞以與差異粘附假說對于自動分選細(xì)胞類型的解釋一致的方式自動分選至無細(xì)胞通道1007的村里中。施萬細(xì)胞優(yōu)選地朝向無細(xì)胞通道1007的村里移動，雖然在本發(fā)明范圍內(nèi)，來自多細(xì)胞體I’，I "的其它類型的細(xì)胞也可存在于襯里內(nèi)。認(rèn)為無細(xì)胞通道1007的富含施萬細(xì)胞的村里有助于軸突向內(nèi)生長至移植物1001的無細(xì)胞通道中。施萬細(xì)胞己知在神經(jīng)發(fā)育和再生中起作用。不受任何特定理論的束縛，認(rèn)為由施萬細(xì)胞和/或受損神經(jīng)中的橫斷軸突釋放的神經(jīng)營養(yǎng)因子可促進(jìn)來自近端原生神經(jīng)的軸突生長穿過軸突導(dǎo)向移植物并且進(jìn)入神經(jīng)的遠(yuǎn)端。因?yàn)槭┤f細(xì)胞沿著無細(xì)胞通道1007的表面安置，所以其經(jīng)過安放以便可在軸突生長至移植物中時(shí)接觸軸突和/或瓊脂糖填充體。因此，施萬細(xì)胞釋放的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子可促進(jìn)軸突生長穿過移植物。根據(jù)前述應(yīng)認(rèn)識到移植物1001適當(dāng)?shù)貫楣こ袒M織，其通過使如上所述將多細(xì)胞體和填充體以預(yù)定方式布置而制備的組織構(gòu)建體101在恒溫箱中成熟來制成。由于使用如上所述的方法，多細(xì)胞區(qū)域形成的三維結(jié)構(gòu)適當(dāng)?shù)貫椴皇苌窠?jīng)支配的。此外，三維結(jié)構(gòu)適當(dāng)?shù)匕▉碜远嗉?xì)胞體的ー些殘留組織培養(yǎng)基。相比之下，許多用于神經(jīng)修復(fù)的現(xiàn)有技術(shù)移植物(包括自體移植物和同種異體移植物)是受神經(jīng)支配的。此外，現(xiàn)有技術(shù)自體移植物和同種異體移植物不包括任何組織培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，軸突導(dǎo)向移植物不包括任何由填充體形成的無細(xì)胞通道。據(jù)信，即使在沒有本文所述的無細(xì)胞通道的情況下來自近端原生神經(jīng)的軸突也可以生長進(jìn)入并且穿過軸突導(dǎo)向移植物。以下更詳細(xì)描述的圖11顯示，將在植入時(shí)包括由填充體占據(jù)的無細(xì)胞通道的軸突導(dǎo)向移植物植入三周之后，軸突(參考數(shù)字1017標(biāo)示的小黒點(diǎn))存在于 移植物中的處于無細(xì)胞通道1007部分外部的許多部位，所述無細(xì)胞通道在植入三周結(jié)束時(shí)仍存在于移植物中。這暗示軸突能夠在不生長穿過填充體或生長穿過無細(xì)胞通道的情況下從近端生長穿過如上所述的富含施萬細(xì)胞的中央部分1005到達(dá)遠(yuǎn)端。因此，缺乏本文所述的無細(xì)胞通道的軸突導(dǎo)向移植物也可支持軸突從近端原生神經(jīng)生長進(jìn)入并穿過移植物并且進(jìn)入原生神經(jīng)結(jié)構(gòu)的遠(yuǎn)端。使用軸突導(dǎo)向移植物來修復(fù)受損神經(jīng)在成熟之后，可將軸突導(dǎo)向移植物植入具有神經(jīng)損傷的活有機(jī)體(例如，人類或其它動物)中。軸突導(dǎo)向移植物可安放在切斷神經(jīng)的末端之間的間隙中。以此方式安放軸突導(dǎo)向移植物促進(jìn)再生軸突生長穿過軸突導(dǎo)向移植物的無細(xì)胞通道并且導(dǎo)致神經(jīng)功能的恢復(fù)。更具體地說，來自切斷原生神經(jīng)的近端的軸突生長穿過軸突導(dǎo)向移植物的無細(xì)胞通道并且進(jìn)入神經(jīng)結(jié)構(gòu)的遠(yuǎn)端。在植入之前，將圍繞軸突導(dǎo)向移植物1001的生物相容性凝膠材料(例如，瓊脂糖)去除，留下例如圖5中示出的結(jié)構(gòu)。如果無細(xì)胞通道1007中的生物相容性凝膠材料是使得軸突可從近端神經(jīng)結(jié)構(gòu)生長進(jìn)入和穿過軸突導(dǎo)向移植物的材料，那么可將其保留在適當(dāng)位置以便植入。例如，如果使用瓊脂糖填充體5來形成無細(xì)胞通道1007，那么瓊脂糖填充體不需要在植入之前從無細(xì)胞通道去除，因?yàn)榧褐词乖趯傊翘畛潴w保留在無細(xì)胞通道以便進(jìn)行植入的情況下，軸突也會生長進(jìn)入并且穿過移植物。將填充體5保留在無細(xì)胞通道1007中可有利地將額外的結(jié)構(gòu)整體性賦予移植物。例如，即使在植入之前或之后對移植物進(jìn)行壓縮，填充體也可保持無細(xì)胞通道敞開。作為另ー個實(shí)例，無細(xì)胞通道1007中的填充體5可在植入軸突導(dǎo)向移植物1001之前去除。去除無細(xì)胞通道1007中的填充體5將是合適的，例如，在填充體由不支持軸突生長的材料組成吋。如果無細(xì)胞通道1007中的填充體5在植入之前加以去除，那么無細(xì)胞通道在植入時(shí)是中空的，并且隨著時(shí)間的推移在軸突生長進(jìn)入移植物中時(shí)由軸突填充。本發(fā)明的軸突導(dǎo)向移植物可用于修復(fù)周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的任何神經(jīng)，所述神經(jīng)直接由于損傷或由于神經(jīng)切除手術(shù)而導(dǎo)致被切斷。軸突導(dǎo)向移植物可使用以上闡明的方法構(gòu)建為適合于修復(fù)切斷神經(jīng)中的間隙的長度，所述間隙的長度在至少約Icm至約7cm的范圍內(nèi)。軸突導(dǎo)向移植物適當(dāng)?shù)貥?gòu)建為具有至少與待修復(fù)的切斷神經(jīng)的末端之間的間隙一樣長的長度。因此，例如，如果切斷神經(jīng)中的間隙的長度為約3cm，那么軸突導(dǎo)向移植物適當(dāng)?shù)匾仓苽錇榫哂兄辽偌s3cm的長度。太長的移植物比太短的移植物要好得多，因?yàn)樵谕饪漆t(yī)生將神經(jīng)暴露時(shí)，太長的移植物可以很容易地切割成適當(dāng)長度。因此，將移植物適當(dāng)?shù)貥?gòu)建以使得其可在植入完成之前的任何時(shí)間切割成較短節(jié)段。軸突導(dǎo)向移植物尤其適合于修復(fù)切斷神經(jīng)中的長度過長導(dǎo)致不可能發(fā)生神經(jīng)的自發(fā)再生的間隙。自發(fā)再生通常只在切斷神經(jīng)的間隙小于約3cm長度的情況下發(fā)生，并且甚至在切斷神經(jīng)的間隙為2cm長度的情況下并不總是一定會發(fā)生。因此，軸突導(dǎo)向移植物尤其適合于修復(fù)切斷神經(jīng)中的至少約2cm的間隙。因此，軸突導(dǎo)向移植物適合于修復(fù)切斷神經(jīng)中的具有約Icm至約7cm范圍內(nèi)的長度的間隙，更適合于修復(fù)切斷神經(jīng)中的具有約2cm至約6cm范圍內(nèi)的長度的間隙，并且更適合于修復(fù)切斷神經(jīng)中的具有約3cm至約5cm范圍內(nèi)的長度的間隙。此外，應(yīng)認(rèn)識到通過使用本發(fā)明技術(shù)來制備軸突導(dǎo)向移植物，移植物的橫截面架構(gòu)可經(jīng)過構(gòu)建以便匹配待修復(fù)的神經(jīng)的橫截面架構(gòu)。具體地說，軸突導(dǎo)向移植物的直徑可例如通過改變多細(xì)胞體和/或填充體的直徑，或通過改變用于構(gòu)建軸突導(dǎo)向移植物的多細(xì) 胞體和或填充體的數(shù)量來變化。另外，可使用ー個以上軸突導(dǎo)向移植物以便修復(fù)較大直徑神經(jīng)的損傷。此外，軸突導(dǎo)向移植物中的無細(xì)胞通道的數(shù)量可使用在上文中描述的技術(shù)來改變以便產(chǎn)生具有適合于需要修復(fù)的受損神經(jīng)束的架構(gòu)的軸突導(dǎo)向移植物。軸突導(dǎo)向移植物可單獨(dú)或在支承套筒(例如，膠原導(dǎo)管或尸體脫細(xì)胞神經(jīng))內(nèi)部來植入切斷神經(jīng)部位。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇合適的支承套筒。通常，在本領(lǐng)域中通過其它技術(shù)(例如，使用自體移植物)用于修復(fù)受損神經(jīng)的膠原導(dǎo)管也適合于用作與本文所述的本發(fā)明軸突導(dǎo)向移植物相關(guān)的支承套筒。例如，可使用Integra Life Sciences出售的NEUR0GEN膠原導(dǎo)管。待插入軸突導(dǎo)向移植物的切斷神經(jīng)部位可使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)技術(shù)來暴露。當(dāng)単獨(dú)(例如，沒有膠原導(dǎo)管)植入軸突導(dǎo)向移植物時(shí)，將軸突導(dǎo)向移植物適當(dāng)?shù)馗≈弥潦中g(shù)區(qū)域上并且作為插入移植物在每個末端用手術(shù)粘附劑(例如，纖維蛋白膠)或縫線來加以固定。當(dāng)軸突導(dǎo)向移植物與例如膠原導(dǎo)管的支承套筒一起植入時(shí)，將膠原導(dǎo)管或其它套筒適當(dāng)?shù)厍懈钜允沟闷溟L度約匹配待植入的軸突導(dǎo)向移植物的長度。還將膠原導(dǎo)管沿著其縱軸加以切割。然后將軸突導(dǎo)向移植物適當(dāng)?shù)馗≈弥潦中g(shù)區(qū)域上并且進(jìn)入縱向切割的導(dǎo)管，并且將導(dǎo)管中的縱向切口重新密封?；蛘?，可將軸突導(dǎo)向移植物放置在縱向切割的導(dǎo)管內(nèi)部，然后轉(zhuǎn)移至手術(shù)區(qū)域。然后可將原生神經(jīng)結(jié)構(gòu)的游離末端適當(dāng)?shù)匮b入導(dǎo)管中并且用手術(shù)粘附劑或手術(shù)縫合材料(例如，9-0尼龍)加以固定。一旦將軸突導(dǎo)向移植物固定至切斷神經(jīng)結(jié)構(gòu)的兩個末端，手術(shù)區(qū)域可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)技術(shù)來加以閉合。
實(shí)施例實(shí)施例I :制備多細(xì)胞體。小鼠骨髓干細(xì)胞。小鼠骨髓干細(xì)胞(BMSC)在Eisenberg等，Bone Marrowしells Transdifierentiate to しardiomyocytes Wnen Introduced into the EmbryonicHeart, Stem Cells24:1236 — 45 (2006)使用的相同條件下分離，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。簡單地說，將完整骨髓從8 — 12周齡野生型ICR小鼠的股骨分離。將骨骼用伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏培養(yǎng)基(Iscove’s modified Dulbecco's medium ；IMDM)沖洗之后，將骨髓重復(fù)穿過20號針并且通過40 y m尼龍?zhí)淄策^濾。將所得細(xì)胞懸液清洗并且在具有MDM/20%胎牛血清(FBS)的細(xì)菌級陪替氏培養(yǎng)皿(Petri dish)中放置四周，并且每周提供新鮮的培養(yǎng)基。分離之后，將小鼠BMSC在補(bǔ)充有12%供體馬血清、12%小牛血清、ImM氫化可的松(hydrocortisone)和I. OX IO5單位/升青霉素和鏈霉素(BMSC培養(yǎng)基)的頂DM中培養(yǎng)。將細(xì)胞在IOcm陪替氏培養(yǎng)皿中生長并且在37°C，5%C02下孵育。需要十二個匯合陪替氏培養(yǎng)皿來制備ー個具有約2. 5mm外徑和3. 5cm長度的軸突導(dǎo)向移植物。施萬細(xì)胞。施萬細(xì)胞(CRL-2765)購自ATCC。培養(yǎng)基組合物是補(bǔ)充有10%FBS和
I.OX IO5単位/升青霉素和鏈霉素(施萬細(xì)胞培養(yǎng)基)的杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium ；DMEM)高葡萄糖。
制備瓊脂糖模型制備2%瓊脂糖溶液。將兩克超純低融點(diǎn)(LMP)瓊脂糖溶解于IOOml超純水/緩沖溶液(I: I, v/v)中。緩沖溶液可為PBS(杜爾貝科氏(Dulbecco’s)磷酸鹽緩沖鹽水Ix)或HBSS (漢克斯氏(Hanks’)平衡鹽溶液Ix)。將瓊脂糖溶液放置含有溫水(80°C )的燒杯中并且保留在熱板上直到瓊脂糖完全溶解為止。只要溫度在36°C以上，瓊脂糖溶液就保持液態(tài)。在此溫度以下，發(fā)生相轉(zhuǎn)變，粘度増加，并且最后瓊脂糖形成凝膠。制備瓊脂糖模型。使用適合于細(xì)胞培養(yǎng)皿221 (10cm直徑)的特氟隆打印(S卩，特氟隆工具201)(圖4A — C)來形成瓊脂糖模型。將組裝體(特氟隆工具+陪替氏培養(yǎng)皿)保持垂直并且將約40ml預(yù)溫的瓊脂糖通過特氟隆工具中的孔傾倒至陪替氏培養(yǎng)皿中。去除所有空氣氣泡之后，將組裝體在4°C下放置至少I小吋。瓊脂糖完全凝膠化之后，將特氟隆工具201去除并且在瓊脂糖中可見溝槽(參見圖4C中的溝槽305)。然后將IOml培養(yǎng)基添加至模型。制備多細(xì)胞體。BMSC多細(xì)胞體。將培養(yǎng)基從BMSC的匯合陪替氏培養(yǎng)皿去除并且將細(xì)胞以IOmlPBS清洗。將I. 5ml的0. 1%胰蛋白酶均勻地散布在細(xì)胞上以便使細(xì)胞與表面分離。當(dāng)細(xì)胞開始從培養(yǎng)皿分離時(shí)，將BMSC培養(yǎng)基中的5ml的2mM CaCl2溶液添加至培養(yǎng)皿。將所得細(xì)胞懸液在900g下離心5分鐘。去除培養(yǎng)基(即，去除上清液)之后，將細(xì)胞球団重懸于含有2mMCaCl2的200 u I BMSC培養(yǎng)基中并且用吸移管上下泵送(即，有力地吸取)若干次以便使細(xì)胞集群破裂并且獲得基本上均勻的細(xì)胞懸液。為了制備大致桿形的BMSC多細(xì)胞體，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至放置在15ml離心管內(nèi)部的2ml Eppendorf管中。高密度球團(tuán)通過在1300g下離心2分鐘來形成。將培養(yǎng)基(S卩，上清液)去除并且將球團(tuán)(即，細(xì)胞粘團(tuán))通過抽吸轉(zhuǎn)移至插入安裝在Iml Eppendorf移液器上的Iml尖端中的毛細(xì)管(外徑(OD)=Imm ;內(nèi)徑(ID)=O. 5或0. 3mm)中。將含有細(xì)胞粘團(tuán)的毛細(xì)管在含有2mM CaCl2的培養(yǎng)基中在37°C，5%C02下孵育15分鐘。將所得成形細(xì)胞粘團(tuán)55以大致桿形體形式從具有柱塞的毛細(xì)管51擠出至填充有培養(yǎng)基的瓊脂糖模型301的溝槽305中，如圖3C中所示。將模型301放置在恒溫箱中過夜。第二天，將大致桿形的成熟BMSC多細(xì)胞體I手動抽吸(S卩，反吸)至毛細(xì)管51'中并且放置在培養(yǎng)基中直到進(jìn)ー步使用，如圖3D中所示。
(B)混合BMSC和施萬細(xì)胞的多細(xì)胞體。將培養(yǎng)基從施萬細(xì)胞的匯合陪替氏培養(yǎng)皿去除并且將細(xì)胞以IOml PBS清洗。將I. 5ml的0. 1%胰蛋白酶均勻地散布在細(xì)胞上以便使細(xì)胞與表面分離。當(dāng)細(xì)胞開始從培養(yǎng)皿分離時(shí)，將5ml施萬細(xì)胞培養(yǎng)基添加至培養(yǎng)皿。所得細(xì)胞懸液在900g下離心5分鐘。將BMSC從匯合陪替氏培養(yǎng)皿分離，重懸于BMSC培養(yǎng)基中的5ml的2mM CaCl2溶液中，并且在900g下離心5分鐘，如上所述。為了形成包含BMSC和施萬細(xì)胞的大致桿形的多細(xì)胞體，估算細(xì)胞球団的體積。含有約90%BMSC和約10%施萬細(xì)胞(v/v)的細(xì)胞懸液在200 u I的BMSC培養(yǎng)基中制備并且在1300g下離心2分鐘以便形成高密度細(xì)胞球団。根據(jù)如上所述的エ序，含有BMSC和施萬細(xì)胞兩者的多細(xì)胞體由此高密度球團(tuán)來制備。實(shí)例2 :制備具有三個無細(xì)胞通道的生物工程軸突導(dǎo)向移植物。將2%瓊脂糖的十毫升預(yù)溫溶液沉積在IOcm陪替氏培養(yǎng)皿中并且均勻地散布以便形成均勻的層。將陪替氏培養(yǎng)皿在4°C下放置以便引起瓊脂糖膠凝。將毛細(xì)管用2%瓊脂糖溶液填充并且冷卻(使用冷的吹入空氣或冷的PBS溶液)以便形成大致桿形的填充體?！ぴ陔p筒顯微鏡下，使用活塞或?qū)Ь€將填充體5從毛細(xì)管51，51’擠出，并且將5cm長瓊脂糖桿(即，填充體)筆直地安放陪替氏培養(yǎng)皿內(nèi)部的瓊脂糖層上。參照圖I和2，將第二填充體5與第一填充體并置(例如，相鄰放置)等直到沉積10個填充體以便形成結(jié)構(gòu)的第一層。將存在于結(jié)構(gòu)的第二層中的六個填充體5如圖I和2中所示來沉積。將三個BMSC多細(xì)胞體I’沉積于結(jié)構(gòu)的第二層的第四、第五和第六位置以便形成軸突導(dǎo)向移植物的底層。如圖I和2所示，結(jié)構(gòu)的第三層通過將五個填充體5沉積在第一、第二、第四、第七和第八位置，兩個BMSC多細(xì)胞體I’沉積在第三和第六位置，并且混合BMSC/施萬細(xì)胞多細(xì)胞體I"沉積在第五位置來形成。在結(jié)構(gòu)的第四層中，將三個填充體5沉積在第一、第五和第七位置，將兩個BMSC多細(xì)胞體I’沉積在第二和第六位置，并且將兩個混合BMSC/施萬細(xì)胞多細(xì)胞體沉積在第三和第四位置I"。結(jié)構(gòu)的第五層由三個填充體5(第一、第三和第六位置)、兩個BMSC多細(xì)胞體I’ (在第二和第五位置)和ー個混合BMSC/施萬細(xì)胞多細(xì)胞體I"(在第四位置)組成。為了形成結(jié)構(gòu)的第六層，將兩個瓊脂糖填充體5沉積在第一和第五位置，并且將三個BMSC多細(xì)胞I’體沉積在第二、第三和第四位置以便形成軸突導(dǎo)向移植物的頂層。第七層由四個瓊脂糖填充體5組成。在整個沉積過程中，將少量組織培養(yǎng)基(每次約IOiU)添加至構(gòu)建體的側(cè)面以便避免材料(即，瓊脂糖和多細(xì)胞體)脫水。以與用于構(gòu)建如上所述并且在圖I中示出的結(jié)構(gòu)的填充體和多細(xì)胞體垂直的取向，將瓊脂糖填充體放置在構(gòu)建體的頂部，并且將0. 5至Iml的液體瓊脂糖傾倒至結(jié)構(gòu)周圍以便維持構(gòu)建體的完整性。在凝膠化之后，添加組織培養(yǎng)基直到整個構(gòu)建體完全淹沒。將構(gòu)建體放置在恒溫箱歷經(jīng)10至14天成熟期，并且每隔一天更換組織培養(yǎng)基。14天之后，去除包圍軸突導(dǎo)向移植物的瓊脂糖并且移植物足夠強(qiáng)固以便維持縫合和植入。圖6是在14天成熟期之后使用以上エ序在IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿221中制備的軸突導(dǎo)向移植物的照片。實(shí)施例3 :施萬細(xì)胞在生物工程軸突導(dǎo)向移植物中的定位。為了觀測成熟軸突導(dǎo)向移植物中的細(xì)胞布置，將施萬細(xì)胞用熒光膜染料，DiIC18 (5)-DS親脂性羰花青示蹤劑來染色。使用以上概述的エ序?qū)⑦@些熒光標(biāo)記的施萬細(xì)胞用于產(chǎn)生混合BMSC/施萬細(xì)胞多細(xì)胞體，并且根據(jù)以上概述的エ序?qū)⑺没旌螧MSC/熒光標(biāo)記的施萬細(xì)胞多細(xì)胞體用于制備軸突導(dǎo)向移植物。在十天成熟期之后，將軸突導(dǎo)向移植物從瓊脂糖去除。將橫切片從成熟的軸突導(dǎo)向移植物切除并且使用熒光立體顯微鏡觀察以便觀測施萬細(xì)胞的熒光染色和定位。如圖7中可見，施萬細(xì)胞(結(jié)構(gòu)中的較明亮區(qū)域表示)在生物工程軸突導(dǎo)向移植物的中央部分1005處的濃度較高并且在周圍的濃度較低。因此，應(yīng)認(rèn)識到形成中央部分的細(xì)胞包括的施萬細(xì)胞的百分比比形成移植物的周圍部分的細(xì)胞的百分比高。結(jié)構(gòu)中的三個無細(xì)胞通道1007在影像中以較暗斑點(diǎn)形式出現(xiàn)。以綠色顯示施萬細(xì)胞的此照片的彩色版本出現(xiàn)在美國臨時(shí)申請第61/337，307號的圖2(a)中，該臨時(shí)申請以引用的方式整體并入本文并且本申請要求其的優(yōu)先權(quán)。在將出現(xiàn)在所述臨時(shí)申請和Hubbard等的參考文獻(xiàn)中的彩色照片轉(zhuǎn)化為以本文中圖7形式呈現(xiàn)的黒白照片的過程中，首先，整個影像的顏色飽和度増加，然后整個影像的亮度增加，影像轉(zhuǎn)化為灰度，然后整個影像的對比度増加。此過程將移植物的綠色熒光部分加亮并且導(dǎo)致移植物的富含施萬細(xì)胞的部分顯得更亮，而移植物的其它部分在增強(qiáng)灰度照片中為較暗的灰色。
施萬細(xì)胞在軸突導(dǎo)向移植物的中央部分處的濃度較高并且在周圍的濃度較低的此布置方式在圖5中示意性地示出。在圖5中，與具有較高濃度施萬細(xì)胞并且含有無細(xì)胞通道1007的中央部分1005相比，外部周圍部分1003具有較低濃度的施萬細(xì)胞。實(shí)施例4 :在大鼠中植入軸突導(dǎo)向移植物ーエ序I通過軸突導(dǎo)向移植物實(shí)現(xiàn)的軸突再生已經(jīng)在嚙齒動物坐骨神經(jīng)損傷模型中得到研究。將重約400克的雌性斯普拉-道來氏大鼠(Sprague Dawley rat)用氯胺酮(87mg/kg)和甲苯噻嗪(13mg/kg)的混合溶液經(jīng)由腹膜內(nèi)(IP)途徑來麻酔。所述エ序在無菌制備和披蓋條件下進(jìn)行并且在エ序期間和恢復(fù)后使用加溫墊。在術(shù)前和術(shù)后將大鼠保持于單ー籠中直到完全恢復(fù)胸骨狀態(tài)為止。在鎮(zhèn)靜之后，將大鼠的左側(cè)大腿剃光井且將大鼠后肢進(jìn)行預(yù)備并且用無菌物披蓋。用手木刀沿著中間側(cè)大腿切開皮膚并且將皮瓣抬高以便暴露肌肉筋膜。將此肌肉筋膜切割并且將大腿肌肉組織之間的間隙縱向切分，以便清晰地暴露坐骨神經(jīng)的分支點(diǎn)處以及其遠(yuǎn)端的直線趨向。將一段Icm的接近其分叉點(diǎn)的神經(jīng)分離并且將Icm神經(jīng)節(jié)段切除。將生物工程軸突導(dǎo)向移植物浮置至區(qū)域上并且作為插入神經(jīng)移植物在每個末端用纖維蛋白膠加以固定，并且容留時(shí)間以便形成密封件。將傷ロ輕輕地沖洗并且在整個エ序中以輕微壓カ實(shí)現(xiàn)止血。將肌肉和皮膚以4-0吸收性縫線來閉合。使大鼠在隔離籠中在加溫墊上恢復(fù)至胸骨狀態(tài)。圖8是使用此エ序植入軸突導(dǎo)向移植物之后的大鼠中的手術(shù)區(qū)域的照片。軸突導(dǎo)向移植物1001在手術(shù)區(qū)域1009中可見。實(shí)施例5 :在大鼠中植入軸突導(dǎo)向移植物ーエ序2將重約400克的雌性斯普拉-道來氏大鼠用氯胺酮(87mg/kg)和甲苯噻嗪(13mg/kg)的混合溶液經(jīng)由IP途徑來麻酔。所述エ序在無菌制備和披蓋條件下進(jìn)行并且在エ序期間和恢復(fù)后使用加溫墊。在術(shù)前和術(shù)后將大鼠保持于單ー籠中直到完全恢復(fù)胸骨狀態(tài)為止。在鎮(zhèn)靜之后，將大鼠的左側(cè)大腿剃光井且將大鼠后肢進(jìn)行預(yù)備并且用無菌物披蓋。用手木刀沿著中間側(cè)大腿切開皮膚并且將皮瓣抬高以便暴露肌肉筋膜。將此肌肉筋膜切割并且將大腿肌肉組織之間的間隙縱向切分，以便清晰地暴露坐骨神經(jīng)的分支點(diǎn)處以及其遠(yuǎn)端的直線趨向。將一段Icm的接近其分叉點(diǎn)的神經(jīng)分離并且將Icm神經(jīng)節(jié)段切除。將生物エ程軸突導(dǎo)向移植物浮置至經(jīng)過切割以便適合于I厘米傷ロ(即，約12至14毫米長度)的縱向切割商購膠原神經(jīng)導(dǎo)向裝置(即，“膠原管”或“膠原導(dǎo)管”)，其用作工程化移植物的支承套筒。將原生坐骨神經(jīng)的游離末端裝入膠原支承套筒中并且用9-0尼龍加以固定。然后將傷ロ沖洗并且以輕微壓カ實(shí)現(xiàn)止血。將肌肉和皮膚以4-0吸收性縫線來閉合。使大鼠在隔離籠中在加溫墊上恢復(fù)至胸骨狀態(tài)。圖9是使用此エ序?qū)⑤S突導(dǎo)向移植物植入膠原導(dǎo)管1011內(nèi)部之后的大鼠中的手術(shù)區(qū)域1009的照片。原生神經(jīng)結(jié)構(gòu)的近端1013和遠(yuǎn)端1015部分也是可見的。實(shí)施例6 :植入之后三周對于軸突導(dǎo)向移植物進(jìn)行的肉眼可見的形態(tài)和組織學(xué)評估。在植入后三周，將大鼠以如上所述相同的方式麻醉并且使植入部位暴露。將包含生物工程軸突導(dǎo)向移植物和原生神經(jīng)軸突導(dǎo)向移植物近端和遠(yuǎn)端的部分的神經(jīng)節(jié)段從大鼠收獲并且拍照以便觀察形態(tài)。圖10是在植入之后三周使用如上所述的エ序2收獲的含有軸突導(dǎo)向移植物的神經(jīng)節(jié)段的照片。圖10中的箭頭指示獲取橫切片以便進(jìn)行組織學(xué)評 估的位置。切片AA在近端原生神經(jīng)處切割 ，切片BB在近端原生神經(jīng)與軸突導(dǎo)向移植物的接合處 ，切片CC在軸突導(dǎo)向移植物的中心處；切片DD在遠(yuǎn)端軸突導(dǎo)向移植物與原生遠(yuǎn)端神經(jīng)的接合處；并且切片EE在原生遠(yuǎn)端神經(jīng)處。存在于遠(yuǎn)端原生神經(jīng)(即，切片EE)中的任何軸突已經(jīng)通過軸突導(dǎo)向移植物再生。圖11顯示與圖10中的箭頭指示的切片近似相對應(yīng)的位置獲取的橫切片在4x和IOx放大率下的組織學(xué)影像。對于組織化學(xué)，將收獲的神經(jīng)節(jié)段在4%多聚甲醛中固定過夜。用こ醇系列脫水之后，將組織處理以便石蠟浸潤和包埋。將4pm橫切片在圖10中指示的位置處切除并且進(jìn)行Bielschowsky染色以便檢測軸突。在圖11中，軸突1017以小黑色斑點(diǎn)形式出現(xiàn)在較高放大率(即，IOx)切片中。另夕卜，膠原支承套筒1011的一部分在一些較低放大率(即，4x)影像中可見。切片中的白色區(qū)域是無細(xì)胞通道1007的剰余部分。連續(xù)切片的這些組織學(xué)影像表明軸突從近端原生神經(jīng)，穿過軸突導(dǎo)向移植物，并且進(jìn)入遠(yuǎn)端原生神經(jīng)的再生。圖12顯示在將用作支承套筒的膠原導(dǎo)管內(nèi)部的生物工程軸突導(dǎo)向移植物植入三周之后，從近端原生神經(jīng)和從遠(yuǎn)端原生神經(jīng)獲取的橫切片在40x放大率下獲取的組織學(xué)影像。圖12中的比例尺1019為lOOym長。軸突1017以小黑色斑點(diǎn)形式出現(xiàn)，并且影像表明在植入三周之后，約40%的存在于近端殘余部分中的軸突穿越生物工程軸突導(dǎo)向移植物并且到達(dá)原生神經(jīng)的遠(yuǎn)端殘余部分，如在高倍放大影像上手動計(jì)數(shù)所獲得。實(shí)施例7 :植入后十二周軸突導(dǎo)向移植物的總體形態(tài)根據(jù)如上所述的エ序?qū)τ诖菩許pragueDawley大鼠的坐骨神經(jīng)進(jìn)行IOmm切除。通過用空的或以使用如上所述的方法制備的生物工程軸突導(dǎo)向移植物填充的膠原導(dǎo)管/套筒對間隙進(jìn)行修復(fù)來進(jìn)行比較研究。十二周之后，將膠原導(dǎo)管(意指在植入時(shí)是空的膠原導(dǎo)管和用作生物工程移植物的套筒的膠原導(dǎo)管)與近端和遠(yuǎn)端神經(jīng)殘余部分一起收獲，并且拍照以便觀察形態(tài)。圖13顯示將単獨(dú)膠原導(dǎo)管(圖(a))或?qū)⒂蒙锕こ梯S突導(dǎo)向移植物填充的膠原導(dǎo)管(圖(b))植入12周之后收獲的導(dǎo)管和近端和遠(yuǎn)端神經(jīng)殘余部分的比較。近端原生神經(jīng)結(jié)構(gòu)1013在收獲節(jié)段的極左末端是可見的。遠(yuǎn)端神經(jīng)結(jié)構(gòu)1015主要地由組織包圍，但是在收獲節(jié)段的極右末端是可見的。在圖(b)中，膠原導(dǎo)管的一部分已經(jīng)去除以便暴露平滑和界限分明的修復(fù)1021。膠原導(dǎo)管中的切ロ的邊界由虛線1023指示。膠原導(dǎo)管1025的其余部分在虛線右側(cè)。照片指示在植入12周之后，神經(jīng)的近端和遠(yuǎn)端殘余部分之間的連續(xù)性已經(jīng)使用任一種修復(fù)方法來重建。然而，含有軸突導(dǎo)向移植物的膠原導(dǎo)管產(chǎn)生更平滑并且界限更分明(即不變直徑)的連接。另外，植入軸突導(dǎo)向移植物的膠原導(dǎo)管幾乎完全是完整的；另一方面，在植入單獨(dú)膠原導(dǎo)管時(shí)，其幾乎完全被再吸收。在圖13的圖(a)中，膠原導(dǎo)管的唯一的剰余部分由實(shí)線1027環(huán)繞。不受任何特定理論的束縛，這被認(rèn)為是由于膠原導(dǎo)管與軸突導(dǎo)向移植物一起植入其中的動物中的炎癥反應(yīng)減少而引起的，因?yàn)锽MSC具有抗炎性質(zhì)。實(shí)施例8 :修復(fù)切斷的人神經(jīng)的方法辨識神經(jīng)需要修復(fù)的人患者。任選地對于患者進(jìn)行神經(jīng)切除手木。具有與待修復(fù)的神經(jīng)的近端殘余部分與遠(yuǎn)端殘余部分之間的距離近似相等的長度的軸突導(dǎo)向移植物根據(jù)以上概述的エ序來制備。
將人患者麻酔。將切斷神經(jīng)暴露并且使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)技術(shù)進(jìn)行觀測。將軸突導(dǎo)向移植物放置神經(jīng)的近端與遠(yuǎn)端殘余部分之間，并且神經(jīng)的近端和遠(yuǎn)端殘余部分通過縫線或手術(shù)粘附劑來固定至移植物。然后將傷ロ沖洗并且以輕微壓カ實(shí)現(xiàn)止血。肌肉和皮膚使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)技術(shù)來閉合。實(shí)施例9 :修復(fù)切斷的人神經(jīng)的方法辨識神經(jīng)需要修復(fù)的人患者。任選地對于患者進(jìn)行神經(jīng)切除手木。具有與待修復(fù)的神經(jīng)的近端殘余部分與遠(yuǎn)端殘余部分之間的距離近似相等的長度的軸突導(dǎo)向移植物根據(jù)以上概述的エ序來制備。將人患者麻酔。將待修復(fù)的神經(jīng)暴露并且使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)技術(shù)進(jìn)行觀測。將軸突導(dǎo)向移植物浮置至經(jīng)過切割以便適合于神經(jīng)的近端殘余部分與神經(jīng)的遠(yuǎn)端殘余部分之間的空間的縱向切割膠原支承套筒中。膠原支承套筒和/或移植物的多余末端如果存在的話可加以去除。將神經(jīng)的近端和遠(yuǎn)端末端裝入膠原支承套筒中并且用縫線或手術(shù)粘附劑加以固定。然后將傷ロ沖洗并且以輕微壓カ實(shí)現(xiàn)止血。肌肉和皮膚使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)技術(shù)來閉合。雖然已結(jié)合其具體實(shí)施方案對本發(fā)明予以描述，但是應(yīng)理解本發(fā)明的方法能夠進(jìn)行進(jìn)ー步改進(jìn)。本申請_在涵蓋大體上符合本發(fā)明原理的、包括雖然不屬于本發(fā)明所公開內(nèi)容范疇但屬于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的公知技術(shù)或常用的技術(shù)手段并可以應(yīng)用于上文中闡述過的以及如以下所附權(quán)利要求范圍示出的必要特征中的任何變型、用途或者變更。當(dāng)介紹本文中的多細(xì)胞構(gòu)建體、三維結(jié)構(gòu)、軸突導(dǎo)向移植物和多細(xì)胞體的要素時(shí)，冠詞“一”和“所述”意在表示存在一個或多個所述要素。術(shù)語“包含”、“包括”和“具有”及其變型_在表示包括在內(nèi)的，并且意指可存在除所列要素以外的其它要素。因?yàn)榭稍谏衔闹性诓槐畴x本發(fā)明范圍的情況下做出各種改變，所以以上說明書中所包含并的且在附圖中示出的所有內(nèi)容均應(yīng)理解為是說明性的并且不具有限制意義。
權(quán)利要求
1.一種多細(xì)胞構(gòu)建體，其包含 多細(xì)胞區(qū)域，其包含多個彼此粘附的活細(xì)胞以形成細(xì)長移植物，以便恢復(fù)切斷神經(jīng)的末端之間的神經(jīng)連接；以及 多個無細(xì)胞通道，其透過所述移植物內(nèi)部軸向延伸。
2.如權(quán)利要求I所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述無細(xì)胞通道是中空的或以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
3.如權(quán)利要求I所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充或全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
4.如權(quán)利要求I所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充、全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充或其任意組合。
5.如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述活細(xì)胞包括選自由間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬細(xì)胞及其組合組成的組的細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述活細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述多細(xì)胞區(qū)域中的活細(xì)胞總數(shù)的約O. 1%至約20%是施萬細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述多細(xì)胞區(qū)域中的活細(xì)胞總數(shù)的約1%至約15%是施萬細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述多細(xì)胞區(qū)域中的活細(xì)胞總數(shù)的1%至約10%是施萬細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述多細(xì)胞區(qū)域中的活細(xì)胞總數(shù)的約3%至約10%是施萬細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述多細(xì)胞區(qū)域中的活細(xì)胞總數(shù)的約5%至約10%是施萬細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述施萬細(xì)胞的至少一些填充所述無細(xì)胞通道與所述多細(xì)胞區(qū)域之間的界面的至少部分。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述移植物具有中央部分和圍繞所述中央部分的周圍部分，所述中央部分中的細(xì)胞，即施萬細(xì)胞的百分比高于所述周圍部分中的細(xì)胞，即施萬細(xì)胞的百分比。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述無細(xì)胞通道中的所述一種或多種無細(xì)胞材料包含瓊脂糖。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中無細(xì)胞通道的數(shù)量的范圍為2至5。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞構(gòu)建體,其中所述活細(xì)胞包括具有抗炎性質(zhì)的細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述移植物是管狀的。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述移植物是工程化組織。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述移植物是不受神經(jīng)支配的。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞構(gòu)建體，其中所述移植物包含組織培養(yǎng)基。
22.—種細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其包含 多個工程化多細(xì)胞體，每個多細(xì)胞體包含多個彼此粘附的活細(xì)胞；以及 多個離散填充體，每個填充體包含抵抗細(xì)胞從所述多細(xì)胞體遷移和向內(nèi)生長至所述填充體中的生物相容性材料， 其中所述多細(xì)胞體以使得每個多細(xì)胞體接觸至少一個其它多細(xì)胞體的方式來布置，并且所述填充體經(jīng)過安放和布置以便形成多個在所述結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。
23.—種細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其包含 多個不受神經(jīng)支配的多細(xì)胞體，每個多細(xì)胞體包含多個彼此粘附的活細(xì)胞；以及 多個離散填充體，每個填充體包含抵抗細(xì)胞從所述多細(xì)胞體遷移和向內(nèi)生長至所述填充體中的生物相容性材料， 其中所述多細(xì)胞體以使得每個多細(xì)胞體接觸至少一個其它多細(xì)胞體的方式來布置，并且所述填充體經(jīng)過安放和布置以便形成多個在所述結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。
24.一種細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其包含 多個多細(xì)胞體，每個多細(xì)胞體包含組織培養(yǎng)基和多個彼此粘附的活細(xì)胞；以及 多個離散填充體，每個填充體包含抵抗細(xì)胞從所述多細(xì)胞體遷移和向內(nèi)生長至所述填充體中的生物相容性材料， 其中所述多細(xì)胞體以使得每個多細(xì)胞體接觸至少一個其它多細(xì)胞體的方式來布置，并且所述填充體經(jīng)過安放和布置以便形成多個在所述結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。
25.如權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述無細(xì)胞通道是中空的或以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
26.如權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充或全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
27.如權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充、全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充或其任意組合。
28.如權(quán)利要求22-27中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述無細(xì)胞通道具有彼此并排的取向并且通過所述多細(xì)胞體彼此隔開。
29.如權(quán)利要求22-28中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中存在至少三個在所述結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。
30.如權(quán)利要求22-29中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述多個活細(xì)胞包括選自由間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬細(xì)胞及其組合組成的組的細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求22-30中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述多個活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求22-31中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述多個活細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求22-32中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述多細(xì)胞體包含具有相對較高百分比的施萬細(xì)胞的第一類型的多細(xì)胞體以及具有相對較低百分比的施萬細(xì)胞的第二類型的多細(xì)胞體。
34.如權(quán)利要求33所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述第二類型的多細(xì)胞體經(jīng)過布置以便圍繞所述第一類型的多細(xì)胞體和所述填充體。
35.如權(quán)利要求33或34中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述第一類型的多細(xì)胞體與所述填充體相鄰安放。
36.如權(quán)利要求33-35中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述第二類型的多細(xì)胞體包含骨髓干細(xì)胞。
37.如權(quán)利要求36所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述第一類型的多細(xì)胞體包含骨髓干細(xì)胞，并且其中所述第二類型的多細(xì)胞體中的骨髓干細(xì)胞的百分比高于所述第一類型的多細(xì)胞體中的骨髓干細(xì)胞的百分比。
38.如權(quán)利要求22-37中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述多細(xì)胞體的至少一些是大致桿形的。
39.如權(quán)利要求22-38中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述填充體的至少一些是大致桿形的。
40.如權(quán)利要求22-37中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述多細(xì)胞體的至少一些是大致球形的。
41.如權(quán)利要求22-37和40中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述填充體的至少一些是大致球形的。
42.如權(quán)利要求22-41中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述填充體的所述生物相容性材料抵抗所述多細(xì)胞體中的細(xì)胞粘附在所述填充體上。
43.如權(quán)利要求22-42中任一項(xiàng)所述的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其中所述填充體的至少一個包含瓊脂糖并且至少一個多細(xì)胞體中的活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞，所述至少一個多細(xì)胞體與所述至少一個填充體接觸，以使得存在與含有瓊脂糖的填充體相鄰的施萬細(xì)胞。
44.一種軸突導(dǎo)向移植物，所述移植物在被移植到具有神經(jīng)系統(tǒng)的活有機(jī)體中并且被安放在切斷神經(jīng)的末端之間的間隙中時(shí)通過促進(jìn)再生軸突生長穿過所述移植物來恢復(fù)神經(jīng)功能，所述移植物包含 細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，其包含多個活細(xì)胞；以及 多個離散的無細(xì)胞通道，其在所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸。
45.如權(quán)利要求44所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的或以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
46.如權(quán)利要求44所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充或全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
47.如權(quán)利要求44所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充、全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充或其任意組合。
48.如權(quán)利要求44-47中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述多個活細(xì)胞包括選自由間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬細(xì)胞及其組合組成的組的細(xì)胞。
49.如權(quán)利要求44-48中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述三維結(jié)構(gòu)是不受神經(jīng)支配的。
50.如權(quán)利要求44-49中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)是工程化組織。
51.如權(quán)利要求44-50中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)包含組織培養(yǎng)基。
52.如權(quán)利要求44-51中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述多個活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞。
53.如權(quán)利要求44-52中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述施萬細(xì)胞的至少一些沿著所述無細(xì)胞通道的表面安置。
54.如權(quán)利要求44-53中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述多個活細(xì)胞包括具有抗炎性質(zhì)的細(xì)胞。
55.如權(quán)利要求44-54中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述多個活細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞。
56.如權(quán)利要求44-55中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道具有彼此并排的取向并且通過所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)中的所述活細(xì)胞的一些彼此隔開。
57.如權(quán)利要求44-56中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中存在至少三個在所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。
58.如權(quán)利要求44-57中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其進(jìn)一步包含在所述無細(xì)胞通道的至少一個中的瓊脂糖填充體。
59.如權(quán)利要求44-58中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞并且所述施萬細(xì)胞的至少一些接觸所述瓊脂糖填充體。
60.一種軸突導(dǎo)向移植物，所述移植物在被移植到具有神經(jīng)系統(tǒng)的活有機(jī)體中并且被安放在切斷神經(jīng)的末端之間的間隙中時(shí)通過促進(jìn)再生軸突生長穿過所述移植物來恢復(fù)神經(jīng)功能，所述軸突導(dǎo)向移植物包含 由多個活細(xì)胞組成的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，所述活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)是工程化組織，不是自體移植物，是不受神經(jīng)支配的，或包含組織培養(yǎng)基。所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)是工程化組織，不是自體移植物，是不受神經(jīng)支配的，或包含組織培養(yǎng)基。
61.如權(quán)利要求60所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)不是自體移植物。
62.如權(quán)利要求60或61所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述多個活細(xì)胞進(jìn)一步包括具有至少一種抗炎性質(zhì)的細(xì)胞。
63.如權(quán)利要求62所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述具有至少一種抗炎性質(zhì)的細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞。
64.如權(quán)利要求61-63中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述多個活細(xì)胞進(jìn)一步包括選自由間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬細(xì)胞及其組合組成的組的細(xì)胞。
65.如權(quán)利要求61-64中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)是不受神經(jīng)支配的。
66.如權(quán)利要求61-65中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)是工程化組織。
67.如權(quán)利要求60-66中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)包含組織培養(yǎng)基。
68.如權(quán)利要求61-67中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述三維結(jié)構(gòu)包括外側(cè)部分和中央部分，所述中央部分在所述外側(cè)部分的相反末端之間軸向延伸，以使得所述外側(cè)部分圍繞所述中央部分，所述中央部分的活細(xì)胞群包含的施萬細(xì)胞的百分比高于所述外圍部分的活細(xì)胞群中的施萬細(xì)胞的百分比。
69.如權(quán)利要求61-67中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其進(jìn)一步包含至少一個在所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。
70.如權(quán)利要求61-69中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述三維結(jié)構(gòu)包括多個在所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的離散的無細(xì)胞通道。
71.如權(quán)利要求69或70所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的或以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
72.如權(quán)利要求69或70所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充或全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
73.如權(quán)利要求69或70所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充、全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充或其任意組合。
74.如權(quán)利要求70-73中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述施萬細(xì)胞的至少一些沿著所述無細(xì)胞通道的表面安置。
75.如權(quán)利要求69-74中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道具有彼此并排的取向并且通過所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)中的所述活細(xì)胞的一些彼此隔開。
76.如權(quán)利要求70-75中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中存在至少三個在所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。
77.如權(quán)利要求70-76中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其進(jìn)一步包含在所述無細(xì)胞通道的至少一個中的瓊脂糖填充體。
78.如權(quán)利要求77所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述施萬細(xì)胞的至少一些接觸所述瓊脂糖填充體。
79.—種軸突導(dǎo)向移植物，所述移植物在被移植到具有神經(jīng)系統(tǒng)的活有機(jī)體中并且被安放在切斷神經(jīng)的末端之間的間隙中時(shí)通過促進(jìn)再生軸突生長穿過所述移植物來恢復(fù)神經(jīng)功能，所述移植物包含 包含多個活細(xì)胞的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，所述三維結(jié)構(gòu)包括外圍部分和中央部分，所述中央部分在所述外側(cè)部分的相反末端之間軸向延伸，以使得所述外側(cè)部分圍繞所述中央部分，所述中央部分的活細(xì)胞群包含的施萬細(xì)胞的百分比高于所述外側(cè)部分的活細(xì)胞群中的施萬細(xì)胞的百分比，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)是工程化組織，不是自體移植物，是不受神經(jīng)支配的，或包含組織培養(yǎng)基。
80.如權(quán)利要求79所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)不是自體移植物。
81.如權(quán)利要求79或80所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)進(jìn)一步包含至少一個在所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。
82.如權(quán)利要求81所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述三維結(jié)構(gòu)包括多個在所述相反末端之間延伸的離散的無細(xì)胞通道。
83.如權(quán)利要求82所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道圍繞所述中央部分。
84.如權(quán)利要求81-83中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述外側(cè)部分圍繞所述無細(xì)胞通道。
85.如權(quán)利要求81-84中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道具有彼此并排的取向并且通過所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)中的所述活細(xì)胞的一些彼此隔開。
86.如權(quán)利要求81-85中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中存在至少三個在所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。
87.如權(quán)利要求81-86中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其進(jìn)一步包含在所述無細(xì)胞通道的至少一個中的瓊脂糖填充體。
88.如權(quán)利要求81-87中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述施萬細(xì)胞的至少一些接觸所述瓊脂糖填充體。
89.如權(quán)利要求81-88中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中至少一些所述施萬細(xì)胞沿著所述無細(xì)胞通道的表面安置。
90.如權(quán)利要求79-89中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述活細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞。
91.如權(quán)利要求79-90中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述多個活細(xì)胞進(jìn)一步包括選自由間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬細(xì)胞及其組合組成的組的細(xì)胞。
92.如權(quán)利要求79-91中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)是不受神經(jīng)支配的。
93.如權(quán)利要求79-91中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)是工程化組織。
94.如權(quán)利要求79-93中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)包含組織培養(yǎng)基。
95.如權(quán)利要求81-94中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的或以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
96.如權(quán)利要求81-94中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充或全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
97.如權(quán)利要求81-94中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充、全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充或其任意組合。
98.一種軸突導(dǎo)向移植物，所述移植物在被移植到具有神經(jīng)系統(tǒng)的活有機(jī)體中并且被安放在切斷神經(jīng)的末端之間的間隙中時(shí)通過促進(jìn)再生軸突生長穿過所述移植物來恢復(fù)神經(jīng)功能，所述移植物包含 包含多個活細(xì)胞的細(xì)長三維結(jié)構(gòu)，所述多個活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞； 至少一個在所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道；以及 在所述無細(xì)胞通道中的至少一個填充體，所述至少一個填充體包含瓊脂糖，其中所述施萬細(xì)胞的至少一些沿著所述無細(xì)胞通道與所述填充體相鄰安置。
99.如權(quán)利要求98所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述三維結(jié)構(gòu)包括多個在所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的離散的無細(xì)胞通道。
100.如權(quán)利要求98或99所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述多個活細(xì)胞進(jìn)一步包括選自由間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬細(xì)胞及其組合組成的組的細(xì)胞。
101.如權(quán)利要求98-100中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述多個活細(xì)胞包括具有抗炎性質(zhì)的細(xì)胞。
102.如權(quán)利要求98-101中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述多個活細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞。
103.如權(quán)利要求99-102中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道具有彼此并排的取向并且通過所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)中的所述活細(xì)胞的一些彼此隔開。
104.如權(quán)利要求99-103中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中存在至少三個在所述細(xì)長三維結(jié)構(gòu)的相反末端之間延伸的無細(xì)胞通道。
105.如權(quán)利要求98-104中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述施萬細(xì)胞的至少一些接觸填充體。
106.如權(quán)利要求98-105中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的或以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
107.如權(quán)利要求98-105中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充或全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充。
108.如權(quán)利要求98-105中任一項(xiàng)所述的軸突導(dǎo)向移植物，其中所述無細(xì)胞通道是中空的、部分以一種或多種無細(xì)胞材料填充、全部以一種或多種無細(xì)胞材料填充或其任意組口 ο
109.—種多細(xì)胞體，其包含多個活細(xì)胞，其中所述細(xì)胞彼此粘附并且所述多個活細(xì)胞包括第一類型的活細(xì)胞和第二類型的活細(xì)胞，其中所述第一類型的活細(xì)胞是施萬細(xì)胞并且所述施萬細(xì)胞占所述多個活細(xì)胞的約O. 1%至約20%。
110.如權(quán)利要求109所述的多細(xì)胞體，其中所述施萬細(xì)胞占所述多個活細(xì)胞的約1%至約 15%。
111.如權(quán)利要求110所述的多細(xì)胞體，其中所述施萬細(xì)胞占所述多個活細(xì)胞的約1%至約 10% O
112.如權(quán)利要求111所述的多細(xì)胞體，其中所述施萬細(xì)胞占所述多個活細(xì)胞的約3%至約 10% ο
113.如權(quán)利要求112所述的多細(xì)胞體，其中所述施萬細(xì)胞占所述多個活細(xì)胞的約5%至約 10% ο
114.如權(quán)利要求109-113中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述第二類型的細(xì)胞是骨髓干細(xì)胞。
115.如權(quán)利要求114所述的多細(xì)胞體，其中所述骨髓干細(xì)胞占所述多個活細(xì)胞中的大多數(shù)。
116.如權(quán)利要求109-115中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體的長度為至少約I厘米。
117.如權(quán)利要求109-116中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體的長度為至少約2厘米。
118.如權(quán)利要求109-117中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體的長度為至少約3厘米。
119.如權(quán)利要求109-118中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體的長度小于約7厘米。
120.如權(quán)利要求109-119中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體的長度小于約5厘米。
121.如權(quán)利要求109-120中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體的長度小于約3厘米。
122.如權(quán)利要求109-115中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體的長度范圍為約I厘米至約7厘米。
123.如權(quán)利要求109-115中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體的長度范圍為約2厘米至約6厘米。
124.如權(quán)利要求109-115中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體的長度范圍為約3厘米至約5厘米。
125.如權(quán)利要求109-124中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體是大致圓柱形的并且具有大致圓形的橫截面。
126.如權(quán)利要求109-125中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體進(jìn)一步包含組織培養(yǎng)基。
127.如權(quán)利要求109-126中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體是不受神經(jīng)支配的。
128.如權(quán)利要求109-127中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體是工程化組織。
129.如權(quán)利要求109-128中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體中的所述細(xì)胞的粘附力足夠強(qiáng)，以使得當(dāng)所述多細(xì)胞體由平坦表面支承時(shí)所述多細(xì)胞體可保持三維形狀，所述三維形狀包括寬度和高度，所述高度是所述寬度的至少約一半。
130.如權(quán)利要求109-129中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體中的所述細(xì)胞的粘附力足夠強(qiáng)，以使得當(dāng)所述多細(xì)胞體由平坦表面支承時(shí)所述多細(xì)胞體可保持三維形狀，所述三維形狀被構(gòu)造為(i)在所述多細(xì)胞體的底部包括接觸表面，在此處所述多細(xì)胞體與所述表面接觸；以及(ii)使得所述多細(xì)胞體的三維形狀在所述平面上的二維投影的面積比所述接觸表面的面積大。
131.如權(quán)利要求109-130中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體中的細(xì)胞的粘附力足夠強(qiáng)，以使得當(dāng)與所述多細(xì)胞體基本上相同的另一個多細(xì)胞體在所述多細(xì)胞體的頂部時(shí)所述多細(xì)胞體可支承所述另一個多細(xì)胞體的重量。
132.如權(quán)利要求109-111中任一項(xiàng)所述的多細(xì)胞體，其中所述多細(xì)胞體中的細(xì)胞的粘附力足夠強(qiáng)，以使得所述多細(xì)胞體可用器械來撿起。
133.—種包含多個活細(xì)胞的多細(xì)胞體，其中所述細(xì)胞彼此粘附并且所述多個活細(xì)胞包括第一類型的活細(xì)胞和第二類型的活細(xì)胞，其中所述第一類型的活細(xì)胞是骨髓干細(xì)胞并且所述骨髓干細(xì)胞占所述多個活細(xì)胞的約80%。
134.一種三維結(jié)構(gòu)，其包含 多個細(xì)長的多細(xì)胞體，每個多細(xì)胞體包含多個彼此粘附的活細(xì)胞，所述多細(xì)胞體具有相反的軸向末端； 其中所述多細(xì)胞體以使得所述多細(xì)胞體具有彼此并排的取向并且一個所述多細(xì)胞體的至少一個末端相對于相鄰的一個所述多細(xì)胞體的對應(yīng)末端軸向偏置的三維方式來布置。
135.如權(quán)利要求134所述的三維結(jié)構(gòu)，其進(jìn)一步包含一個或多個填充體，每個填充體包含抵抗細(xì)胞從所述多細(xì)胞體遷移和向內(nèi)生長至所述填充體中的生物相容性材料，其中所述填充體與所述多細(xì)胞體一起以所述三維方式布置。
136.如權(quán)利要求135所述的三維結(jié)構(gòu)，其中所述填充體包含細(xì)長填充體，所述細(xì)長填充體以與所述一個多細(xì)胞體的偏置末端首尾相連銜接的方式安放。
137.如權(quán)利要求135所述的三維結(jié)構(gòu)，其中所述多細(xì)胞體包含第一組多細(xì)胞體和第二組多細(xì)胞體，所述第一組多細(xì)胞體所具有的末端相對于所述第二組多細(xì)胞體的對應(yīng)末端軸向凹陷，所述填充體包含一組細(xì)長填充體，所述細(xì)長填充體以與所述第一組多細(xì)胞體的凹陷末端首尾相連銜接的方式安放，所述第二組中的多細(xì)胞體具有與所述組中的填充體的所述銜接末端重疊的足夠長度。
138.—種制備具有由施萬細(xì)胞填充的多個軸向通道的多細(xì)胞構(gòu)建體的方法，其包括以下步驟 1)制備多種類型的細(xì)胞粘團(tuán)，所述細(xì)胞粘團(tuán)在所選定的活細(xì)胞當(dāng)中具有不同濃度的施萬細(xì)胞， 2)使每個細(xì)胞粘團(tuán)成形為細(xì)長的形狀， 3)將所述成形的細(xì)胞粘團(tuán)在受控環(huán)境中孵育以使得所述細(xì)胞彼此粘附以便形成細(xì)長的多細(xì)胞桿， 4)制備具有與所述多細(xì)胞桿相似大小的無細(xì)胞填充桿或支承桿， 5)根據(jù)一定的方式來布置多個多細(xì)胞桿和無細(xì)胞桿，所述方式使得每個所述多細(xì)胞桿接觸至少一個其它多細(xì)胞桿，并且使得所述具有較低濃度施萬細(xì)胞的多細(xì)胞桿放置在所述周圍層中，而具有所述較高濃度施萬細(xì)胞的多細(xì)胞桿放置在所述中心，以及 6)使所述多細(xì)胞桿與至少一個其它多細(xì)胞桿融合以便形成所需的構(gòu)建體。
139.—種三維神經(jīng)移植物構(gòu)建體，其包含 (a)多個第一工程化多細(xì)胞體，其中所述多個第一工程化多細(xì)胞體中的每個工程化多細(xì)胞體包含多個第一活細(xì)胞； (b)多個第二工程化多細(xì)胞體，其中所述多個第二工程化多細(xì)胞體中的每個工程化多細(xì)胞體包含多個第二活細(xì)胞； (c)多個離散填充體，其中所述多個離散填充體中的每個離散填充體包含抵抗所述多個第一活細(xì)胞或第二活細(xì)胞遷移或向內(nèi)生長的生物相容性材料；并且 其中所述多個離散填充體形成多個在所述三維結(jié)構(gòu)的第一末端和第二末端之間縱向延伸的無細(xì)胞通道。
140.如權(quán)利要求139所述的三維神經(jīng)移植物構(gòu)建體，其中所述多個第一活細(xì)胞和所述多個第二活細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬細(xì)胞或其任意組合。
141.如權(quán)利要求139所述的三維神經(jīng)移植物構(gòu)建體，其中所述多個第一活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞。
142.如權(quán)利要求139所述的三維神經(jīng)移植物構(gòu)建體，其中所述多個第二活細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞。
143.如權(quán)利要求141所述的三維神經(jīng)移植物構(gòu)建體，其中所述多個第一工程化多細(xì)胞體集聚在所述多個無細(xì)胞通道的周圍。
144.如權(quán)利要求142所述的三維神經(jīng)移植物構(gòu)建體，其中所述多個第二工程化多細(xì)胞體集聚在所述移植物的外圍。
145.如權(quán)利要求139所述的三維神經(jīng)移植物構(gòu)建體，其中所述填充體包含瓊脂糖。
146.一種槽形生物結(jié)構(gòu)，其包含 (a)多個第一活細(xì)胞； (b)多個第二活細(xì)胞；以及 (c)多個無細(xì)胞通道； 其中所述多個無細(xì)胞通道在所述三維結(jié)構(gòu)的第一末端與第二末端之間縱向延伸。
147.如權(quán)利要求146所述的槽形生物結(jié)構(gòu)，其中所述無細(xì)胞通道是中空的。
148.如權(quán)利要求146所述的槽形生物結(jié)構(gòu)，其中所述無細(xì)胞通道以填充體填充或部分填充。
149.如權(quán)利要求146所述的槽形生物結(jié)構(gòu)，其中所述多個第一活細(xì)胞和所述多個第二活細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬細(xì)胞，或其任意組合。
150.如權(quán)利要求146所述的槽形生物結(jié)構(gòu)，其中所述多個第一活細(xì)胞包括施萬細(xì)胞。
151.如權(quán)利要求146所述的槽形生物結(jié)構(gòu)，其中所述多個第二活細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞。
152.如權(quán)利要求150所述的槽形生物結(jié)構(gòu)，其中所述多個第一活細(xì)胞集聚在所述多個無細(xì)胞通道的周圍。
153.如權(quán)利要求151所述的槽形生物結(jié)構(gòu)，其中所述多個第二活細(xì)胞集聚在所述移植物的外圍。
154.如權(quán)利要求146-153中任一項(xiàng)所述的槽形生物結(jié)構(gòu)用于重新接合受損軸突的近端和遠(yuǎn)端殘余部分的用途。
155.如權(quán)利要求146-153中任一項(xiàng)所述的槽形生物結(jié)構(gòu)用于制備重新接合受損軸突的近端和遠(yuǎn)端殘余部分的神經(jīng)移植物的用途。
全文摘要
一種工程化三維結(jié)構(gòu)包括彼此粘附的活細(xì)胞。所述活細(xì)胞適當(dāng)?shù)匕ㄊ┤f細(xì)胞和至少一種其它類型的細(xì)胞。伴隨施萬細(xì)胞的細(xì)胞可以適當(dāng)?shù)貫楣撬韪杉?xì)胞或具有一種或多種抗炎性質(zhì)的另一種類型的細(xì)胞。所述結(jié)構(gòu)適當(dāng)?shù)貫橐浦参?，該移植物在被移植到活有機(jī)體的切斷神經(jīng)的近端殘根與遠(yuǎn)端殘根之間時(shí)促進(jìn)恢復(fù)性軸突生長。所述移植物可任選地包括多個在所述移植物的相反軸向末端之間延伸的無細(xì)胞導(dǎo)管。生物打印(Bio-printing)技術(shù)可以用于通過堆疊多個多細(xì)胞體來組裝三維構(gòu)建體，所述三維構(gòu)建體通過成熟而變?yōu)檩S突導(dǎo)向移植物，每個多細(xì)胞體包括多個活細(xì)胞，這些活細(xì)胞彼此充分粘附以便在堆疊所述多細(xì)胞體來形成所述結(jié)構(gòu)時(shí)避免發(fā)生塌陷。
文檔編號C12N5/071GK102869391SQ201180017227
公開日2013年1月9日 申請日期2011年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者G·弗爾加克斯, S·H·科爾伯特, B·A·哈伯德, F·馬爾加, D·克里斯蒂安森 申請人:密蘇里大學(xué)管理者