專利名稱：檢測(cè)和/或定量沙門氏菌屬物種的肽核酸探針，試劑盒和方法和其應(yīng)用的制作方法
檢測(cè)和/或定量沙門氏菌屬物種的肽核酸探針，試劑盒和方法和其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)與臨床和食品安全性關(guān)聯(lián)的微生物的方法。為此目的，開發(fā)了檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)的PNA探針。除了探針之外，本發(fā)明包括ONA FISH方法和其應(yīng)用于檢測(cè)和/或定量沙門氏菌屬(Salmonella spp.)物種的試劑盒,其可用于食品和臨床領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
沙門氏菌屬(Salmonella)包括可導(dǎo)致跨簡單胃腸炎到系統(tǒng)性感染的疾病的幾種病原性細(xì)菌。疾病嚴(yán)重性通常由沙門氏菌屬(Salmonella)物種/株的毒力，宿主(人或其他動(dòng)物物種)和宿主健康狀態(tài)測(cè)定。 屬的種系發(fā)生分析顯示了其分為2個(gè)物種乍得沙門氏菌(Salmonella bongori)和腸沙門氏菌(Salmonella enterica)。雖然如此，至今已鑒定多于2500種血清型，大多數(shù)能感染人和廣范圍的動(dòng)物物種。沙門氏菌屬(Salmonella)株被常規(guī)鑒定，及根據(jù)Kauffmann-White血清分型方案分類,其基于外膜中存在的抗原類型。此細(xì)菌可經(jīng)糞便-口腔途徑或當(dāng)發(fā)生土壤，水和食品的糞便污染時(shí)通過與外部貯器直接接觸而直接在人之間傳播。因此開發(fā)穩(wěn)健的檢測(cè)方法致使鑒定全部這些樣品類型的細(xì)菌變得重要。例如，“Food and drug Administration”旨在通過在家禽飼養(yǎng)場(chǎng)實(shí)施對(duì)于污染的卵殼的測(cè)試程序來控制腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)的傳播，由于卵殼已鑒定為在微生物傳播中重要。沙門氏菌屬(Salmonella)的檢測(cè)傳統(tǒng)上使用培養(yǎng)方法進(jìn)行。但是，這些方法是艱辛而且耗時(shí)(4 6天)和艱辛的過程。像這樣，需要可輔助控制細(xì)菌以便減少人和動(dòng)物中的沙門氏菌病的更快的和更可靠的新方法的開發(fā)。為此目的，已開發(fā)許多分子檢測(cè)方法，以減少鑒定食品，糞便，水和臨床樣品中的沙門氏菌屬(Salmone 11 a )需要的時(shí)間。這些方法包括免疫酶測(cè)定(ELISA)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，及FISH。但是，一些研究顯示，基于PCR及ELISA的方法無法檢測(cè)一些通過培養(yǎng)方法為陽性的樣品。即便如此，基于PCR的方法被證明為相比ELISA方法更精確。另一方面，當(dāng)在PCR之前進(jìn)行選擇性富集步驟，不僅檢測(cè)全部培養(yǎng)-陽性樣品，而且通過PCR可檢測(cè)未通過培養(yǎng)方法檢測(cè)到的沙門氏菌屬(Salmonella)的存在。這些研究揭示，富集步驟可通過消除問題諸如在特定類型的樣品，諸如食品和糞便樣品中低數(shù)的細(xì)菌和抑制性物質(zhì)的存在而增加分子檢定靈敏度。但是，基于PCR的方法通常需要DNA提取步驟，而且以上方法均不，除了 FISH之外，允許樣品之中細(xì)菌的直接可視化。此可為重要,例如,通過允許直接評(píng)估樣品中卵殼的沙門氏菌屬(Salmone 11 a )污染。FISH是廣泛應(yīng)用于樣品之內(nèi)細(xì)菌鑒定和定位的分子測(cè)定。此方法基于小寡核苷酸(探針)與特定rRNA區(qū)的特異性結(jié)合。探針偶聯(lián)于熒光色素，且在雜交之后，熒光信號(hào)由于細(xì)胞之內(nèi)的高rRNA拷貝數(shù)而可檢測(cè)。已有一些研究報(bào)道使用DNA探針的沙門氏菌屬(Salmonella)檢測(cè)(Kutter 等人,2006;Nordentoft 等人,1997)。
近來，已開發(fā)用于微生物檢測(cè)的肽核酸探針(PNA)。這些分子模擬DNA及能遵從Watson-Crick規(guī)則與互補(bǔ)核酸特異性雜交。但是,建立的鍵更強(qiáng)，由于，在PNA分子中，其帶負(fù)電的糖-磷酸酯主鏈結(jié)構(gòu)被單元中中性重復(fù)的(2-氨基乙基)甘氨酸取代。FISH技術(shù)中此分子的充足的使用致使過程更穩(wěn)健，更快和更有效。對(duì)于沙門氏菌屬(Salmonella),已之前開發(fā)PNA FISH方法(Perry-O，Keefe等人，2001)。但是，使用的探針具有與其他物種，諸如伴放線放線桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans),姆蟲巴克納氏菌(Buchnera aphidicola),流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)和耶爾森菌屬(Yersinia spp.)物種互補(bǔ)的序列，使其成為對(duì)于診斷欠有吸引力。由此認(rèn)為，設(shè)計(jì)及測(cè)試新探針及開發(fā)用于此特定微生物的新方法是重要的。
重要的是注意到，盡管優(yōu)化之后非常穩(wěn)健，PNA FISH方法的開發(fā)就如PCR方法的開發(fā)，極其需求及需要涉及的不同參數(shù)的化學(xué)和物理特征的大量知識(shí)。此外，熟知的是，使PNA FISH方法對(duì)生物工作，不保證靶向相同的生物的其他序列會(huì)發(fā)揮功能。而且，盡管研究者通常感覺對(duì)出版陰性結(jié)果天然缺乏興趣，幾個(gè)研究可見于文獻(xiàn)，其中作者僅能致力于對(duì)用于相同的微生物的一些探針工作。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及肽核酸(PNA)探針和其用于檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)(即，鑒定或定量)的方法。本發(fā)明中描述的探針識(shí)別微生物23S rRNA或?qū)?yīng)于提及的rRNA的基因組序列。PNA探針具有其結(jié)構(gòu)固有的生理化學(xué)特征，且當(dāng)將它們應(yīng)用于基于FISH的方法時(shí)，允許相比使用DNA更快的，更穩(wěn)健的和更特異性分析。此方法的優(yōu)勢(shì)之一是探針在廣泛的生物學(xué)樣品中穩(wěn)健地工作，其通常不與其他檢測(cè)分子方法發(fā)生。另一關(guān)聯(lián)方面是檢測(cè)需要的時(shí)間。本發(fā)明開發(fā)的方法匹配余下分子方法報(bào)道的最佳時(shí)間，甚至當(dāng)樣品類型在分析之前需要富集步驟時(shí)。對(duì)于臨床或食品安全角度，方法的快速及可靠性可決定污染和/或感染的適當(dāng)?shù)募凹皶r(shí)處理。本發(fā)明的另一方面涉及基于此探針向熒光原位雜交(FISH)的應(yīng)用的試劑盒的開發(fā)，允許在廣普生物學(xué)樣品中，以迅速和簡單方式檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，此處描述的PNA探針允許檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)的rRNA, rDNA或rRNA的互補(bǔ)序列中的祀序列。本發(fā)明的實(shí)施方式之一是描述用于檢測(cè)和/或定量沙門氏菌屬(Salmonella)的PNA探針，其特征在于，其與序列SEQ ID N0:l — 5’-AGG AGC TTC GCT TGC-3’具有至少86%的相似性，優(yōu)選與序列 SEQ ID NO: I —5，-AGG AGC TTC GCT TGC-3’ 具有 87%，88%，89%，90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 的相似性。在本發(fā)明的更可優(yōu)選的實(shí)施方式中，將之前描述的序列連接到至少一種類型的可檢測(cè)的級(jí)分。使用的可檢測(cè)的級(jí)分的類型可尤其選自以下基團(tuán)之一綴合物，分支的檢測(cè)系統(tǒng)，生色團(tuán)，熒光團(tuán)，放射性同位素，酶，半抗原或發(fā)光化合物。在甚至更可優(yōu)選的實(shí)施方式中，熒光團(tuán)可尤其為以下中的至少一種Alexa系列熒光團(tuán)，花青苷，5-(及-6)羧基-2’，7’_ 二氯熒光素，5-R0X (5-羧基-X-若丹明，三乙基銨鹽)。仍是本發(fā)明的主題的是用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中沙門氏菌屬(Salmonella)的存在或缺失和/或定量的試劑盒。在本發(fā)明的更可優(yōu)選的實(shí)施方式中，試劑盒可額外地存在以下溶液中的至少一種固定溶液，雜交溶液及洗滌溶液。在本發(fā)明的再一優(yōu)選的實(shí)施方式中，固定溶液可包含多聚甲醛和乙醇，即2 8%(重量/Vol)的多聚甲醛和25 90% (vol/vol)的乙醇，和/或雜交溶液可包含甲酰胺。仍是本發(fā)明的對(duì)象的是描述用于檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)或用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的沙門氏菌屬(Salmonella)的方法，其使用早先提及的PNA探針及其包括以下步 驟· PNA探針與生物學(xué)樣品接觸；· PNA探針與存在于生物學(xué)樣品之中的微生物的靶序列雜交； 作為指示生物學(xué)樣品中提及的檢測(cè)和定量的雜交檢測(cè)，雜交可優(yōu)選通過熒光進(jìn)行。生物學(xué)樣品可尤其從血，空氣，食品，水，活組織檢查或糞便獲取。仍是本發(fā)明的對(duì)象的是早先描述的PNA探針，早先描述的試劑盒和方法應(yīng)用于檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella),或檢測(cè)生物學(xué)樣品中的沙門氏菌屬(Salmonella)的方法的用途。發(fā)明概述本發(fā)明包含旨在用于檢測(cè)或定量沙門氏菌屬(Salmonella)株的PNA探針，試劑，方法和試劑盒。此處描述的PNA探針允許通過鍵合rRNA,對(duì)應(yīng)于rRNA (r)的基因組序列，或它們的互補(bǔ)序列來特異性檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)。PNA探針(關(guān)于DNA探針)的更高特異性允許相關(guān)的核苷酸序列之間的更佳區(qū)別。此與此探針具有特定關(guān)聯(lián)，由于有一些與沙門氏囷屬(Salmonella)系統(tǒng)發(fā)生地相關(guān)的微生物，其在選擇的靶區(qū)之內(nèi)存在僅一個(gè)錯(cuò)配(本發(fā)明描述的探針的第14位的核苷酸)。此情況的一些例是志賀菌屬(Shigella)物種，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)物種和大腸埃希氏菌(Escherichia coli) K12 株。本發(fā)明中描述的PNA探針具有15個(gè)核苷酸，具有以下核苷酸序列SEQ ID NO: I — 5，-AGG AGC TTC GCT TGC-3，。但是，待用于檢測(cè)的探針可與上述序列存在至少86%的同一性。將此探針應(yīng)用于通過熒光原位雜交(FISH)分析，其在沙門氏菌屬(Salmonella)-陽性樣品的情況中，導(dǎo)致通過熒光顯微鏡檢或通過流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)的熒光信號(hào)的發(fā)射。依經(jīng)驗(yàn)使用特定軟件進(jìn)行新PNA-FISH探針的開發(fā)。起初通過靶向微生物的rDNA序列與相關(guān)的微生物的序列的比對(duì)進(jìn)行探針序列的選擇。此允許潛在地有用的區(qū)的鑒定，然后基于其他參數(shù)諸如特異性，雜交溫度，鳥嘌呤/胞嘧啶的百分率，鍵合自由能和二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)其評(píng)價(jià)。
探針設(shè)計(jì)及合成之后，不得不開發(fā)FISH過程，固定/滲透化，雜交和洗滌的3個(gè)步驟，及就選擇的探針進(jìn)行優(yōu)化。此過程通常涉及以下參數(shù)溫度，甲酰胺和乙醇濃度，及雜交及洗滌時(shí)間。重要的是注意到，由于處理復(fù)雜性和大量的變量，不是總是可能開發(fā)對(duì)于各序列的方法，由此，常常測(cè)試幾種替代品和序列。良好-成功的雜交然后允許通過熒光顯微鏡檢，流式細(xì)胞術(shù)或?qū)崟r(shí)PCR推知微生物的存在/缺失和甚至濃度。檢測(cè)的熒光信號(hào)通常是小探針與存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的幾十個(gè)或幾百個(gè)rRNA拷貝特異性結(jié)合的結(jié)果。報(bào)道由探針和靶形成的穩(wěn)定的復(fù)合物的存在的探針的該可檢測(cè)的級(jí)分選自以下基團(tuán)之一綴合物，分支的檢測(cè)系統(tǒng)，生色團(tuán)，熒光團(tuán)，放射性同位素，酶，半抗原或發(fā)光化合物。本發(fā)明中描述的方法包括樣品和與之前描述的具有類似序列的至少一種PNA探針的接觸。因而，與用于檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)的基于表型特征和需要幾天來產(chǎn)生結(jié)果的常規(guī)方法相反，分析基于具有確定的結(jié)果的單測(cè)試。仍是本發(fā)明的對(duì)象的是適合用于進(jìn)行測(cè)試以檢測(cè)，S卩，發(fā)現(xiàn)，鑒定或測(cè)量存在沙門 氏菌屬(Salmonella)的生物學(xué)樣品的試劑盒。試劑盒包含PNA探針和進(jìn)行原位雜交測(cè)試需要的其他選擇的試劑或化合物。在更可優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)中，適合用于進(jìn)行用于檢測(cè)，鑒定或定量沙門氏菌屬(Salmonella)的測(cè)定的試劑盒包含額外地固定，雜交和洗滌溶液。優(yōu)選地，方法旨在為用于治療性決定和質(zhì)量控制的診斷佐劑。由此，此用于沙門氏菌屬(Salmonella)鑒定的方法的實(shí)施會(huì)允許對(duì)細(xì)菌的充足的臨床處理和污染來源的早期鑒定。PNA探針可直接應(yīng)用于在載玻片上制備的樣品，由于這些探針的應(yīng)用不涉及在雜交之前用于細(xì)胞膜滲透化的試劑或酶的使用。但是，需要雜交中常使用的一些化合物。因此，探針正常包括進(jìn)更用戶-友好的試劑盒中。如果需要方法涉及通過流式細(xì)胞術(shù)的PNA FISH分析，可使用相同的雜交化合物將探針應(yīng)用于懸浮液中的樣品。定義(a)如本文所用，術(shù)語〃核苷酸〃包括使用與核酸相關(guān)的技術(shù)的人員通常知道的天然的和人工分子，由此產(chǎn)生特異性結(jié)合核酸的聚合物；(b)當(dāng)使用的術(shù)語〃核苷酸序列〃與含有亞基的聚合物段所指相同，在此情況中是核苷酸；(C)術(shù)語〃靶序列〃指稱旨在在測(cè)試中檢測(cè)的沙門氏菌屬(Salmonella)的核苷酸序列，其中探針的核苷酸的部分被設(shè)計(jì)為雜交；(d)術(shù)語"PNA探針〃指稱具有核苷酸序列且對(duì)于與目標(biāo)微生物的靶序列雜交特異性的PNA的亞基的聚合物。PNA分子是帶負(fù)電的糖-磷酸主鏈結(jié)構(gòu)被由重復(fù)的N-(2-氨基乙基)甘氨酸單元形成的手性和電中性取代的DNA模擬物；(e)當(dāng)使用術(shù)語〃可檢測(cè)的級(jí)分〃時(shí)，其指稱可連接于探針，由此致使探針由儀器或方法可檢測(cè)的分子；(f)術(shù)語〃樣品〃指稱可含有用于檢測(cè)的微生物或靶序列的任何生物學(xué)樣品。樣品可為臨床(例如血，尿，糞便，等)，食品(例如肉，卵，嬰兒配方，乳，等)或環(huán)境(例如水)。

圖I代表用于探針選擇的23S rRNA序列的部分比對(duì)。在比對(duì)之上顯示SalPNA1873探針的互補(bǔ)序列，并也標(biāo)記多態(tài)位置。發(fā)明詳述PNA探針設(shè)計(jì)為了鑒定潛在地有用的寡核苷酸以用作探針，選擇在National Centre forBiotechnology Information (NCBI)網(wǎng)站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)可利用的17種23S rRNA基因序列。此選擇含有10種沙門氏菌屬(SalmonelIa)序列，包括各7個(gè)亞種的代表性的株，及來自屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的相關(guān)的物種的7種其他株(圖I)。使用在歐洲生物信息學(xué)學(xué)會(huì)(EBI)可利用的ClustalW軟件比對(duì)序列，并選擇 目標(biāo)區(qū)。鑒定6個(gè)潛在地有用的區(qū)，然后在NCBI (BLAST軟件)及在SILVA rRNA數(shù)據(jù)庫計(jì)劃(軟件Probe Check)測(cè)試，以便發(fā)現(xiàn)具有檢測(cè)的最高數(shù)的沙門氏菌屬(Salmonella)序列及檢測(cè)的最低數(shù)的非-沙門氏菌屬(Salmonella)序列的探針。也使用其他標(biāo)準(zhǔn)用于探針選擇，諸如高鳥嘌呤/胞嘧啶百分率；二級(jí)結(jié)構(gòu)和雜交溫度的類型。在NCBI數(shù)據(jù)庫中僅I個(gè)18bp的區(qū)呈現(xiàn)能檢測(cè)全部沙門氏菌屬(Salmonella)株。對(duì)于此區(qū)，設(shè)計(jì)4種可能的探針。選擇這些之一，由于其未與任何非-沙門氏菌屬(Salmonella)序列雜交，且其含有60%的GC喊基。根據(jù)提及的選擇標(biāo)準(zhǔn)，選擇的序列是5’ -AGGAGCTTCGCTTGC-3’。此序列在腸沙門氏菌腸亞種傷寒血清型變種(S. entericasubsp. enterica serovar Typhimurium) LT2 (ATCC43971)株，登錄號(hào) No. U77920 的第1873和1887位的23S rRNA之間雜交。探針根據(jù)在株LT2中靶序列的初始位置命名為SalPNA1873。隨后，合成選擇的序列，并將寡核苷酸，在N末端，附接到熒光色素AlexaFluor5940 [PNA探針性能的理論評(píng)估在探針設(shè)計(jì)之后，通過測(cè)定靈敏度和特異性的理論值來評(píng)價(jià)其性能。這些參數(shù)用以上提及的在rRNA SILVA數(shù)據(jù)庫可利用的軟件ProbeCheck評(píng)價(jià)。對(duì)于此理論估計(jì),考慮了數(shù)據(jù)庫中全部101種沙門氏菌屬(Salmonella)序列(僅包括具有至少1，900bp的良好-質(zhì)量序列)。將探針與存在于對(duì)于大RNA亞基(LSU，23S/28S)的數(shù)據(jù)庫的總11，124個(gè)序列比對(duì)。也針對(duì)對(duì)于小亞基(SSU，16S/18S)的數(shù)據(jù)庫測(cè)試，以評(píng)定與16S rRNA序列可能的交叉雜交的存在。特異性計(jì)算為nS/(TnS) X 100，其中nS代表未與探針反應(yīng)的非-沙門氏菌屬(Salmonella)株的數(shù)，和TnS是檢查的非-沙門氏菌屬(Salmonella)株的總數(shù)。靈敏度計(jì)算為S/(TS) X 100，其中S代表由探針檢測(cè)的沙門氏菌屬(Salmonella)株的數(shù)，和TS是存在于數(shù)據(jù)庫中的沙門氏菌屬(Salmonella)株的總數(shù)。搜索確認(rèn)，探針SalPNA1873僅檢測(cè)數(shù)據(jù)庫中存在的101種沙門氏菌屬(Salmonella spp.)物種序列。因此，獲得100%的理論特異性和靈敏度(表I)。為了比較此研究中開發(fā)的探針與早先開發(fā)的探針，測(cè)試探針的理論特異性和靈敏度
· Sal23S10 (Perry-0，Keefe 等人，2001) — SEQ ID NO: 6 ；· Salm63 (Kutter 等人，2006) — SEQ ID NO:7 ；· Sal3 (Nordentoft 等人，1997) — SEQ ID NO:8也用ProbeCheck軟件評(píng)定(表I)。這些序列的理論評(píng)定顯示，探針SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8，分別檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)的95，73和96個(gè)序列，數(shù)據(jù)庫中存在的101株，其對(duì)應(yīng)于94%，72%和95%的靈敏度值。關(guān)于檢測(cè)的非-沙門氏菌屬(Salmonella)序列的數(shù)，SEQ IDNO: I和SEQ ID NO:8未檢測(cè)任何序列，不像SEQ ID NO:6和SEQ ID NO: 7。這些值允許估計(jì) 100% (SEQ ID NO: I 和 SEQ ID Ν0:8)，98· 13% (SEQ ID Ν0:6)和 99. 97% (SEQ ID Ν0:7)的特異性。進(jìn)行的理論評(píng)估顯示，探針SalPNA1873改善沙門氏菌屬(Salmonella)的檢測(cè)主 要由于2方面此文獻(xiàn)中描述的探針的PNA分子的優(yōu)勢(shì)和特異性和靈敏度值。對(duì)于探針sal3和Salm63，PNA分子使得FISH過程相比DNA FISH過程更容易和更快，而無既有的PNA探針超過對(duì)于探針SalPNA1873獲得的特異性和靈敏度的理論值。表I :用于檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella spp.)物種的既有探針的理論特異性和
靈敏度
lSaU|Salm63|Sa 丨 23S1 ~|SalPNA1873 I
SEQ ID NO; 8SEQ ID NO: 7 SEO ID NO: 6 SEQ ID NO: I
......................................................................................DNA_DNA_PNA_.......PNA................................ j
Τ7ΓΙIT AATCACTTCACCT TCGACTGACT TAAGtCGGGATG ACGACCTTC牙叫”_ACGTG_TCAGCTCC GC_GCTTGC
氏株菌
屬-_ _ _-I
特異性(％)_100_99,97_98,13_100|
靈敏度(％)95,0572,2394,0610
參考文獻(xiàn)INordewtoff 等人，1997|Kutter等人，2_6|θ’ Kccfc等人,2_1丨此工作j*在數(shù)據(jù)庫中存在的總共101個(gè)沙門氏菌屬(Salmonella)序列中檢測(cè)的沙門氏菌屬(Salmonella)株。#在數(shù)據(jù)庫中保藏的總共11，023個(gè)非-沙門氏菌屬(Salmonella)序列中檢測(cè)的非_沙門氏菌屬(Salmonella)株。本發(fā)明的PNA探針包含優(yōu)選15個(gè)核苷酸，且可與序列SEQ ID N0:1 — 5’_AGG AGCTTC GCT TGC-3’具有至少 86% 同一性，優(yōu)選與 SEQ ID N0:1 —5，_AGG AGC TTC GCT TGC-3’具有 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 的相似性?；蛘?，本發(fā)明也涵蓋探針的核苷酸序列的變異。該變異可包括缺失，插入，其中。例如以下序列之一· SEQ ID NO:2 — 5，-TCA GGA GCT TCG CTT-3，；· SEQ ID NO:3 — 5，-GGA GCT TCG CTT GCG-3，；· SEQ ID NO:4 — 5，-TCA GGA GCT TCG CTT GC-3，；· SEQ ID NO:5 — 5，-AGG AGC TCC GCT TGC-3，。
PNA探針的可檢測(cè)的級(jí)分不限于下列實(shí)施例，PNA探針的可檢測(cè)的級(jí)分可包括各種類型的分子，尤其諸如葡聚糖綴合物，生色團(tuán)，熒光團(tuán)，放射性同位素，酶，半抗原，化學(xué)發(fā)光化合物。作為一例，在可優(yōu)選使用的那些熒光團(tuán)類之中是(但不限于)=Alexa系列熒光團(tuán)，Alexa Fluor系列，花青苷，5-(及_6)羧基-2’，7’- 二氯熒光素，5-R0X (5-羧基-X-若丹明)，三乙基銨鹽。方法本發(fā)明提供測(cè)定沙門氏菌屬(Salmonella)的存在的方法，其使用與此處描述的15個(gè)核苷酸的區(qū)-SEQ ID NO: I具有至少86%的同源性的核苷酸序列。方法可包括使具有本文所述的PNA探針的樣品在適當(dāng)?shù)碾s交條件或適當(dāng)?shù)脑浑s交條件下與細(xì)菌靶序列接觸(如顯示于實(shí)施例I)。 方法可分為樣品制備(其在必需時(shí)包括富集步驟)，固定，雜交，洗滌和結(jié)果的可視化(見實(shí)施例I)。方法可對(duì)粘附的或懸浮的細(xì)胞實(shí)施。雜交條件-優(yōu)化以下步驟是雜交條件的可能的優(yōu)化，無對(duì)本發(fā)明的限制有影響PNA探針和靶序列的雜交的幾種因素。這些包括甲酰胺(或其他變性化學(xué)試劑)的百分率，鹽濃度和因而離子強(qiáng)度，雜交溫度，去污劑濃度，PH和其他。為了測(cè)定最佳雜交條件，個(gè)別修改不同因素和變化各因素直到達(dá)到期望的辨別程度可為必需。更近靶序列來自樣品中的另一非-靶，需要更大嚴(yán)格度程度以限定影響雜交的各種因素。在本發(fā)明中，非-靶序列，諸如志賀菌屬(Shigella)物種，可相比靶序列具有僅I個(gè)不同核苷酸，及像這樣增加的水平的區(qū)別是避免非特異性雜交必需的。對(duì)于此文獻(xiàn)中描述的探針，檢測(cè)了以下條件· 53°C和59°C之間的雜交溫度。對(duì)于在載玻片中的雜交和在懸浮液中的雜交，于57 °C獲得最強(qiáng)熒光信號(hào)。 使用50%和80%之間的乙醇濃度的固定步驟，但在信號(hào)強(qiáng)度中未觀察到差異。 測(cè)試了雜交時(shí)間(30，45，60和90min)，但較短時(shí)間和更長一樣有效。在以上所述的全部參數(shù)的優(yōu)化之后，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致更強(qiáng)熒光信號(hào)的方法如下在專用的載玻片中制備各細(xì)菌培養(yǎng)涂片用于熒光顯微鏡檢觀察。然后涂片是 浸入4% (wt/vol)多聚甲醒(Sigma)IO分鐘，之后是50% (vol/vol)乙醇，也持續(xù)10分鐘； 將樣品風(fēng)干，然后用20μ I的含有下列成分的雜交溶液覆蓋10%(wt/Vol)硫酸葡聚糖(Sigma);IOmM NaCl (Sigma)；30% (vol/vol)甲酰胺(Sigma);0. 1% (wt/vol)焦磷酸鈉(Sigma) ;0· 2% (wt/vol)聚乙烯卩比咯燒酮(Sigma) ;0· 2% (wt/vol) Ficoll (Sigma) ；5mMEDTA 二鈉(Sigma);0. 1% (vol/vol)Triton X-100 (Sigma)；50mM Tris-HCl (pH7. 5; Sigma)和200nM的PNA探針； 將樣品用蓋玻片覆蓋，其放進(jìn)小濕盒，避光及于57°C溫育30分鐘；
然后，將蓋玻片移出，并將載玻片浸入預(yù)加溫的含有下列成分的洗滌溶液(57 °C ) 5mM Tris 喊(Sigma), 15mM NaCl (Sigma)和 1% (vol/vol) Triton X-100(pHIO;Sigma)。 也于57°C進(jìn)行洗滌步驟30分鐘。隨后，從洗滌溶液除去載玻片，及在相同的溫育器中于57°C干燥約5分鐘。 顯微鏡觀察之前，放置一滴非-熒光浸沒油(Merck)，并用蓋玻片覆蓋。在顯微鏡檢之前將載玻片在暗處存儲(chǔ)最多24小時(shí)。雜交也可在懸浮液中進(jìn)行。在一些情況中，此過程輔助幾乎完全消除自體熒光，即紅細(xì)胞的自體熒光，在血樣品的情況中，及嬰兒配方中蛋白的自體熒光。在此情況中，將在無菌水中均質(zhì)化的培養(yǎng)物離心(10，000 X g持續(xù)5分鐘)，并將沉淀在500 μ I 4%多聚甲醛中均質(zhì)化。在I小時(shí)之后，將細(xì)胞再離心一次，以便移出多聚甲醛，并將沉淀在500 μ I的50%(vol/vol)乙醇中均質(zhì)化。于_20°C溫育30min后，將細(xì)胞在100μ I的具有200nM PNA探 針的雜交溶液中再一次均質(zhì)化，并于57°C溫育30min。雜交之后，將細(xì)胞離心及在500 μ I的洗滌溶液中均質(zhì)化(如上所述)，并于57°C溫育30min。最終，將細(xì)胞離心，以移出洗滌溶液，并在500 μ I的無菌水中均質(zhì)化。接下來，將20 μ I的細(xì)胞懸浮液在適合于突光的顯微鏡載玻片上擴(kuò)展，或?qū)?00 μ I通過膜(孔徑0. 2 μ m，硝酸纖維素，Whatman)過濾。為了檢查獲得的信號(hào)與自體熒光不相關(guān)，將全部樣品用顯微鏡中可利用的其他濾器觀察。將樣品也同時(shí)用DAPI染色，以確認(rèn)存在于樣品的全部細(xì)胞用探針SalPNA1873 —SEQ ID NO: 1(本發(fā)明中描述的)標(biāo)記。而且，在各測(cè)定中進(jìn)行陰性對(duì)照，跟隨方法全部步驟，但不將探針添加到雜交溶液。探針實(shí)驗(yàn)特異性和靈敏度的測(cè)試一旦雜交方法被完全優(yōu)化，測(cè)試PNA探針的特異性和靈敏度的實(shí)驗(yàn)值。對(duì)此,將過程應(yīng)用于61種代表性的沙門氏菌屬(Salmonella)株(屬于2種沙門氏菌屬(Salmonella)物種及6種腸沙門氏菌(S. enterica)亞種)及46種其他株。后來的株包括屬于相同的家族的25種分類學(xué)上相關(guān)的株(志賀菌屬(Shigella),克雷伯菌屬(Klebsiella),朽1 樣酸桿菌屬(Citrobacter),泛菌屬(Pantoea),耶爾森菌屬(Yersinia),腸桿菌屬(Enterobacter),埃希氏菌屬(Escherichia)和沙雷氏菌屬(Serratia))和屬于不同目(假單胞菌屬(Pseudomonas)),綱(螺桿菌屬(Helicobacter)和彎曲菌屬(Campylobacter)),或甚至門(利斯特菌屬(Listeria)和葡萄球菌屬(Staphylococcus))的21株。除了未被SalPNA1873 — SEQ ID NO: I檢測(cè)的腸沙門氏菌VI亞種(S. entericasubsp. VI)之外,檢測(cè)全部其余59個(gè)沙門氏菌屬(Salmonella)株,然而對(duì)于使用的其他物種未觀察到雜交。對(duì)于3種志賀菌屬(Shigella)物種不可能評(píng)定PNA-FISH結(jié)果，由于在陽性和陰性(無探針)樣品中檢測(cè)到的這些株的強(qiáng)自體熒光信號(hào)。此結(jié)果無關(guān)于探針和志賀菌屬(Shigella)物種之間的僅I個(gè)核苷酸的差異，因?yàn)楦ナ现举R菌(Shigellaf Iexneri )，其具有類似RNA序列，未與探針雜交。而且，其他物種諸如小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Y. enterocolitica)及大腸埃希氏菌(Escherichia coli)K_12也在相同的位置具有精確地僅I個(gè)錯(cuò)配，且未觀察到交叉-反應(yīng)。此結(jié)果支持來自其他作者的觀察，這些作者說到PNA探針允許區(qū)別具有僅I個(gè)核苷酸錯(cuò)配的序列(Petersen等人，2004)。基于這些結(jié)果，獲得100%的實(shí)驗(yàn)特異性和96. 7%的靈敏度。
富集可尤其從食品，活組織檢查，血，水，糞便得到待分析的樣品。含有沙門氏菌屬(Salmonella)的樣品通常呈現(xiàn)低污染水平。因?yàn)榇?，建議了輔助檢測(cè)過程的富集步驟。此富集步驟可使用幾種類型的培養(yǎng)基進(jìn)行，用于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和/或沙門氏菌屬(Salmonella)的從富含復(fù)合物的培養(yǎng)基到選擇性培養(yǎng)基。溫育溫度可依賴于選擇的培養(yǎng)基，及建議的溫育時(shí)間應(yīng)為8 24小時(shí)。在4種不同類型的樣品水，糞便，嬰兒配方和血中測(cè)試本發(fā)明中描述的PNA探針。將樣品根據(jù)各類型的樣品的分析中通常使用的方法富集。在水和糞便樣品的情況中，如國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)所建議，使用緩沖的胨化的水(BPW)進(jìn)行第I預(yù)富集步驟(16 18小時(shí))。此富集之后，探針允許全部測(cè)試的樣品中的檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)，而結(jié)果與通過對(duì)于這些樣品建議的ISO方法(對(duì)于糞便和水樣品，分別為ISO 6579:2002 (檢測(cè)食品 和動(dòng)物飼料中的沙門氏菌屬(Salmonella))和ISO 6340:1995 (水質(zhì)量-檢測(cè)和枚舉沙門氏菌屬(Salmonella)))獲得的那些一致。在嬰兒配方的情況中，如之前對(duì)于檢測(cè)相同的類型的樣品中的阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii )推薦的,將后者溶于水(1:10)及于37°C溫育8小時(shí)。在血樣品的情況中，在血培養(yǎng)中通常使用的培養(yǎng)基(TSB-胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉湯)中于37°C進(jìn)行富集16 18小時(shí)。富集之后，在載玻片或懸浮液中進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)。雜交之前，樣品應(yīng)在蒸餾的無菌水中1:10稀釋，以便最小化一些組分(例如嬰兒配方或紅細(xì)胞的蛋白)的自體熒光的干擾。使用本發(fā)明中描述的PNA探針，含有沙門氏菌屬(Salmonella)的全部樣品是陽性。這些實(shí)驗(yàn)顯示，使用此PNA探針的檢測(cè)方法通常能在不同類型的樣品中在小于20小時(shí)內(nèi)檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)。而且顯示，可通過進(jìn)行僅8小時(shí)的富集步驟來檢測(cè)含有僅lCFU/ml的樣品。盡管已測(cè)試用于各類型的樣品的建議的富集培養(yǎng)基，標(biāo)準(zhǔn)化富集步驟是可能的。幾個(gè)作者已顯示，可將緩沖的胨化的水(BPW)用作富集含有沙門氏菌屬(Salmonella)的樣品，甚至對(duì)于具有高水平的競(jìng)爭(zhēng)微生物的樣品的通用培養(yǎng)基。將此方法與就上述樣品使用的常規(guī)方法比較，顯示，PNA樣品的實(shí)施可節(jié)省沙門氏菌屬(Salmonella)細(xì)菌的檢測(cè)至少3天。在固體和緊湊樣品的情況中，應(yīng)使這些經(jīng)歷用平刀片沖擊的機(jī)械過程，其解離樣品，將細(xì)菌釋放到緩沖的胨化的水。在活組織檢查的情況中，將樣品切成3 5 μ m片，放置在載玻片上，并無需富集步驟而直接雜交。用于檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)開發(fā)的多數(shù)方法基于PCR技術(shù)或基于選擇性培養(yǎng)基。而前者在技術(shù)上有更多需求，且通常也涉及富集步驟以改善檢測(cè)限；后者是耗時(shí)的且可給出不精確的結(jié)果(12，34，38)。此工作中提供的PNA-FISH流程相比PCR方法技術(shù)上要求較少，且相比培養(yǎng)方法更快和更精確。盡管需要富集步驟，獲得結(jié)果需要的總時(shí)間小于20h(除了 PIF，其耗時(shí)僅12h)，相比對(duì)于基于PCR的方法報(bào)道的那些(9，12，35，39)，值類似或甚至更佳。此處描述的方法，對(duì)于沙門氏菌屬(Salmonella)探針，及甚至對(duì)于PCR和ELISA流程，展示為是目前使用的基于培養(yǎng)的技術(shù)的可靠的替代方法。其顯示，相比常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)，此處描述的PNA探針允許在檢測(cè)中節(jié)省3天，相比之前描述的探針，無論它們是DNA或PNA，呈現(xiàn)更高特異性(見表I )，且未受在一些分子方法，即PCR中發(fā)揮抑制物的作用的物質(zhì)的存在的影響。結(jié)果的可視化此步驟可在具有對(duì)于使用的熒光團(tuán)敏感的濾光片的任何落射熒光顯微鏡中進(jìn)行。存在于顯微鏡的不能檢測(cè)探針的熒光信號(hào)的其他濾光片用于確認(rèn)自體熒光的缺失。試劑盒本發(fā)明也涉及允許測(cè)試來自沙門氏菌屬(Salmonella)的細(xì)菌的存在的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包含與SEQ ID NO: I具有至少86%同一性的PNA探針和選擇用于進(jìn)行測(cè)試的另一試劑或組合物。 本發(fā)明的PNA探針，其特征，方法和試劑盒是適合于在靶生物內(nèi)部存在或不存在的核酸序列的分析。像這樣，本發(fā)明可用于，生物分析或提取自或源于目的生物的核酸的分析，暗示靶序列的來源不是對(duì)本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例例證用于實(shí)施本發(fā)明的不同情況和幾個(gè)步驟，是本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，不旨在限制它們之中的任何實(shí)施例實(shí)施例I:在不同樣品(臨床，食品或環(huán)境樣品)中屬于沙門氏菌屬(Salmonella)的細(xì)菌的檢測(cè)序列SEQ ID NO: I — 5，-AGG AGC TTC GCT TGC-3，(偶聯(lián)于 Alexa Fluor 594)樣品制備在應(yīng)用PNA探針之前，使臨床，食品或環(huán)境樣品之前經(jīng)歷富集步驟。此發(fā)生，因?yàn)橥ǔＩ抽T氏菌屬(Salmonella)呈現(xiàn)低污染水平。此富集步驟可使用對(duì)于用于各樣品的常規(guī)分析方法建議的培養(yǎng)基進(jìn)行。在食品，動(dòng)物飼料，糞便或水的情況中，使用BPW。對(duì)于粉末化的乳或嬰兒配方，使用無菌水來以1/10 (重量/vol)比溶解粉。對(duì)于血樣品，使用復(fù)合TSB培養(yǎng)基，通常用于血培養(yǎng)物。于37°C，以120rpm跨8 (乳粉和嬰兒配方)和16 18小時(shí)(糞便，水，血，等)之間的溫育時(shí)間。對(duì)于不同樣品類型的同時(shí)分析，建議的是，將使用的方法通過于37°C，120rpm在BPW中進(jìn)行富集8小時(shí)來標(biāo)準(zhǔn)化。在陰性結(jié)果的情況中，在8小時(shí)的溫育之后，應(yīng)在過夜富集(16 18小時(shí))之后重復(fù)PNA FISH分析。富集步驟之后，將一滴培養(yǎng)基放入適合用于熒光的載玻片。將載玻片在溫育器爐中于57°C放置約5分鐘，或使風(fēng)干。不需要富集步驟的樣品應(yīng)在固定步驟中起始過程。固定為在雜交過程期間防止23S rRNA的損失，將樣品浸入4%多聚甲醛(wt/vol)和50%乙醇(vol/vol)的溶液各10分鐘。雜交固定之后，然后將樣品用一滴含有下列成分的雜交溶液覆蓋10%(wt/Vol)硫酸葡聚糖(Sigma) ;IOmM NaCl (Sigma) ；30% (vol/vol)甲酸胺(Sigma) ;0· 1% (wt/vol)焦憐酸鈉(Sigma) ;0· 2% (wt/vol)聚乙烯卩比咯燒酮(Sigma) ;0· 2% (wt/vol) Ficoll (Sigma) ；5mMEDTA 二鈉(Sigma);0. 1% (vol/vol)Triton X-100 (Sigma)；50mM Tris-HCl (pH7. 5; Sigma)；及200nM PNA探針。將樣品用蓋玻片覆蓋(為了保證探針的均質(zhì)擴(kuò)展)，放置進(jìn)小濕盒(為了防止雜交溶液的蒸發(fā))，避光及于57°C溫育30分鐘。洗滌雜交時(shí)間之后，將蓋玻片移出，并將載玻片浸入于57°C預(yù)加溫的含有5mM Tris堿，15mM NaCl和1% (vol/vol)Triton X-100 (pHIO)的洗滌溶液。然后將樣品放進(jìn)爐，于雜交溫度持續(xù)30分鐘。隨后，從洗滌溶液除去載玻片，并在相同的溫育器中，于57°C干燥約5分鐘。在顯微鏡可視化之前，放置一滴非-熒光浸沒油(Merck)及用蓋玻片覆蓋。在顯微鏡檢之前，在暗處保持載玻片24小時(shí)的最大時(shí)期。結(jié)果通過在具有能檢測(cè)鍵合到PNA探針的熒光色素Alexa Fluor 594的濾光片的熒光顯微鏡中觀察來獲得結(jié)果。實(shí)施例2:嬰兒配方中沙門氏菌屬(Salmonella)和克羅諾桿菌屬(Cronobacter)細(xì)菌的檢測(cè)此實(shí)施例例證將對(duì)于沙門氏菌屬(Salmonella spp.)物種的探針與之前在Almeida等人,2009中開發(fā)的對(duì)于克羅諾桿菌屬(Cronobacter spp.)物種的探針一起使用的可能性。這2個(gè)屬在最近被鑒定為粉末化的嬰兒配方的最頻繁的污染物，該污染是新生兒嬰兒中菌血癥，腦膜炎及壞死小腸結(jié)腸炎的主要原因。這2種探針呈現(xiàn)非常近似的雜交溫度，且可在多重測(cè)定(同時(shí)利用幾種探針)中容易使用。序列SEQ ID NO: I — 5，-AGG AGC TTC GCT TGC-3，(偶聯(lián)于 Alexa Fluor 594)SEQ ID NO:6 — 5，-TGC AGG ATT CTC TGG-3，(偶聯(lián)于 Alexa Fluor 488)樣品制備將IOg的各嬰兒配方稱重及與90ml的無菌水水合?？墒褂酶吡康膵雰号浞剑３直?/10 (重量/vol)。隨后，將水合的樣品于37°C和120rpm溫育8小時(shí)。富集之后，取樣品及1/10稀釋，以最小化來自嬰兒配方蛋白的自體熒光的干擾。最終將I滴稀釋的樣品放入適合的載玻片，并在溫育器中于57°C風(fēng)干約5分鐘。雜交如之前在實(shí)施例I中所述，僅有I個(gè)輕微差異，進(jìn)行雜交。雜交溶液含有2種探針用于檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)的PNA探針和用于檢測(cè)克羅諾桿菌屬(Cronobacter)的PNA探針，各為200nM的濃度。洗滌根據(jù)實(shí)施例I中描述的過程進(jìn)行洗滌。結(jié)果通過用裝備用于檢測(cè)連接到PNA探針的熒光色素Alexa Fluor594和488的專用的濾光片的熒光顯微鏡觀察樣品來獲得結(jié)果。參考文獻(xiàn)# Almeida，C.，N. F. Azevedoj C. Iversenj S. Fanning, C. W. Keevi I, andM.J. Vieira, 2009. Development and application of a novel peptide nucleic acidprobe for the specific detection of Cronobacter genomospecies(Enterobactersakazakii)in powdered infant formula. Appl Environ Microbiol 75:2925-30.# Perry-Oi Keefe, H.，S. Rigby, K. Oliveira，D. Sorensen, H. Slender, J.Coullj and J. J. Hyldig-Nielsenj 2001. Identification of indicator microorganismsusing a standardized PNA FISH method. Journal of Microbiological Methods47:281-292. -Kutterj S. , A.Hartmann,and M. Schmid. 2006. Colonization ofbarley(Hordeum vulgare)with Salmonella enterica and Listeria spp.FemsMicrobiology Ecology 56:262-271.# Nordentoftj S. , H. Christensen, and H. C. Wegener. 1997. Evaluation of afluorescence-labelled oligonucleotide tide probe targeting 23S rRNA for insitu detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections andtheir rapid identification in bacterial smears. Journal of Clinical Microbiology35:2642-2648. · WO 02/27036 A2-Probes,probe sets, methods and kits pertaining for thedetection, identification and/or enumeration of bacteria。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)和/或定量沙門氏菌屬(Salmonella)的PNA探針，其特征在于，其包含與SEQ ID NO: I — 5，-AGG AGC TTC GCT TGC-3，具有至少86%相似性的至少I個(gè)序列。
2.權(quán)利要求I的PNA探針，其特征在于，其包含以下序列中的至少一種 SEQ ID NO: I — 5’ -AGG AGC TTC GCT TGC-3’ ； SEQ ID NO:2 — 5’ -TCA GGA GCT TCG CTT-3’ ； SEQ ID NO:3 — 5’ -GGA GCT TCG CTT GCG-3’ ； SEQ ID NO:4 — 5’ -TCA GGA GCT TCG CTT GC-3’ ； SEQ ID NO:5 — 5’ -AGG AGC TCC GCT TGC-3’。
3.權(quán)利要求I的PNA探針，其特征在于，其能檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)rRNA，rDNA或rRNA的序列互補(bǔ)中的靶序列。
4.權(quán)利要求I的PNA探針，其特征在于，其額外地包含與SEQID NO: 5 一 5’ -TGC AGGATT CTC TGG-3’具有至少86%相似性的I個(gè)序列。
5.權(quán)利要求I 4之任一項(xiàng)的PNA探針，其特征在于，其被連接于至少一種類型的可檢測(cè)的級(jí)分。
6.權(quán)利要求5的PNA探針，其特征在于，探針的可檢測(cè)的級(jí)分的類型選自下列之一綴合物，分支的檢測(cè)系統(tǒng)，生色團(tuán)，熒光團(tuán)，放射性同位素，酶，半抗原或發(fā)光化合物。
7.權(quán)利要求6的PNA探針，其特征在于，熒光基團(tuán)是下列中的至少一種Alexa系列，Alexa Fluor系列的熒光團(tuán)，花青苷，5_(及_6)羧基_2’，7’- 二氯熒光素，5-R0X (5-羧基-X-若丹明，三乙基銨鹽)。
8.用于檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)的試劑盒,其特征在于,其包含權(quán)利要求I 7之任一項(xiàng)中描述的探針中的至少一種。
9.權(quán)利要求8的試劑盒，其特征在于，其還包含以下溶液中的至少一種一種固定溶液，一種雜交溶液及一種洗滌溶液。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其特征在于，固定溶液包含多聚甲醛和乙醇，即2 8%(wt/voI)的多聚甲醒和25 90% (vol/vol)的乙醇。
11.權(quán)利要求9的試劑盒，其特征在于，雜交溶液包含甲酰胺。
12.用于檢測(cè)沙門氏菌屬(Salmonella)的方法，其特征在于，其使用權(quán)利要求I 7中描述的PNA探針，且其包括以下步驟 (a)PNA探針與生物學(xué)樣品接觸； (b)PNA探針與存在于所述的樣品中的微生物的靶序列雜交； (c)作為指示所述的樣品的所述的檢測(cè)和定量的雜交檢測(cè)。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于，生物學(xué)樣品源于血，空氣，食品，水或活組織檢查。
14.權(quán)利要求12的方法,其特征在于,雜交由突光發(fā)生。
15.權(quán)利要求I 7之任一項(xiàng)中描述的PNA探針的用途，其特征在于，其應(yīng)用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的沙門氏菌屬(Salmonella spp.)物種的方法。
16.權(quán)利要求8 11之任一項(xiàng)中描述的試劑盒的用途，其特征在于，其應(yīng)用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的沙門氏菌屬(Salmonella spp.)物種。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)不同類型的樣品中的沙門氏菌屬(Salmonella)的肽核酸(PNA)探針的開發(fā)。PNA是DNA的合成分子類似物，由于其物理化學(xué)性質(zhì)，允許相比DNA探針，以更高靈敏度更快的分析。將這些探針與熒光原位雜交(FISH)，允許樣品中微生物的直接可視化的分子生物學(xué)技術(shù)組合。這2種技術(shù)的組合致使FISH成為更快的，更簡單的和更有效的方法?？蓪⒋颂结槕?yīng)用于多種樣品諸如血，食品，活組織檢查，糞便，水和其他臨床，環(huán)境或農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)樣品。本發(fā)明也包括用于使用以上所述的樣品類型鑒定沙門氏菌屬(Salmonella spp.)物種的檢測(cè)試劑盒和相應(yīng)過程的開發(fā)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102939390SQ201180017179
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者N·F·里貝羅品托德奧利維拉阿澤維多, M·J·洛佩茲達(dá)克斯塔維埃拉, C·M·費(fèi)爾南德斯阿爾梅達(dá), C·W·齊威爾 申請(qǐng)人:米尼奧大學(xué)