專利名稱：：調(diào)節(jié)cd28表達的方法和組合物的制作方法I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于通過使用寡聚物，特別是對治療免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的疾病有效的寡聚物來調(diào)節(jié)基因表達的領(lǐng)域。II.發(fā)明背景雖然免疫系統(tǒng)在保護高等生物體免受有生命危險的感染中起決定性的作用，但免疫系統(tǒng)在多種疾病的發(fā)病機理中也是一個關(guān)鍵部分。免疫系統(tǒng)起作用的疾病包括免疫系統(tǒng)與自身抗原反應(yīng)的自身免疫疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡，或與由外來抗原反應(yīng)引發(fā)的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)疾病，如在移植排斥中所見的移植物抗宿主疾病。許多常見T-細胞介導(dǎo)疾病的發(fā)病和惡化是由不正常T-細胞激活驅(qū)動的不適當(dāng)免疫反應(yīng)引起的。激活T細胞的存在已在多種T細胞介導(dǎo)的皮膚病中報道(Simon.etal.，(1994)J.InvestDerm.，103539-543)。如折磨2％西方人口包括四百萬美國人的牛皮癬就是一種皮膚失調(diào)，特征為角化細胞過度增殖和激活T細胞的異常真皮和表皮浸潤，許多報告提示這些激活T細胞在牛皮癬(Baadsgaardetal.，(1990)J.InvestDerm.，95275-282，Changetal.，(1992)Arch.Derm，1281479-1485，Schlaaketal.，(1994)J.InvestDerm.，102145-149)和AIDS加重的牛皮癬(Duvic(1990)J.InvestDerm.，9038S-40S)中的主要作用。在牛皮癬中，激活的損傷T細胞主要釋放Thl細胞因子(IL-2，γ干擾素)(Schlaak等，(1994)J.InvestDerm.，102145-149)。這些分泌的細胞因子誘導(dǎo)正常角化細胞表達與牛皮癬損傷所發(fā)現(xiàn)的相同表型(HLADR+/ICAM-1+)(Baadsgaard等，(1990)J.InvestDerm.，95275-282)。而且由于其體內(nèi)和體外炎癥原性質(zhì)，以及從激活的T細胞和牛皮癬損傷的角化細胞中大量分泌，IL-8被認為是牛皮癬皮膚所見病理變化如角化細胞過度增殖的主要原因。再者，受體B7家族之一(激活A(yù)PC上發(fā)現(xiàn)的CD28天然配基)BB1已顯示在牛皮癬中表達，不影響皮膚角化細胞(Nickoloff等，(1993)Am.J.Pathology，1421029-1040)。其它幾種疾病被認為由異常T細胞激活引起，包括I型(胰島素依賴)糖尿病，甲狀腺炎，肉樣瘤病，多發(fā)性硬化，自身免疫葡萄膜炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，炎性腸疾病(Crohn’s和潰瘍性結(jié)腸炎)及自身免疫肝炎。此外，多種縮合癥包括膿毒性休克和腫瘤誘導(dǎo)的惡病質(zhì)可能與T細胞激活和增加的潛在毒性水平淋巴因子的產(chǎn)生有關(guān)。正常的T細胞激活還通過提供對“外來”供體組織有效破壞的必需信號介導(dǎo)移植細胞和器官的排斥反應(yīng)。致使T細胞增殖、基因表達和特異免疫調(diào)節(jié)細胞因子分泌的T-淋巴細胞的激活需要兩個獨立的信號。第一個信號包括通過特異T細胞受體/CD3復(fù)合物識別抗原提呈細胞(APCs)表面主要組織相容性復(fù)合物分子提呈的抗原。T細胞和APCs之間抗原非特異性細胞間相互作用提供用于調(diào)節(jié)T細胞對抗原反應(yīng)的第二個信號。這些二級或共刺激信號決定T細胞對抗原的反應(yīng)幅度。共刺激細胞通過增加特異細胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平和穩(wěn)定選擇的mRNAs起反應(yīng)。無共刺激情況下，T細胞激活導(dǎo)致失敗的或無反應(yīng)性的T細胞反應(yīng)。一個關(guān)鍵的共刺激信號通過T細胞表面受體CD28與APC上的B7相關(guān)分子的相互作用提供(Linsley和Ledbetter(1993)Ann.Rev.Immunol.，11191-212)。CD28在95％的CD4+T細胞(對B細胞抗體產(chǎn)生起輔助功能)和50％的CD8+T細胞(具有細胞毒作用)上組成型表達(Yamada等，(1985)Eur.J.Immunol.151164-1168)?？乖蝮w外促有絲分裂刺激后，進一步發(fā)生CD28表面水平的誘導(dǎo)和某些免疫調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生。它們包括白介素2(IL-2)，為T細胞細胞周期進行需要的；γ干擾素，發(fā)揮廣泛的抗病毒和抗腫瘤作用以及白介素2(IL-8)，為中性粒細胞和淋巴細胞有效的趨化因子。這些細胞因子已顯示被T細胞激活的CD28通路調(diào)節(jié)(Fraser等，(1991)Science，251F313-316，Seder等，(1994)J.Exp.Med.，179299-304，Wechsler等，(1994)J.Immunol.，1532515-2523)。IL-2，γ干擾素和IL-8對促進廣泛的免疫應(yīng)答是必需的，異顯示在許多T細胞介導(dǎo)的疾病狀態(tài)下過表達。在某些T細胞介導(dǎo)的皮膚失調(diào)如過敏性接觸皮炎和扁平苔癬，在大多數(shù)皮膚和表皮CD3+T細胞中高水平表達，但在正常皮膚和基底細胞癌(一種非T細胞介導(dǎo)的皮膚病)中，CD28僅在血管周T細胞表達。相似地，在過敏性接觸皮炎和扁平苔癬情況下，發(fā)現(xiàn)B7在皮膚樹狀細胞，皮膚APCs和角化細胞表達，但不在正常皮膚和基底細胞癌表達(Simon等，(1994)J.InvestDerm.，103539-543)。因此這提示CD28/B7通路是T細胞介導(dǎo)的皮膚病的一個重要的介體。由喪失自身耐受性引起的某些自身免疫疾病相關(guān)的異常T細胞激活主要以CD28+T細胞的存在和在激活的職業(yè)APCs(單核細胞，巨噬細胞成樹狀細胞)上表達其配基B7為特征。這些包括自身免疫Graves甲狀腺炎(Garcia-Cozar等，(1993)Immunol.，1232)。肉樣瘤病(Vandenbergh等，(1993)Int.Immunol.，5317-321)，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Verwilgher等，(1994)J.Immunol.，1531378-1385)和系統(tǒng)紅斑狼瘡(Sfikakis等(1994)Clin.Exp.Immunol.，968-14)。在介導(dǎo)移植細胞和器官排斥反應(yīng)的正常T細胞激活中，CD28被其合適的B7配基在T細胞受體接合過程中結(jié)合對于相對外來抗原如供體組織的適當(dāng)同種異體反應(yīng)是極其關(guān)鍵的(Azuma等，(1992)J.Exp.Med.，175353-360，Turka等，(1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，8911102-11105)。自身免疫疾病的傳統(tǒng)療法不阻止T細胞激活；在對自身抗原的自身反應(yīng)性免疫應(yīng)答中的效應(yīng)器步驟。如類固醇和非類固醇抗炎藥物(NSAIDS)目前用于改善癥狀，但它們不阻止疾病的演進。此外，類固醇具有副作用如誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松，器官毒性和糖尿病，并加速軟骨退化過程和引起2-8小時的稱作注射后潮紅。NSAIDS會有胃腸副作用并增加粒細胞缺乏癥和醫(yī)源性肝炎的危險。免疫抑制藥物也用做另一種治療形式，特別在晚期疾病階段。然而，這些藥物抑制整個免疫系統(tǒng)并且治療經(jīng)常有嚴(yán)重的副作用，包括高血壓和腎毒性。還有建立的免疫抑制劑如環(huán)孢菌素和FK506不能抑制CD28依賴的T細胞激活通路(June等，(1987)，Mol.Cell.Biol.，74472-4481)。給出了治療免疫系統(tǒng)介導(dǎo)疾病目前可得到的藥物和方法的缺點，才有興趣提供治療這些疾病的新方法和組合物。III.發(fā)明概述本發(fā)明提供了治療免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的疾病的方法和組合物。本發(fā)明的組合物具有降低CD28在感興趣的細胞中表達的能力，它依次減輕在免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的疾病中免疫系統(tǒng)的致病作用。降低CD28表達的標(biāo)題方法也作為減少CD28+T細胞的抗原刺激作用的方法，從而降低CD28+T細胞的激活水平以及與T細胞激活相關(guān)的細胞因子釋放，包括白介素-2，干擾素-γ和白介素-8。發(fā)明的組合物包括許多不同的能夠減少CD28表達的寡聚物。本發(fā)明的一個方面是提供能夠通過干擾CD28表達而減少CD28表達的寡聚物。本發(fā)明的寡聚物有與CD28基因或CD28基因轉(zhuǎn)錄本，或其部分同源的核酸堿基序列，這里的同源性足以允許在胞內(nèi)條件下形成核酸雙鏈螺旋或三鏈螺旋。本發(fā)明的寡聚物可以是DNA，RNA，或各種其合成類似物。在具體的實施方案中，寡聚物具有11到50個堿基，它包含被3到5個堿基分開的至少兩個GGGG序列。本發(fā)明的另一個方面是提供遺傳工程載體，用于本發(fā)明的寡聚物在感興趣細胞內(nèi)的胞內(nèi)表達，優(yōu)選天然表達CD28細胞。本發(fā)明的另一個方面是提供包含一個或多個本發(fā)明不同寡聚物的藥用制劑。該藥用制劑可以適合各種形式的人體用藥或要導(dǎo)入身體內(nèi)的細胞給藥。本發(fā)明的另一個方面是提供治療免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的疾病的方法。本發(fā)明的方法包括通過給予有效量本發(fā)明的寡聚物來調(diào)節(jié)CD28表達。本發(fā)明的方法包括治療自身免疫疾病的方法，減少炎癥、應(yīng)答的方法，減少選擇的細胞因子產(chǎn)生的方法，滅活T細胞的方法，以及免疫抑制移植病人的方法。IV.附圖簡述圖1是CD28基因的5′非翻譯區(qū)序列(1A)和人CD28的mRNA序列(1B，1C)。圖1B和1C表示多核苷酸序列不同的鄰近部分。圖2為用不同的CD28特異的5對照硫代磷酸酯及硫代磷酸酯3′羥基丙胺寡核苷酸處理后，存活(活的)T細胞百分率的圖示。圖3為抗-CD3單克隆抗體/PMA誘導(dǎo)的CD28在來自兩位供者(GV010和JC011)的人T細胞中表達的圖示，(A)和CD28特異的反對照代磷酸酯(B，分批1和2)以及硫代磷酸酯-3′-羥基丙胺(C)寡核苷酸對抗CD3單克隆抗體/PMA誘導(dǎo)的CD28在來自相同兩位供者的外周血T細胞中表達的影響圖示。圖4圖示A)促細胞分裂原對來自供者KS006的人T細胞的誘導(dǎo)T細胞增殖作用，和B)CD28特異的和對照硫代磷酸酯寡核苷酸對抗CD3單克隆抗體/PMA誘導(dǎo)的人T細胞增殖的影響。圖5圖示在人T細胞中抗CD3單克隆抗體和PMA對白介素2(IL-2)生成的誘導(dǎo)作用和CD28特異的及對照硫代磷酸酯(B)硫代磷酸酯-3′羥基丙胺(C)寡核苷酸對人外周T細胞中抗CD3單克隆抗體/PMA誘導(dǎo)的IL-2生成的影響。圖6圖示抗CD3單克隆抗體和PMA對人T細胞中γ干擾素(IFNγ)產(chǎn)生的誘導(dǎo)(A)，以及CD28特異的和對照硫代磷酸酯(B)硫代磷酸酯-3′羥基丙胺(C)寡核苷酸對人外周T細胞中抗CD3單克隆抗體/PMA誘導(dǎo)的γ干擾素生成的影響。圖7圖示抗CD3單克隆抗體和PMA對人T細胞中白介素8(IL-8)生成的誘導(dǎo)作用(A)以及CD28特異的和對照硫代磷酸酯(B)硫代磷酸酯-3′羥基丙胺(C)寡核苷酸對人外周T細胞中抗CD3單克隆抗體/PMA誘導(dǎo)的IL-8生成的影響。圖8圖示在用及不用CD28特異的和對照硫代磷酸酯3′羥基丙胺寡核苷酸的處理的人外周T細胞中，抗CD3單克隆抗體和PMA對白介素-2受體(IL-2R，或稱為CD25)(A)和細胞內(nèi)粘附分子1(ICAM-1，或稱為CD54)(B)表達的誘導(dǎo)。圖9圖示抗CD3單克隆抗體和PMA處理前后，HUT78(A)和Jurkat(B)人T細胞系中CD28的表達，以及CD28特異的硫代磷酸酯寡核苷酸在抗CD3單克隆抗體和PMA處理的Jurket細胞(C)的作用。圖10圖示CD28特異的硫代磷酸酯寡核苷酸對抗CD3單克隆抗體和PMA處理的HUT78(A)和Jurkat(B)人T細胞系中白介素2生成的影響。圖11圖示硫代磷酸酯寡核苷酸對激活T細胞中輔助分子的表面表達和細胞因子分泌的影響。圖12圖示硫代磷酸酯寡核苷酸對CD28和CD25mRNA水平的影響。圖13圖示寡核苷酸RT035(SEQIDNO44)和RT04S(SEQIDNO45)有關(guān)對有功能的CD28表達抑制作用的特異性。圖14圖示由CD28特異的寡核苷酸RT03S(SEQIDNO44)和RT04S(SEQIDNO45)體外的耐受誘導(dǎo)。圖15圖示32P標(biāo)記的硫代磷酸酯RT03S(SEQIDNO44)和RTC06S(SEQIDNO48)在細胞外上清液(上欄)和Jurkat細胞裂解后(下欄)中的體外穩(wěn)定性。V.特殊實施方案的詳述在此描述的是用于治療免疫系統(tǒng)介導(dǎo)疾病的方法和組合物，其中期望的療效通過減少CD28的表達，從而取消激活的CD28+T細胞功能并減少其它免疫系統(tǒng)細胞的激活來獲得。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)抗原依賴的T細胞激活可通過減少CD28在CD28+T細胞中的表達而受到抑制。本發(fā)明提供許多可用于減少CD28在T細胞中表達的化合物。在此描述的發(fā)明包括發(fā)現(xiàn)降低CD28在T細胞中的表達會抵觸T細胞的抗原特異性激活。此發(fā)現(xiàn)可用來提供許多用靶向CD28的寡聚物和降低CD28表達的非寡聚物治療免疫系統(tǒng)介導(dǎo)疾病的方法。通過采用此申請中所描述的降低CD28表達生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)，提供了治療免疫系統(tǒng)介導(dǎo)疾病的多種方法，這些方法可使用還沒有合成或純化的非寡聚物化合物。本發(fā)明的一個方面是對于可用于抑制某些基因表達的寡聚物提供通常被認為是一種已建立的利用“反義”寡核苷酸或“反義療法”的技術(shù)。已有許多關(guān)于構(gòu)建和應(yīng)用反義的文章。典型的為Steinetal.，Science，2611004-1012(1993)；Milligan，etal.，藥物化學(xué)雜志，361923-1937(1993)；Helene，etal.，J.Biochim.Biophys.Acta，104999-125(1990)；Wagner，自然.，372333-335(1994)；andCrookeandLebleu，反義研究及應(yīng)用，CRCPress，BocaRaton(1993)。在些使用的術(shù)語“反義”，除非另外指明，指能與多核苷酸形成雙鏈或三鏈螺旋的寡聚物(包括寡核苷酸)以抵觸基因表達。在這些及其它類似文章中描述的反義設(shè)計及應(yīng)用的原則可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用于設(shè)計、制造和使用本發(fā)明CD28特異的寡聚物的各種實施方案。本發(fā)明的寡聚物能調(diào)節(jié)CD28基因的表達。本發(fā)明的寡聚物包括那些具有能通過與CD28轉(zhuǎn)錄本(或其部分)雜交形成雙鏈多核苷酸螺旋或通過與CD28基因的一部分或多個部分雜交形成雙鏈多核苷酸螺旋的特性的寡聚物，其中螺旋形成可發(fā)生在胞內(nèi)條件下。本發(fā)明的寡聚物還包括那些能影響基因表達調(diào)控的寡聚物，如通過作為分子誘餌(moleculardecoy)阻止轉(zhuǎn)錄因子與CD28基因非翻譯區(qū)的調(diào)節(jié)元件之間的蛋白-核酸相互作用。此外，本發(fā)明的寡聚物包括那些能與CD28基因的一個或多個部分形成三鏈多核苷酸螺旋的寡聚物，其中此螺旋形成可在細胞內(nèi)條件下發(fā)生。雙鏈螺旋和三鏈螺旋的核酸堿基配對關(guān)系(如腺嘌呤-胸腺嘧啶，胞嘧啶-鳥嘌呤，尿嘧啶-胸腺嘧啶)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并可用來設(shè)計本發(fā)明的寡聚物。能與本發(fā)明所給寡聚物形成雙鏈或三鏈螺旋的CD28基因或CD28基因轉(zhuǎn)錄本區(qū)域稱做被此寡聚物“靶向”。人CD28是一種存在于T細胞亞群表面的90kDa同源二聚跨膜糖蛋白。CD28存在于大多數(shù)CD4+T細胞和約50％CD8+T細胞上。編碼人CD28的DNA序列已測出，可見于其它地方，在Lee等，JournalofImmunology，145344-352(1990)和公眾可獲得的基因數(shù)據(jù)庫如GenBank。人CD28基因包含四個外顯子，每個決定預(yù)期蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。已觀察到人CD28基因產(chǎn)生不同大小的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。本發(fā)明的寡聚物可參照分開的CD28基因核苷酸序列或CD28基因衍生的cDNAs序列進行設(shè)計。本發(fā)明的組合物和方法可通過參照來自非人哺乳動物的CD28基因序列容易地改動以用于非人的哺乳動物。非人CD28基因的序列可通過使用將先前確定的來自人(或其它哺乳動物)的CD28基因序列作為基因庫雜交探針和/或PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴增引物而得到。雖然公開的CD28基因核苷酸序列被認為是準(zhǔn)確的，但即使公開的CD28核苷酸堿基序列含有序列錯誤，本主題發(fā)明可被本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員實行。公開序列中適當(dāng)?shù)暮塑账釅A基序列錯誤可以通過重測序本發(fā)明寡聚物靶向的CD28基因區(qū)域(或CD28基因轉(zhuǎn)錄本)的方法來測得?？捎贸Ｒ?guī)DNA測序技術(shù)進行重測序。本發(fā)明的寡聚物優(yōu)選含約11-50個核酸堿基單位。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易欣賞發(fā)明的寡聚物明顯長于50個核酸堿基單位。在本發(fā)明的一個較優(yōu)選實施方案中，寡聚物包含約8-25個核酸堿基單位；更優(yōu)選約14-22個核酸堿基單位。本發(fā)明寡聚物的優(yōu)選大小限制只適于胞外給予細胞的寡聚物，不適于胞內(nèi)產(chǎn)生的CD28特異寡聚物，如用于操縱靶宿主細胞基因載體所產(chǎn)生的。本發(fā)明的寡聚物可具有多種不同的核酸堿基序列。本發(fā)明的寡聚物可被選來通過與實際上CD28基因的CD28轉(zhuǎn)錄本的任何區(qū)域雜交(通過核酸-核酸相互作用)以減少CD28的表達，或通過與識別CD28基因非翻譯序列的非核酸分子雜交(通過核酸-蛋白相互作用)來減少CD28的表達。例如，本發(fā)明的寡聚物可被選做能與CD28轉(zhuǎn)錄本的翻譯區(qū)、CD28轉(zhuǎn)錄本非翻譯區(qū)，CD28轉(zhuǎn)錄本非剪切區(qū)，CD28基因內(nèi)含子，CD28啟動子序列，CD28調(diào)節(jié)序列，CD28轉(zhuǎn)錄本的5′帽區(qū)，CD28基因編碼區(qū)等(包括不同特征區(qū)域的組合)雜交。針對本發(fā)明寡聚物的CD28基因和CD28基因轉(zhuǎn)錄本的優(yōu)選實施方案在CD28基因(及其轉(zhuǎn)錄本)的翻譯和/或轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。通過選擇由寡聚物核酸堿基配對序列而改變螺旋形成在CD28或CD28基因轉(zhuǎn)錄本上發(fā)生的位置，寡聚物的效力即產(chǎn)生期望生物效應(yīng)所需的量將會改變。本發(fā)明寡聚物的優(yōu)選實施方案具有最高的可能效力。本發(fā)明不同寡聚物的效力可通過本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的各種體外試驗進行測定。這些方法的實施例在本申請書的實驗部分可找到。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員主張不期望產(chǎn)生靶向還存在于CD28基因之外的基因座位的多核苷酸序列的寡聚物。例如，不期望產(chǎn)生靶向CD28轉(zhuǎn)錄本的5′非翻譯區(qū)中Ala序列的寡聚物(CD28的Alu區(qū)域描述于Lee等，JournalofImmunology，145352(1990))。與CD28基因之外的基因或基因轉(zhuǎn)錄本形成雙鏈或三鏈螺旋的寡聚物的使用可通過針對公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫如GenBank中存在的多核苷酸序列信息進行寡聚物核苷酸堿基序列同源性搜索來最小化。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的寡聚物與所選靶序列表現(xiàn)完美的核酸堿基互補性，即寡聚物中每個核酸堿基可與雙螺旋(或三螺旋)的另一條鏈上的第二個(或第三個)核酸堿基進行堿基配對。然而，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員懂得各種對CD28基因靶特異的和/或能抑制CD28表達的寡聚物可能具有與CD28基因(任一條鏈)，CD28基因轉(zhuǎn)錄本或CD28特異調(diào)節(jié)蛋白缺乏完全雜交性的核苷酸堿基序列。本發(fā)明寡聚物優(yōu)選實施方案中寡聚物具有下列核苷酸堿基序列；5′TTGTCCTGACGATGGGCTA3′(SEQIDNO1)RT015′AGCAGCCTGAGCATCTTTGT3′(SEQIDNO2)RT025′TTGGAGGGGGTGGTGGGG3′(SEQIDNO3)RT035′GGGTTGGAGGGGGTGGTGGGG3′(SEQIDNO4)RT04在本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方案中，具有RT01，RT02，RT03和RT04所示核苷酸堿基序列的寡聚物為硫代磷酸酯。特別優(yōu)選的寡聚物為Tam等，Nucl.Acid.Res.22977-986(1994)所述的硫代磷酸酯-3′羥基丙胺。本發(fā)明的寡聚物可被設(shè)計以減少CD28在已內(nèi)化的細胞外給予本發(fā)明寡聚物的T細胞中的表達。此外，本發(fā)明的寡聚物可設(shè)計為當(dāng)通過運用基因表達載體細胞內(nèi)產(chǎn)生寡聚物時減少CD28的表達。CD28表達的抑制可通過下列方式完成(I)干擾CD28基因轉(zhuǎn)錄，(ii)干擾CD28基因轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄，(iii)干擾CD28基因轉(zhuǎn)錄本的加工，或(i)，(ii)和(iii)的任意組合。干擾CD28表達的準(zhǔn)確度和機制將依賴于下列因素，如特定寡聚物的結(jié)構(gòu)，寡聚物的核苷酸堿基序列，寡聚物的劑量，給予本寡聚物的方式等等。在些使用的術(shù)語“寡聚物”指天然存在的多核苷酸如DNA，RNA，和具有與DNA或RNA形成雙鏈或三鏈螺旋能力的天然存在核酸的各種人造類似物。許多為天然存在多核苷酸人造類似物的寡聚物具有在本發(fā)明的方法中應(yīng)用時優(yōu)于DNA或RNA的性質(zhì)。這些性質(zhì)包括對DNA/RNA較高親合性，核酸內(nèi)切酶抗性，核酸外切酶抗性，脂溶性，RNaseH活性等。例如，通過在核苷酸間磷酸二酯鍵用烷基或烷氧基替代磷酸酯氧以形成烷基磷酸酯寡核苷酸或烷基磷酸三酯寡核苷酸，以增加脂溶性和/或?qū)怂崦赶目剐?。像這樣的非離子寡聚物以增加對核酸酶水解的抗性和/或增加細胞攝取為特征，同時保留了與互補核酸序列形成穩(wěn)定復(fù)合物的能力。雖然許多作為天然存在核酸類似物的寡聚物在此被明確描述，并/或為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，應(yīng)看到未來開發(fā)的作為核酸類似物的許多寡聚物可望容易由本領(lǐng)域的技術(shù)人員用于抑制CD28基因的表達。下面給出了通過選擇合適核酸堿基序列以靶向CD28基因(及其轉(zhuǎn)錄本)，從而用作本發(fā)明寡聚物的不同的目前可得到DNA/RNA類似物的簡要綜述。在那些文章中描述的各種寡聚物是可能適用于本發(fā)明的方法和組合物中抑制CD28表達的寡聚物的不同種可能實施方案的例子而非限制。甲基磷酸酯(及其它烷基磷酸酯)寡聚物可在溶液和不溶性聚合支持物上用多種方法制備(AgrawalandFiftina，核酸研究.，63009-3024(1979)；Milleretal.，生物化學(xué)，185134-5142(1979)；Milleretal.，生物化學(xué)雜志.，2559659-9665(1980)；Milleretal.，核酸研究.，115189-5204(1983)；Milleretal.，核酸研究.，116225-6242(1983)；Milleretal.，生物化學(xué)，255092-5097(1986)；Sinhaetal.，四面體通訊.24877-880(1983)；Dormanetal.，四面體通訊.4095-102(1984)；JagerandEngels，四面體通訊.，251437-1440(1984)；Nobleetal.，核酸研究.，123387-3404(1984)Callahanetal.，美國國家科學(xué)院院報，831617-1621(1986)；Koziolkiewiczetal.，ChemicaScripta，26251-260(1986)；AgrawalandGoodchild，四面體通訊.，383539-3542(1987)；Lesnikowskietal.，四面體通訊.，285535-5538(1987)；Sarinetal.，美國國家科學(xué)院院報，857448-7451(1988)。其它用作寡聚物的寡核糖核苷酸類似物描述于Inova等，核酸研究，156131(1987)(2′-O-甲基核糖核苷酸)，Inova等，F(xiàn)EBSLett.，215327(1987)。關(guān)于怎樣制造和使用硫代磷酸酯及二硫代磷酸酯的敘述參見美國專利No.5,292,875，美國專利No.5,286,717，美國專利No.5,276,019，美國專利No.5,264,423，美國專利No.5,218,103，美國專利No.5,194,428，美國專利No.5,183,885，美國專利No.5,166,387,美國專利No.5,151,510，美國專利No.5,120,846，美國專利No.4,814,448，美國專利No.4,814,451，美國專利No.4,096,210，美國專利No.4,094,873，美國專利No.4,092,312，美國專利No.4,016,225，美國專利No.4,007,197，美國專利No.3,972,887，美國專利No.3,917,621，and美國專利No.3,907,815，Dagleetal.，核酸研究184751-4757(1990)，Lokeetal.，美國國家科學(xué)院院報，863474-3478(1989)，LaPlanche，etal.，核酸研究.，149081(1986)andbyStec，etal.，美國化學(xué)會志.1066077(1984)，andSteinetal.，核酸研究.163209-3221(1988)。關(guān)于如何制造和使用亞磷酰胺的敘述參見Agrawaletal.，美國國家科學(xué)院院報.，857079-7083(1988)，Dagleetal.，核酸研究，18(6)4751-4757(1990)，Dagleetal.，核酸研究.19(8)1805-1810(1991)，其它感興趣的多核苷酸類似物包括骨架結(jié)構(gòu)中含縮醛或硫醛的化合物。關(guān)于如何制造和使用這些化合物參見Gaoetal.，生物化學(xué)316228-6236(1992)，Quaedfilegetal.，四面體通訊.33(21)3081-3084(1992)，Jonesetal.，有機化學(xué).582983-2991(1993)。其它感興趣的多核苷酸類似物包括骨架結(jié)構(gòu)中含甲硅烷基和硅氧橋的化合物。關(guān)于如何制造和使用這些化合物參見OgilvieandCormier，四面體通訊.，26(35)4159-4162(1985)，CormierandOgilvie，核酸研究.16(10)4583-4594(1988)，PCTpublicationWO94/06811。其它感興趣的多核苷酸類似物包括骨架結(jié)構(gòu)中含甲硅烷基和乙酰酯橋的化合物。關(guān)于如何制造和使用這些化合物參見Gaitetal.，J.Chem，Soc.，PerkinTrans，11684(1974)，MungallandKaiser，有機化學(xué)雜志.42(4)703-706(1977)，andCoulletal.，and四面體通訊.28(7)745-748(1987)。具有嗎啉代堿基骨架鍵的多核苷酸類似物也已被描述。如何制造和使用這些核苷酸類似物的資料見美國專利Nos.5,034,506，5,235,033，5,034,506，5,185,444。具有不同胺，肽及其它非手性和/或中性連接的多核苷酸類似物已描述在Caulfieldetal.，生物有機及藥物化學(xué)通訊.，3(12)2771-2776(1993)，Mesmaekeretal.，生物有機及藥物化學(xué)通訊.，4(3)395-398(1994)；Angew，Chem，Int，Ed，Engl.，33(2)226-229(1994)，美國專利No.5,166,315，and美國專利No.5,142,047。亞基間具有硫醚和其它硫鍵的多核苷酸描述在SchneiderandBrenner，四面體通訊.，31(3)335-338(1990)，Huangetal.，有機化學(xué)雜志.，563869-3882(1991)；MusickiandWidlanski，四面體通訊.，32(10)1267-1270(1991)；HuangandWidlanski，四面體通訊.，33(19)2657-2660(1992)；andReynoldsetal.，有機化學(xué)雜志.572983-2985(1992)，andPCTpublicationWO91/15500。其它感興趣多核苷酸類似物包括肽核酸(PNAs)和相關(guān)多核苷酸類似物。如何制造和使用肽核酸的敘述參見Buchardt等，TrendsinBiotech.，11(1993)和PCTpublicationWO93/12129。其它用于反義抑制的寡聚物已描述在Thuongetal.，美國國家科學(xué)院院報.，845129-5133(1987)，美國專利No.5,217,866，Lamond，Biochem.Soc.Transactions，211-8(1993)(2′-O-alkyloligoribonucleotides)，Onoetal.，生物綴合物化學(xué)，4499-508(1993)(在其脫氧核糖1位上載有氨基鍵的2′-脫氧尿嘧啶)，Kawasaietal.，藥物化學(xué)雜志.，36831-841(1993)(2′-脫氧-2′-氟硫代磷酸酯寡核苷酸)。PCTpublicationWO93/23570，Augustynsetal.，核酸研究，21(20)4670-4676(1993)。此外，寡聚物可進一步修飾以增加復(fù)式組合的穩(wěn)定性和/或增加細胞攝取。這些修飾的實施例見標(biāo)題為“用于序列特異性結(jié)合的含酰胺或氨基甲酸酯鍵的構(gòu)象限制寡聚物”的PCT公開WO93/24507Nielsen等，Science，2541497-1500(1991)，標(biāo)題為“改進的核苷酸間鍵”的PCT公開WO92/05186，標(biāo)題為“帶有新鍵的寡核苷酸類似物”1990年10月24日提交的PCT公開WO91/06629和4月24日提交的美國專利5,264,562，標(biāo)題為“假核苷和假核苷酸及其聚合物”的PCT公開WO91/13080，標(biāo)題為“2′-修飾的寡核苷酸”的PCT公開WO91/06556，標(biāo)題為“核酸外切酶抗性寡核苷酸及制備方法”于1990年6月5日提交的PCT公開WO90/15065，和美國專利No.5,256,775。本發(fā)明的寡聚物包含多種核酸堿基。除了DNA或RNA中發(fā)現(xiàn)的天然存在的如胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和次黃嘌呤的核酸堿基外，本發(fā)明的寡聚物可含有天然存在核酸堿基合成類似物的一個或多個核酸堿基。這些非天然存在雜環(huán)堿基包括但不限于氮雜和脫氮雜嘧啶類似物，氮雜和脫氮雜嘌呤類似物以及其它雜環(huán)堿基類似物，其中嘌呤和嘧啶環(huán)上的碳和氮原子有一個或多個被下列雜原子取代，如氧、硫、硒、磷等。優(yōu)選的堿基組成為那些可參入雙鏈多核苷酸中一條鏈的堿基，以便同雙鏈多核苷酸中互補鏈上的天然存在堿基保持堿基配對結(jié)構(gòu)關(guān)系。本發(fā)明提供許多治療各種免疫失調(diào)的方法。這里使用的術(shù)語“治療”或“處理”指對疾病予以預(yù)防和改善已在個體中出現(xiàn)的癥狀。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員會贊同治療對預(yù)防疾病發(fā)生或減少與疾病相關(guān)的癥狀不必完全有效。對病人來說，任何對癥狀嚴(yán)重性的緩解，癥狀發(fā)作的延遲或推遲癥狀嚴(yán)重度的進展都是期望的，本發(fā)明方法可治療的免疫失調(diào)包括表達CD28的T細胞介導(dǎo)或造成特發(fā)效應(yīng)的疾病。CD28表達的抑制導(dǎo)致激活CD28+T細胞正常產(chǎn)生的細胞因子表達減少，這些細胞因子包括白介素-2，γ干擾素和白介素8。因此，本發(fā)明的方法包括但不限于由白介素-2，γ干擾素，白介素-8?；蚱浣M合而引起疾病的治療方法，借此T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)被中斷或減弱。給病人服用本寡聚物來治療的免疫失調(diào)實例包括器官移植排斥，膿毒性休克，腫瘤誘導(dǎo)的惡病質(zhì)和多種自身免疫疾病?？捎杀痉椒ㄖ委煹淖陨砻庖呒膊“ㄏ铝杏僧惓細胞激活介導(dǎo)的疾病I型(胰島素依賴的)糖尿病，甲狀腺炎，肉樣瘤病，多發(fā)性硬化，自身免疫葡萄膜炎，潰瘍性結(jié)腸炎，再生障礙性貧血，系統(tǒng)紅斑狼瘡，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，寄生蟲誘導(dǎo)的炎癥和肉芽腫，Crohn氏疾病，牛皮癬，多肌炎，皮肌炎，硬皮病，脈管炎，牛皮癬關(guān)節(jié)炎，Graves病，gravis菌絲體，自身免疫肝膽疾病等。此外，本發(fā)明的方法和組合物提供多種綜合癥的治療，包括膿毒性休克和腫瘤引起的惡病質(zhì)，其中致病效應(yīng)至少部分通過激活的CD28+T細胞分泌的淋巴因子介導(dǎo)。本發(fā)明的疾病治療方法包含給予病人有效量本寡聚物的各步驟。準(zhǔn)確的劑量，即給予病人的CD28特異寡聚物的有效量將隨多種因素如被治療的具體疾病，治療組合物中的準(zhǔn)確寡聚物，病人的年齡及狀況等而改變。確定合適藥物劑量的步驟為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知，還可在Remington’sPharmaceuticalScience(最新版)，MarkPublishingCompany，Easton，Pa.等中查到。隨了直接給病人施用CD28靶向寡聚物外，本發(fā)明設(shè)想從病人取得CD28+細胞或能表達CD28的細胞可以帶有或不帶有其他細胞。并用本發(fā)明的一種或多種寡聚物轉(zhuǎn)化的治療方法。轉(zhuǎn)化可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法，如電穿孔，陽離子脂質(zhì)如DOTMA或DOSPA等。轉(zhuǎn)化的細胞再重新導(dǎo)入體內(nèi)。本發(fā)明的另一方面是提供通過給予CD28特異寡聚物治療免疫失調(diào)的方法，其中該寡聚物在細胞內(nèi)通過重組多核苷酸表達載體產(chǎn)生。細胞內(nèi)產(chǎn)生的CD28特異寡聚物必須是RNA或DNA分子。分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員知道用于感興趣的多核苷酸表達的重組多核苷酸載體。用于感興趣的多核苷酸表達的重組載體詳述見“體細胞基因治療”，ed.P.L.Chang，CRCPress，BocaRaton(1995)，R.C.Muligan，科學(xué)，260926-932(1993)，F(xiàn).W.Anderson，科學(xué)，256808-873(1992)，Culveretal.，Hum.GeneTher.，2107-109(1991)等。通過遺傳工程治療免疫失調(diào)的本方法中所用的合適重組載體能整合到T細胞基因組中或在T細胞胞漿中復(fù)制。用于細胞內(nèi)給藥的CD28特異寡聚物優(yōu)選比細胞外給藥的CD28寡聚物明顯長。在細胞內(nèi)CD28給藥的本方法優(yōu)選實施方案中，CD28特異寡聚物與一個或多個完整CD28轉(zhuǎn)錄本或完整CD28基因互補；但是合適的細胞內(nèi)產(chǎn)生的CD28特異寡聚物在長度上較短。不像細胞外給予的CD28特異寡聚物，CD28特異寡聚物沒有細胞內(nèi)攝取或細胞外酶水解的問題。用胞內(nèi)CD28特異物的本方法可包括直接給病人服用CD28特異寡聚物編碼的重組載體?；蛘?，將CD28特異寡聚物產(chǎn)生的載體直接給予已從病人分離得到的細胞(即干細胞，T細胞，全血，骨髓等)，由此產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細胞。轉(zhuǎn)化細胞可接著再導(dǎo)入病人。本發(fā)明還特別提供能表達一種或多種本發(fā)明寡聚物的表達載體。通常這些表達載體以可操作組合包含一個啟動子和一個編碼能抑制CD28在T細胞表達的寡聚物的多核苷酸序列。雖然許多不同的啟動子可用于本發(fā)明的載體，但優(yōu)選的啟動子能驅(qū)動在T細胞中高水平表達。本發(fā)明的表達載體還包含各種調(diào)節(jié)序列。現(xiàn)有的表達載體，特別是那些明確為基因治療設(shè)計的載體易適于本發(fā)明CD28靶向寡聚物的表達。用常規(guī)基因工程技術(shù)如Sambrook等，MolecularCloning，2ndEd.，ClodSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)所述，這些載體可適于CD28靶向寡聚物的表達。本發(fā)明的另一方面是為給予本發(fā)明寡聚物提供藥物制劑以治療免疫系統(tǒng)介導(dǎo)疾病。藥學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地制作這些藥物制劑。這些制劑包含本發(fā)明的一種或多種寡聚物；而在本發(fā)明的實施方案中包含不止一種不同類型的寡聚物，這些寡聚物被優(yōu)選不能相互雜交。本發(fā)明的藥物制劑適合以多種對所選給藥方法合適的方式給予個體，包括口服，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)和局部等。本藥物制劑除含有本發(fā)明的一種或多種不同的寡聚物外，還可含有一種或多種非生物活性化合物，即賦形劑，如穩(wěn)定劑(促進長期貯存)，乳化劑，粘合劑，增稠劑，鹽，防腐劑等。胃腸外給藥的制劑可包括無菌水溶液，也可含緩沖液，稀釋液及其他合適添加劑。可設(shè)計本發(fā)明的藥物制劑以加速細胞攝取組合物中的寡聚物，如可將寡聚物封裝入合適的脂質(zhì)體。局部給藥的藥物制劑對局部治療特別有用。局部治療的制劑包括軟膏，噴劑，凝膠，懸液，乳液，乳膏等。局部用藥制劑除本寡聚物外還可包括載體材料如異丙醇，甘油，石蠟，硬脂酸醇，聚乙二醇等。藥用載體還可包括已知的化學(xué)吸收促進劑。促吸收劑的實例是如二甲基乙酰胺(美國專利No.3,472,931)，三氯乙醇或三氟乙醇(美國專利No.3,891,757)，某些醇及其混合物(英國專利No.1,001,949)和英國專利說明書No.1,464,975。本寡聚物除治療用途外，它們還可作為分析實驗室工具來研究T細胞激活。T細胞除CD28和抗原特異T細胞受體外還有幾種表面受體。由于多種受體介導(dǎo)的通路間可能的和實際的相互作用，研究所選受體各自的生物特性會遇到困難。通過給以減少CD28在T細胞中表達的機制，本發(fā)明的寡聚物和方法還為研究不依賴于CD28激活通路的T細胞行為提供了有用的實驗室方法。通過參考下列實施例會更好地了解本發(fā)明。下列實施例被提供以解釋本發(fā)明，而不作為本發(fā)明的限制。VI.實施例-系列1寡核苷酸寡脫氧核苷酸在DNA自動合成儀(AppliedBiosystems394型)上用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺方法合成。β-氰乙基亞磷酰胺，合成試劑和CPG聚苯乙烯柱從AppliedBiosystems(ABI，F(xiàn)osterCity，C.A)購得。3′-氨基修飾C3CPG柱購自GlenResearch(Sterling，VA)。對硫代磷酸酯寡核苷酸，標(biāo)準(zhǔn)的氧化瓶被二硫化四乙基硫羰/乙腈取代，并用標(biāo)準(zhǔn)ABI硫代磷酸酯程序來進行硫代磷酸酯連接的逐步增加。從可控孔度玻璃柱上切下后，在55℃用濃氨水處理寡核苷酸8小時除去保護基團。寡核苷酸通過HPLC用反相半制備C8柱(ABI)純化。用80％乙酸處理切除DMT并用乙醇沉淀后。經(jīng)用分析C18柱(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)通過HPLC達到了樣品的純度。所有＞90％純度的寡核苷酸被冷凍干燥。寡核苷酸再溶于無菌法離子水(1CN，CostaMesa)中，通過OD260nm的佐值把濃度調(diào)至400μM，等分并在實驗前于-20℃貯存。所有情況下，至少使用三批列于表1寡核苷酸。細胞株和T細胞的純化60ml健康供體的血經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心后，從淡黃色層中分離外周血單核細胞(PBMCs)。然后從PBMCs用對于T細胞專一的Lymphokwik淋巴細胞分離試劑(LK-25T，OneLambda，CanogaParkCA)純化T細胞。然后平均40-60×106T細胞的產(chǎn)品在含有20μMHEPES緩沖液，pH7.4，5％自身血漿，1％L-谷氨酰胺，1％青霉素/鏈霉素和0.05％2-巰基乙醇的20-30mlRPMI-APS(RPMI-1640)培養(yǎng)基(ICN，CostaMesa，CA)中于37℃溫育過夜，除去任何沾污的粘著細胞。所有的實驗中，T細胞用RPMI-APS洗，然后鋪在96孔板上，每孔細胞濃度2-3×106細胞/ml。表1AS反義TF三鏈螺旋SS正義RO隨機寡聚物</tables>表2AS反義TF三鏈螺旋</tables></tables></tables>T細胞淋巴瘤細胞株，JurkatE6-1(CD28+CD24+)細胞(152-T1B和)HUT78(CD28-/CD4+)細胞(T1B-161)(ATCC，Rockville，MD)保持在RPMI-10(含20μMHEPFS緩沖液，pH7.4，10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logan，UT)，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/鏈霉素的RPML-1640)中。促分裂原誘導(dǎo)的T細胞激活和寡核苷酸處理在加入人外周T細胞或T細胞淋巴瘤細胞株(0.2-0.3×106)之前，一式二份的96孔板預(yù)包被有純化的抗-CD3單克隆抗體(mA6)(6.25-200ng/孔)(克隆HIT3a，Pharmingen，SanDiego，CA)并用冷磷酸鹽緩沖的生理鹽水，pH7.4(PBS)洗二次。抗-CD3mA6-處理的T細胞進一步通過加入2ng佛波醇12-豆蔻酸13-乙酯(PMA)(Calbiochem，LaJolla，CA)激活并在37℃溫育48小時。激活后抗-CD3/PMA激活的T細胞立即用1-20μMCD28特異的和對照寡核苷酸處理，并在24小時后再處理。來向成對平板之一的T細胞用于免疫熒光分析，上清液用于細胞因子研究，第二塊平板用于T細胞增殖分析。免疫熒光研究激活后，來自第一塊平行板的150ml細胞上清液轉(zhuǎn)至另一塊板中用于分析細胞來源的細胞因子產(chǎn)生。剩下的細胞用等滲鹽水pH7.4(BectonDickinson，Mansfield，MA)洗二遍，重懸于50ml等滲鹽水中并分成二份樣品。一份樣品用PE-CD28/FITC-CD4或PE-CD54/FITC-CD25共染色，并通過用PE/FITC標(biāo)記的異型配對對照單克隆抗體染色另一份樣品來評估非特異熒光。所有的熒光標(biāo)記單克隆抗體由BectonDickinson(SanJose，CA)獲得。用飽和mAb濃度在暗處、4℃溫育45分鐘。在用FACScan流式細胞儀(BectonDickinson)分析前，用PBS洗去未參入的標(biāo)記物?？乖芏仍陂T控活細胞中間接測得，并用熒光平均通道(MCF)表示。特異抗原(CD54，CD25)的表面表達表示為凈通道變化(MCS)，即用FITC-或PE-標(biāo)記的抗原特異性mAb染色的細胞的MCF減去FITC-或PE-標(biāo)記的異型配對(IgG1)對照mAb染色細胞的MCF得到?；蛘哒f，用CD28mAb染色細胞的CD4+-亞群的表面表達由CD28-CD4+細胞的MCF減去CD28+CD4+的MCF測得。對照未處理的和寡核苷酸處理的細胞的存活率通過用活體染料碘化丙錠(終濃度5μg/ml)染色多個供體中每行寡核苷酸測得。排斥碘化丙錠的活細胞百分數(shù)用流式細胞術(shù)測得，且在用劑量范圍1-20μM的寡核苷酸處理的所有行中＞90％(90-99％)圖2。細胞因子分析測定在第一塊平行板的細胞上清液中來自細胞的人細胞因子濃度。促分裂原引起的白介素2(IL-2)水平的變化通過使用商品可得ELISA試劑盒(R&DsystemsQuantikinekit，Minneapolis，MN)或用依賴IL-2的細胞系CTLL-2(ATCC，Rockville，MD)用生物方法測得。促分裂原引起的γ干擾素和白介素8(IL-8)水平的變化分別通過使用Endogen(Cambridge，MA)和R&D系統(tǒng)(Quantikirekit，Minneapolis，MN)試劑盒測定。所有的ELISA結(jié)果表示為pg/ml，并且CTLL-2生物測試方法以代表由CTLL-2細胞對3H-胸腺嘧啶(ICN，Costa，Mesa，CA)的依賴于IL-2的細胞參入的每分鐘計數(shù)來表示。T細胞增殖試驗所有實驗中的第二塊平行板用來分析促分裂原引起的T細胞增殖的變化?？笴D3/PMA激活72h并在有或無寡核苷酸存在下，細胞用1μCi3H-胸腺嘧啶(ICN，Costa，Mesa，CA)脈沖并在37℃保溫過夜。由放射活性標(biāo)記參入來評價的促分裂原引起的細胞生長通過收集細胞并在WallacBetaplate計數(shù)儀(Wallac，Gaithersburg，MD)上液閃計數(shù)測得。CD28特異的寡核苷酸對激活人T細胞中CD28表達的抑制作用抗CD3/PMA處理的人T細胞，其CD28的表面表達(用免疫熒光分析)從靜息T-細胞的122±7.74MCS增至MCS150±9.27(n＝9)。靜息與激活T細胞中CD28表達的差異被定義為促分裂原引起的CD28表達(圖3A)。圖3B和3C表示用硫代磷酸酯(以S-寡聚物表示，圖3B)和硫代磷酸酯-3′胺(以A-寡聚物表示，圖3C)形式的CD28特異反對照寡核苷酸處理2個供者的抗CD3/PMA激活的T細胞，每種寡核苷酸分別兩行。在劑量范圍2-10μM的四種候選寡核苷酸RT01-RT04(表1)中，RT03和RT04的硫代磷酸酯和硫代磷酸酯-3′-胺形式是促分裂原誘導(dǎo)的CD28表達的活性最好的抑制劑，均在5μM或更少時抑制誘導(dǎo)CD28表達大于50％(IC50)。這兩種長度不同的寡核苷酸被設(shè)計與CD28基因轉(zhuǎn)錄起始位點的5′上游區(qū)雙鏈DNA的一段雜交。用對照寡核苷酸RTC01(SEQIDNO5)-RTC06(SEQIDNO10)(表1)未見類似的劑量依賴性對促分裂原誘導(dǎo)的CD28表達的抑制作用。所有實驗均用來自7個供體的T細胞、以每種寡核苷酸至少3行進行。在人T細胞中可證明寡核苷酸對CD28表達的調(diào)節(jié)這一事實是重要的，因為外周、表皮和真皮T-淋巴細胞將是CD28特異的寡核苷酸的靶點。CD28特異寡核苷酸對促分裂原誘導(dǎo)的T細胞增殖的抑制作用抗CD3/PMA處理的促分裂原作用通過靜息細胞激活后觀察到的增殖增加可證明。3H-胸腺嘧啶的參入以每分鐘計數(shù)表示，在激活T細胞中為301641±47856(n＝9)，在靜息T細胞中為650±566(n＝9)?？笴D3和PMA對T細胞增殖的作用是協(xié)同的，如圖4A所示。圖4B表示CD28特異的和對照硫代磷酸酯寡核苷酸對抗CD3/PMA激活的T細胞增殖作用的代表性實驗。在至少七個獨立的實驗中，在劑量范圍2-10μM所有實驗中，RT03和RT04的硫代磷酸酯(數(shù)據(jù)未示)和硫代磷酸酯-3′胺(圖4B)形式均為促分裂原誘導(dǎo)的T細胞增殖的最具活性的抑制劑，抑制T細胞增殖達45％。用對照寡核苷酸RTC01(SEQIDNO6)-RTC06(SEQIDNO10)未見相似的劑量依賴的對促分裂原誘導(dǎo)的T細胞增殖的抑制作用。在這里用CD28特異的寡核苷酸RT03和RT04處理會逆轉(zhuǎn)激活T細胞的過度增殖，因此證明調(diào)節(jié)CD28通路對T細胞激活的活性生物功能和T細胞增殖有重要作用。CD28特異寡核苷酸對激活的來自T細胞細胞因子產(chǎn)生的抑制作用激活的T細胞產(chǎn)生多種免疫調(diào)節(jié)細胞因子，包括IL-2，γ干擾素和IL-8。CD28誘導(dǎo)的對IL-2和IL-8的限制元件已被證明位于兩個基因的啟動子序列，因而顯示被CD28通路調(diào)節(jié)(Fraseretal.，(1991)Science251313-316，Seder等(1994)J.Exp179299-304)。γ干擾素也已顯示被CD28通路調(diào)節(jié)(Wechsler等，J.Immunol.，1532515-2523(1994))。AntiCD3/PMA處理靜息T細胞顯著增加T細胞來源的全部三種細胞因子的水平(圖5A，6A，7A)。圖5，6和7分別描述CD28特異和對照寡核苷酸的硫代磷酸酯(B)和硫代磷酸酯-3′胺變體對來自相同代表性供體的激活T細胞的影響。CD28特異寡核苷酸RT03(SEQIDNO3)和RT04(SEQIDNO4)而非對照寡核苷酸RT01(SEQIDNO5)-RT06(SEQIDNO10)(數(shù)據(jù)未示)以劑量依賴的方式抑制激活T細胞中促分裂原誘導(dǎo)的IL-2，γ干擾素和IL-8的產(chǎn)生。CD28特異寡核苷酸的硫代磷酸酯(IC505μM)和硫代磷酸酯-3′胺(IC5010μM)形式在2-10μM范圍內(nèi)同樣有活性。用4個或更多不同供體可見全部三種細胞因子的相似結(jié)果。這些觀察證明CD28特異寡核苷酸也能調(diào)節(jié)T細胞激活的CD28通路的多個效應(yīng)分子。寡核苷酸對CD28表達抑制作用的特異性CD28特異寡核苷酸RT03和RT04的特異性通過3種方法評價。(1)不依賴于CD28的T細胞激活標(biāo)志物第一種方法是確定CD28特異寡核苷酸是否能抑制不依賴于CD28共刺激通路而起作用的其它人T細胞激活標(biāo)志物的表達。靜息T細胞的激活顯著增加IL-2受體(CD25)和細胞內(nèi)粘附分子ICAM-1(CD54)的表達。然而，這些輔助分子不受CD28通路調(diào)節(jié)(June等，Mol.CellBiol.74472-4481(1987)，Damle等，J.Immunol.，1492541(1992))。圖8表示CD28特異的和對照寡核苷酸對促分裂原激活的T細胞中CD25(圖8A)和CD54(圖8B)表達的影響。用2-10μMCD28特異的和對照寡核苷酸處理后，激活T細胞CD25和CD54的表達均無明顯下降。這清楚地證明CD28特異寡核苷酸對抑制其靶蛋白表達的特異性。(2)CD28陰生T細胞株，HUT78第二種方法是證明CD28通路是真正的CD28特異寡核苷酸的靶點，它通過比較CD28+T細胞白血病細胞系JurkatE6-1和CD28-T細胞淋巴瘤細胞系HUT78中促分裂原誘導(dǎo)的IL-2的產(chǎn)生來證明。圖9A證實在靜息和激活HUT78細胞中均無CD28表達，而JurkatE6-1細胞激活后CD28的基本水平升高(圖9B)。在CD28+JurkatE6-1細胞中，CD28特異而對照寡核苷酸能抑制促分裂原誘導(dǎo)的CD28表達(圖9C)和IL-2的產(chǎn)生(圖10B)。相反在CD28-HUT78細胞中，促分裂原誘導(dǎo)的IL-2產(chǎn)生不受CD28特異和對照寡核苷酸的影響(圖10A)。這清楚地證明這些寡核苷酸只抑制CD28調(diào)節(jié)的IL-2產(chǎn)生的專一性。(3)CD28通路的專一激活第三種方法是抗CD28單克隆抗體與促分裂原(抗CD3/PMA)聯(lián)合使用特異地通過CD28通路激活靜息T細胞，用與僅使用促分裂原激活T細胞的采用的相同方法。前面已展示抗CD28mAb與PMA或抗CD3mAb聯(lián)合使用給靜息T細胞提供刺激信號，并僅促進CD28依賴的而非TCR依賴的T細胞增殖和細胞因子產(chǎn)生的增加(June等，(1987)Mol.CellBiol.74472-4481)。CD28特異而非對照寡核苷酸的硫代磷酸酯及硫代磷酸酯-3′胺變體能抑制依賴于CD28的IL-2，IL-8和γ干擾素產(chǎn)生的激活，以及抗CD28/促分裂原激活的靜息T細胞的T細胞增殖(數(shù)據(jù)未示)。這清楚地證明僅CD28特異寡核苷酸只作用于T細胞激活的CD28通路。VII.實施例-系列2寡核苷酸用AppliedBiosystems394DNA合成儀合成寡核苷酸。標(biāo)準(zhǔn)氧化瓶用二硫化四乙基硫羰/乙腈取代后，導(dǎo)入硫代磷酸酯鍵。寡核苷酸的純度用分析HPLC確定。所有純度＞90％的寡核苷酸被凍干并重溶于水中(400μM)。列于表3和5的每種寡聚物至少用3行。用T4多核苷酸激酶和32P-γATP得到5′標(biāo)記的寡核苷酸。T細胞激活研究從健康供體通過密度梯度離心及Lymphokwik(OneLambda)T細胞富集分離外周血單核細胞(PBMCs)。污染的單核細胞通過粘附到塑料上去除。純化的T細胞CD2+＞99％，HLA-DR+＜1％，CD25+＜5％。從ATCC得到JurkatE6-1(CD28+/CD4+)T細胞和HUT78(CD28-/CD4+)T細胞及單核細胞系THP。細胞從0.2-0.3×106/孔濃度培養(yǎng)，并用固定在板上的抗CD3單克隆抗體(mAb)(HIT3A0.25μg/ml)(Pharmingen和2ng佛波醇-12-豆蔻酰13-乙酯(PMA)(Calbiochem)激活。免疫熒光研究細胞用PE-CD28/FITC-CD4或PE-CD54/FITC-CD25mAb或PE/FITC標(biāo)記的異型配對對照(BectonDickinson)共染。細胞表面抗原密度(CD28，CD54，CD25)通過流式細胞術(shù)(FACScan，BectonDickinson)確定。存活率測來自多個供體的對照未處理和寡聚物處理的CD4+細胞對碘化丙錠的排斥確定，所有寡核苷酸每行1-10μM用溫育48h后代表性址＞90％(90-99％)。增殖和細胞因子試驗增殖反應(yīng)通過測最后16h中3H-胸腺嘧啶(1μCiICN)的參入來確定，細胞被收集到濾紙上，在WallacBetaplate計數(shù)器上液閃計數(shù)后測量DNA合成。培養(yǎng)上清液中細胞因子濃度用IL-2，IL-8(R&D系統(tǒng))和IFN-γ(Endogen)的ELISA試劑盒測試或通過用依賴于IL-2的細胞系CTLL-2(ATCC)生物測試獲得。RT-PCR和Southern分析用Trizol試劑(GIBCO/BRL)抽提總細胞RNA。用寡聚物(dT)15引物和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(H.C.)進行cDNA合成反應(yīng)(Promega)。PCR反應(yīng)(GeneAmpPCRkit，Perkin-ElmerCetus)由含3μlcDNA，dVTPs(每種200μM)，每種引物0.5μM和1單位Taq聚合酶的50μl混合物組成。使用的引物如下CD28，5′-CTGCTCTTGGCTCTCAACTT-3′(正義)和5′AAGCTATAGCAAGCCAGGAC-3′(反義)白介素-2受體p55α鏈引物(Stratagene)和pHE7核糖體基因。Kao，H.T.，Nevins，J.R.(1983)Mol.CellBiol.3，2058-2065。擴增條件在94℃45秒，57℃1分鐘，72℃2分鐘進行35個循環(huán)，外后72℃8分鐘。PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖分離，在20×SSC中轉(zhuǎn)至HybondN+膜(Amersham)過度并用0.4MNaOH固定。印跡用32P-γATP標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交。沖洗印跡再用PhosphorInager分析。MLR和同種抗原特異的T細胞試驗對于MLR反應(yīng)，PBMCs與絲裂霉素C(50μg/ml)處理的來自HLA不同的個體的PBMCs一起培養(yǎng)(1∶1)。在同種抗原特異的T細胞試驗中，從破傷風(fēng)毒素致敏的健康供體的PBMCs分離的T細胞與自身絲裂霉素C處理的PBMCs在破傷風(fēng)毒素(2μg/mlListBiologicals)存在下以1∶1比例共同培養(yǎng)。在兩個實驗中，2×105細胞/孔在進一步分析前于37℃培養(yǎng)6天。體外寡核苷酸穩(wěn)定性研究寡核苷酸時間穩(wěn)定性分析如以前所述進行(Tam，R.C.，Li，Y.，Noonberg，S.，Hwang，D.G.，Lui，G.，Hunt，C.A.，Garovoy，M.R.(1994)核酸研究.22，977-986)。通過電泳和Nickspin柱定量評價寡核苷酸降解分布型。硫代磷酸酯寡核苷酸對CD28表達的抑制作用是專一的并影響激活的T細胞功能圖11歸納了表3中硫代磷酸酯寡核苷酸對激活T細胞中輔助分子的表面表達和細胞因子分泌的影響。使用的寡聚物被設(shè)計與DC28基因的5′非翻譯區(qū)(UT)雜交，為反義(AS)或富G序列。對照寡聚物為正義鏈(SS)或互補鏈(CS)序列。用抗CD3抗體和PMA處理靜息T細胞(R)48小時增加了輔助分子CD28(A)，CD25(B)和CD54及細胞因子IL-2(D)，IFMγ(E)和IL-8(F)表達的數(shù)據(jù)以三次的樣品的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。兩次加入(0和24h)2μM()，5μM()和10μM()的表3硫代磷酸酯對激活引起的T細胞功能的累積作用通過免疫熒光分析(輔助分子)和用CTLL-2生物方法(IL-2)及ELISA(IFNγ，IL-8)測定分泌細胞分子水平來監(jiān)測。門控活CD4+細胞的表面抗原密度(MCS)與IgG1對照相比，隨平均熒光通道的增加測定。依賴于IL-2的3H-胸腺嘧啶細胞參入以每分鐘計數(shù)(CPM)測量，免疫反應(yīng)IFNγ和IL-8以pg/ml測量。所示數(shù)據(jù)均從來自一個供體的T細胞進行的實驗得來，為9個不同供體的代表性實驗。表3硫代磷酸酯寡核苷酸寡聚物序列(5′to3′)描述SEQIDNORT01STTGTGGTGACGATGGGCTAAS5′UT79-9742RT02SAGCAGCCTGAGCATCTTTGTAS5′UT94-11343RT03STTGGAGGGGGTGGTGGGGG-rich5′UT58-7544RT04SGGGTTGGAGGGGGTGGTGGGGG-rich5′UT58-7845RTC01STAGCCCATCGTCAGGACAASStoRT0146RTC02SACAAAGATGCTCAGGCTGCTSStoRT0247RTC06SAACCTCCCCCACCACCCCCStoRT0348數(shù)據(jù)證明所選的硫代磷酸酯寡聚物(表3)可特異地阻斷CD4+T細胞中激活引起的CD28表達。在一個代表性供體(圖11A)中，硫代磷酸酯寡聚物RT03S(SEQIDNO44)、和RT04S(SEQIDNO45)(IC50≤5μM)以劑量相關(guān)形式抑制激活誘導(dǎo)的CD28表達而非IL-2受體(CD25)或細胞內(nèi)粘附分子-1(ICAM-1或CD54)的表達。用反義寡聚物RT01S(SEQIDNO42)或RT02S(SEQIDNO43)或?qū)φ展丫畚颮TC01S(SEQIDNO46)，RTC02S(SEQIDNO47)和RTC06S(SEQIDNO48)未見相似的抑制作用。而且我們提供了活性寡聚物通過阻斷激活人T細胞的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)激活誘導(dǎo)的CD28的證據(jù)。在10μM，RT03S(SEQIDNO44)和RT04S(SEQIDNO45)而非代表性的對照寡聚物RTC06S(SEQIDNO48)降低激活誘導(dǎo)的CD28表達水平而非IL-2受體mRNA的表達水平(圖12)。圖12顯示硫代磷酸酯寡核苷酸在10μM對CD28和CD25mRNA水平的影響?？偟募毎鸕NART-PCR并用特異放射性標(biāo)記探針Southern分析后，檢測了不存在(泳道2)或存在寡核苷酸RT03S(SEQIDNO44)(泳道4)，RTC06S(SEQIDNO64)(泳道5)和RT03D(SEQIDNO49)(泳道6)時CD28及CD25mRNA的靜息(泳道1)和抗CD3/PMA激活(6h)的水平。CD28探針來自外顯子2(5′-ACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAA-3′)，IL-2受體的探針產(chǎn)自起始引物混合液。用產(chǎn)自pHE7有義引物的探針雜交后評價相等的上樣量。CD28缺陷的HUT(7)和THP(8)細胞株的RNA用作對照。展示的數(shù)據(jù)是3個分別實驗的代表。因此，生物活性硫代磷酸酯對CD28mRNA水平的特異抑制與其對CD28表面蛋白的作用相平行。而且，活性寡聚物取消了激活誘導(dǎo)的T細胞功能，如RT03S(SEQIDNO44)和RT04S(SEQIDNO45)而非RT01S(SEQIDNO42)或RT02S(SEQIDNO43)或?qū)φ展丫畚颮TC01S(SEQIDNO46)，RTC02S(SEQIDNO47)和RTC06S(SEQIDNO48)，明顯抑制激活T細胞中抗CD3/PMA誘導(dǎo)的細胞因子IL-2，IFNr和IL-8的合成(IC50≤5μM，范圍在2-10μM)(圖11B)。因為其它共刺激通路也能誘導(dǎo)激活T細胞中淋巴因子的合成(Damle，N.K.，Klussman，K.，Linsley，P.S.，Aruffo，A.(1992).J.Immunol，148，1985-1992)，確定RT03S(SEQIDNO44)和RT04S(SEQIDNO45)的生物活性是否對有功能的CD28表達特異是重要的。所以我們比較了硫代磷酸酯在CD28+T細胞白血病細胞系JurkatE6-1和CD28-T細胞淋巴瘤細胞系HUT78中抗CD3/PMA誘導(dǎo)的IL-2產(chǎn)生的影響。如圖13所總結(jié)的，用抗CD3抗體和PMA處理靜息細胞(R)48小時，使CD28在Jurkat(A，右)而非LUT78(A，左)細胞的表達增加。然而，激活使Jurkat(C，左)和HUT78(D，左)細胞中IL-2產(chǎn)生增加。活性寡核苷酸RT03S(SEQIDNO44)和RT04S(SEQIDNO45)在1μM(□)，2μM()，5μM()和10μM()抑制激活Jurkat細胞中CD28表達(B)和IL-2水平(C，右)，但對激活HUT78細胞(D，右)中依賴于CD28的IL-2分泌沒有影響。展示的數(shù)據(jù)為三次單獨實驗的代表。在圖13A中，免疫細胞熒光分析證實在靜息和激活HUT78細胞中無CD28表達，而JurkatE6-1細胞經(jīng)激活，CD28組成水平提高。而且，在JurkatE6-1細胞中，RT03S(SEQIDNO44)和RT04S(SEQIDNO45)(1-10μM范圍)顯著抑制激活誘導(dǎo)的CD28表達(圖13B)和IL-2產(chǎn)生(圖13C)。相反地，雖然激活的HUT78細胞產(chǎn)生相似水平的IL-2，但未觀察到類似的對淋巴因子寡聚物依賴抑制作用(圖13D)。我們還證明了特異抗CD28mAb與抗CD3聯(lián)合指向的T細胞激活(表達CD28，IL-2，IL-8和IFNγ)被生物活性硫代磷酸酯寡聚物(數(shù)據(jù)未示)阻斷。先前顯示CD28分子直接交聯(lián)只促進依賴CD28而非依賴TCR的T細胞增殖和細胞因子產(chǎn)生的增加(Jure，C，H.，Ledbetter，J.A.，Gillespie，M.M.，Lindsen，T.，Thompson，C.B.(1987)Mol.CellBiol.7，4472-4481)。總之，數(shù)據(jù)有力地提示活性寡聚物的生物活性對T細胞激活的CD28通路是特異的。硫代磷酸酯寡核苷酸在同種抗原依賴的T細胞試驗和初級同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)中T細胞增殖反應(yīng)的抑制作用我們下一步比較了CD28特異性寡核苷酸RT03S(SEQIDNO44)和RT04S(SEQIDNO45)在體外阻斷抗原特異初級免疫反應(yīng)的效能。在圖14中，CD28的靜息(A，B)和激活(E，F(xiàn))水平在破傷風(fēng)毒素特異T細胞實驗(頂系列，A和B)和混合淋巴細胞反應(yīng)(底系列，E和T)中表示。CD4+，CD28-hiT細胞的百分比在右手A、B、E和F的標(biāo)志物中顯示。寡聚物活性通過可能的兩次加入(0和96h)1μM(□)，2μM()，5μM()和10μM()表1的硫代磷酸酯寡核苷酸以減少每個實驗中CD28-hi表達T細胞(C，G)和激活T細胞增殖(D，H)的百分率來評價。T細胞激活在對破傷風(fēng)毒素的反應(yīng)(頂系列)時被誘導(dǎo)，或被絲裂霉素C處理的刺激因子PBMCs(Y)(底系列)刺激響應(yīng)T細胞(X)后誘導(dǎo)。這些數(shù)據(jù)為三次分別實驗的代表。在圖14中，用破傷風(fēng)毒素特異的T細胞實驗(圖14B)和初級混合淋巴細胞反應(yīng)(圖14F)，我們觀察了6天試驗階段后，表達激活誘導(dǎo)的CD28-hi的T細胞亞群的出現(xiàn)。加入RT03S(SEQIDNO44)和RT04S(SEQIDNO45)(2-10μM)導(dǎo)致破傷風(fēng)毒素特異的(圖14D)和響應(yīng)細胞抗原特異的(圖14H)T細胞增殖的相應(yīng)減少和CD28-hi表達(圖14C，14G)的劑量相關(guān)降低。用RT01S(SEQIDNO42)或?qū)φ展丫畚颮T01S(SEQIDNO46)，RTC02S(SEQIDNO47)或RT06S(SEQIDNO48)未觀察到相似作用。體外寡核苷酸穩(wěn)定性擴展了硫代磷酸酯寡核苷酸的生物活性已知用硫代磷酸酯核苷酸間連接的寡聚物修飾能給與核酸酶抗性并因而擴展體外生物活性從1-2小時到24小時(Stein，C.A.，Cheng，Y.C.(1993)Science261，1004-1012)。表4顯示硫代磷酸酯RT03S(SEQIDNO44)和RT06S(SEQIDNO48)對連續(xù)存在或在第2天(D)從細胞外環(huán)境除去寡核苷酸后對表面CD28表達的時間作用。用免疫熒光細胞術(shù)進行監(jiān)測。結(jié)果以激活T細胞(MCFA)和寡核苷酸處理的激活T細胞(MCFX)表面抗原表達的差異來表示。靜息T細胞在2-4天的CD28表達在119-121范圍。“NO”代表無可區(qū)分差異。表4.硫代磷酸酯在連續(xù)或不連續(xù)寡核苷酸處理后的時間活性CD28表達差異(MCFA-MCFX)RT03S(SEQIDRTC06S(SEQIDNO44)NO47)天MCFA051005102144.818.48.99.31.91.7ND3C135.621.915.95.1NDND3.23D136.818.311.87.11.73.814C128.918.29.76.1NDNDND4D130.12.3NDNDNDNDND如表4所示，RT03S(SEQIDNO44)作用的持久超過24小時，并相應(yīng)于寡聚物劑量持續(xù)2，3，4天。但在第2天從細胞外環(huán)境除去RT03S(SEQIDNO44)，抑制激活保持24小時然后在后面24小時內(nèi)完全消除。用代表性對照寡聚物RT06S(SEQIDNO48)在相同時間過程中未觀察到寡聚物活性。相似的現(xiàn)象在寡聚物介導(dǎo)的對激活T細胞增殖抑制作用中觀察到(數(shù)據(jù)未示)。僅硫代磷酸酯修飾提供的生物利用度增加不能說是RT03S(SEQIDNO44)顯著延長生物活性的原因。所以，我們證明效應(yīng)的擴展持續(xù)還與RT03S(SEQIDNO44)二級結(jié)構(gòu)提供的體外穩(wěn)定性有關(guān)。圖15總結(jié)32P標(biāo)記硫代磷酸酯RT03S(SEQIDNO44)和RT06S(SEQIDNO48)在細胞外上清液(頂系列)和Jurkat細胞裂解物(底系列)中體外穩(wěn)定性的試驗結(jié)果。(A)每種寡核苷酸隨時間(0-96h)的降解(2000cpm)通過在20％聚丙烯酰胺變性膠上電泳再用PhosphorImager觀察來評價。(B)每個時間點剩余的完整全長32P-RT03S(SEQIDNO44)(o)和32P-RT06S(SEQIDNO48)(·)相對于t＝0的百分比在10000cpm細胞外上清液和細胞裂解液通過Nickspin柱(Pharmacia)的洗脫液中測定。同時分析分子量標(biāo)準(zhǔn)(Std)，32P-NTP(N)和游離32P-正磷酸鹽(P)。在圖15A中，電泳圖清晰顯示對細胞外上清液(S)和細胞裂解物(L)，在與Jurkat細胞溫育96h后剩余的完整32P標(biāo)記RT03S(SEQIDNO44)比RT06S(SEQIDNO48)多。Nickspin柱數(shù)據(jù)與此觀察一致(圖15B)。這里，96h后完整從RT03S(SEQIDNO44)，回收的完整寡聚物比例為54％(S)和59％(L)，RT06S(SEQIDNO48)為10％(S)和34％(L)。此外，僅二級結(jié)構(gòu)不足以說明增強的核酸酶抗性和RT03S(SEQIDNO44)生物活性的持續(xù)，因為其磷酸二酯配對物RT03D在體外穩(wěn)定性研究中幾乎無生物活性(表5)，半壽期僅為24小時(數(shù)據(jù)未示)。表5負責(zé)抑制CD28表達和CD28依賴性IL-2產(chǎn)生的寡核苷酸序列的鑒定*表達的相對抑制寡聚物序列CD28IL-2SEQIDNORT03S(D)TTGGAGGGGGTGGTGGGG100(3)100(44)44(49)RT11SGGGGAGGAGGGGCTGGAA10010050RT04SGGGTTGGAGGGGGTGGTG12310045GGGRT05STTGGAGGGGGAGGAGGGG13610051RT09STTGGAGGGGGAGGTGGGG12610052RT10STTGGAGGCGGTGGTGGCG313853RT24STTGGAGCCGGTGGTGGCC405754RT25STTGGAGGGGCTCCTCGGG442555RT23STTGGAGCCGGTGGTGG385756RT18SGGGGTGGTGGGG10312057RT19SGGGGTTGGGG308958RTC07STGGGG2259RTC08SGGGG2260RT20SCACTGCGGGGAGGGCTGG587661GGRT21SATGGGGTGCACAAACTGG516362GGRT15SAACGTTGAGGGGCAT265263RT06STTCCAGCCCCTCCTCCCC292264RTC06SAACCTCCCCCACCACCCC4248在準(zhǔn)備表5中數(shù)據(jù)時，硫代磷酸酯寡核苷酸的體外活性通過其抑制抗CD3/PMA激活的外周人T細胞中CD28表達的能力和對JurkatT細胞中激活I(lǐng)L-2產(chǎn)生的作用來確定。結(jié)果相對于5μMRT03S(SEQIDNO44)的活性(100％)來表示，其抑制范圍在7次實驗中為CD28表達52-79％，IL-2產(chǎn)生為76-89％。RT03D(SEQIDNO49)的磷酸二酯形式的值在圓括號中。賦予體外生物活性的最小序列的鑒定活性硫代磷酸酯RT03S(SEQIDNO44)是一個18單體、原本設(shè)計與人CD28基因5′非翻譯區(qū)雜交，并且含兩套鄰近四G序列。為了鑒定對人T細胞中激活誘導(dǎo)CD28表達和JurkatT細胞中CD-28依賴的IL-2產(chǎn)生的抑制作用關(guān)鍵的序列相關(guān)因子，從RT03S(SEQIDNO44)選擇性添加、去掉或替換堿基，并測相對于母體寡聚物的活性(表5)。在5′端(RT04S)加入3個G或在兩個四G序列之間區(qū)域加入一個或多個變化(RT05(SEQIDNO51)，RT09S(SEQIDNO52)不減少相對于RT03S(SEQIDNO44)的抑制作用。有趣的是相對于RT03S(SEQIDNO44)有義序列(RT11S(SEQIDNO50))也不表現(xiàn)活性變化。而相反，在兩套四G中用胞嘧啶取代或去掉一個或多個G(RT10S(SEQIDNO53)，RT24S(SEQIDNO54)，RT25S(SEQIDNO55)，RT23S(SEQIDNO56)(SEQIDNO56))導(dǎo)致相對于RT03S(SEQIDNO44)的活性顯著喪失。去掉RT03S(SEQIDNO44)5′第一個四G中6個殘基對寡核苷酸的抑制活性沒有影響(RT18S(SEQIDNO57)。相反地，在兩個四G序列之間減少(RT19S(SEQIDNO58))或增加(RT20S(SEQIDNO61)，RT21S(SEQIDNO62)殘基數(shù)目則顯著降低相對于RT03S(SEQIDNO44)的抑制活性。TGGGG，GGGG或含4個連續(xù)G的序列如RT15S(SEQIDNO63)相對于RT03S(SEQIDNO44)幾乎沒有抑制活性。這些數(shù)據(jù)證明RT03S(SEQIDNO44)的生物活性依賴于含由3-5個殘基分開的2套4個相鄰G的特殊序列基元。根據(jù)通過妨礙CD28功能所給的耐受性(Boussiotis，V.A.，F(xiàn)reeman，G.J.，Gray，G.，Gribben，J.，Nadler，L.M.(1993)J.Exp.Med.178，1753-1763)，檢測寡聚物介導(dǎo)的CD28表達抑制是否能為體外誘導(dǎo)T細胞無反應(yīng)性和同種抗原特異的耐受提供更有效的戰(zhàn)略是重要的。我們指出硫代磷酸酯寡聚物RT03S(SEQIDNO44)和TR04S通過相應(yīng)寡聚物的劑量減少mRNA和成熟蛋白的水平抑制人CD4+T細胞中抗CD3/PMA誘導(dǎo)的CD28表達。而且為了證明靶特異性，我們檢測了寡聚物介導(dǎo)的對IL-2受體和ICAM-1表達的影響兩種已知的不依賴CD28通路調(diào)節(jié)的輔助分子(Damle，N.K.，等.，(1992)J.Immunol.148，1985-1992；June，C.H.，等.，(1987)Mol.CellBiol.7，4472-4481；Stein，C.A.，等.，Y.-C.(1993)Science261，1004-1012；Boussiotis，V.A.，等，(1993)J.Exp.Med.178，1753-1763)。因此，激活信息、CD25的蛋白水平和CD54的表面表達抵抗寡聚物作用。通過CD28通路的共刺激直接誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)細胞因子如IL-2，IFNγ和IL-8在激活T細胞中的表達(Fraser，J.D.，等.，(1991)Science251，313-316Jenkins，M.K.，等.，(1991)J.Immunol.147，2461-2466；Seder，R.A.，等(1994)J.Eep.；Med.179，299-304；Wechsler，A.S.，等.，(1994)J.Immunol.153，2515-2523)要成功的耐受性，活性CD28特異寡聚物必須取消這個功能。給與活性寡聚物導(dǎo)致激活誘導(dǎo)的IL-2，IFNγ和IL-8產(chǎn)生隨之調(diào)節(jié)。為了強調(diào)活性寡聚物抑制依賴CD28功能的敏銳特異性，我們指出它們不能防止在CD28缺陷細胞株HUT78中的激活誘導(dǎo)的IL-2產(chǎn)生。而且，激活T細胞中寡聚物介導(dǎo)的對IL-8產(chǎn)生的最大抑制未超過50％，提示保存一個驅(qū)動依賴于CD28的IL-8產(chǎn)生的另外調(diào)節(jié)通路。寡聚物活性不限于多克隆激活的T細胞，因為抑制激活誘導(dǎo)的CD28水平導(dǎo)致在MLR和破傷風(fēng)毒素特異T細胞試驗中T細胞增殖顯著減少。因而，我們的活性寡聚物體外介導(dǎo)同種抗原特異的耐受，并提供用于誘導(dǎo)T細胞低應(yīng)答，如CTCA4Ig，一種高等合力B7結(jié)合物所見的配基捕捉戰(zhàn)略的另一個可能選擇。(Tan，P.，Anasetti，C.，Hansen，J.A.，Melrose，J.，Brunvand，M.，Bradshaw，J.，Ledbetter，J.A.，Linsley，P.S(1993)J.Exp.Med.177，165-173.)。在測定活性藥效基團作用持續(xù)時，我們觀察到RT03S(SEQIDNO44)對激活的CD28表達和依賴CD28的T細胞增殖表現(xiàn)令人吃驚的持續(xù)抑制，甚至在寡聚物處理后96h。生物活性不與毒性相關(guān)，因為除去寡聚物在24h內(nèi)完全逆轉(zhuǎn)抑制活性。再者，比較硫代磷酸酯RT03S(SEQIDNO44)和RT06S(SEQIDNO48)，我們的體外穩(wěn)定性研究顯示在RT03S(SEQIDNO44)的富G序列介導(dǎo)的二級結(jié)構(gòu)增加主要與硫代磷酸酯相關(guān)的核酸酶抗性2-4倍(Stein，C.A.，Cheng，Y，C.(1993)Seience261，1004-1012)。32P-RT03S(SEQIDNO44)擴展的半壽期(96h)與其生物活性和持續(xù)有關(guān)。此外，RT03S(SEQIDNO44)的磷酸二酯配合物RT03D顯示體外穩(wěn)定性和生物活性均減少，與先前的報道(Maltese，J.Y.，Sharma，H.W.，Vassiler，L.，Narayanan，R.(1995)NucleicAcidsRes.23，1146-1151)觀察相一致，所以二級結(jié)構(gòu)給予的穩(wěn)定性不單對RT03S(SEQIDNO44)的生物活性增加負責(zé)。因而硫代磷酸酯修飾和二級結(jié)構(gòu)賦予的核酸酶穩(wěn)定性可能是延長RT03S(SEQIDNO44)抑制活性的原因。在依賴于雜交的反義和反基因模型(antigene)中，單個堿基對替換實際上能消除活性(Maltese，J.Y.，Sharma，H.W.，Vassiler，L.，Narayanan，R.(1995)NucleicAcidsRes.23，1146-1151)。相反地，CD28特異寡聚物的活性僅當(dāng)序列替換發(fā)生在對寡聚物功能結(jié)構(gòu)需要的兩套四G時才顯著降低。此外，二級結(jié)構(gòu)陽離子穩(wěn)定作用(100mMKCl和NaCl)存在于RT03S(SEQIDNO44)后，寡聚物熔解曲線顯示一種轉(zhuǎn)換性質(zhì)(數(shù)據(jù)未示)，提示G-四聚體的形成(Hardin，CC，Watson，T，Corregan，M.，Bailey，C.(1992)Biochemistry31，833-841)?？傊覀兊臄?shù)據(jù)提供證據(jù)，即這類CD28特異寡聚物通過不依賴于雜交的機制，序列的二級結(jié)構(gòu)起作用，可能通過G-四聚體形成定界寡聚物活性。類似地，Bennett，C.F.，Chiang，M.Y.，Wilson-Lingardo，L.，Wyatt，J.R.(1994)NucleicAcidsRes.22，3202-3209，證明他們的硫代磷酸酯寡聚物的活性基于含有兩套3個或更多相鄰G的序列中形成的G-四聚體，這提出寡聚物介導(dǎo)的人磷酸二酯酶A2的調(diào)節(jié)是通過特異的核酸-蛋白相互作用。通過一些G-四聚體結(jié)構(gòu)的特異蛋白識別已在端粒，中心粒中(Blackburn，E.H.(1990)J.Biol.Chem.265，5919-5921)，免疫球蛋白轉(zhuǎn)換區(qū)(Shimizu，A.，Honjo，T.(1984)Cell36，801-803)以及一類叫做aptamers的調(diào)節(jié)寡聚物中證明(Bock.L.C.，Griffin，L.C.，Latham，J.A.，Vermaas，E.H.，Toole，J.J.(1992)Nature355，564-566；Huizenga，D.E.，Szostak，J.W.(1995)Biochemistry34，656-665；Bergan，R.，Connell，Y.，F(xiàn)ahmy，B.，Kyle，E.，Neckers，L.(1994)NucleicAcidsRes.22，2150-2154。在我們的研究中，能從一套4個連續(xù)的G形成分子間四鏈G-四聚體結(jié)構(gòu)的寡聚物，如端粒(Smith，F(xiàn).W.，F(xiàn)eigon，J.(1992)Nature356，164-167)較弱地抑制CD28表達。其中的一個例子是RT15S(SEQIDNO63)，其富G序列先前已被他人證實抑制C-myc表達(sequence14inBurgess，T.L.，F(xiàn)isher，E.F.，Ross，S.L.，Bready，J.V.，Qian，Y.-X.，Bayewitch，L.A.，Cohen，A.M.，Herrera，C.J.，Hu，S.S.-F.，Kramer，T.B.，Lott，F(xiàn).D.，Martin，F(xiàn).H.，Pierce，G.F.，Simonet，L.，F(xiàn)arrell，C.L.(1995)Proc.Natl.Acad，Sci.USA92，4051-4055)。另一個富G結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)G-四聚體已顯示介導(dǎo)aptameric的凝血酶抑制作用(Wang，K.Y.，McCurdy，S.，Shea，R.G.，Swaminanthan，S.，Bolton，P.H.(1993)Biochemistry32，1989-1904；Macaya，R.F.，Schultze，P.，Smith，F(xiàn).W.，Roe，J.A.，F(xiàn)eigon，J.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90，3745-3749)。RT03S(SEQIDNO44)的序列分析預(yù)示殘基3-4，7-8，12-13和16-17的配對G能潛在地形成這種G-四聚體結(jié)構(gòu)。然而，去掉妨礙分子間四聚體的殘基1-6(RT18S(SEQIDNO57))對阻斷抑制CD28表達和CD28依賴的IL-2產(chǎn)生無效。這些數(shù)據(jù)提示RT03S(SEQIDNO44)的活性來自另一個G-四聚體結(jié)構(gòu)。RT03S(SEQIDNO44)確實具有一個類似于別人預(yù)測基元的12單體序列(Smith，F(xiàn).W.，F(xiàn)eigon，J.(1993)Biochemistry32，8682-8692)，對二聚G-四聚體的形成是必需的。二聚G-四聚體可來自DNA雙鏈?zhǔn)交蚱叫屑胺雌叫墟?。這兒相鄰鏈有助于四個G形成四個堆積G-四聚體。由具有4個堿基分開兩套相鄰四個G的12個殘基組成的每條鏈為一基元，與形成和穩(wěn)定性有關(guān)。我們已顯示核心12單元序列(RT18S(SEQIDNO57))具有與RT03S(SEQIDNO44)相似的活性。兩個四G區(qū)域中G→C的替換(RT10S(SEQIDNO53)，RT23S(SEQIDNO56)，RT24S(SEQIDNO54)，RT25S(SEQIDNO55))也導(dǎo)致相對RT03S(SEQIDNO44)抑制活性喪失56-69％，相似地，將幾套G分開的堿基插入(RT20S(SEQIDNO61)，RT21S(SEQIDNO62))或消除(RT19S(SEQIDNO58)減少相對生物活性52-70％。總之，這些數(shù)據(jù)提示只有形成二聚G-四聚體能力的特殊序列基元對硫代磷酸酯寡聚物介導(dǎo)的抑制功能CD28表達是重要的。這類二聚G-四聚體發(fā)揮其生物效應(yīng)的機理還不知道。但是，幾個證據(jù)線索證實這個基元能使我們的活性寡聚物作為誘餌起作用的假設(shè)，大概通過競爭阻止二聚G-四聚體啟動子序列與特異轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。1)相應(yīng)于CD28基因上游區(qū)的寡聚物(RT11S(SEQIDNO50)表現(xiàn)與RT03S(SEQIDNO44)相同的生物學(xué)活性。2)我們的活性寡聚物通過非反義機制起作用。3)這些寡聚物調(diào)節(jié)CD28mRNA表達；從而其生物活性與直接靶蛋白相互作用無關(guān)。4)類G啟動子區(qū)域普遍增加G-四聚體形成的啟動子序列的可能性是一種普遍調(diào)節(jié)現(xiàn)象(Evans，T.，Schon，E.，Grazyna，G.M.，Patterson，J.，Efstratiadis，A.(1984)核酸研究，12，8043-805；Kilpatrick，M.W.，Torri，A.，Kang，D.S.，Engler，J.A.，Wells，R.D.(1986)生物化學(xué)雜志，261，11350-11354；Clark，S.P.，Lewis，C.D.，F(xiàn)elsenfeld，G.，(1990)核酸研究，18，5119-5126.)。5)雙鏈寡聚物可作為轉(zhuǎn)錄因子E2F的誘餌(Morishita，R.，Gibbons，G.H.，Horuchi，M.，Ellison，K.E.，Nakajima，M.，Zhang，L.，Kaneda，Y.，Ogihara，T.，Dzau，V.J.(1995)Proc，Natl.Acad.Sci.USA92，5855-5859)。6)類G寡聚物已顯示介導(dǎo)Spl轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)(Perez，J.R.，Li，Y.，Stein，C.A.，Majumder，S.，vanOorschot，A.，Narayanan，R.(1994)美國國家科學(xué)院院報91，5957-5961)。參考文獻收編所有專利、專利申請書和引用的文章在此收錄作為參考。等價物前面所寫說明書被認為對使本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明是足夠的。事實上，為完成本發(fā)明對上述內(nèi)容的各種修改對有機化學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的，也將在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.能減少T細胞中CD28基因表達的寡聚物。2.權(quán)利要求1的寡聚物，其中所說的寡聚物能與CD28基因轉(zhuǎn)錄本雜交。3.權(quán)利要求2的寡聚物，其中所說的寡聚物與CD28的起始密碼子雜交。4.權(quán)利要求1的寡聚物，其中所說的寡聚物能與CD28基因雜交。5.權(quán)利要求4的寡聚物，其中所說的寡聚物與CD28起始密碼子的轉(zhuǎn)錄本雜交。5.權(quán)利要求1的寡聚物，其中該寡聚物包含至少11個核酸堿基和和少于50個核酸堿基。6.權(quán)利要求1的寡聚物，其中所說寡聚物為DNA或RNA分子。7.權(quán)利要求1的寡聚物，它具有少于22個堿基并包括序列5′TTGTCCTGACGATGGGCTA3′(SEQIDNO1)。8.權(quán)利要求1的寡聚物，它具有少于22個堿基并包括序列5′AGCAGCCTGAGCATCTTTGT3′(SEQIDNO2)。9.權(quán)利要求1的寡聚物，它具有少于22個堿基并包括序列5′TTGGAGGGGGTGGTGGGG3′(SEQIDNO3)。10.權(quán)利要求1的寡聚物，它具有少于22個堿基并包括序列5′GGGTTGGAGGGGGTGGTGGGG3′(SEQIDNO4)。11.權(quán)利要求1的寡聚物，它具有包含被3-5個堿基分開的至少兩個GGGG序列、有11-50個堿基的硫代磷酸酯骨架。12.治療至少部分由CD28介導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包含步驟向病人施用有效量的權(quán)利要求1寡聚物。13.治療至少部分由CD28介導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包含步驟向病人施用有效量的寡聚物，該寡聚物包含由3-5個堿基分開的至少兩個GGGG序列并有11-50個堿基。14.權(quán)利要求13的方法，其中該寡聚物包含序列5′TTGGAGGGGGTGGTGGGG3′(SEQIDNO3)。15.權(quán)利要求13的方法，其中該寡聚物包含序列5′GGGTTGGAGGGGGTGGTGGGG3′(SEQIDNO4)。16.權(quán)利要求12-15的方法，其中所說的給藥步驟進一步包含下列步驟從病人取出表達CD28細胞；將所說寡聚物導(dǎo)入所述細胞從而制得寡聚物轉(zhuǎn)化的細胞，并將所說寡聚物轉(zhuǎn)化的細胞給予病人。17.權(quán)利要求12-15的方法，其中所說的給藥步驟還包含下列步驟從供者取出表達CD28細胞；將所說寡聚物導(dǎo)入所述細胞從而制得寡聚物轉(zhuǎn)化的細胞，并將所說寡聚物轉(zhuǎn)化的細胞導(dǎo)入病人。16.權(quán)利要求12-15的方法，其中所說寡聚物由表達載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。17.一組重組表達載體，所述載體以可操作組合包含啟動子和編碼能抑制CD28在T細胞中可誘導(dǎo)性表達的寡聚物的多核苷酸序列。17.包含權(quán)利要求1寡聚物的藥物制劑。18.權(quán)利要求17的藥物，其中該寡聚物11-50個堿基長并包含由3-5個堿基分開的至少兩個GGGG序列。19.權(quán)利要求17的藥物，其中該寡聚物長18-25個堿基并包含5′TTGGAGGGGGTGGTGGGG3′(SEQIDNO3)序列。20.權(quán)利要求17的藥物，其中該寡聚物長18-50個堿基并包含5′GGGTTGGAGGGGGTGGTGGGG3′(SEQIDNO4)序列。21.包含權(quán)利要求17-20至少兩種不同寡聚物的藥物制劑。22.權(quán)利要求17-21的藥物制劑，其中所說的制劑適于胃腸外給藥。全文摘要提供了能夠在T細胞中降低CD28基因的寡聚物。除特異性序列之外,本發(fā)明還包括一組寡聚物,其含有被3至5個堿基分開的至少兩個GGGG序列。靶點包括CD28基因,5′非翻譯區(qū)和起始密碼子,及其各自的轉(zhuǎn)錄本。方法包括使用寡聚物以減低免疫系統(tǒng)在免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的疾病中的致病作用,包括移植物抗宿主病,膿毒性休克綜合征,病毒病,牛皮癬,Ⅰ型糖尿病(胰島素依賴的),甲狀腺炎,肉樣瘤病,自身免疫性葡萄膜炎,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,全身性紅斑狼瘡和炎性腸疾病。文檔編號A61P37/02GK1181021SQ96193197公開日1998年5月6日申請日期1996年2月5日優(yōu)先權(quán)日1995年2月9日發(fā)明者R·C·塔姆申請人:Icn藥品公司