專利名稱：一種蛇毒浮腫因子抑制蛋白的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種蛇毒浮腫因子抑制蛋白的制備及其應(yīng)用,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛇屬于低等動物，全世界大約有13科、400屬、2700多種，其中四分之一 是毒蛇。我國大約有8科、53屬、173種。代表了各式各樣的生存環(huán)境下基因 以及功能蛋白質(zhì)所對應(yīng)的變化，是最直接最真實(shí)的生物進(jìn)化材料。
蛇的全身都是寶，在我國有著悠久的藥用歷史?！侗静菥V目》中收載蛇 蛻、蛇皮、蛇肉、蛇血、蛇內(nèi)臟、蛇毒、蛇膽、蛇舌、蛇卵、蛇油等均可入藥， 尤其是蛇毒。蛇毒是毒蛇特化的口腔腺——毒腺的分泌物，平時(shí)貯于毒腺囊中， 咬物時(shí)經(jīng)顳肌收縮壓擠，毒液即沿毒腺導(dǎo)管從毒牙排出。新鮮毒液為粘稠狀的 液體，化學(xué)成分復(fù)雜，不同種類的成分也不同，除含65_82%的水分外，主要 是蛋白酶和活性多肽，能引起中毒或死亡。通常以復(fù)合毒成分的方式存在，主 要有神經(jīng)毒素、肌肉壞死因子、浮腫因子、溶血因子、出血因子等。
全世界每年發(fā)生被毒蛇咬傷的事故上萬人次，遭成傷殘甚至死亡的人數(shù)逐 年增加，給人類的生命和財(cái)產(chǎn)造成巨大的損失。由于蛇毒成分復(fù)雜，其生物學(xué)、 基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及蛇毒化學(xué)生物學(xué)等基礎(chǔ)研究在國內(nèi)外開展的還不深 入，找到蛇毒的有效抑制劑，用于毒蛇咬傷的治療藥物的種類和數(shù)量就非常有限。
大連蛇島蝮蛇(G7o;^'附W^/aom^)是我國特產(chǎn)的一種毒蛇。蝮蛇咬蝮蛇 并不致其死亡，說明蝮蛇體內(nèi)存在具有中和蛇毒成分的抑制因子。對蛇毒中的 神經(jīng)毒素、肌肉壞死因子、浮腫因子、溶血因子、出血因子等的分離、純化研 究的較多，但對蛇毒抑制蛋白的開發(fā)，目前還僅僅停留在對蛇毒混合物進(jìn)行中 和抑制的混合抑制蛋白資源產(chǎn)品的加工上，而對蛇毒成分中的單一成分進(jìn)行特 異性的抑制，研究的還非常少。此外，目前的蛇毒抑制劑大多是從動物(如馬) 體內(nèi)獲得，這就需要飼養(yǎng)大量的動物才能實(shí)現(xiàn)，而體外獲得蛇毒抑制蛋白的方 法和手段還不多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種蛇毒浮腫因子抑制蛋白的制備及制備 的蛋白的應(yīng)用，采用生物技術(shù)，分離、純化出一種對蛇毒中浮腫因子具有抑制 作用的單一成分蛋白并提供能在體外生產(chǎn)和獲得對蛇毒浮腫因子具有抑制作用 蛋白的方法，可用于被毒蛇咬傷及其它疾病的治療中。
本發(fā)明的技術(shù)方案-
是從大連蛇島蝮蛇血清離心，分離獲得血漿和凝固成分。將粗血清進(jìn)行50 %的硫酸胺沉淀，沉淀得到的蛋白質(zhì)經(jīng)過2次Sephadex G-200的凝膠過濾，獲 得能抑制蛇毒中浮腫因子的蛋白成分，再經(jīng)離子交換柱、親和層析柱、反相 RP-HPLC后，獲得單一成分蛋白，該蛋白分子量為25 kDa，利用氨基酸測序儀 測定，鑒定出蛋白N末端70 AA和C末端20 AA。根據(jù)N末端和C末端氨基酸 序列，設(shè)計(jì)PCR引物；從大連蛇島蝮蛇肝臟cDNA文庫中，獲得該浮腫因子抑制 蛋白所對應(yīng)的基因序列為516bp，將獲得的線性PCR產(chǎn)物構(gòu)建到表達(dá)載體TOPO上，可實(shí)現(xiàn)在體外表達(dá)生產(chǎn)對蛇毒中浮腫因子具有抑制作用的蛋白的目的，用 于臨床對浮腫現(xiàn)象及其他疾病的治療。
本發(fā)明的效果和益處是大連蛇島蝮蛇資源有限，已成為瀕危物種受到國 家保護(hù)，而人工養(yǎng)殖因其成活率低，嚴(yán)重影響了蛇毒抑制蛋白的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。 目前的蛇毒抑制蛋白大多是從動物(如馬等)體內(nèi)獲得，這就需要飼養(yǎng)和屠殺 大量的動物才能實(shí)現(xiàn)，而體外獲得蛇毒抑制劑的方法可以保護(hù)野生動物免受傷 害。
本發(fā)明工藝簡單、安全，蛋白易于純化，避免了動物帶給人的傷害。從表達(dá) 載體獲得的對蛇毒中浮腫因子具有抑制作用的蛋白，與從動物(如馬等)體內(nèi) 獲得的蛇毒抑制蛋白相比成本低廉。并且提供了一種針對蛇毒中浮腫因子具有 抑制作用的單一蛋白成分的生產(chǎn)方法，避免了以往的混合抑制蛋白對毒蛇中復(fù) 合蛇毒作用的盲目性和弓I起副作用的不安全性。


圖l是浮腫因子抑制蛋白的分離、純化過程的流程圖。
圖2是大連蛇島蝮蛇血清的50%硫酸胺沉淀蛋白進(jìn)行二次Sephadex G-200
凝膠過濾圖。
圖中A是第一次凝膠過濾圖，加樣量500mg，獲得的對浮腫因子具有抑制 作用的洗脫組份。圖中B是第一次凝膠過濾獲得的對浮腫因子具有抑制作用的 洗脫組份再進(jìn)行第二次凝膠過濾圖，加樣量250 mg，同樣分取對浮腫因子具有 抑制作用的洗脫組份。
圖3是將圖.2B獲得的對浮腫因子具有抑制作用的洗脫組份再進(jìn)行離子交 換層析(DEAE-Toyopearl650M)的圖，分取對浮腫因子具有抑制作用的洗脫組份。
圖4是將浮腫因子固定化的親和層析圖。將圖.3獲得的對浮腫因子具有抑 制作用的洗脫組份流過浮腫因子固定化的親和層析柱，利用蛋白一蛋白間的相 互作用，獲得高純度的浮腫因子抑制蛋白。
圖5是圖4親和層析獲得的高純度蛋白再經(jīng)反相高壓液相色譜(RP-HPLC) 獲得純浮腫因子抑制蛋白的圖。
圖6是圖5獲得的純浮腫因子抑制蛋白用12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳 分離(SDS-PAGE)的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
將大連蛇島蝮蛇斷頭后取血(10 15ml/條)，在4。C下靜置一晚。以下結(jié) 合技術(shù)方案和附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。
1. 蛋白抑制蛇毒浮腫因子的活性測定法 蛇毒浮腫因子為一種磷脂酶A2 (PLA2)，它對卵磷脂能水解而產(chǎn)生游離的
脂肪酸，浮腫因子抑制蛋白能中和它的作用。根據(jù)這一特性，用來測定浮腫因 子抑制蛋白的活性(參考Takahashi and Osaka, egg yolk lipoprotein assay, 1970)。
2. 蛇毒抑制蛋白的分離、純化
對蛇毒中浮腫因子具有抑制作用的蛋白的分離、純化過程的流程，如圖.l所示。
2.1蛇毒抑制蛋白的Sephadex G-200凝膠過濾
將大連蛇島蝮蛇的血清離心，分離獲得血漿和凝固成分。將粗血清進(jìn)行50 %的硫酸胺沉淀，沉淀得到的蛋白質(zhì)經(jīng)過2次Sephadex G-200過濾，采用分離 柱3xl55cm;緩沖液0.1 M Tris陽HCl(pH 7.5)、 2mMEDTA、 0.05MNaCl;流速l.Oml/min;每管分取3ml，獲得對蛇毒浮腫因子具有抑制作用的蛋白。 結(jié)果如圖.2所示。
2.2蛇毒抑制蛋白的陰離子交換層析(DEAE-Toy叩earl 650M)
將第二次Sephadex G"200凝膠過濾分離獲得的對浮腫因子具有抑制作用的 蛋白再進(jìn)行陰離子交換層析DEAE-Toyopearl 650M。采用分離柱1.7x 15 cm; 緩沖液0.05 MTris-HCl(pH7.5);流速l.Oml/min;每管分取5 ml，獲得對 蛇毒中浮腫因子具有抑制作用的蛋白。結(jié)果如圖.3所示。 2.3親和層析
將陰離子交換層析DEAE-Toyopearl 650M獲得的對蛇毒中浮腫因子具有抑 制作用的蛋白，再利用浮腫因子固定化的Sepharose 4B (Phramacia)柱子進(jìn)行親和 層析，獲得能中和蛇毒浮腫因子的蛋白成分。采用分離柱1X15 Cm;緩沖液:
0.05 MTris-HCl(pH7.5);流速l.Oml/min;每管分取5ml。結(jié)果如圖.4所示。
2.4反相RP-HPLC色譜
親和層析獲得的能中和蛇毒浮腫因子的蛋白成分再經(jīng)反相RP-HPLC，獲得 單一成分。采用分離柱Wakosil 5C18-200， 0.46 x 15 cm;緩沖液0.06 % TFA(A)， 80 % CH3CN/20 % A(B);溶出梯度B 0 - 65 % (130 min)。結(jié)果如圖.5所示。
2.5 SDS-PAGE
經(jīng)反相高壓液相色譜(RP-HPLC)獲得純浮腫因子抑制蛋白,經(jīng)SDS-PAGE 分離證明，該蛋白的分子量為25kDa。
2.6氨基酸測序
反相RP-HPLC精制后的蛋白質(zhì)，使用儀器120A pheny-thiohydration (PTH)，
進(jìn)行氨基酸測序，測定出該蛋白的N末端70個(gè)殘基和C末端20個(gè)殘基的氨基酸序列。結(jié)果如下
N末端序列ETCNGTMMTC KDNEDTCVTF KTELIRAPLS FTFISKMCST SDTCHLDYVE TNLPHELAVR SKRACCVGDE
C末端序列PIAEWELDVK CTTAFPQASQ
3.蛇毒抑制劑基因表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)
3.1大連蛇島蝮蛇cDNA文庫的構(gòu)建取大連蛇島蝮蛇的肝臟組織0.5g，加液 氮研磨，加入提取緩沖液2ml，用試劑盒RNA-PCRkit(AMV)Ver.2.1 (TaKaRa) 提取總RNA。然后以總RNA為模板，引物為oligo(dT)20，反轉(zhuǎn)錄獲得單鏈的 cDNA文庫。
3.2PCR引物的合成根據(jù)N末端和C末端氨基酸測序的結(jié)果，人工合成引 物正向引物(S) : 5'-GARAGNTGYAAYGGNACNATGATG-3， 反向引物(A) : 5'-NCARTGYTTRGAYGCNTGYGGYTT-3，
3.3蛇毒浮腫抑制因子基因的克隆以大連蛇島蝮蛇的cDNA為模板，以S、 A為引物進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)為94 。C預(yù)變性lmin后，94。C變性20s， 50。C退 火延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，然后72 'C延伸1 min。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)瓊 脂糖凝膠電泳法回收純化后，在T4DNA連接酶作用下，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)低熔 點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法回收純化后，在T4 DNA連接酶作用下，用試劑盒TOPO TA cloning Kit (Invitrogen, Carisland， USA)將PCR產(chǎn)物亞克隆到TOPO載體連接得 到質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DHsa。提取DNA進(jìn)行酶切鑒定和序列分析，得到516bp 的基因序列，其下方為對應(yīng)的氨基酸序列。通過比較發(fā)現(xiàn)，該浮腫因子抑制蛋白和中國白媚蝮蛇(Chinese mamushi， G/cycZ/ws Wom/ q^z'Wm力'cw)血清中的 蛇毒抑制蛋白有高度同源性，同源率為92%，因此是一種新的浮腫因子抑制蛋 白。序列表
<110>大連理工大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)院 <120> —種蛇毒浮腫因子抑制蛋白的制備及其應(yīng)用 <130> —種蛇毒浮腫因子抑制蛋白的制備及其應(yīng)用 <160> 2
<170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 516 <212> DNA
<213> Gloydius shedaoensis SEQIDNO: 1
gagaLcttgcsatggtsctstgsLtgscctgtasagstsatgssgat (45) acttgcgtgacgttta站actgsiactgat站gagctcctctgtcc (90) ttcactttcatttcaaaaatgtgcagcacgtctgacacctgccat(135) cttgactacgtggagacaaatctaccacatgaactggcagtgagg(180) tccaaaagagcgtgctgtgttggggatgaatgtaaaactatgccg(225) cctgttgtgcttgaacatcacgacaatcgttacaatggactccat(270) tgtcctggatgcattggactcgcctcaactgaatgcaatgaaaaa(315) ctggtttcctgccgggatactgaaaaccagtgtttgtctctaact(360) gggaagaacctagatttcttggtcgatgatataactatgaaagga(405) tgcgctactgagagtttgtgcactttacttcagaagaagatcttc(450) tcacctatagcggaatgggaactagatgtcaaatgtactacagct(495) ttcccacaggcttcccagtga(516)
SEQIDNO: 2
ETCNGTMMTCKDNEDTCVTFKTELIRAPLSFTFISKMCSTSDTCHLDYVETNLPHELAVRSKRACCVGD ECKTMPPWLEHHDNRYNGLHCPGCIGLASTECNEKLVSCRDTENQCLSLTGKNLDFLVDDITMKGCA TESLCTLLQKKIFSPIAEWELDVKCTTAFPQASQ
權(quán)利要求
1、一種蛇毒浮腫因子抑制蛋白的制備，其特征在于從大連蛇島蝮蛇血清離心，分離獲得血漿和凝固成分；將粗血清進(jìn)行50％的硫酸胺沉淀，沉淀得到的蛋白質(zhì)經(jīng)過2次Sephadex G-200的凝膠過濾，再經(jīng)離子交換柱、親和層析柱、反相RP-HPLC后，獲得單一成分蛋白，該蛋白分子量為25kDa。
2、 權(quán)利要求1所述制備蛋白的應(yīng)用，其特征在于利用氨基酸測序儀測定， 鑒定出該蛋白N末端70 AA和C末端20 AA;根據(jù)N末端和C末端氨基酸序列， 設(shè)計(jì)PCR引物，從大連蛇島蝮蛇肝臟cDNA文庫中，獲得該浮腫因子抑制蛋白所 對應(yīng)的基因序列為685bp，將獲得的線性PCR產(chǎn)物構(gòu)建到表達(dá)載體TOPO上， 實(shí)現(xiàn)在體外表達(dá)生產(chǎn)對蛇毒中浮腫因子具有抑制作用的蛋白的目的，用于臨床 對浮腫現(xiàn)象及其他疾病的治療。
全文摘要
一種蛇毒浮腫因子抑制蛋白的制備及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。涉及到從大連蛇島蝮蛇(Gloydius shedaoensis)的血清中分離、純化出一種對蛇毒中浮腫因子具有抑制作用的蛋白。其特征在于分離、純化這種抑制蛋白所采用的方法，將蝮蛇粗血清進(jìn)行硫酸胺沉淀、經(jīng)2次凝膠過濾、陰離子交換柱、親和層析柱、反相HPLC后獲得單一成分，分子量為25kDa，鑒定該蛋白N端70個(gè)和C端20個(gè)氨基酸序列。其特征還在于獲得蛇毒浮腫因子抑制蛋白對應(yīng)的基因序列，將基因序列構(gòu)建到TOPO表達(dá)載體上，用于體外生產(chǎn)表達(dá)該蛋白。本發(fā)明的效果和益處是提供了一種體外生產(chǎn)蛇毒浮腫因子抑制蛋白的制備方法，并可應(yīng)用于被毒蛇咬傷和其它疾病的臨床治療中。
文檔編號C12P21/02GK101607991SQ20091001262
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者伍會健, 李淑晶, 楊春華, 邢欣榮 申請人:大連理工大學(xué)