一種優(yōu)化的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因oh-tci及其表達(dá)方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI及其表達(dá)載體和應(yīng)用，合成優(yōu)化的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18-T-OH-TCI和pET43.1-OH-TCI，并轉(zhuǎn)到大腸桿菌中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組大腸桿菌分泌表達(dá)了融合蛋白NusA-OH-TCI，經(jīng)thrombin酶切后，獲得具有明顯抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活性的重組rOH-TCI，本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以獲得高表達(dá)量、高活性的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI，克服了以其他方式獲取OH-TCI的成本高、表達(dá)量低的缺點(diǎn)。在醫(yī)藥、化工等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用前景。
【專利說明】—種優(yōu)化的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI及其表達(dá)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種優(yōu)化的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI及其表達(dá)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前從國產(chǎn)眼鏡蛇科眼鏡王蛇中首次分離得到了蛇毒Kunitz-型蛋白酶抑制劑0H-TCI，是目前自然界發(fā)現(xiàn)的唯一同時(shí)具有胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制活性且對二者抑制活性基本相同的Kunitz-家族成員。OH-TCI與抑肽酶Aprotinin同屬Knitz-型蛋白酶抑制劑，二者的成熟肽均由58個(gè)氨基酸殘基組成。但二者胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性有明顯的差異。抑肽酶(Aprotinin)是一種廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有抑制纖溶酶、激肽釋放酶和保護(hù)血小板的作用。在臨床上，主要用于治療急性胰腺炎和減少術(shù)中的出血量。
[0003]OH-TCI是從眼睛王蛇蛇毒少量提取獲得。由于其來源困難，不能進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，采取DNA重組技術(shù)生產(chǎn)蛋白酶抑制劑OH-TCI是解決其供需矛盾的有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI所存在的外源 蛋白的表達(dá)在細(xì)胞周質(zhì)空間、翻譯后加工不理想、產(chǎn)量低的不足，提供了一種優(yōu)化的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI及其表達(dá)方法和應(yīng)用。本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以獲得高表達(dá)量、高活性的rOH-TCI，不受原材料來源的限制，克服了以其他方式獲取OH-TCI的成本高、表達(dá)量低和活性低的缺點(diǎn)。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0006]本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因0H-TCI，其具有序列表SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
[0007]克隆所述基因的特異性引物為:
[0008]引物F1: 5，-ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3 ’ ；
[0009]引物Rl: 5，-ACGCGGCCGCTTAACCACCACCACCACCAA-3，。
[0010]在所述OH-TCI基因的5’端加有SmaI酶切位點(diǎn)，3’端加有HandIII酶切位點(diǎn)。
[0011]本發(fā)明還提供了所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI編碼產(chǎn)生的蛋白酶抑制劑OH-TCI，其具有序列表SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0012]含有所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI的重組載體，所述重組載體為PUC18-0H-TCI 和 pET43.1-OH-TC10
[0013]本發(fā)明還提供了所述眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI在在制備治療急性胰腺炎和減少術(shù)中的出血量的藥物或保健品中的應(yīng)用。所述眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI具有對胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性。
[0014]本發(fā)明選擇眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因0H-TCI，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性對基因序列進(jìn)行優(yōu)化，并人工合成優(yōu)化后的OH-TCI基因，將其與PUC18-T載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中獲得重組質(zhì)粒PUC18-0H-TCI，以重組質(zhì)粒pUC18-0H-TCI為模板，用F1、Rl引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段0H-TCI。將合成的優(yōu)化后的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI與載體pET43.1a連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET43.1-0H-TCI。將重組質(zhì)粒PET43.1-0H-TCI經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21中，在含抗生素Ampicillin篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子，將陽性轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基中，將菌株按2%接種量接入LB培養(yǎng)基中，于37°C,210r/min搖床培養(yǎng)至0D600值達(dá)到0.5-0.6時(shí)，加IPTG，28°C溫度下誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件的探索，以確定表達(dá)的最佳條件。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集菌體細(xì)胞。超聲破碎，離心。菌體裂解物上清進(jìn)行SDS-PAGE，得到與預(yù)期一致大小約為73kD的目的條帶。N1-NTA親和層析純化融合蛋白NusA-OH-TCI ;融合蛋白NusA-OH-TCI連接處設(shè)計(jì)有thrombin的酶切位點(diǎn),用thrombin酶切融合蛋白，通過HPLC方法制備重組rOH_TCI。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法測定重組rOH-TCI的分子量。由于thiOmbin酶切，在重組rOH-TCI的N端殘留兩個(gè)氨基酸Gly-Ser，結(jié)果表明，重組蛋白rOH_TCI蛋白分子量與理論基本一致(6490.40Da)。重組rOH-TCI對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶具有明顯抑制活性。 [0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:本發(fā)明利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來作為生產(chǎn)眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI的表達(dá)系統(tǒng)，它具有生產(chǎn)成本低、操作簡單、生長迅速、表達(dá)效率高和良好的發(fā)酵性能等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明優(yōu)化后的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI的基因經(jīng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白酶抑制劑OH-TCI具有高活性、高表達(dá)量的優(yōu)點(diǎn)。
[0016]結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清
λ.Μ
/E.ο
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是原始OH-TCI序列與本發(fā)明優(yōu)化后OH-TCI基因序列對比圖譜。
[0018]圖2是本發(fā)明中重組表達(dá)質(zhì)粒pET43.1-0H-TCI示意圖譜。
[0019]圖3是本發(fā)明中重組表達(dá)質(zhì)粒pET43.1-0H-TCI的測序圖譜。
[0020]圖4 是本發(fā)明中 pET43.1-0H-TCI 蛋白表達(dá)的 SDS-PAGE 圖譜，1、ρΕΤ43.1-0H-TCI/BL21 誘導(dǎo)前；2、pET43.1-0H-TCI/BL21 誘導(dǎo)后；3、pET43.1-0H-TCI/BL21 誘導(dǎo)后菌體超聲離心上清；4、pET43.1-0H-TCI/BL21誘導(dǎo)后菌體超聲離心沉淀；5、N1-NTA樹脂純化NusA-OH-TCI融合蛋白；M、MAKER蛋白分子量。
[0021]圖5是本發(fā)明中重組蛋白rOH-TCI (rOT)的HPLC純化圖譜。
[0022]圖6是本發(fā)明中rOH-TCI質(zhì)譜分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0024]實(shí)施例1
[0025]一、OH-TCI基因的選擇、優(yōu)化和合成
[0026]1、OH-TCI基因的選擇[0027]眼鏡王蛇毒中分離新型蛋白酶抑制劑OH-TCI，屬于Kunitz-家族，成熟分子由58個(gè)氨基酸組成，它是目前已報(bào)道唯一對胰蛋白酶和糜蛋白酶同時(shí)具有優(yōu)良抑制活性的蛋白分子。
[0028]2、OH-TCI基因序列的優(yōu)化
[0029]外源基因的內(nèi)在特性如密碼子偏好性是影響外源蛋白有效表達(dá)的重要因素。本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，將OH-TCI基因的大腸桿菌低頻密碼子優(yōu)化成高頻密碼子，以提高目的蛋白的翻譯速度和表達(dá)量。OH-TCI基因的核苷酸序列與Genbank中OH-TCI基因序列對比如附圖1所示。
[0030]在圖1中，圖譜上面一條序列是Genbank中OH-TCI基因序列(NCBI序列號:EU246692.1)，下面一條是優(yōu)化后的OH-TCI基因序列，兩者對比后的橫線部分為相同堿基，標(biāo)示部分為差異堿基。
[0031]圖1表明，與Genbank中OH-TCI序列相比，優(yōu)化后的OH-TCI有38個(gè)堿基發(fā)生了置換。
[0032]通過專業(yè)軟件分析，所述OH-TCI基因的5’端加有SmaI酶切位點(diǎn)(CCCGGG)，3’端加有HandIII酶切位點(diǎn)(AAGCTT)。酶切位點(diǎn)如SEQ ID No:1所示的核苷酸中的下劃線所
【權(quán)利要求】
1.一種優(yōu)化的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因d/TJ，其具有序列表SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI，其特征在于克隆所述基因的特異性引物為: 引物 Fl:5’ -ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’ ；
引物 Rl:5’ -ACGCGGCCGCTTAACCACCACCACCACCAA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI，其特征在于在所述OH-TCI基因的5 ’端加有I酶切位點(diǎn)，3 ’端加有Heindl 11酶切位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求1所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因d/TJ編碼產(chǎn)生的蛋白酶抑制劑OH-TCI，其具有序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
5.含有權(quán)利要求1所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因OH-TCI的重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為PUC18-0H-TCI和pET43.1-0H-TCI。
7.權(quán)利要求4所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI的表達(dá)方法，其特征在于它包括以下步驟:將所述的基因與pUClS-T載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中獲得重組質(zhì)粒PUC18-0H-TCI,以pUC18-0H-TCI為模板，用F1、Rl引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段OH-TCI，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET43.1-0H-TCI并將其轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21中，篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子，將陽性轉(zhuǎn)化子接種于液體培養(yǎng)基中，將菌株按2%接種量接入LB培養(yǎng)基中，于37°C，210r/min搖床培養(yǎng)至0D_值達(dá)到0.5-0.6時(shí)，加IPTG，28°C溫度下誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集菌體細(xì)胞，純化融合蛋白NusA-OH-TCl，用thrombin酶切融合蛋白得到重組蛋白酶抑制劑rOH-TCl。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI在制備治療急性胰腺炎和減少術(shù)中的出血量的藥物或保健品中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI在制備治療急性胰腺炎和減少術(shù)中的出血量的藥物或保健品中的應(yīng)用，其特征在于所述眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑OH-TCI具有對胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性。
【文檔編號】A61P1/18GK103740730SQ201410001201
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】孫同毅 申請人:濰坊醫(yī)學(xué)院