專利名稱：中華眼鏡蛇神經(jīng)生長(zhǎng)因子cDNA、克隆和表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組中華眼鏡蛇(Chinesecobra[Naja naja atra])神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)的cDNA和克隆，神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)和利用其表達(dá)載體制備神經(jīng)生長(zhǎng)因子的方法和所述蛋白質(zhì)的藥學(xué)用途。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性蛋白之一。它主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)，如交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和前腦膽堿能神經(jīng)元，NGF參與調(diào)節(jié)它們的發(fā)育和分化，維持它們的正常功能，促進(jìn)它們的損傷后的修復(fù)。目前NGF在促進(jìn)神經(jīng)損傷后的修復(fù)以及治療早老性癡呆等一些神經(jīng)元變性疾病已顯示出重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前已從多種生物材料分離純化出NGF，但含量最豐富的仍是多種蛇毒和雄性小鼠頜下腺中。
糖尿病是由于胰島β細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)的胰島素分泌不足所引起的疾病。目前，治療糖尿病多采用注射胰島素或口服降血糖的其他藥物等方法，以及配合飲食療法等手段。一旦患有糖尿病，病人只得終生服藥。雖然基因工程的方法或細(xì)胞移植的方法也多被人們所嘗試，但都沒有能找到根本的解決方法。糖尿病的并發(fā)癥很多，如動(dòng)脈硬化、高血壓、血臟受累、感染、末梢神經(jīng)炎等。雖然NGF已為人們所熟知，且利用NGF進(jìn)行過末梢神經(jīng)炎的治療，已取得了一定的成果。近年來有人發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophicfactor，BDNF)可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血糖，但至今未見有關(guān)NGF減低血糖的報(bào)道，尤其是采用蛇毒腺NGF進(jìn)行降低血糖的報(bào)道，更無人利用重組蛇NGF進(jìn)行這方面的工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供中華眼鏡蛇蛇毒重組神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的cDNA序列。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供重組NGF cDNA編蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供制備重組神經(jīng)生長(zhǎng)因子的方法。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供重組神經(jīng)生長(zhǎng)因子在降低血糖及改善胰島功能，以及治療由糖尿病引起的末梢精神炎方面的藥學(xué)用途。
本發(fā)明的技術(shù)的詳細(xì)描述從中華眼鏡蛇毒腺中分離提取出總RNA，利用RT-PCR的方法反轉(zhuǎn)錄出總cDNA，利用我們?cè)O(shè)計(jì)的引物，提供了一條特異的cDNA序列，其長(zhǎng)度為348bp多核苷酸序列，我們還提供一個(gè)在畢赤酵母菌中成功表達(dá)的一分子量約為13000的小分子量蛋白質(zhì)。
中華眼鏡蛇神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF cDNA序列為從中華眼鏡蛇毒腺中克隆，含348個(gè)堿基對(duì)，核苷酸序列為1gaagatcatc ctgtgcataa cctaggggaa cattctgtgt gtgacagtgt cagtgcctgg61 gttactaaaa ctacagcaac agacatcaaa ggcaatacgg tgactgtgat ggaaaatgta121 aatcttgata acaaagtcta caagcagtac ttttttgaaa ccaagtgcaa aaatccaaat
181 ccagaaccga gtgggtgcag gggcattgat tccagccatt ggaattctta ttgcaccgaa241 acagacacat ttatcaaggc attaaccatg gaaggcaatc aggcatcctg gcgcttcatt301 cggattgaaa ctgcctgtgt gtgtgtaatc actaaaaaaa aggggaac將此cDNA序列構(gòu)建入質(zhì)粒pET23b和pPIC9K，分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌和酵母菌，誘導(dǎo)、表達(dá)出一種重組蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)由116個(gè)氨基酸殘基組成，其序列為1 edhpvhnlge hsvcdsvsaw vtkttatdik gntvtvmenv nldnkvykqy51 ffetkcknpn pepsgcrgid sshwnsycte tdtfikaltm egnqaswrfi101 rietacvcvi tkktgn神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備，此基因的克隆載體為pET23b和pPIC9K，步驟是a、對(duì)中華眼鏡蛇進(jìn)行斬頭處死后，盡快分離出毒腺，并放入液氮中凍存。
b、取上述毒腺，加入TRIzol試劑，氯仿，振搖后置于冰上，離心取上清，將上清移入另一離心管中，加入異丙醇，冰上放置然后于上述條件再離心，將沉淀中加入75％乙醇洗滌，混勻，再離心得RNA沉淀，風(fēng)干后，加入適量TE溶液或無RNase的水中備用。
c、采用RNAPCR Kit(AMV)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，以上述總RNA作為模板和含有BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行RT-PCR制備神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因片段，反映產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳鑒定，在348bp附近有一條帶為目的基因的條帶。
d、構(gòu)建入質(zhì)粒pET23b利用上述雙酶切將已鑒定的基因片段構(gòu)建入質(zhì)粒pET23b的多克隆位點(diǎn)中，并在大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增，制備感受態(tài)細(xì)用氯化鈣法，構(gòu)建后采用PCR和雙酶切片段電泳進(jìn)行鑒定，用上述方法將含有NGF cDNA的pET23b轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)NGF蛋白。
e、目的基因向酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中的構(gòu)建與篩選利用含SnaBI和Eco521雙酶切位點(diǎn)的引物對(duì)含有目的基因的pET23b進(jìn)行PCR，利用電泳鑒定并利用Qiagen公司提供的試劑盒將PCR產(chǎn)物純化，再利用此兩酶對(duì)pPIC9K酶切，插入純化過的目的基因，從而得到含目的基因的pPIC9K。
利用電穿孔將含有目的基因的pPIC9K質(zhì)粒轉(zhuǎn)換入畢赤酵母菌pichia pastoris GS115，在組氨酸缺乏的條件下，利用不同濃度的G418對(duì)重組子進(jìn)行篩選，得到對(duì)G418有抗性的菌株，對(duì)此菌株進(jìn)行培養(yǎng)到一定情況下，在甲醇誘導(dǎo)酵母菌表達(dá)并分泌重組的NGF。
此蛋白質(zhì)在畢赤酵母菌GS115中表達(dá)，用DEAE-Sephadex25和SdphadexG-50對(duì)其進(jìn)行純化，用His-Bind Column70971-3進(jìn)行親和層析。
另外研究了神經(jīng)生長(zhǎng)因子使血糖降低和改善胰島的組織學(xué)改變，顯示上機(jī)提到的特征的重組神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF可以用于藥物生產(chǎn)，治療II型糖尿病及其并發(fā)癥末梢神經(jīng)炎過程中，降低血糖、改善胰島功能等。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不限于實(shí)施例。
實(shí)施例1NGF cDNA的克隆a、對(duì)中華眼鏡蛇進(jìn)行斬頭處死后，盡快分離出毒腺，并放入液氮中凍存。
b、取0.1～1g組織，加入1～5mlTRIzol試劑，氯仿，振搖15～30sec后置于冰上5～10min。于4℃離心10000～30000xg 10～30min，取上清。將上清移入另一離心管中，加入0.5～2ml異丙醇，并在冰上放置10～20min。然后于上述條件再離心。將沉淀中加入75％乙醇洗滌，混勻，再子4℃離心得RNA沉淀。風(fēng)干后，加入適量TE溶液或無RNase的水中備用。
c、RT-PCR采用RNAPCR Kit(AMV)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。其基本要點(diǎn)是反應(yīng)液中加入MgCl2、RNA PCR緩沖液、脫氧單核苷酸混合物、核糖核酸酶抑制劑、隨機(jī)9聚物、樣品RNA。反應(yīng)總量20～100μl，反應(yīng)后進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)物中含有MgCl2、PCR緩沖液、Tap酶和引物(含有BamHI和HindIII酶切位點(diǎn))。反應(yīng)總體積20～100μl。反映產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳鑒定，在348bp附近有一條帶為目的基因的條帶。
PT-PCR采用寶生物工程有限公司提供的TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.2.1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。其基本要點(diǎn)是反應(yīng)液中加入25mmol/L MgCl24μl10×RNA PCR buffer 2μlRnase Free dHO 8.5μldNTP Mixture 2μlRnase Inhibitor 0.5μlReverse Transcriptase1μl
Random 9mers 1μlSample RNA 1μl(oisutuve cibreik RNA) (1μl)總體積20μl反映條件是30℃10min55℃30min99℃5min5℃ 5minPCR反應(yīng)取上述反應(yīng)液5μl，加入Eppendorf管中，加入下列反應(yīng)液25mmol/L MgCl21.5μl10×RNA PCR buffer 2μl無菌蒸餾水 16μlTaKarA taq 0.125μlPrimer I 0.25μlPrimerII0.25μl總體積25μl反映條件94℃ 2min 反應(yīng)用引物為
F5’-GGGGATCCGGAAGATCATCCTGTGCA-3’R5’-CCCAAGCTTGTTCCCCTTTTTTTTAGTGATTAC-3反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳鑒定。在348bp附近有一條帶為目的的基因片段帶，其cDNA序列為從中華眼鏡蛇毒腺中克隆，含348個(gè)堿基對(duì)，核苷酸序列為1 gaagatcatc ctgtgcataa cctaggggaa cattctgtgt gtgacagtgt cagtgcctgg61 gttactaaaa ctacagcaac agacatcaaa ggcaatacgg tgactgtgat ggaaaatgta121 aatcttgata acaaagtcta caagcagtac ttttttgaaa ccaagtgcaa aaatccaaat181 ccagaaccga gtgggtgcag gggcattgat tccagccatt ggaattctta ttgcaccgaa241 acagacacat ttatcaaggc attaaccatg gaaggcaatc aggcatcctg gcgcttcatt301 cggattgaaa ctgcctgtgt gtgtgtaatc actaaaaaaa aggggaac實(shí)施例2在大腸桿菌中重組NGF的表達(dá)構(gòu)建入質(zhì)粒pET23b利用上述雙酶切將已鑒定的基因片段構(gòu)建入質(zhì)粒pET23b的多克隆位點(diǎn)中，并在大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增，制備感受態(tài)細(xì)用氯化鈣法，構(gòu)建后采用PCR和雙酶切片段電泳進(jìn)行鑒定，用上述方法將含有NGF cDNA的pET23b轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)NGF蛋白。
實(shí)施例3在畢赤酵母菌中重組NGF的表達(dá)目的基因向酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中的構(gòu)建與篩選。利用含SnaBI和Eco521雙酶切位點(diǎn)的引物對(duì)含有目的基因的pET23b進(jìn)行PCR，利用電泳鑒定并利用Qiagen公司提供的試劑盒將PCR產(chǎn)物純化。再利用此兩酶對(duì)pPIC9K酶切，插入純化過的目的基因。從而得到含目的基因的pPIC9K。
含有His標(biāo)簽的引物F5’-GCTACGTAGAAGATCATCCTGT-3’R5’-TTCGGCCGGTGGTGGTGGTGGTGGTGCGCAAGCTT-3’不含有His標(biāo)簽的引物F5’-GCTACGTAGAAGATCATCCTGT-3’R5’-TTCGGCCGGTGGTGGTGGTGGTGGTGCGCAAGCTT-3’利用電穿孔將含有目的基因的pPIC9K質(zhì)粒轉(zhuǎn)換入畢赤酵母菌pichia pastoris GS115。電穿孔的條件是2.5KV，800-1000Ω，25μF，時(shí)間為14-21毫秒。儀器為Bio-Rad E.colipulser，美國(guó)。
此蛋白質(zhì)摘畢赤酵母菌GS115中表達(dá)，用DEAE-Sephadex25和SdphadexG-50對(duì)其進(jìn)行純化，用His-Bind Column70971-3進(jìn)行親和層析。
在組氨酸缺乏的條件下，利用不同濃度的G418對(duì)重組子進(jìn)行篩選。得到對(duì)G418有抗性的菌株。對(duì)此菌株進(jìn)行培養(yǎng)到一定情況下，在甲醇誘導(dǎo)酵母菌表達(dá)并分泌重組的NGF。
蛋白質(zhì)由116個(gè)氨基酸殘基組成，其序列為1 edhpvhnlge hsvcdsvsaw vtkttatdik gntvtvmenv nldnkvykqy51 fetkcknpn pepsgcrgid sshwnsycte tdtfikaltm egnqaswrfi101 rietacvcvi tkktgn實(shí)施例4重組NGF降低血糖及改善胰島功能應(yīng)用SD大鼠實(shí)驗(yàn)表明，向大鼠腹腔一次性注射鏈霉佐菌素55mg/kg體重制作糖尿病模型。確定血糖高于16mmol/L后，實(shí)驗(yàn)組每日分別后肢肌肉注射從中華眼鏡蛇蛇毒中提取NGF和重組中華眼鏡蛇NGF各100U/kg和50U/kg，每周一次從尾部取血測(cè)定血糖。結(jié)果表明，從中華眼鏡蛇提取的NGF和重組NGF均能使血糖降低和改善胰島的組織學(xué)改變。入II型糖尿病支援者肌肉注射已經(jīng)國(guó)家批準(zhǔn)上市的NGF兩個(gè)月后，可見血糖明顯降低。
權(quán)利要求
1.中華眼鏡蛇神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF cDNA，其特征是從中華眼鏡蛇毒腺中克隆，含348個(gè)堿基對(duì)，其核苷酸序列為1 gaagatcatc ctgtgcataa cctaggggaa cattctgtgt gtgacagtgt cagtgcctgg61 gttactaaaa ctacagcaac agacatcaaa ggcaatacgg tgactgtgat ggaaaatgta121 aatcttgata acaaagtcta caagcagtac ttttttgaaa ccaagtgcaa aaatccaaat181 ccagaaccga gtgggtgcag gggcattgat tccagccatt ggaattctta ttgcaccgaa241 acagacacat ttatcaaggc attaaccatg gaaggcaatc aggcatcctg gcgcttcatt301 cggattgaaa ctgcctgtgt gtgtgtaatc actaaaaaaa aggggaac
2.權(quán)利要求1所述cDNA序列的表達(dá)，其特征是表達(dá)的重組蛋白質(zhì)由116個(gè)氨基酸殘基組成，其序列為1 edhpvhnlge hsvcdsvsaw vtkttatdik gntvtvmenv nldnkvykqy51 fetkcknpn pepsgcrgid sshwnsycte tdtfikaltm egnqaswrfi101 rietacvcvi tkktgn
3.權(quán)利要求1所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備，其特征是a、對(duì)中華眼鏡蛇進(jìn)行斬頭處死后，盡快分離出毒腺，并放入液氮中凍存；b、取上述毒腺，加入TRIzol試劑，氯仿，振搖后置于冰上，離心取上清，將上清移入另一離心管中，加入異丙醇，冰上放置然后于上述條件再離心，將沉淀中加入75％乙醇洗滌，混勻，再離心得RNA沉淀，風(fēng)干后，加入適量TE溶液或無RNase的水中備用；c、采用RNAPCR Kit(AMV)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，以上述總RNA作為模板和含有BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行RT-PCR制備神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因片段，反映產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳鑒定，在348bp附近有一條帶為目的基因的條帶；d、構(gòu)建入質(zhì)粒pET23b利用上述雙酶切將已鑒定的基因片段構(gòu)建入質(zhì)粒pET23b的多克隆位點(diǎn)中，并在大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增，制備感受態(tài)細(xì)用氯化鈣法，構(gòu)建后采用PCR和雙酶切片段電泳進(jìn)行鑒定，用上述方法將含有NGF cDNA的pET23b轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)NGF蛋白；e、目的基因向酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中的構(gòu)建與篩選利用含SnaBI和Eco521雙酶切位點(diǎn)的引物對(duì)含有目的基因的pET23b進(jìn)行PCR，利用電泳鑒定并利用Qiagen公司提供的試劑盒將PCR產(chǎn)物純化，再利用此兩酶對(duì)pPIC9K酶切，插入純化過的目的基因，從而得到含目的基因的pPIC9K；利用電穿孔將含有目的基因的pPIC9K質(zhì)粒轉(zhuǎn)換入畢赤酵母菌pichia pastoris GS115，在組氨酸缺乏的條件下，利用不同濃度的G418對(duì)重組子進(jìn)行篩選，得到對(duì)G418有抗性的菌株，對(duì)此菌株進(jìn)行培養(yǎng)到一定情況下，在甲醇誘導(dǎo)酵母菌表達(dá)并分泌重組的NGF。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備，其特征是此蛋白質(zhì)在畢赤酵母菌GS115中表達(dá)，用DEAE-Sephadex25和SdphadexG-50對(duì)其進(jìn)行純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備，其特征是此蛋白質(zhì)在畢赤酵母菌GS115中表達(dá)，用His-Bind Column70971-3進(jìn)行親和層析。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的中華眼鏡蛇神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGFcDNA，其特征是用于降低血糖及改善胰島功能，以及治療由糖尿病引起的末梢精神炎方面的藥學(xué)用途。
全文摘要
中華眼鏡蛇神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF cDNA、克隆及表達(dá)，涉及重組中華眼鏡蛇神經(jīng)生長(zhǎng)因子的cDNA和克隆，神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)和利用其表達(dá)載體制備神經(jīng)生長(zhǎng)因子的方法和所述蛋白質(zhì)的藥學(xué)用途。從中華眼鏡蛇毒腺中分離提取出總RNA，利用RT－PCR的方法反轉(zhuǎn)錄出總cDNA，利用我們?cè)O(shè)計(jì)的引物，提供了一條特異的cDNA序列，其長(zhǎng)度為348bp多核苷酸序列，我們還提供一個(gè)在畢赤酵母菌中成功表達(dá)的一分子量約為13000的小分子量蛋白質(zhì)。重組神經(jīng)生長(zhǎng)因子在降低血糖及改善胰島功能，以及治療由糖尿病引起的末梢精神炎方面的藥學(xué)用途。
文檔編號(hào)A61P3/10GK1597952SQ20041002151
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月19日
發(fā)明者郝文學(xué), 趙寶昌, 田曉光, 愛萍 申請(qǐng)人:郝文學(xué)