專利名稱：神經(jīng)生長因子基因定位改造動物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過轉(zhuǎn)基因方法獲得的動物及其制備方法和應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及利用胚胎千細(xì)胞(ES)培養(yǎng)技術(shù)和同源重組技術(shù)將目的基因定位整合到小鼠基因組中，從而獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因動物。該方法得到的動物可以應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和獲得目的蛋白。更具體地本發(fā)明涉及使用神經(jīng)生長因子基因定位改造小鼠及其制備人源性神經(jīng)生長因子及其突變體蛋白質(zhì)的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)是最早被發(fā)現(xiàn)和被證實(shí)的細(xì) 胞生長調(diào)節(jié)因子，也是研究得最清楚的神經(jīng)營養(yǎng)因子[HoJL,HeS，HuA等 人，JExpMed, 1995 ，181 (4) :1493 - 1505.]。 NGF在神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞 的增殖、分裂轉(zhuǎn)化和神經(jīng)元的發(fā)育、軸突的生長、遞質(zhì)的合成及細(xì)胞的凋亡 等階段均起著重要作用[Sayada C ， Denamur E, Elion J等人，Gene ， 1992 ， 120 (1) :129- 130.]。其促進(jìn)胚胎和發(fā)育中交感、感覺神經(jīng)元的分化和成熟，還參 與維持成年交感神經(jīng)元的正常功能和營養(yǎng)支持成年感覺神經(jīng)元[Zhang D ， Yang X， Berry J，等人，J In2fect Dis ，1997 ， 176 (4) :1035 - 1040.]。中樞神經(jīng) 系統(tǒng)的基底前腦膽堿能神經(jīng)元和紋狀體的膽堿能中間神經(jīng)元的發(fā)育、分化也 受到NGF的調(diào)節(jié)[Pal S , Barnhart KM， Wei Q，等人Vaccine， 1999， 17 (5) :459 -465.]。由于NGF生物功能的重要性，表明它具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。人NGF 是由a、 p和Y3種肽鏈以ci2P2Y2的形式，通過非共價(jià)鍵結(jié)合而成的。進(jìn)一步發(fā) 現(xiàn)其中P亞單位具有神經(jīng)生長因子完全的生物學(xué)功能，它是由2個118氨基酸 通過非共價(jià)鍵結(jié)合而成的二聚體，每個單體內(nèi)有3組二硫鍵，3個二硫鍵的正 確形成對蛋白的折疊起重要作用，進(jìn)而影響到0 -NGF的生物學(xué)活性 (Cys58-Cysl聰，Cys68-Cys110, Cysl5-Cys80 )。由于人NGF在體內(nèi)含量甚微， 而且受人體材料來源的限制，使人P-NGF不可能大規(guī)模生產(chǎn)。許多人曾嘗試 用基因工程的方法生產(chǎn)人P-NGF，但由于p-NGF在細(xì)菌、酵母的表達(dá)系統(tǒng)中不能正確進(jìn)展和修飾以及二聚體化，以至于得到的表逸產(chǎn)物缺少活性(De Bemardez Clark E， Schwarz E， Rudolph, R等人，1999;309:217-36. Ikemura H, Takagi H， Inouye M，等人，J Biol Chem. 1987 Jun 5;262(16):7859-64. Nishizawa M， Ozawa F， Higashizaki T，等人，Appl Microbiol Biotechnol. 1993 Feb;38(5):624-30.)。利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)人P -NGF在理論上存在較大的優(yōu) 勢，但表達(dá)量較低，難以規(guī)?；?C ANTHONY ALTAR, Louis E. BURTONt， GREGORY L。 Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 88, pp. 281-285， January 1991)。 而且可能其生物學(xué)活性并不等同于從人體中提取得到的NGF。例如，美國的 Genentech公司開發(fā)的重組人NGF三期臨床結(jié)果并不理想。所以雖然重組人 NGF已經(jīng)在多種生物中(細(xì)菌、酵母、CHO細(xì)胞昆蟲和細(xì)胞)被表達(dá)，并且 被作為用于治療的藥物已經(jīng)研究了很長時間，但都還沒有作為藥品被批準(zhǔn)使 用。由于眾多人類基因在小鼠中有同源性并且小鼠繁殖期短、個體較小易于 養(yǎng)殖，因此，小鼠是研究哺乳動物和人類基因功能的模式生物。過去的許多 年已經(jīng)通過對小鼠進(jìn)行基因突變處理獲得了許多種表達(dá)外源蛋白質(zhì)的小鼠。 NGF的生物學(xué)作用以及NGF與其受體的相互作用的研究一直是神經(jīng)和發(fā)育生 物學(xué)研究的熱點(diǎn)。Crowley利用基因敲除技術(shù)將小鼠的NGF基因破壞，觀察對 神經(jīng)發(fā)育的影響(Crowley C, Spencer SD， Nishimura MC，等人Cell. 1994 Mar 25;76(6):1001-11.)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)感覺和交感神經(jīng)元對NGF有嚴(yán)格的依賴性，其 它神經(jīng)營養(yǎng)因子不能彌補(bǔ)NGF對這些神經(jīng)元的作用。另外Smeyne等敲除了 NGF的細(xì)胞高親合力受體TrkA ，以考察TrkA在神經(jīng)發(fā)育中的作用(Smeyne RJ, Klein R， Schnapp A， et al .Nature. 1994 Mar 17;368(6468): 193-4.)。但NGF和 TrkA整體基因敲除后的小鼠在胚胎發(fā)育中死亡或出生后生命力低下，這可能 是由于NGF或其受體在發(fā)育過程中存在重要的作用，所以這種基因敲除小鼠 對研究NGF與其受體的特異作用方面存在局限性。因此，如何對小鼠的NGF 基因進(jìn)行改造以穩(wěn)定表達(dá)小鼠NGF蛋白質(zhì)的突變體蛋白是本領(lǐng)域仍未解決的 問題。成年雄性小鼠頜下腺內(nèi)NGF的含量很高，而且由于小鼠繁殖快，便于飼 養(yǎng)，所以小鼠可以成為提取和純化NGF的良好來源。目前上市的P-NGF就是從小鼠頜下腺中提取得到的。但與鼠源性的NGF相比，人NGF在嚙齒類動物 和變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎及帕金森氏病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭卸加懈玫闹委熜Ч?；?且人源神經(jīng)生長因子相比鼠源NGF具有更小的免疫原性，在人體內(nèi)更具有穩(wěn) 定性和安全性。80年代末以來，在基因打靶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因敲 入(knock-in)技術(shù)，為我們生產(chǎn)人NGF提供了新的途徑。通過同源重組技 術(shù)以及小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將人的NGF基因替換了小鼠的NGF基因，從這種 轉(zhuǎn)基因小鼠的頜下腺中可以提取到大量的成熟人3 -NGF蛋白，可用于研究和 規(guī)?；a(chǎn)。但這一轉(zhuǎn)基因方法的用途并不局限于此。例如，NGF的生物學(xué)作用以及 NGF與其受體的相互作用的研究一直是神經(jīng)和發(fā)育生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。 Crowley利用基因敲除技術(shù)將小鼠的NGF基因破壞，觀察對神經(jīng)發(fā)育的影響 (Crowley C， Spencer SD， Nishimura MC， et al . Cell. 1994 Mar 25;76(6):1001-11.)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)感覺和交感神經(jīng)元對NGF有嚴(yán)格的依賴性，其 它神經(jīng)營養(yǎng)因子不能彌補(bǔ)NGF對這些神經(jīng)元的作用。另外Smeyne等敲除了 NGF的細(xì)胞高親合力受體TrkA ，以考察TrkA在神經(jīng)發(fā)育中的作用(Smeyne RJ， Klein R， Schnapp A, et al .Nature. 1994 Mar 17;368(6468): 193-4.)。但NGF 和TrkA整體基因敲除后的小鼠在胚胎發(fā)育中死亡或出生后生命力低下，這可 能是由于NGF或其受體在發(fā)育過程中存在重要的作用，所以這種基因敲除小 鼠對研究NGF與其受體的特異作用方面存在局限性。體外突變得到的NGF突 變體為研究NGF與其受體的作用提供了良好的基礎(chǔ)。例如利用只與TrkA結(jié)合 而不與其低親合力受體P75結(jié)合的突變體NGF可以考察P75的作用，使研究更 有目的性、針對性和特異性(Horton A， Laramee Q Wyatt S，等人，Mol Cell Neurosci. 1997; 10(3-4): 162-72. Ryden M， Hempstead B， Ibanez CF，等人，J Biol Chem. 1997 Jun 27;272(26): 16322-8 )。我們利用基因敲入技術(shù)將突變的 NGF構(gòu)建入了小鼠中，得到了NGF突變體小鼠。為在整體動物水平上研究NGF 突變體及其受體功能研究開辟了新的道路。同時也為在體內(nèi)篩選和純化高活 性和安全性的NGF突變體開辟了 一條新的途徑。 發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供一種轉(zhuǎn)基因動物，其中該動物基因組中的6NGF-P碁因被改造，進(jìn)而該動物表達(dá)該種動物NGF-P的突變體蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語"動物"是指其基因組包含NGF-P基因的動物， 例如但不限于嚙齒類、豬、貓、人、雞、蛇、蛙、魚等，其中優(yōu)選嗜齒類動 物例如小鼠、大鼠等，最優(yōu)選小鼠。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語"該種動物NGF-P的突變體蛋白質(zhì)"是指具有 NGF-p蛋白質(zhì)活性的突變體蛋白質(zhì)，具有至少70%的同源性，優(yōu)選至少80% 的同源性，更優(yōu)選至少90%的同源性蛋白質(zhì)，例如可以是具有人NGF-p蛋白 質(zhì)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，M酸序列的同源性，通?？赏ㄟ^已知的軟件或電腦程序 如BestFit或Gap配對比較程序進(jìn)行確定。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)基因動物的基因組中至少一條染色體上的NGF-I3基因被 目的基因或其突變體基因所替換。優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)基因動物的基因組中全部的 NGF-p基因被外源目的基因或其突變體基因所替換。本發(fā)明進(jìn)一步的目標(biāo)是提供一種制備轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物的方法，其特征 在于通過同源重組技術(shù)使所述動物基因組中的NGF-(3基因被改變，從而表達(dá) 該種動物NGF-P基因的突變體蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種制備轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物的方法，其 包括以下步驟1) 構(gòu)建打靶栽體，其中所述栽體含有目的NGF-P基因或突變的NGF-卩基因；2) 使用步驟l)中所構(gòu)建的打靶載體轉(zhuǎn)染胚胎千細(xì)胞； 3 )制備供體囊胚；4) 將步驟2)中獲得的經(jīng)過轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞顯微注射入步驟3)中所 獲得的供體嚢胚中；5) 將步驟4)中所獲得的供體囊胚轉(zhuǎn)移到受體動物的子宮中；以及6) 獲得轉(zhuǎn)基因動物。在構(gòu)建打靶栽體中，同源臂的長度對打靶效率影響很大，原則上同源臂 越長，發(fā)生同源重組的幾率就越大，所以大多數(shù)載體同源臂的長度在5 8Kb 之間。同源臂和正負(fù)選擇標(biāo)記的相對位置決定了只有通過同源重組打靶成功7的克隆才能通過藥物培養(yǎng)基被篩選出來。但為了進(jìn)一步確定是否打把成功，通常采用PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)計(jì)引物時采用的原則是 一個引物同正選 擇標(biāo)記基因序列退火，另 一個引物同打靶栽體外側(cè)相臨的基因組序列退火。 由于PCR擴(kuò)增的效率取決于兩個引物之間的距離，所以通常情況下，兩側(cè)的 同源臂長度是不對稱的。有長短臂之分，以便于PCR進(jìn)行檢測。同時長臂要 足夠長，保證有足夠的同源序列形成染色體交換復(fù)合體。為了增加同源重組 的幾率，并避免過長而造成實(shí)驗(yàn)操作上的困難以及后續(xù)檢測中的復(fù)雜性，優(yōu) 選短臂的長度為l 10Kb，其中優(yōu)選2Kb。優(yōu)選長臂的長度為l 10Kb，其中優(yōu) 選3 8Kb,最優(yōu)選5Kb。對于載體的選擇，正如本領(lǐng)域中所熟知的，載體是能夠或者輔助將實(shí)體 從一種環(huán)境轉(zhuǎn)入其它環(huán)境的工具。某些在重組DNA技術(shù)中所使用的載體能夠 使例如DNA片斷(例如異源DNA片斷例如異源cDNA片斷)被轉(zhuǎn)入寄主內(nèi)和/ 或靶細(xì)胞內(nèi)，以達(dá)到復(fù)制該含有本發(fā)明中所使用的和/或表達(dá)本發(fā)明所使用蛋 白質(zhì)的核苦酸序列的載體的目的。在重組DNA4支術(shù)中所^使用的載體的例子包 括但不限于質(zhì)粒、染色體、人工染色體或病毒。在本發(fā)明中所使用的栽體包 括但不限于pLoxPneo、 pPNT等質(zhì)粒載體。本發(fā)明還涉及使用根據(jù)本發(fā)明所制備的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物生產(chǎn)該動物 NGF-P突變體蛋白質(zhì)的方法，其包括以下步驟1) 培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明所獲得的轉(zhuǎn)基因動物；2) 從經(jīng)過培養(yǎng)的動物組織中提取具有神經(jīng)生長因子活性的目標(biāo)蛋白。 對于所述的提取目標(biāo)蛋白的動物組織沒有特別的限定，例如包括但不限于頜下腺。在本發(fā)明中所生產(chǎn)的該種動物NGF-P的突變體蛋白質(zhì)'，是指具有NGF-p 蛋白質(zhì)活性的突變體蛋白質(zhì)，與該種動物NGF-P蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至 少70%的同源性，優(yōu)選至少80%的同源性，更優(yōu)選至少90%的同源性蛋白質(zhì)， 例如可以是具有人NGF-P蛋白質(zhì)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明所提供的制備NGF- 0蛋白質(zhì)突變體 的方法所制備的小鼠NGF- P蛋白質(zhì)的突變體。其中在本發(fā)明中小鼠NGF- 0 蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少70%的同源性，優(yōu)選至少80%的同源性，更優(yōu) 選至少90%的同源性蛋白質(zhì)，例如可以是具有人NGF-P蛋白質(zhì)的g酸序列 的蛋白質(zhì)。所制備的NGF-p蛋白質(zhì)可以被制成藥學(xué)上可以接受的藥物組合物。在本 發(fā)明中，藥物組合物是一種含有藥學(xué)有效量的藥學(xué)活性藥物或由藥學(xué)有效量 的藥學(xué)活性藥物組成的組合物。其優(yōu)選含有藥學(xué)上可以接受的栽體、稀釋劑 或賦形劑(包括其組合)。用于治療應(yīng)用的可以接受的栽體或稀釋劑是藥物領(lǐng) 域中熟知的。對藥物栽體、賦形劑或稀釋劑的選擇可以根據(jù)所期望的給藥路 線和標(biāo)準(zhǔn)的藥物實(shí)踐而選擇。所述藥物組合物可以包括(或另外)賦形劑或 稀釋劑、任何適當(dāng)?shù)恼辰Y(jié)劑、潤滑劑、懸浮劑、包被劑、溶劑。藥學(xué)上可以 接受的栽體的例子包括例如水、鹽溶液、乙醇、硅樹脂、蠟、凡士林油、植 物油、聚乙二醇、丙二醇、脂質(zhì)體、糖、凝膠、乳糖、淀粉糖、硬脂酸鎂、 云母、表面活性劑、硅酸、粘性石蠟、香精油、脂肪酸單甘油酯和二甘油脂、 石油烴脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。


圖lA是pLoxPneo載體質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖，圖1B是打靶栽體pm-hNGF 的結(jié)構(gòu)示意圖，圖1C是的打靶栽體pm-hNGF的構(gòu)建過程示意圖；圖2A是打靶栽體pm-mNGF的結(jié)構(gòu)示意圖，圖2B是打靶栽體pm-mNGF 的構(gòu)建過程示意圖；圖3是人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干細(xì)胞的鑒定的Southern 印跡結(jié)果示意圖；圖4是人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干細(xì)胞的鑒定的PCR結(jié)果 示意圖；圖5是P-NGF突變體基因定位整合小鼠胚胎千細(xì)胞的鑒定的Southern 印跡結(jié)果示意圖；圖6是人& -NGF基因定位整合小鼠的PCR鑒定基因型結(jié)果示意圖； 圖7是人P-NGF成熟肽基因定位整合小鼠的鑒定的Southern雜交鑒定 結(jié)果示意圖；圖8是P-NGF突變體基因定位整合小鼠的鑒定的Southern印跡鑒定結(jié)果示意圖；圖9是利用SDS-PAGE鑒定所提取蛋白質(zhì)分子量大小結(jié)果示意圖； 圖10是利用等電聚焦電泳測定所提取蛋白的等電點(diǎn)結(jié)果示意圖； 圖ll是所提取人神經(jīng)生長因子的比活測定的結(jié)果示意圖； 圖12是所提取突變NGF的受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。 實(shí)施例實(shí)施例l人NGF成熟肽基因打靶栽體的構(gòu)建。1) 合成下列引物片段PI ￡bo RI CGGAATTCgtccctagctcacttcattcaaggaP2 ggaagatgggatgggaggatgagcgcttgctccggtgagtP3 actcaccggagcaagcgctcatcctcccatcccatcttccacaggggcgaP4 gggctgcaggcaagtcaggctcttctcacagccttP5 aaggctgtgagaagagcctgacttgcctgcagcccccttccccacctP6 5g/11 ACCAGATCTgccatgacaggcctcaggagaP7 M CGGAATTCGTCGACggtttcatgttaagattgcctttgctcP8扁CGGAATTCGCGGCCGCtcctggaaccaggagtcagagggaatggat2) 上游長臂構(gòu)建以小鼠基因組DNA(ling)為摸板，用引物P1+P2各100ng, Pfb高保真酶 2.5單位，dNTP 250拜ol/L， 2.5mmol/L MgC12， 25mmol/L TrisHCl(pH8.3)進(jìn) 行PCR反應(yīng)(94。C30秒，55。C30秒，72。C4分，使用Perkin Elmer 9700型 PCR儀，共30循環(huán)),PCR產(chǎn)物經(jīng)P/。瓊脂糖電泳后用Qiagen Gel Extraction Kit (購自QIAGEN)純化，獲得4.4kb DNA片斷；以引物P3+P4各lOOng為 引物，以人基因組DNA(lpg)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(條件同上，但72。C延 伸時間45秒)，獲得擴(kuò)增0.37kbDNA片斷，并同樣電泳分離純化；以小鼠 基因組DNA為模板，P5+P6各100ng為引物同上條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得 0.65kbDNA片斷，并同樣進(jìn)行分離純化工；將上述3片段各取100ng，混合后 為模板，以引物Pl+P6各100ng進(jìn)行PCR擴(kuò)增(條件同上，72°C延伸時間 5分)，獲得5.4kbDNA片段，并通過同上方法電泳分離純化。3) 下游短臂構(gòu)建以小鼠基因組DNA為模板(lng)， 51物P7+P8各100呢進(jìn)行PCR擴(kuò)增(條 件同上，72。C延伸2分)，獲得2kbDNA片段，并同上通過瓊脂糖電泳分 離并純化。4)打靶載體的構(gòu)建pLoxPneo栽體質(zhì)粒(圖1A)用5coRI+i^"I(Biolabs,下同)酶切，通過1% 瓊脂糖電泳后，用QiagenGdExtractionKit純化；上游長臂DNA片段用五co RI+^p"I消化，瓊脂糖電泳后回收2.06kbDNA片段并同上純化(中間片段)， 將該片段與上述載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取正確的克隆。將經(jīng)序列 分析正確的質(zhì)粒用ATp"I+j5awHI酶切，回收后用做克隆載體，上游長臂片段 用尺pwI+^g/II酶切，回收3.4kbDNA片段，插入上述構(gòu)建栽體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a,挑選正確的克隆。將正確的質(zhì)粒用屈oI+M rt酶切，經(jīng)電泳后回收作為 克隆栽體，將下游短臂用Sa/I+MwI消化，電泳回收后克隆至上迷栽體，獲得 打靶栽體pm-hNGF (圖1B)，構(gòu)建過程如圖1C所示。構(gòu)建的質(zhì)粒通過核^ 列分析證實(shí)正確后用于基因打靶。 實(shí)施例2: p-NGF基因突變體打靶載體的構(gòu)建本實(shí)施例是在小鼠0 -NGF成熟肽基因基礎(chǔ)上改變了三個氨基酸位點(diǎn)。1) 合成引物p2，、 P3'、 P4，和P5，P2， 5'ggaagactgggtgggtggatgagcgcttgctccggtgagt 3， P3' 5，actcacc路agcaagcgctcatecacccacccagtcttccacatggggg 3' P4， 5，gggctgcaggcaagtcagcctcttettgtagcctt 3' P5， 5，aaggctacaagaagaggctgacttgcctgcagcccccttccccacct 3，2) NGF突變體的獲得合成以引物P3，+P4，各100ng為引物，以鼠基因組DNA(lpg)為摸板PfU 高保真酶2.5單位，dNTP 250pmol/L， 2.5mmol/L MgC12， 25mmol/L TrisHCl(pH8.3)進(jìn)行PCR^應(yīng)(94。C 30秒，55。C30秒，72。C45秒，使用Perkin Elmer 9700型PCR儀，共30循環(huán))，PCR產(chǎn)物經(jīng)l。/o瓊脂糖電泳后用Qiagen Gel Extraction Kit(購自QIAGEN )純化，獲得0.37kb DNA片段。以獲得0.37kb DNA 片段為模板，利用stratogen公司的點(diǎn)突變試劑盒將NGF成熟肽的第32位Lys、 34位Lys、 35位Glu突變成Aia，獲得突變體基因片段。具體方法參考stratagen公司的點(diǎn)突變試劑盒說明書。3)上游長臂構(gòu)建 以小鼠基因組DNA(1嗎)為模板，用引物P1+P2，各100ng， Pfti高保真酶2.5 單位，dNTP 250拜ol/L, 2.5mmol/L MgC12， 25mmol/L TrisHCl(pH8.3)進(jìn)行 PCR^應(yīng)(94。C30秒，55。C30秒，72。C4分，使用Perkin Elmer 9700型PCR儀， 共30循環(huán))，PCR產(chǎn)物經(jīng)l。/。瓊脂糖電泳后用Qiagen Gel Extraction Kit (購自 QIAGEN)純化，獲得4.4kbDNA片斷；以小鼠基因組DNA為模板，P5，+P6 各100ng為引物同上條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得0.65kbDNA片斷，并同樣進(jìn)行 分離純化；將上述兩片段與2)中的NGF突變體片段共三片段各取100ng,混合 后為模板，以引物Pl+P6各100ng進(jìn)行PCR擴(kuò)增(條件同上，72。C延伸時間5 分)，獲得5.4kbDNA片段，并通過同上方法電泳分離純化。4) 下游短臂構(gòu)建同實(shí)施例l5) 打靶載體的構(gòu)建pLoxPneo栽體質(zhì)粒用五co RI+K戸I(Biolabs，下同)酶切后純化；上游長臂 DNA片段用五coRI+ii:/wI消化，回收2.06kbDNA片段，將該片段與上述栽體 連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取正確的克隆。將經(jīng)序列分析正確的質(zhì)粒用 /QwRSawHI酶切，回收后用做克隆載體，上游長臂片段用/^wI+丑g/II酶切， 回收3.4kbDNA片段，插入上述構(gòu)建栽體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選正確的克 隆。將正確的質(zhì)粒用屈oI+iVort酶切，經(jīng)電泳后回收作為克隆載體，將下游短 臂用Sa/I+iVort消化，電泳回收后克隆至上述栽體，獲得打靶栽體pm-mNGF (圖2A)，構(gòu)建過程如圖2B所示。構(gòu)建的質(zhì)粒通過核酸序列分析證實(shí)正確后 用于基因打靶。實(shí)施例3人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干細(xì)胞的獲得. 1)滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)和處理解凍小鼠原代成纖維細(xì)胞至2個100mm平皿中，于滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)液 (DMEM, 15°/oFBS， 0.1mM(3-巰基乙醇，0.1mmol/L青-鏈霉素，O.lmmol/LL-谷氨酰胺，O.lmM非必需氨基酸)、37°C、 5%C02培養(yǎng)3天后，用胰蛋白酶 消化處理并轉(zhuǎn)移到6個150mm組織培養(yǎng)孤培養(yǎng)，3天后，再轉(zhuǎn)移到々0個150mm 組織培朱臟中培養(yǎng)3~4天，直到細(xì)胞鋪滿孤底。用終濃度為l(Hig/ml的絲裂審素C處理成纖維細(xì)胞，37X:培養(yǎng)2 3h。將含絲裂霉素C處理過的，已失去有 絲分裂活性的成纖維細(xì)胞凍存，制備為成滋養(yǎng)層細(xì)胞。2) 電穿孔法轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞形成后，接種129/ter小鼠胚胎干細(xì)胞，培養(yǎng)基為在滋養(yǎng)層細(xì) 胞培養(yǎng)液中添加1000U/mlLIF。轉(zhuǎn)染前用lml0.25。/。的胰酶處理，然后加入 3.5mlES細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌后懸浮于PBS之中。質(zhì)粒pm-hNGF 50嗎，用NotI酶 切使重組載體線性化，與lml上述ES上述細(xì)胞懸液混合，用基因脈沖儀 (Biomd),600V，25pF電擊轉(zhuǎn)染，室溫l分后加入7mlES細(xì)胞培養(yǎng)基，加入4個已 長滿滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿，生長24h后加G418至280ng/ml， gancyclovir 2pmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)7天(每天換培養(yǎng)基)，然后挑取克隆。3) 人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干細(xì)胞的鑒定(1) Southern印跡:提取ES細(xì)胞和G418/FIAU雙抗性克隆的基因組DNA,然 后用EcoRI消化，用打靶栽體5，端的探針a進(jìn)行Southern印跡。野生型應(yīng)該在 10kb處有一陽性條帶。而因?yàn)樵谌薔GF成熟肽基因中有一EcoRI位點(diǎn)，所以 在同源重組后的ES細(xì)胞中在5kb處還會有 一條陽性帶，如圖3(2) PCR鑒定引物l (5'gctcatcctcccatcccatcttccaca3，)位于于成熟肽基 因5，端，引物2 ( 5'gaacgagatcagcagcctctgttcca 3，)位于Neo基因上。利用引物l 和引物2擴(kuò)增，在野生型胚胎干細(xì)胞中不會擴(kuò)增出條帶，而在同源重組后的干 細(xì)胞中擴(kuò)增出1200bP的擴(kuò)增條帶(圖4) ， PCR產(chǎn)物通過五coRI進(jìn)行酶切鑒定。 并通過DNA序列分析證實(shí)'J 、鼠NGF基因組DNA上的成熟肽基因已被人基因 所替換。實(shí)施例4P-NGF突變體基因定位整合小鼠胚胎干細(xì)胞的獲得。1) P-NGF突變體基因定位整合小鼠胚胎干細(xì)胞的獲得方法同實(shí)施例32) P -NGF突變體基因定位整合小鼠胚胎干細(xì)胞的鑒定(1) Southem印跡提取ES細(xì)胞和G418/FIAU雙抗性克隆的基因組DNA， 然后用&wHI消化，用下游同源臂5，端的探針b進(jìn)行Southe加印跡。野生型應(yīng)該 在800bp處有一陽性條帶。而在同源重組后的ES細(xì)胞中由于兩個BamHI位點(diǎn) 之間插入了neo基因，所以陽性條帶增至了2.7kb左右(圖5)。(2) PCR鑒定設(shè)計(jì)NGF成熟肽5，端引物1 (5，gctcatccacccacc cagtcttccaca 3，)和Neo基因上的引物2 ( 5'gaacgagatcagcagcctctgttcca 3，)。在野生型胚胎 千細(xì)胞中不會擴(kuò)增出條帶，將在同源重組后的干細(xì)胞中擴(kuò)增出1200bP的擴(kuò)增 條帶，PCR產(chǎn)物通過DNA序列分析證實(shí)小鼠NGF基因組DNA上的成熟肽基因 已被突變的基因所替換。實(shí)施例5人NGF成熟肽基因定位整合小鼠的獲得1 ) 供體嚢胚的制備取4-6周C57BL/6J不動情雌鼠，腹腔注射5單位孕馬血清促性腺激素 (Pregnant mare serum gonadotropin)，48h^腹腔注射5單位人絨毛膜促性腺激 素，并將雌鼠轉(zhuǎn)移至有種雄鼠的籠中與雄鼠交配。48h后檢查小鼠，有陰栓者 分籠飼養(yǎng)。交配第四天后，引頸處死供體雌鼠，解剖找到子宮，用剪刀將左 右兩側(cè)子宮在輸卵管與子宮角的銜接處剪下，然后小心剪下子宮的聯(lián)體部分， 置于無菌的60mm培養(yǎng)皿中。再用剪刀在子宮頭與子宮尾分別剪去輸卵管和 子宮角部分，使得兩根單獨(dú)的子宮是暢通的。用一次性注射器吸足量的 Brinster，s BMOC-3(GIBCO BRL)培養(yǎng)液套上5號針頭，在視體解剖鏡下插入子 宮腔，推動注射針?biāo)_洗子宮腔，小鼠胚胎將迅速沉降至培養(yǎng)孤底部。取一 個35mm的培養(yǎng)亞，滴上數(shù)滴培養(yǎng)液，再蓋上礦物油。在浮見體鏡下用沖卵管 收集胚胎并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液滴中，放于37'C、 5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時。2) 囊胚顯微注射注射用ES細(xì)胞應(yīng)在數(shù)天前解凍，注射當(dāng)天早晨換上新鮮的ES細(xì)胞培養(yǎng) 液，1 2小時后胰酶處理，作成單細(xì)胞懸液保存在Brinster，sBMOC-3培養(yǎng)液 中。從35mm培養(yǎng)亞中挑選約10個形態(tài)飽滿、邊界清晰、囊胚腔較大的囊胚 轉(zhuǎn)移到安裝好持卵管和注射針的注射槽內(nèi)。在10倍鏡下用注射針吸取10~15 枚小而圓的ES細(xì)胞，在40倍鏡下用吸卵管吸附嚢胚的一側(cè)，將注射針調(diào)整至 對準(zhǔn)囊胚的中心并使它們處于同一水平面。轉(zhuǎn)動注射針的操縱桿，使注射針 快速刺破嚢胚的壁，進(jìn)入嚢胚腔，推動注射泵使ES細(xì)胞順序進(jìn)入嚢胚腔，小 心拔出注射針。按照囊胚情況和受體鼠數(shù)量決定囊胚注射的個數(shù)。注射后的 囊胚置Brinster，s BMOC-3培養(yǎng)液液滴里培養(yǎng)。3) 胚胎的子宮移植受體鼠為昆明白假孕鼠，是經(jīng)過與結(jié)扎輸精管的雄鼠交配后的雌鼠。用酒精消毒受體鼠背部，在右側(cè)靠近第一腰錐的部位做一個lcm左右橫向切口 。 向兩側(cè)拉展直至可透過腹膜看見右側(cè)卵巢及其脂肪墊。在腹膜上用尖鑷撕開 一個3mm的小口。左手夾住脂肪墊向外拉出，子宮隨之可見。用小號止血鉗 夾住少許脂肪墊稍作固定。將移卵管接上一個口控管，在體視解剖鏡下依次 小心吸入培養(yǎng)液、氣泡、培養(yǎng)液、氣泡、注射后的嚢胚、氣泡、少量培養(yǎng)液。 左手持尖鑷夾住在子宮和輸卵管接口處附近2mm遠(yuǎn)的子宮壁，右手持一個4 號注射器針頭和移卵管。在解剖鏡下，針頭在緊挨尖鑷處避開血管扎一個小 孔，將移卵管的前端小心插入小孔中。將胚胎緩慢吹入子宮中。子宮和腸系 膜送回腹腔，封閉切口。(見基因打靶技術(shù)，pl33.楊曉等，科學(xué)出版社)。 4) 轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得如果移植手術(shù)成功，17天后可有幼鼠出生，數(shù)天后可從毛色上判斷是否 獲得高嵌合度的嵌合體小鼠。選擇嵌合度高的嵌合體小鼠與C57BL/6J交配， 在子代中可獲得純棕色的轉(zhuǎn)基因雜合子小鼠。將這些雜合子小鼠交配可篩選 出純合子轉(zhuǎn)基因小鼠。實(shí)施例6 P-NGF突變體基因定位整合小鼠的獲得。具體方法同實(shí)施例5。 實(shí)施例7人NGF成熟肽基因定位整合小鼠的鑒定1) 鼠基因組DNA的制備剪15天小鼠尾巴尖約0.5cm放入Eppendorf管中。每管加入鼠尾裂解緩沖 (0.5%SDS，0.1MNaCl， 0.05MEDTA, 0.01M Tris-Cl pH8.0，蛋白酶K， 200ug/ml) 400ul。然后50。C保溫過夜。每管加入200ul飽和的NaCl (6M), 劇烈震蕩混勻，然后置于冰上10min。室溫14000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移 到干凈的Eppendorf管中，每管加入0.8ml乙醇，混勻。14000rpm離心5min, 棄上清，室溫干燥后將DNA重懸于50 100ulTE中。2) PCR鑒定小鼠的基因型引物l (5， acaggactcaccggagcaagcgctcat 3，)位于于成熟肽基因5，端，引物 2 (5，gaacgagatcagcagcctctgttcca3，)位于Neo基因上。引物3 (5 ，gaactcccagtgtggataagtaga3 ，)位于成熟肽基因下游非編碼區(qū)，引物4(5'aatagtagagaagcagccatcagagca 3，)位于下游同源臂5，端。以提取的小鼠基 因組DNA(lng)為摸板，用引物l+引物2各100ng，Pfo高保真酶2.5單位，dNTP 250nmol/L， 2,5mmol/L MgC12， 25mmol/L TrisHCl(pH8.3)進(jìn)行PCR^應(yīng)(94。C 30秒，55。C30秒，72。Cl分鐘，使用Perkin Elmer 9700型PCR儀，共30循環(huán))， PCR產(chǎn)物經(jīng)l。/o瓊脂糖電泳，在野生型C57BL/6J小鼠中沒有特異性擴(kuò)增條帶出 現(xiàn)；在雜合子和純合子轉(zhuǎn)基因小鼠中將有1200bP的擴(kuò)增條帶。擴(kuò)增條帶經(jīng)分 離純化后用于測序，以確定為人NGF成熟肽基因。以引物3+引物4各100ng 為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(條件同上，但72。C延伸時間2分鐘)，PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖電泳，野生型C57BL/6J將出現(xiàn)190bp的條帶；雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠也 會出現(xiàn)一條l卯bp條帶，但在2000bp處還會出現(xiàn)一條擴(kuò)增帶；純合子轉(zhuǎn)基因小 鼠只在2000bp出現(xiàn)一條擴(kuò)增帶(圖6)。3)純合子小鼠的NGF成熟肽基因序列測定剪純合子小鼠尾巴尖約0.5cm放入Eppendorf管中。每管加入鼠尾裂解緩 沖(0.50/oSDS，0.1MNaCl，0.05MEDTA，0.01MTris-ClpH8.0，蛋白酶K， 200ug/ml) 400ul。然后50。C保溫過夜。每管加入200ul飽和的NaCl (6M)， 劇烈震蕩混勻，然后置于冰上10min。室溫14000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移 到干凈的Eppendorf管中，每管加入0.8ml乙醇，混勻。14000rpm離心5min， 棄上清，室溫干燥后將DNA重懸于50 100ulTE中。設(shè)計(jì)成熟肽基因上游引物 (5，AATCCCTTTCAACAGGACTCACCGGAGCAA3，)和NGF成熟肽下游引 物(5'AAGGGGGCTGCAGGCAAGTCAGCCTCTTC 3，)。以提取的小鼠基 因組DNA(1嗎)為摸板，PfU高保真酶進(jìn)行PCRA應(yīng)(94。C30秒，55。C30秒， 72。Cl分鐘，使用Perkin Elmer 9700型PCR儀,共30循環(huán))，PCR產(chǎn)物經(jīng)l。/。瓊脂 糖電泳后純化，TA克隆后測序。測序結(jié)果表明成熟肽基因?yàn)槿藀-NGF成熟 肽基因。序列如下TCATCATCCCATCCCATCTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGAGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATT GTACCACGACTCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCATGGATGGCAAGC AGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCTGTGTGTGTGTGCT CAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA 4)Southern雜交筌定提取鼠尾基因組DNA后用EcoRI消化。用打靶栽體5 ，端的探針aii行 Southem印跡，野生型C57BL/6J應(yīng)該在10kb處有一陽性條帶。而因?yàn)樵谌薔GF 成熟肽基因中有一EcoRI位點(diǎn)，所以在雜合子子代小鼠中在5kb處還會有一條 陽性帶。在純合子轉(zhuǎn)基因小鼠中只有5kb處陽性條帶(圖7)。實(shí)施例8 P-NGF突變體基因定位整合小鼠的鑒定1) PCR鑒定和結(jié)果同實(shí)施例72) 純合子小鼠的NGF成熟肽基因序列測定剪純合子小鼠尾巴尖約0.5cm放入Eppendorf管中。每管加入鼠尾裂解緩 沖(0.5%SDS，0.1MNaCl，0.05MEDTA，0.01MTris-ClpH8.0，蛋白酶K， 200ug/ml) 400ul。然后50。C保溫過夜。每管加入200ul飽和的NaCl (6M), 劇烈震蕩混勻，然后置于冰上10min。室溫14000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移 到干凈的Eppendorf管中，每管加入0.8ml乙醇，混勻。14000rpm離心5min， 棄上清，室溫干燥后將DNA重懸于50 100ulTE中。設(shè)計(jì)成熟肽基因上游引物 (5'AATCCCTTTCAACAGGACTCACCGGAGCAA3，)和NGF成熟肽下游引 物(5，AAGGGGGCTGCAGGCAAGTCAGCCTCTTC3，)。以提取的小鼠基 因組DNA(1嗎)為摸板，Pfii高保真酶進(jìn)行PCR^應(yīng)(94。C30秒，55。C30秒， 72。Cl分鐘，使用PerkinElmer9700型PCR儀，共30循環(huán))，PCR產(chǎn)物經(jīng)l。/o瓊脂 糖電泳后純化，TA克隆后測序。測序結(jié)果表明成熟肽基因?yàn)樾∈骵-NGF突 變體成熟肽基因。序列如下TCATCCACCCACCCAGTCTTCCACATGGGGGAGTTCTCAGTGTGTGAC AGTGTCAGTGTGTGGGTTGGAGATAAGACCACAGCCACAGACATCGCCGGCGCGGCTGT GACAGTGCTGGCCGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAGACAGTACTTTTTTGAGACC AAGTGCCGAGCCTCCAATCCTGTTGAGAGTGGGTGCCGGGGCATCGACTCCAAACACTGG AACTCATACTGCACCACGACTCACACCTTCGTCAAGGCGTTGACAACAGATGAGAAGCA GGCTGCCTGGAGGTTCATCCGGATAGACACAGCCTGTGTGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTACAAGAAGAGGCTGA3) Southern印跡鑒定提取鼠尾基因組DNA后用5awffl消化。用下游同源臂5，端的探針b進(jìn)行 Southem印跡，野生型C57BL/6J應(yīng)該在800bp處有一陽性條帶。而在P-NGF 突變基因同源重組后，由于兩個丑a附ffl位點(diǎn)之間插入了neo基因，所以雜合 子小鼠在2.7kb左右還會有一條陽性條帶。純合子轉(zhuǎn)基因小鼠中只有2.7kb處 陽性條帶(圖8)。實(shí)施例9人NGF成熟肽基因定位整合的小鼠頜下腺中神經(jīng)生長因子的提取 1)提取方法健康雄性小鼠，體重30 40g,在一級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，頸推脫臼處死后， 立即摘取頜下腺。按l: 2 5(g:ml)加入純化水，用高速組織粉碎機(jī)充分 勻漿，勻漿液再用冷純化水稀釋2 3倍后12000rpm離心1小時，取離 心上清液在0.02M pH6.8 PB中充分透析。CM-S印harose FF層析柱用 0.02MpH6.8PB充分平衡后上樣。上樣后用平衡液沖洗，收集蛋白流出 峰。蛋白流出液置0.25mM pH6.8 PB中透析24h,其間換透析液2 ~ 3次。 透析后液加1M乙酸緩沖液(pH4.0)迅速降低pH至4.0，然后加NaCl 使成0.4M，靜置約5min后10000g離心30min，取上清。CM-Sepharose FF層析柱用pH4.0 、 0.05M乙酸液(含0.4MNaCl)充分平衡后上樣， 上樣后用平衡液沖洗到基線后再用pH9.0, 0.05MTris緩沖液洗脫雜峰至 基線后，在該液下用0~0.4M NaCl梯度洗脫，收集目標(biāo)蛋白峰。然后目標(biāo)蛋白經(jīng)凝膠過濾層析，Superdex G75 prep grade層析柱用0.05M pH9.0 (含0.15M NaCl)充分平衡后上樣，收集目標(biāo)蛋白峰。經(jīng)凝膠過 濾層析純化的蛋白用孔徑20nm除病毒膜包過濾除病毒，收集濾過液。2)電泳鑒定提取的蛋白利用SDS-PAGE鑒定其分子量大小(鑒 定結(jié)果見圖9)。同時做等電聚焦電泳以測定蛋白的等電點(diǎn)(鑒定結(jié)果見 圖10)。實(shí)施例10 P-NGF突變基因定位整合小鼠頜下腺中神經(jīng)生長因子的提取方法同實(shí)施例9， SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖9實(shí)施例11人神經(jīng)生長因子的比活測定以進(jìn)一步鑒定實(shí)施例9所提取蛋白質(zhì)采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法測定培養(yǎng)瓶底部涂鼠尾膠，干燥，用含 10%FCS DMEM培養(yǎng)液洗滌2次后加3ml DMEM培養(yǎng)液平衡過夜，臨用倒 棄培養(yǎng)液。取8日齡雞胚背根神經(jīng)節(jié)(DRG)，接種于涂有鼠尾膠原的培養(yǎng) 瓶中，每瓶接種3-5個神經(jīng)節(jié)。置二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，5%C02, 37"C培養(yǎng)2 小時后，加入用DMEM培養(yǎng)液按3倍梯度稀釋的NGF待測樣品。結(jié)果判斷 標(biāo)準(zhǔn)無突起生長判為"-"，少量突起判為"+ ",突起較長較密據(jù)其程度判 為"++" "+++"，突起最長最密為"++++"，過量抑制以"#，，表示。以生長最長 最密時每毫升中待測樣品的含量作為一個活性單位。測活結(jié)果見圖11。(圖9 說明圖ll重組人NGF誘導(dǎo)雞胚背根神經(jīng)節(jié)分化l:27ng/mlNGF;2:9ng/ml NGF; 3: 3ng/mlNGF; 4: lng/mlNGF; 5: 0.33ng/mlNGF; 6:陰性對照， DRG培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中)。實(shí)施例12突變體NGF的生物學(xué)特性鑒定及其活性測定 1)突變NGF的受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)將野生型小鼠NGF和突變的NGF用1251標(biāo)記。然后分別加入表達(dá)TrkA的細(xì) 胞和表達(dá)P75的A875人黑腫瘤細(xì)胞中。配體和受體復(fù)合物用 JV-hydroxysuccinimi(iyl-4-azidobenzoate進(jìn)行化學(xué)鉸鏈，裂解細(xì)胞，鉸鏈后的復(fù) 合物在4匸免疫沉淀過夜，SDS電泳后放射自顯影。結(jié)果顯示突變的NGF和野 生型的NGF都能夠與高親合力受體TrkA結(jié)合，而突變后的NGF不能與P75結(jié)合。圖12 (說明1 TrkA-WtNGF復(fù)合物放射自顯影2 TricA-MutantNGF復(fù)合 物放射自顯影3 P75-WtNGF復(fù)合物放射自顯影4 P75 Mutant NGF復(fù)合物放 射自顯影)2)突變NGF比活性測定采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法測定培養(yǎng)瓶底部涂鼠尾膠，千燥，用含 10%FCS DMEM培養(yǎng)液洗滌2次后，加3ml DMEM培養(yǎng)液平衡過夜，臨用倒 棄培養(yǎng)液。取8日齡雞胚背根神經(jīng)節(jié)(DRG)，接種于涂有鼠尾膠原的培養(yǎng) 瓶中，每瓶接種3-5個神經(jīng)節(jié)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)無突起生長判為"-，，，少量 突起判為"+ "，突起較長較密據(jù)其程度判為"++"~"+++",突起最長最密為 "++++",過量抑制以"#"表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高濃度的情況下突變NGF和野生 型NGF對促進(jìn)神經(jīng)節(jié)生長的能力相當(dāng)(27ng/ml、 9ng/ml、)。而在低濃度下 (3ng/ml 、 lng/ml、 0.3ng/ml)促進(jìn)神經(jīng)節(jié)生長的能力明顯減弱。測定方法同實(shí)施例11實(shí)施例13人神經(jīng)生長因子制劑配方1)人神經(jīng)生長因子凍干制劑神經(jīng)生長因子半成品用Lowry法測定含量，將蛋白液用無熱原25mM、 pH6.8的PB(含0.05%人血白蛋白、5%甘露醇)稀釋至所需體積，經(jīng)0.22拜 濾膜過濾后，無菌分裝后冷凍、千燥，軋蓋，4'C保存。 2)人神經(jīng)生長因子水針劑神經(jīng)生長因子半成品用Lowry法測定含量，將蛋白液用無熱原25mM、 pH6.8的PB(含0.05%人血白蛋白)#釋至所需體積，經(jīng)0.22拜濾膜過濾后， 無菌分裝后軋蓋，-20°(:保存。3)神經(jīng)生長因子滴眼液神經(jīng)生長因子半成品用Lowry法測定含量，將蛋白液用無熱原20mM、 pH6.8的PB(^f濃度均為3.33mg/ml甘氨酸、丙氨酸和精氨酸及0.5%NaCl) 稀釋至所需體積，經(jīng)0.22pm濾膜過濾后，無菌分裝后軋蓋，-20°(:保存。 實(shí)施例14突變神經(jīng)生長因子制劑配方方法同實(shí)施例13根據(jù)上述，顯然可對本發(fā)明作大量的改變。因此，在所附的權(quán)利要求范 圍內(nèi)，除了上述具體描述的方法外，可用其它方法實(shí)施本發(fā)明。SEQUENCE LISTING<110>北京三諾佳邑<120>神經(jīng)生長因子基因定位改造動物及其制備方法和應(yīng)用 <130> OICN073024 <160> 26<170> Patentln vision 3.3<210> 1<211> 33<212> DNA <213>人工序列<400> 1cggaa加gt ccctagctca cttcattc助鵬 3 3<210> 2<211> 40<212> DNA <213>人工序列<400> 2ggaaga鵬at鵬agpt鵬cgcttgctcc鵬agt 40<210> 3<211> 50<212> DNA <213>人工序列<400> 3actcaccgga gc鄉(xiāng)cgctc atectcccat cccatc加c acag^gcga 50<210> 4<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 421gggctgcagg caagtc^gc tcttctcaca gcctt 3 5<210> 5<211> 47<212> DNA <213>人工序列<400> 5aaggctgtga gaagagcctg acttgcclgc agcccccttc cccacct 47<210> 6<211> 30<212> DNA <213>人工序列<400> 6accagatctg ccatgacagg cctcaggaga 30<210> 7<211> 41<212> DNA <213>人工序列<400> 7cggaattcgt cgacggtttc atgtte^at tgcctttgct c 41<210> 8<211> 46<212> DNA <213>人工序列<400> 8cggaattcgc ggccgctcct ggaaccagga gtcag^gga atggat 46<210> 9<211> 40<212> DNA <213>人工序列<400> 9ggaagactgg gtgggtggat gagcgcttgc tccggagt 40<210> 10<211> 49<212> DNA <213>人工序列<400> 10actcaccgga gcaagcgctc atccacccac ccagtcttcc acatggggg 49<210> 11<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 11gggctgcagg caagtcagcc tcttcttgta gcctt35<210> 12<211> 47<212> DNA <213>人工序列<400> 12aaggctacaa gaagaggctg acttgcctgc agcccccttc cccacct 47<210> 13<211> 27<212> DNA <213>人工序列<400> 13gctcatcctc ccatcccatc ttccaca 27<210> 14<211> 26<212> DNA <213>人工序列<400> 143g咖gagatc agcagcctct gttcca<210> 15<211> 27<212> DNA <213>人工序列<400> 15gctcatccac ccacccagtc ttccaca<210> 16<211> 26<212> DNA <213>人工序列<400> 16gaacgagatc agcagcctet gttcca<210> 17<211> 27<212> DNA <213>人工序列<400> 17acaggactca ccggagcaag cgcteat<210> 18<211> 26<212> DNA <213>人工序列<400> 18gaacgagatc agcagcctet gttcca<210> 19<211> 24<212> DNA <213>人工序列g(shù)aactcccag tgtggat鄉(xiāng)啤a 24<210> 20<211> 27<212> DNA <213>人工序列<400> 20aatagtagag aagcagcoat c呢agca 27<210> 21<211> 30<212> DNA <213>人工序列<400> 21aatccctttc aacaggactc accggagcaa 30<210> 22<211> 29<212> DNA <213>人工序列<400> 22旭gggggctg caggcaagtc agcctcttc 29<210> 23<211> 363<212> DNA <213>測序結(jié)果<400> 23tcatcatccc atcccatctt ccacaggggc gaattctcgg tgtgtgacag tgtcagcgtg 60tgggttgggg ataagaccac cgccacagac atcaa^gca aggaggtgat ggtgttggga 120gaggtgaaca ttaacaacag tgtattcaaa cagtactttt ttgagaccaa gtgccgggac 180ccaaatcccg ttgacag鄉(xiāng)gtgixggggc attgactc助agcact^aa ctcatattgt 240accacgactc acacctttgt caa^cgctg accatg^^ gcaagcaggc tgcctggcgg 3 00tttatccgga tagatacggc ctgtgtgtgt gtgctcagca ggaaggctgt gagaagagcc tga<210> 24<211> 30<212> DNA <213>人工序列360 363<400> 24aatccctttc aacaggacte accggagcaa<210> 25<211> 29<212> DNA <213>人工序列<400> 25aagggggctg c鄉(xiāng)caagtc agcctcttc<210> 26<211> 363<212> DNA <213>測序結(jié)果<400> 26tcatccaccc acccagtctt ccacatgggg gagttctcag tgtgtgacag tgtcagtgtg tgggttggag ataagaccm;鄉(xiāng)cacagac atcgccggcg cggctgtgac agtgctggcc gaggtgaaca ttaacaacag tgtattcaga cagtactttt ttgagaccaa gtgccgagcc tccaatcctg ttgagagtgg gtgccggggc atcgactcca aacactggaa ctcatactgc accacgactc acaccttcgt caaggcgttg acaacagatg agaagcaggc tgcctggagg ttcatcc銘a tagacacagc ctgtgtgtgt ggctcagca ggaaggctac aagaagaggc tga302960120180240300 360 36權(quán)利要求
1. 一種轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物，其特征在于所述動物基因組中的NGF-β基因被改變，所述動物表達(dá)該動物NGF-β的突變體蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物，其特征在于所述動物表達(dá) 人源NGF-p蛋白或其突變體蛋白質(zhì)。
3. 根無權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物，其特征在于所述動物 的基因組中至少一條染色體上的NGF-p基因被該動物NGF-p基因的突變體所 替換。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物，其特征在于所述動物 的基因組中的全部NGF-p基因都被該動物NGF-P基因的突變體所替換。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物，其特征在于所 述的嚙齒類動物為小鼠。
6. —種獲得權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因動物的方法，其特征在 于通過同源重組技術(shù)使所述動物的NGF-p基因被改變，進(jìn)而使該動物表達(dá)該 動物NGF-p的突變體蛋白質(zhì)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述動物表達(dá)人源NGF-(3蛋白質(zhì)或其突變體蛋白質(zhì)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于包括以下步驟1) 構(gòu)建打靶栽體，其中所述栽體含有外源NGF-(3基因或突變的NGF-卩基因；2) 使用步驟l)中所構(gòu)建的打靶載體轉(zhuǎn)染胚胎千細(xì)胞； 3 )制備餘沐囊胚；4) 將步驟2)中獲得的經(jīng)過轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞顯微注射入步驟3)中所獲 得的供體囊胚中；5) 將步驟4)中所獲得的供體囊胚轉(zhuǎn)移到受體動物的子宮中；以及6) 獲得轉(zhuǎn)基因動物。
9. 一種制備嚙齒類動物NGF-jJ的突變體蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括以 下步驟1) 培養(yǎng)4,權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的嚙齒類動物； 2) 從步驟1)中所培養(yǎng)的動物的組織中提取目標(biāo)蛋白。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述嚙齒類動物為小鼠。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于所迷的組織為頜下腺。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9 11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所提取的目標(biāo)蛋 白是人源NGF-p蛋白質(zhì)或其突變體蛋白質(zhì)。
13. 通過權(quán)利要求9 12中任一項(xiàng)所述的方法所制備的蛋白質(zhì)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)被制成藥學(xué)上 可以接受的制劑。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)被制成注射劑 或滴眼液的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過轉(zhuǎn)基因方法獲得的動物及其制備方法和應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及利用胚胎干細(xì)胞(ES)培養(yǎng)技術(shù)和同源重組技術(shù)將目的基因定位整合到小鼠基因組中，從而獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因動物。該方法得到的動物可以應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和獲得目的蛋白。更具體地本發(fā)明涉及使用神經(jīng)生長因子基因定位改造小鼠及其制備人源性神經(jīng)生長因子及其突變體蛋白質(zhì)的方法和應(yīng)用。
文檔編號C12N15/85GK101260398SQ20071008601
公開日2008年9月10日 申請日期2007年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日
發(fā)明者馮宇霞, 周志文, 張洪山, 陳紅波 申請人:舒泰神(北京)藥業(yè)有限公司