專利名稱：用于測(cè)定甲型h1n1流感病毒全基因序列的引物及測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲型Hmi流感病毒檢測(cè)技術(shù)，具體地說，涉及一種用于測(cè)定甲型Hmi 流感病毒全基因序列的引物及其試劑盒。
背景技術(shù)：
流行性感冒(流感)是由流行性感冒病毒(流感病毒)的引起的呼吸系統(tǒng)傳染病。流 感病毒屬于正粘病毒科，是負(fù)單鏈RNA病毒。流感病毒根據(jù)核蛋白(Nucleoprotein，NP)和 基質(zhì)蛋白(Matrix protein, MP)抗原性的不同分為甲、乙、丙三種分型，均可以感染人。其 中甲型流感病毒的變異能力最強(qiáng)，能引起流感季節(jié)性流行或流感大流行。乙型流感病毒變 異能力較弱，一般起流感季節(jié)性流行。丙型流感病毒抗原性比較穩(wěn)定，較少引起流行。甲型流感病毒自1918年從鳥類進(jìn)入人際傳播，引起西班牙流感大流行。甲型流感 病毒通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換發(fā)生變異，產(chǎn)生病毒變異株或新的病毒亞型，是甲型流感病 毒在人群引起季節(jié)性流行的流感大流行的主要原因。人際流行毒株和禽流感病毒通過抗原 轉(zhuǎn)換發(fā)生重組，引起1957年和1968年兩次流感大流行，分別把H2N2和H3N2兩種流感病毒 亞型帶入人群中。流感大流行使一種病毒亞型持續(xù)在人群中傳播，引起季節(jié)性流感流行直 至下一次流感大流行。HlNl自1957年停止在人群中傳播，1977年重新進(jìn)入人際流行。H2N2 自1968年后不在人群中流行。目前Hmi和H3N2兩種甲型流感病毒同時(shí)在人群中流行。甲型流感病毒的病毒體結(jié)構(gòu)主要包括包膜和核衣殼。病毒體包膜上鑲嵌著兩種糖 蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, ΝΑ)。目前已鑒定了 16 種HA (Η1-Η16)和9種NA (Nl-N9)0甲型流感病毒通過HA和NA不同的組合方式而形成多 種亞型，如曾在人群中流行的Hmi、H2N2和H3N2。病毒核衣殼位于病毒體的核心，主要成分 是由病毒RNA和NP組成的核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)，在RNP上附著著RNA聚 合酶復(fù)合體蛋白(PB1，PB2和PA)。甲型流感病毒基因組包括8個(gè)基因片段，編碼11種蛋白 質(zhì):ΗΑ, ΝΑ, NP, Ml, M2, PA, PBl, PB2, PB1-F2 和，PB2,以及兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein, NS) NSl, NS2 (NEP)02009年4月，從墨西哥和美國(guó)的流感患者身上鑒定一種新的豬源Hmi流感病毒。 隨著新甲型Hmi在世界范圍迅速傳播，世界衛(wèi)生組織(World health organization, WHO) 于2009年6月11日宣布將流感大流行警戒級(jí)別提升至最高級(jí)別6級(jí)，宣布流感疫情進(jìn)入 全球大流行階段。在流感大流行的初期進(jìn)行病毒傳播的密切監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病例，迅速進(jìn)行 鑒定，對(duì)減低流感大流行的危害具有十分重要的意義。根據(jù)流感流行的規(guī)律，新的流感變異株產(chǎn)生后，世界各國(guó)的人口聚居地都會(huì)先出 現(xiàn)輸入性病例傳入，繼而相繼蔓延為以本地感染為主的社區(qū)流行和地域大流行。在這次甲 型Hmi流感當(dāng)中，包括我國(guó)在內(nèi)的一些國(guó)家由于早期采取了嚴(yán)格的防控措施，有效推遲了 本土病例的傳播，為藥物儲(chǔ)備和疫苗研發(fā)爭(zhēng)取到了寶貴的時(shí)間。本研究組參與甲型Hmi流 感的廣東省的密切監(jiān)測(cè)。2009年5月18日成功對(duì)廣東首例輸入性甲型Hmi流感疑似病例進(jìn)行第一時(shí)間核酸檢測(cè)，確定傳染源，對(duì)尋找、隔離密切接觸者的工作贏得寶貴時(shí)間。但 是我們也發(fā)現(xiàn)根據(jù)WHO推薦的46對(duì)全基因測(cè)序引物(http://WWW. who. int/csr/disease/ swineflu/en/index. html )，出現(xiàn)三分之一以上的引物特異性差及靈敏度低的現(xiàn)象，嚴(yán)重影 響對(duì)甲型Him流感病毒全基因序列測(cè)定監(jiān)控的進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種能用于測(cè)定甲型Hmi流感病毒全基 因序列的引物。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種用于測(cè)定甲型Hmi流感病毒全基因序列的引物，包含48對(duì)特異性引物，48對(duì)特異 性引物分成12組用于檢測(cè)甲型Hmi流感病毒HA片段全基因編碼序列，甲型Hmi流感病 毒HA片段全基因包括ΗΑ，ΝΑ, NP, Ml, M2，PA, PBl和PB2八個(gè)片段；
第1組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒HA基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO -J, SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 11所示核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 12 所示核苷酸序列；
第2組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒NP基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :15，SEQ ID NO :17，SEQ ID NO :19，SEQ ID NO 21 所示核 苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22所示核苷酸序列；
第3組物用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒NA基因片段的引物核苷酸序列，其上游 引物如 SEQ ID NO 23, SEQ ID NO :25，SEQ ID NO :27，SEQ ID NO :29，SEQ ID NO 31 所示 核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32所示核苷酸序列；
第4組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒M基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物 如 SEQ ID NO 33, SEQ ID NO :35，SEQ ID NO :37，SEQ ID NO 39 所示核苷酸序列，其下游 引物相對(duì)應(yīng)如 SEQ ID NO 34, SEQ ID NO :36，SEQ ID NO :38，SEQ ID NO 40 所示核苷酸序 列；
第5組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒NS基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如SEQ ID NO 41, SEQ ID NO :43，SEQ ID NO :45所示核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如 SEQ ID NO 42, SEQ ID NO :44，SEQ ID NO 46 所示核苷酸序列；
第6組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒PB2基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 49，SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 53，SEQ ID NO 55，SEQ ID NO 57, SEQ ID NO 59, SEQ ID N0:61，SEQ ID NO :63所示核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如 SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :50，SEQ ID NO :52，SEQ ID NO :54，SEQ ID NO :56，SEQ ID NO 58，SEQ ID NO :60，SEQ ID NO :62，SEQ ID NO 64 所示核苷酸序列；
第7組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒PBl基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 65, SEQ ID NO :67，SEQ ID NO :69，SEQ ID NO -Jl, SEQ ID NO :73，SEQ ID NO 75, SEQ ID NO :77，SEQ ID NO :79所示核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如SEQ ID NO:ID NO :70，SEQ ID NO -J2, SEQ ID NO :74，SEQ ID NO :76，SEQ ID NO 78, SEQ ID NO 80所示核苷酸序列；
第8組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒PA基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 81, SEQ ID NO :83，SEQ ID NO :85，SEQ ID NO :87，SEQ ID NO :89，SEQ ID NO 91, SEQ ID NO :93，SEQ ID NO :95所示核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如SEQ ID NO: 82，SEQ ID NO :84，SEQ ID NO :86，SEQ ID NO :88，SEQ ID NO :90，SEQ ID NO :92，SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 96所示核苷酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供甲型Hmi流感病毒全基因序列的測(cè)定方法，其采用 常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò)增樣品的核酸片段，PCR總體系中添加各種引物濃度為0. 2 μ mol/1 ；其他 試劑可使用常規(guī)的的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)混合液，包括Taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，一步法RT-PCR反應(yīng) 緩沖液；PCR運(yùn)行條件為95 °C預(yù)變性，5 min ；95 °C變性，30 s ；55 °C退火，30 s ；72 V 延伸，60 s;回到步驟2，重復(fù)循環(huán)30次；72 °C,10 min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明利用一對(duì)待測(cè)甲型流感病毒病原體核酸序列的特異性、高效性及重疊性高的引 物，通過常規(guī)PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)靶核酸序列片段的擴(kuò)增，再進(jìn)行分小片段測(cè)序而高效率的測(cè)定 甲型流感病毒全基因組。優(yōu)點(diǎn)如下
1.操作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定，48個(gè)PCR反應(yīng)過程均在同一條件下進(jìn)行，效率高，可根據(jù)需要。2.靈敏度高，48個(gè)PCR反應(yīng)均能高效進(jìn)行。3.特異性強(qiáng)，48個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物均為單條泳帶。4.適用范圍廣，取樣簡(jiǎn)單。樣品中DNA、肝素、EDTA、檸檬酸鹽、血紅蛋白、白蛋白 和脂質(zhì)等的污染將不會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響，因而適用于各種待測(cè)樣品如咽喉拭子、血液等。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1.使用本發(fā)明引物對(duì)1株甲型流感病毒全基因分段PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)其進(jìn)行各種改造和修改，這些等價(jià)形式同樣落入本發(fā)明 的保護(hù)范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商 所建議的條件。實(shí)施例1 引物和探針的設(shè)計(jì)
通過分別對(duì)所有GenBank數(shù)據(jù)庫中已知100株甲型Hmi病毒株的基因序列進(jìn)行比對(duì) 分析，選擇高度保守的區(qū)段，設(shè)計(jì)48對(duì)引物和探針，如SEQ ID NO:廣96所述。引物設(shè)計(jì)的 原則如下
(1)引物長(zhǎng)度約20-23nt，GC含量在45%_55%之間。
(2) PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度一般在400-600 bp之間。(3)對(duì)于同一個(gè)模板片段，設(shè)計(jì)引物使每個(gè)位點(diǎn)有2-3個(gè)PCR擴(kuò)增片段覆蓋，以避 免PCR反應(yīng)發(fā)生點(diǎn)突變影響結(jié)果判讀。
分析上述病毒特異性基因的信息，經(jīng)序列分析軟件DNASTAR進(jìn)行引物間/內(nèi)二聚體的 排除，并經(jīng)BLAST驗(yàn)證引物的特異性與相近病原體的同源性，設(shè)計(jì)出針對(duì)上述病原體檢測(cè) 的引物和探針。實(shí)施例2 =PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建與優(yōu)化 1.樣本采集
本實(shí)驗(yàn)室于2009年5月17日及5月觀日采集三例疑似病例樣本，包括廣東省首例輸 入性甲型Hmi疑似病例以及我國(guó)第1例和第2例甲型Hmi 二代疑似病例戴某和薛某的鼻 /咽拭子標(biāo)本。2.鼻/咽拭子標(biāo)本RNA的提取
使用 QIAmp MiniElute Virus Spin Kit (Qiagen, Chatsworth, CA)提取鼻 / 咽拭子 標(biāo)本的RNA，操作按照說明書進(jìn)行
(1)第一次使用此試劑盒時(shí)，在AWl和AW2緩沖液中按照試劑瓶上提示體積加入100% 乙醇，19 ml Affl中加入25 ml無水乙醇，13 ml Affl中加30 ml無水乙醇；在AL中加入28 μ g/ml carrier RNA。(2)取 25 μ 1 Qiagen Protease 放入 1. 5 ml 離心管中。(3)在生物安全柜內(nèi)將呼吸道樣本(鼻拭子和咽拭子)取200 μ 1加入此管中，充 分混勻。若標(biāo)本不足200 μ 1，則用生理鹽水補(bǔ)足至終體積為225 μ L·(4)在每管分別加入200 μ 1 AL (內(nèi)需要提前加入沘μ g/ml carrier RNA)，充 分混勻振蕩15 s。56°C孵育15 min0短暫離心，將管蓋上的液體離到管底。(5)加入250 μ 1無水乙醇，充分混勻振蕩15 s，室溫(15_25°C )裂解5 min。短 暫離心，將管蓋上的液體離到管底。(6)將上述裂解液加入QIAamp MinElute離心柱上，6000 g(8000 rpm)，室溫離心 1 min，棄收集管中的離心液。濾柱仍放回收集管上，將步驟3)剩余的混合液全部吸入濾柱 中，離心后棄離心液。(7)于濾柱中加入500 μ 1 AWl液，6000 g (8000 rpm)，室溫離心1 min，棄收集
管中的離心液。(8)從試劑盒中取一支干凈的2 ml收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于 濾柱中加入500 μ 1 AW2液，6000 g(8000 rpm)，室溫離心1 min。將濾柱移到一個(gè)干凈的 收集管中，加入500 μ 1無水乙醇，6000 g (8000 rpm)，室溫離心1 min。(9)將濾柱移到一個(gè)干凈的收集管中，20000 g (14000 rpm)，室溫離心3 min。離 心后將濾柱放在56°C，3 min以干燥濾膜。(10)將濾柱放在1. 5 ml Eppendorf管上，向?yàn)V柱中加入20-150 μ 1的AVE液，室 溫靜置1 min。20000 g (14000 rpm)室溫離心1 min，收集離心液即為提取的核酸。提取 的核酸溶液分裝三份至0. 2 ml PCR管中，一份用于檢測(cè)，其他保存，用于后續(xù)的研究。(Il)RNA純度和濃度檢測(cè)取2 μ 1 RNA溶液，以核酸蛋白定量?jī)x(NanoDrop
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定甲型Hmi流感病毒全基因序列的引物，其特征在于，包含48對(duì)特異性 引物，48對(duì)特異性引物分成12組用于檢測(cè)甲型Hmi流感病毒HA片段全基因編碼序列，甲 型Hmi流感病毒HA片段全基因包括ΗΑ，ΝΑ, NP, Ml, M2，PA, PBl和PB2八個(gè)片段；第1組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒HA基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO -J, SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 11所示核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 12 所示核苷酸序列；第2組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒NP基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :15，SEQ ID NO :17，SEQ ID NO :19，SEQ ID NO 21 所示核 苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22所示核苷酸序列；第3組物用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒NA基因片段的引物核苷酸序列，其上游 引物如 SEQ ID NO 23, SEQ ID NO :25，SEQ ID NO :27，SEQ ID NO :29，SEQ ID NO 31 所示 核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32所示核苷酸序列；第4組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒M基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物 如 SEQ ID NO 33, SEQ ID NO :35，SEQ ID NO :37，SEQ ID NO 39 所示核苷酸序列，其下游 引物相對(duì)應(yīng)如 SEQ ID NO 34, SEQ ID NO :36，SEQ ID NO :38，SEQ ID NO 40 所示核苷酸序 列；第5組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒NS基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如SEQ ID NO 41, SEQ ID NO :43，SEQ ID NO 45所示核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如 SEQ ID NO 42, SEQ ID NO :44，SEQ ID NO 46 所示核苷酸序列；第6組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒PB2基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 47, SEQ ID NO :49，SEQ ID NO :51，SEQ ID NO :53，SEQ ID NO :55，SEQ ID NO 57, SEQ ID NO 59, SEQ ID N0:61，SEQ ID NO :63所示核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如 SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :50，SEQ ID NO :52，SEQ ID NO :54，SEQ ID NO :56，SEQ ID NO 58，SEQ ID NO :60，SEQ ID NO :62，SEQ ID NO 64 所示核苷酸序列；第7組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒PBl基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 67，SEQ ID NO 69，SEQ ID NO 71, SEQ ID NO 73，SEQ ID NO 75, SEQ ID NO :77，SEQ ID NO :79所示核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如SEQ ID NO: 66，SEQ ID NO :68，SEQ ID NO :70，SEQ ID NO -J2, SEQ ID NO :74，SEQ ID NO :76，SEQ ID NO 78, SEQ ID NO 80所示核苷酸序列；第8組用于檢測(cè)和鑒定甲型Hmi流感病毒PA基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 81, SEQ ID NO :83，SEQ ID NO :85，SEQ ID NO :87，SEQ ID NO :89，SEQ ID NO 91, SEQ ID NO :93，SEQ ID NO :95所示核苷酸序列，其下游引物相對(duì)應(yīng)如SEQ ID NO: 82，SEQ ID NO :84，SEQ ID NO :86，SEQ ID NO :88，SEQ ID NO :90，SEQ ID NO :92，SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 96所示核苷酸序列。
2.—種甲型Hmi流感病毒全基因序列的測(cè)定方法，其特征在于，采用常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò) 增樣品的核酸片段，PCR總體系中添加各種引物濃度為0.2 ymol/l，PCR運(yùn)行條件為95°C預(yù)變性，5 min ；95 °C變性，30 s ；55 °C退火，30 s ；72 °C延伸，60 s;回到步驟2，重復(fù)循 環(huán) 30 次；72 °C,10 min。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于測(cè)定甲型H1N1流感病毒全基因序列的引物及測(cè)定方法。本發(fā)明涉及48對(duì)特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好的引物，通過48個(gè)常規(guī)PCR反應(yīng)對(duì)甲型H1N1流感病毒8個(gè)片段基因序列測(cè)定，包括HA，NA，NP，M1，M2，PA，PB1，PB2片段。利用這48進(jìn)行檢測(cè)的方法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，特異性強(qiáng)，靈敏度高，適用于甲型H1N1流感病毒鑒定及流行病學(xué)調(diào)查研究等。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102140544SQ20111005895
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月11日
發(fā)明者何振健, 吳玨珩, 張定梅, 徐霖, 曹開源, 朱勛, 李蔓英, 李雋 , 楊紈, 袁潔, 黎孟楓 申請(qǐng)人:中山大學(xué)