專利名稱：引物序列內(nèi)包含無堿基部分的、用于pcr擴增的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及引物以及使用該引物進行PCR擴增的方法。更確切地說，本發(fā)明涉及能夠擴增不同模板、并且具有與模板DNA的突變位點或多態(tài)性位點互補的無堿基部分 (abasic parts)的引物，本發(fā)明還涉及使用該引物進行PCR擴增的方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈式反應(yīng)(以下稱為“PCR”)是使用最為廣泛的核酸擴增方法，所述方法由 重復(fù)的循環(huán)組成，所述循環(huán)包括雙鏈DNA的變性；將寡聚核苷酸引物退火至DNA模板；以 及通過DNA聚合酶將引物進行延伸(Mullis等人，美國專利No. 4，683，195、No. 4，683，202 和No. 4，800, 159 ；Saiki等人，1985)。將用于PCR的寡聚核苷酸引物設(shè)計成使其退火至DNA 的相反鏈(opposite strand)，將由DNA聚合酶形成的引物延伸產(chǎn)物作為另一引物的模板。 PCR擴增使得DNA序列的數(shù)目以指數(shù)方式增加，并且所擴增的DNA序列長度可通過寡聚核苷 酸引物的5'端決定。核酸擴增的成功，特別是PCR擴增的成功，取決于引物的靶特異性退火。因此，優(yōu) 化分子間的相互作用非常重要。其取決于退火溫度，所述退火溫度使得引物退火只進入其 完全互補體，或進入在核苷酸序列中有一處或多處錯配的序列。通常，隨著退火溫度升高， 引物退火至與所述引物完全匹配的特異性模板的機率也增加，這表明只擴增靶序列的機率 在增加。當退火溫度較低時，會產(chǎn)生模板和引物之間的錯配容許量(tolerance)，從而導(dǎo)致 非靶序列擴增的增加。因此，通過調(diào)節(jié)退火溫度，可以控制模板和引物之間的配對特異性。 舉例來說，如果只用一種引物進行擴增的對照組生成了不同的PCR產(chǎn)物，這表明該單個引 物退火進入模板的一個或多個區(qū)域。在這種情況下，優(yōu)選升高退火溫度。考慮到升高退火 溫度對于引物的退火特異性的影響，可通過溫度來調(diào)節(jié)引物的退火，并且需要開發(fā)退火調(diào) 節(jié)引物系統(tǒng)，所述系統(tǒng)有利于改進引物的退火特異性，而不考慮引物的設(shè)計。對于引物的退火特異性，不僅要考慮退火溫度，還應(yīng)考慮其他的引物參數(shù)，例如 引物長度、GC含量以及PCR產(chǎn)物的長度。當使用滿足所述參數(shù)的引物時，由于克服了背景 (background)問題以及引物生成非特異性產(chǎn)物的問題，引物的退火具有特異性，靶DNA擴 增的退火特異性得以改進。適當設(shè)計的引物不僅解決了非特異性退火問題和背景問題，還 促使從RNA-PCR的基因組模板中區(qū)分出cDNA。許多情況下，引物序列不必與模板序列完全互補。要求與模板完全匹配的區(qū)域為 3'端，因為這一區(qū)域正是通過DNA聚合酶進行延伸的區(qū)域。也就是說，所述區(qū)域?qū)τ诖_保 退火至靶序列的特異性最為重要。引物的5'端對于退火至靶序列的特異性而言是次要的， 為了傳遞另外的非互補序列(例如限制酶位點和啟動子序列)，可改變引物的5'端。在體外診斷中，分子診斷測試或核酸測試是發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域，其在世界市場 中顯示出大約20%的年增長率。在2003年，分子診斷測試占體外診斷市場總額的8%，達 到3萬億韓元的規(guī)模。但在2008年，其占到13%，并顯示出至少5萬億韓元的銷售額，表明 其年增長率為19%。分子診斷測試是一種對致病性病毒、細菌和真菌進行檢驗的PCR。更準確地說，其通過使用寡聚核苷酸(引物、探針)來檢驗病原體造成的感染，所述寡聚核苷 酸與特異性病原體基因的核苷酸序列互補。根據(jù)這一通過PCR對病原體感染進行診斷的方 法，將靶模板基因特異性引物用于只對所述靶基因進行篩選，從而判斷其是陽性還是陰性， 這比使用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附分析)進行的抗原-抗體分析在靈敏度和經(jīng)濟效率方面更 有優(yōu)勢。多重PCR是另外一種PCR，其便于使用一個或多個引物組從反應(yīng)物同時擴增 一個或多個靶序列。由于這一方法在1988年首次提出(Chamberlain等人，Deletion Screening of the Duchenne musculardystrophy locus via multiplex DNA Amplification, Nucleic Acids Res.，16，11141-11156，1988)，其已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于 DNA 分析的各種領(lǐng)域，所述分析包括基因缺失分析(匿名，Diagnosis ofDuchenne and Becker musculardystrophies by polymerase chain reaction,A multicenter study,JAMA 267, 2609-2615,1992 ;Henegariu等人，Rapid screening of the Y chromosome inidiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factorexpressed during spermatogenesis, Andrologia, 26,97—106,1994)、突變禾口多態(tài)性分析(Shuber 等 人，Efficient 12-mutation testing in the CFTR gene :a general model for complex mutation analysis, Hum. Mol. Geenet.,2,153-158,1993 ；Mutirangura 等 人’ Multiplex PCR of three dinucleotiderepeats in the Prader-ffi11i/AngeIman critical region(15ql1-q13) :moleculardiagnosis and mechanism of uniparental disomy, Hum. Mol. Genet. , 2, tube, BioTechniques 21，480-484，1996)、以及 RNA 檢測(Zou 等人，Identification ofnew influenzaB virus variants by multiplex reverse transcription-PCR and the heteroduplexmobility assay, J. Clin. Microbiol.，36，1544-1548，1998)。特別地，在診斷傳染性疾病方面，這一方 法對于鑒定病毒、細菌、真菌和/或寄生蟲很有價值且十分重要。然而，多重PCR經(jīng)常由于擴增中涉及的人為因素而產(chǎn)生復(fù)雜的結(jié)果，造成錯誤。因 此，所得到的結(jié)果包括由反應(yīng)失敗造成的“假陰性”以及因假產(chǎn)物的擴增而產(chǎn)生的“假陽 性”。產(chǎn)生假陽性結(jié)果的原因是引物退火至完全不同的序列，即使該序列與最初識別的序列 有關(guān)。在多重PCR中，必須對引物的雜交動力學進行設(shè)計，使其類似于另一種不同引物的雜 交動力學，所述另一種引物也用于同樣的多重反應(yīng)物。在一定程度上可對退火溫度和引物 濃度進行計算，而其他用于多重反應(yīng)的一般條件則憑經(jīng)驗進行確定。隨著引物組數(shù)目的增 力口，非特異性引發(fā)(priming)的機率也增加。因此，無論什么時候加入每個引物組，都需要 改變條件。此外，在多重PCR中，由與反應(yīng)物競爭而產(chǎn)生的人為因素(例如引物耗盡)會增 力口，并且隨著循環(huán)的重復(fù)，不同等地擴增的產(chǎn)物之間的產(chǎn)率差異會變大。因此，多重PCR反 應(yīng)條件的優(yōu)化會花費大量時間和勞動。每種多重PCR需要各不相同的唯一的反應(yīng)條件，從 而使得新型診斷方法的開發(fā)需要較高的成本。單核苷酸多態(tài)性(以下稱為“SNP”)是指在染色體的核苷酸序列中，根據(jù)種族、年 齡或性別，核苷酸多態(tài)性中一個不同的核苷酸對(nucleotidepair)會引起個體差異，這大 多在DNA核苷酸序列多態(tài)性中被發(fā)現(xiàn)。通常，在人類基因中，每1，000個核苷酸會有一個發(fā) 生突變。即使在患有相同疾病的患者中也觀察到了個體差異，其原因似乎是SNP的差異。目前為止開發(fā)出的SNP分析方法例如有SSCP法(單鏈構(gòu)象多態(tài)性法)、PCR-RELP法(限制性 片斷長度多態(tài)性法)、等位基因特異性PCR法(AS-PCR法)、使用GC尾部引物的Tm-shift基 因分型法、DASH法(動態(tài)等位基因特異性雜交法)、熒光偏振法、Taqman法(5'-外切核酸 酶分析法)、分子信標法(Molecular Beacons)、OLA法(寡聚核苷酸連接酶分析法)、焦磷 酸測序法、單核苷酸延伸法、以及MALDI-T0F法(基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時間法) 等。這些方法使用模板特異性寡聚核苷酸或熒光標記的探針寡聚核苷酸進行SNP分析。
當靶基因以含有突變基因座的多個多態(tài)性基因形式存在于基因序列中時，需要根 據(jù)多態(tài)性的種類將引物設(shè)計為具有所對應(yīng)的突變基因座的互補序列。為此，必須對所有基 因特異性多態(tài)性序列進行鑒定。如果沒有鑒定出多態(tài)性基因，則不能完成對全部靶基因的 檢測。因此，在特異性核苷酸序列包含有限的突變或多態(tài)性的情況下，需要一種使用一對引 物就能簡便地擴增所述突變基因座的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服常規(guī)PCR方法存在的問題。因此，本發(fā)明的目的是提供用 于PCR擴增的引物，其中靶基因的不同多態(tài)性位點被無堿基部分取代；以及提供便于共同 擴增不同模板的核酸的PCR方法，所述模板在其核苷酸序列中具有突變基因座或多態(tài)性基 因座。
具體實施例方式為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了用于PCR擴增的引物，所述引物在其引物序列內(nèi) 包含無堿基部分。在本發(fā)明中，“無堿基部分”表示不包含具體編碼信息的核苷。由于其不含有 編碼信息，相應(yīng)模板DNA的核苷酸可為任意的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。本 文所述的無堿基部分優(yōu)選位于對應(yīng)于引物序列的突變位點和/或多態(tài)性位點的區(qū)域 中。本發(fā)明所述的引物為包含無堿基部分的、用于PCR擴增的引物，所述無堿基部分 選自于由dSpaCer(5' -0-二甲氧基三苯甲基-1' 2' -二脫氧核糖-3' -[(2-氰 乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺)、1 ‘-甲氧基-dSpaCer(5' -0-二甲氧基三 苯甲基-1'-甲氧基-2' -二脫氧核糖-3' -[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞 磷酰胺)、PC SpacerPhosphoamidite ([4_ (4，4 ‘ - 二甲氧基三苯甲氧基)丁酰胺 基甲基)-1-(2_硝基苯基)-乙基]-2-氰乙基-(N，N-二異丙基)-亞磷酰胺)、 rSpacer CEPhosphoamidite (5 ‘ -0-二甲氧基三苯甲基-1 ‘-脫氧核糖-'-0-三 異丙基甲硅氧基甲基-3' -[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺)、Spacer C12CEPhosphoamidite (12-(4，4' - 二甲氧基三苯甲氧基)-十二烷基-1_[(2_ 氰乙 基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺)、Spacer Phosphoamidite 18 (18_0_ 二甲氧基三苯 甲基六甘醇，1-[(2_氰乙基)_(N，N- 二異丙基)]-亞磷酰胺)、SpacerPhosphoamidite 9 (9-0- 二甲氧基三苯甲基-三甘醇，1-[ (2-氰乙基)-(N，N- 二異丙基)]-亞磷酰胺)以及 Spacer Phosphoamidite C3(3-(4,4' - 二甲氧基三苯甲氧基)丙基 _1_[ (2-氰乙基)-(N， N-二異丙基)]_亞磷酰胺)所組成的組，但不總限于此。即使一種引物是由另一種結(jié)構(gòu)變 化很小的亞磷酰胺合成而得，只要其在所述引物序列內(nèi)包含相同的無堿基部分，那么該引物也可包含于本發(fā)明的標準中。在所述引物序列插入無堿基部分便于用一個引物組對一個基因中具有不同多態(tài) 性位點的模板進行擴增。對引物中無堿基部分的數(shù)目沒有限制，但優(yōu)選在3'端、內(nèi)部序 列(internal sequence)和5 ‘端有1_10個無堿基部分，并且更優(yōu)選在3 ‘端、內(nèi)部序列 (internal sequence)和5'端中有1_3個無堿基部分。如果無堿基部分的數(shù)目大于10，弓丨 物的Tm會顯著變低，從而造成退火至模板DNA序列失敗，這意味著PCR反應(yīng)失敗。倘若如 此，則無法實現(xiàn)本發(fā)明的同等地擴增具有突變位點的不同模板的目的。 本發(fā)明還提供一種用于PCR擴增的組合物，所述組合物包含反應(yīng)緩沖液、4種不同 的dNTP、DNA聚合酶、探針以及所述用于PCR擴增的引物?？蛇m當改進常規(guī)的PCR反應(yīng)緩沖液(包含Tris-HCl、KCl、(NH4) 2S04、MgSO4、MgCl2 等)用于制備本發(fā)明所述反應(yīng)緩沖液。所述4種不同的dNTP為dATP、dTTP、dGTP和dCTP。 DNA聚合酶不限于具體的酶。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，使用Taq DNA聚合酶、Klen Taq DNA聚合酶或Ptu DNA聚合酶進行PCR。本發(fā)明所述用于PCR擴增的引物的濃度為 l-50pmol/20ul PCR反應(yīng)混合物。所述引物的濃度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。為了方便實驗、防止PCR反應(yīng)產(chǎn)物造成的污染、使DNA聚合酶和dNTP保持穩(wěn)定以 及改進反應(yīng)性，本發(fā)明的用于PCR擴增的組合物可另外包含染料和/或穩(wěn)定劑。所述染料選 自于由溴酚藍、二甲苯青、溴甲酚紅和甲酚紅所組成的組，但不總限于此。所述穩(wěn)定劑可選 自于由明膠、牛血清白蛋白、Thesit、PEG-8000和多元醇所組成的組，但不總限于此。所述組 合物中染料的含量為 0. 0001-0. 01wt%，優(yōu)選 0. 001-0. 005wt%，更優(yōu)選 0. 001-0. 003wt%。 所述組合物中穩(wěn)定劑的含量為2-1，OOOmM，優(yōu)選100-500mM，更優(yōu)選100_300mM。本發(fā)明提供了一種用于PCR擴增的方法，所述方法使用在引物序列內(nèi)包含無堿基 部分的所述PCR引物。所述方法包括將用于PCR擴增的組合物與模板DNA混合的步驟，所述組合物含有 在引物序列內(nèi)包含無堿基部分的所述引物；以及用所述混合物進行PCR擴增的步驟。本發(fā)明所述用于PCR擴增的方法用于共同擴增不同的核酸模板，所述模板在其核 苷酸序列中具有突變位點和/或多態(tài)性位點，但不總限于此。本文所述的用于PCR擴增的 引物均可含有本發(fā)明的無堿基部分?；蛘撸鲆镏豢珊袩o堿基部分，而另一引物可 為不含有無堿基部分的正常引物。PCR通過重復(fù)變性、退火和延伸的循環(huán)而進行，這一 PCR擴增機理是本領(lǐng)域技術(shù)人 員所公知的。變性、退火和延伸分別優(yōu)選在85-95°C進行1-60秒、在40-70°C進行1_60秒、 在50-75°C進行1-60秒?？蛇m當?shù)卣{(diào)節(jié)溫度范圍和反應(yīng)時間。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式 中，當引物在其序列中含有一個無堿基取代時，熔解溫度(以下稱為“Tm”)降低大約8°C， 特別地，當引物在其3'端含有一個無堿基取代時，Tm降低大約1.5°C。為補償由無堿基部 分所降低的Tm，向所述引物的兩端均加入與所述模板互補的核苷酸，從而可調(diào)節(jié)PCR反應(yīng) 性。當向3'端加入互補核苷酸時，每加入2個核苷酸，Tm增加大約0.5°C。當引物含有1 個、2個或3個無堿基部分取代，并且同時向5'端加入5個互補核苷酸時，Tm分別降低約 4°C、10°C和18°C。Tm可隨DNA聚合酶種類、引物長度、引物核苷酸以及反應(yīng)條件發(fā)生變化。 當引物被設(shè)計成在其序列中具有突變位點時，溫度等效性(temperature equivalence)條 件可通過Tm調(diào)控來確定?？赏ㄟ^導(dǎo)入無堿基部分并延伸引物的長度來控制PCR的特異性。因此，通過只使用一對引物，即可共同擴增序列中具有突變位點的不同模板。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式(實施例1和實施例2)中，使用不同的DNA聚合酶，并 使用人基因組DNA作為模板，用具有無堿基取代的引物進行PCR。結(jié)果，當使用Taq DNA聚 合酶并且有1個核苷酸被取代時，Tm降低了大約3-6°C。當使用Pfu DNA聚合酶并且有1 個核苷酸被取代時，Tm降低了大約6°C。當使用Klen Taq DNA聚合酶并且有1個核苷酸被 取代時，盡管沒有影響PCR反應(yīng)，Tm大約降低了 1-2°C。因此證實，包含無堿基部分的引物 可與不同種類的DNA聚合酶一起使用。適當?shù)囊约白罴训臒o堿基引物條件可根據(jù)每種DNA 聚合酶進行測定。因此，考慮到測定條件，可建立可確保溫度等效性的、具有突變位點的引 物構(gòu)建條件。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式(實施例4)中，與對照引物組相比，當在引物3'端有1 個核苷酸被無堿基部分取代時，Tm降低了大約1. 5°C。當在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被取 代時，Tm降低大約8°C。與此同時，與對照引物組相比，當在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被取 代并且向3'端加入5個與模板互補的核苷酸時，Tm降低了大約4°C。當在內(nèi)部序列中有 2個核苷酸被取代并且向3'端加入5個與模板互補的核苷酸時，Tm降低了大約10°C。當 有3個核苷酸被取代并且向3'端加入5個與模板互補的核苷酸時，Tm降低了大約18°C。 當在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被取代并且向3'端加入1個與模板互補的核苷酸時，Tm降 低了大約5°C。當在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被取代并且向3'端加入3個與模板互補的 核苷酸時，Tm降低了大約4. 5°C。當在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被取代并且向3'端加入5 個與模板互補的核苷酸時，Tm降低了大約4°C。上述結(jié)果如表1所示。表 1 此時再次對上述結(jié)果進行總結(jié)。與在每個末端有1個核苷酸被取代的情形相比， 當在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被取代時，Tm降低了大約6.5°C。當在內(nèi)部序列中有1個、2 個和3個核苷酸被取代、并且向每個3'端加入5個互補核苷酸時，核苷酸的數(shù)目每增加一 個，Tm降低大約6°C-8°C。當在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被取代、并且每次向3'端加入2 個互補核苷酸(例如加入1個、3個和5個互補核苷酸)時，每加入兩個互補核苷酸，Tm提 高大約0.5 °C。
基于上述結(jié)果，可在引物設(shè)計期間在每種引物中建立可實現(xiàn)溫度等效性的引物構(gòu)建條件。在構(gòu)建核苷酸序列期間，將無堿基部分插入引物中，可使Tm的波動幅度(margin) 最小化。因此，可改進PCR反應(yīng)的特異性。如同上文所解釋的那樣，本發(fā)明所述用于PCR擴增的引物在其引物序列內(nèi)包含無 堿基部分，通過使用一對引物，在所述引物序列中導(dǎo)入無堿基部分，能夠同時擴增核苷酸序 列中具有突變位點的不同模板。


本發(fā)明中優(yōu)選實施方式的應(yīng)用參考附圖可以得到更好的理解，其中圖1為顯示聚合酶鏈式反應(yīng)(以下稱為“PCR”)擴增結(jié)果的電泳照片，所述PCR擴 增使用Taq DNA聚合酶并用含有無堿基部分的p55/p53引物組進行。圖2為顯示PCR擴增結(jié)果的電泳照片，所述PCR擴增使用Klen TaqDNA聚合酶并 用含有無堿基部分的p55/p53引物組進行。圖3為顯示PCR擴增結(jié)果的電泳照片，所述PCR擴增使用Taq DNA聚合酶并用含 有無堿基部分的p63/p55引物組進行。圖4為顯示PCR擴增結(jié)果的電泳照片，所述PCR擴增使用Pfu DNA聚合酶并用含 有無堿基部分的p63/p55引物組進行。圖5為顯示使用Klen Taq DNA聚合酶進行PCR的結(jié)果的電泳照片，所述PCR分別 使用下述引物組進行對照引物組、在3'端有1個核苷酸被無堿基部分取代的引物組、在 內(nèi)部序列中有1個核苷酸被無堿基部分取代的引物組、以及在內(nèi)部序列中有2個核苷酸被 無堿基部分取代并且向3'端加入5個互補核苷酸的引物組。圖6為顯示使用Klen Taq DNA聚合酶進行PCR的結(jié)果的電泳照片，所述PCR分別 使用下述引物組進行對照引物組、在內(nèi)部序列中有3個核苷酸被無堿基部分取代并且向 3'端加入5個互補核苷酸的引物組、在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被無堿基部分取代并且向 3'端加入1個互補核苷酸的引物組、在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被無堿基部分取代并且向 3'端加入3個互補核苷酸的引物組、以及在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被無堿基部分取代并 且向3'端加入5個互補核苷酸的引物組。圖7為顯示引物對的熔解曲線的圖，所述引物對的無堿基部分位置不同，其通過 實時基因擴增儀進行分析。圖8為顯示引物對的熔解曲線的圖，所述引物對在內(nèi)部序列中 的無堿基部分數(shù)目不同，其通過實時基因擴增儀進行分析。圖9顯示引物對的熔解曲線的 圖，所述引物對在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被無堿基部分取代，并且加入到3'端的核苷酸 數(shù)目不同。在圖7-圖9中，每張圖中紫紅色的線表示隨溫度(X軸)增加時熒光水平(Y軸) 的降低。圖10為顯示在引物的對應(yīng)于乙型肝炎病毒S基因的多態(tài)性位點的內(nèi)部序列中有 1個核苷酸被無堿基部分取代的圖。圖11和圖12為顯示實時PCR結(jié)果的圖，所述實時PCR用下述引物以及探針進 行在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被dSpacer取代的引物(dS)、有1個核苷酸被Γ -甲氧 基-dSpacer取代的引物(Me_dS)、或包含正常核苷酸(Reg)的引物。每條線表示具有不同 濃度的三種標準樣品隨PCR循環(huán)數(shù)增加時的熒光水平。實施例在下面的實施例中，對本發(fā)明實用的和現(xiàn)有的優(yōu)選實施方式進行說明。但是，可以理解的是，在考慮本發(fā)明所公開的內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā) 明的精神和范圍內(nèi)進行修改和改進。t施例1 用句,含無堿某部分的D55/D53引物講行PCR擴 曾的功效的檢齡 通過用Taq DNA聚合酶(Bioneer，以下稱為“Taq”)和Klen Taq DNA聚合酶 (Bioneer，以下稱為“Klen Taq”)進行PCR，研究了使用無堿基引物進行的核酸擴增的反 應(yīng)性和特異性，所述無堿基引物由p55/p53引物組構(gòu)建。用人基因組DNA作為模板DNA，并 使用下述三對引物對照引物組(擴增長度211bp，15pmol/20 μ 1反應(yīng)混合物)，由ρ55引 物(核苷酸序列5' -CTC TTC CTG CAG TAC TCC CCT GC-3'，序列編號1)禾口 ρ53引物 (核苷酸序列5' -GCC CCA GCT CAC CAT CGC TA-3'，序列編號2)組成；第一樣品組引 物組(15pmol/20 μ 1反應(yīng)混合物)，由No2_lF (序列編號3)和No2_lR(序列編號4)組成， 所述No2-lF通過將p55引物從5'端起第10個核苷酸的“C”用“N”取代(dSpacer, Glen Research，產(chǎn)品目錄No. ΙΟ-1914-χχ)而制備，所述No2_lR通過將p53引物從5'端起第9 個核苷酸的“T”用“N”取代(dSpacer)而制備；第二樣品組引物組(15pmol/20y 1反應(yīng)混 合物)，由No2-2F (序列編號5)和No2-2R(序列編號6)組成，所述No2_2F通過將p55引物 從5'端起第10個和第11核苷酸的“CA”用“NN”取代(dSpacer)而制備，所述No2_2R通 過將P53引物從5'端起第9個和第10個核苷酸的“TC”用“NN”取代(dSpacer)而制備。使用Taq DNA聚合酶( υ/20μ 1反應(yīng)混合物)或Klen Taq DNA聚合酶(Bioneer， 以下稱為"Klen Taq”)(0. 4U/20 μ 1反應(yīng)混合物)作為用于PCR的酶。此外，加入dNTP混 合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP，每種2. 5mM)作為用于所述反應(yīng)的添加劑(2 μ 1/20 μ 1反 應(yīng)混合物)。加入 IOOmM 的 Tris-HCl、400mM 的 KCl 以及 15mM 的 MgCl2 (pH 9. 0,2 μ 1/20 μ 1 反應(yīng)混合物)作為用于Taq或Klen Taq聚合酶的IOx反應(yīng)緩沖液。按下述步驟進行PCR。當使用Taq時，按下述步驟進行擴增在94°C預(yù)變性5分鐘； 在94°C變性30秒；在45°C _59°C退火50秒；在72°C延伸50秒；從變性到延伸進行38個循 環(huán)；以及在72°C最終延伸5分鐘。當使用Klen Taq時，按下述步驟進行擴增在37°C進行 非特異性反應(yīng)5分鐘；在94°C預(yù)變性5分鐘；在94°C變性30秒；在45°C _59°C退火50秒； 在72°C延伸50秒；從變性到延伸進行38個循環(huán)；以及在72°C最終延伸5分鐘。PCR的結(jié) 果用含有2. 0%瓊脂糖的0. 5x TBE緩沖液(Trizma核苷酸、硼酸和0. 5M的EDTA，pH 8. 0) 通過電泳進行證實。圖1顯示出對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果，所述PCR使用Taq分別用下述 引物組進行對照引物組、第一樣品組引物組以及第二樣品組引物組。1-10道、11-20道和 21-30道表示使用不同的引物所獲得的結(jié)果，所述引物分別為對照引物組、第一樣品組引物 組和第二樣品組引物組。此時，退火溫度分別為45. 1°C、45. 3°C、46. 3°C、47. 7°C、49. 4°C、 51. 4°C >53. 3°C >55. 3°C >57. 6°C和 59. 0°C。此處的 M 表示 100 2，OOObpDNA 長度的標記 物(Bioneer)。這一 DNA長度的標記物含有下述13個雙鏈DNA片段100bp、200bp、300bp、 400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、l, OOObpU, 200bp、1，600bp 以及 2，OOObp 長度的 片段。在對照組的情況下，觀察到兩個明顯(strong)的條帶。上方條帶為目標條帶，下方條帶表示引物二聚體條帶。表示非特異性產(chǎn)物的條帶是位于所述目標條帶上方留下拖尾痕 跡的條帶。如圖1所示，當使用第一樣品組引物組和第二樣品組引物組時，非特異性反應(yīng)和 二聚體模式減少。特別地，第一樣品組引物組比第二樣品組引物組在減少非特異性反應(yīng)和 二聚體模式方面更為有效。此外，證實了高PCR產(chǎn)物。對每個Tm進行比較。在對照組(1-10 道)中，在 45. 1°C、45. 3°C、46. 3°C、47. 7°C、 49. 4°C、51. 4°C、53. 3°C、55. 3°C、57. 6°C和59. 0°C的退火溫度下，模板全部得以擴增。與 此同時，當使用第一樣品組引物組(11-20道)時，模板只在55. 3°C的退火溫度下得以擴 增(18道)。因此，ATm = 59.0°C-55. 3°C= 3. 7°C。與此同時，當使用第二樣品組引 物組(21-30道)時，模板只在51.4°C的退火溫度下得以擴增(26道)。因此，A Tm = 59. 0°C -51. 4°C= 7. 6°C。圖2為顯示用PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的電泳照片，所述PCR在Klen Taq的存在下使用下述引物組進行對照引物組、第一樣品組引物組以及第二樣品組引物 組。1-30道和M的說明與實施例1中相同。如圖2所示，當使用第一樣品組引物組和第二 樣品組引物組時，非特異性反應(yīng)和二聚體模式減少。以與圖1中所描述的相同的方式對每個Tm進行比較。第一樣品組引物組的ATm 為1.4°C，第二樣品組引物組的ATm*5.7°C。上述結(jié)果表明，內(nèi)部序列中有1個核苷酸被取代的第一樣品組引物在Taq和Klen Taq的存在下減少了非特異性反應(yīng)，而內(nèi)部序列中有2個核苷酸被取代的第二樣品組引物 在Taq和Klen Taq的存在下也減少了非特異性反應(yīng)。也就是說，無堿基部分的引入沒有增 加非特異性反應(yīng)，而是減少了非特異性反應(yīng)。因此，本發(fā)明所述的引物被證實作為引物保持 了反應(yīng)特異性，其中本發(fā)明所述的引物包含不與模板互補的無堿基部分。當樣品組引物的 特定核苷酸被無堿基部分(dSpacer)取代時，PCR的退火溫度有所降低，而與DNA聚合酶的 種類無關(guān)。實施例2 使用包含無堿基部分的p63/p55引物進行PCR擴增的功效的檢驗通過用Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶(Bioneer，以下稱為“Pfu”)進行PCR， 研究了使用無堿基引物進行的核酸擴增的反應(yīng)性和特異性，所述無堿基引物由p63/p55引 物組構(gòu)建。用人基因組DNA作為模板DNA，并使用下述三對引物對照引物組(擴增長度 447bp，15pmol/20 u 1 反應(yīng)混合物)，由 p55 引物(核苷酸序列5' -CTC TTC CTG CAG TAC TCCCCT GC-3'，序列編號 1)和 p63 引物(核苷酸序列5' -GGC CAC TGA CAACCA CCC TTA CC-3'，序列編號7)組成；第一樣品組引物組(15pmol/20ia反應(yīng)混合物)，由No2_lF和 No3-lR(序列編號8)組成，所述No3-lR通過將p63引物從5'端起第10個核苷酸的“C” 用“N”取代(dSpacer)而制備；第二樣品組引物組(15pmol/20u 1反應(yīng)混合物)，由No2_2F 和No3-2R (序列編號9)組成，所述No3-2R通過將p63引物從5'端起第10個和第11個核 苷酸的“CA”用“NN”取代(dSpacer)而制備。使用Taq或Pfu聚合酶(1U/20 ill反應(yīng)混合物)作為用于PCR的酶。此外， 加入dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP，每種2. 5mM)作為用于所述反應(yīng)的添加劑 (2 u 1/20 ii 1 反應(yīng)混合物)。加入 lOOmM 的 Tris_HCl、400mM 的 KC1 禾P 15mM 的 MgCl2 作 為用于Taq聚合酶的10x反應(yīng)緩沖液(pH 9.0,2u 1/20 u 1反應(yīng)混合物)。加入200mM的Tris-HClUOOmM 的 KCl、100mM 的(NH4)2S04、20mM 的 MgS04、l% Triton X-100 以及 lmg/ml 乙酰化的BSA作為用于Pfu聚合酶的10x反應(yīng)緩沖液(pH8. 8，2 u 1/20 u 1反應(yīng)混合物)。按下述步驟進行PCR 在37°C進行非特異性反應(yīng)5分鐘；在94°C預(yù)變性5分鐘；在 94°C變性30秒；在45°C -59°C退火50秒；在72°C延伸50秒；從變性到延伸進行38個循 環(huán)；以及在72°C最終延伸5分鐘。PCR的結(jié)果用含有2. 0%瓊脂糖的0. 5x TBE緩沖液通過 電泳進行證實。圖3為顯示用PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的電泳照片，所述PCR在Taq的 存在下使用下述引物組進行對照引物組、第一樣品組引物組以及第二樣品組引物組。1-30 道和M的說明與實施例1中相同。如圖3所示，當使用第一樣品組引物組和第二樣品組引 物組時，非特異性反應(yīng)和二聚體模式減少。特別地，第一樣品組引物組比第二樣品組引物組 在減少非特異性反應(yīng)和二聚體模式方面更為有效。A Tm分別為5. 7°C和7. 6°C。圖4為顯示用PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的電泳照片，所述PCR在Pfu的 存在下使用下述引物組進行對照引物組、第一樣品組引物組以及第二樣品組引物組。1-30 道和M的說明與實施例1中相同。如圖3所示，當使用第一樣品組引物組和第二樣品組引 物組時，非特異性反應(yīng)和二聚體模式減少。特別地，第二樣品組引物組比第一樣品組引物組 在減少非特異性反應(yīng)和二聚體模式方面更為有效。A Tm分別為5. 7°C和7. 6°C。上述結(jié)果表明，在Taq和Klen Taq的存在下，第一樣品組引物和第二樣品組引物 增加了 PCR反應(yīng)性并減少了非特異性反應(yīng)。因此證實，無堿基引物對于PCR反應(yīng)性和特異 性具有功效。當樣品組引物的特定核苷酸被無堿基部分(dSpacer)取代時，PCR的退火溫 度有所降低，而與DNA聚合酶的種類無關(guān)。實施例3 :DNA聚合酶對于無堿基引物構(gòu)建條件的功效用對照引物組通過下述方式構(gòu)建無堿基引物在3'端取代1個核苷酸(樣品2)、 在內(nèi)部序列中取代1個核苷酸(樣品3)、在內(nèi)部序列中取代2個核苷酸并向3 ‘端加入5個 互補核苷酸(樣品4)、在內(nèi)部序列中取代3個核苷酸并向3'端加入5個互補核苷酸(樣 品5)、在內(nèi)部序列中取代1個核苷酸并向3'端加入1個互補核苷酸(樣品6)、在內(nèi)部序列 中取代1個核苷酸并向3'端加入3個互補核苷酸(樣品7)、以及在內(nèi)部序列中取代1個 核苷酸并向3'端加入5個互補核苷酸(樣品8)。用人基因組DNA作為模板DNA。以12-40pmol/20 u 1反應(yīng)混合物的濃度使用每個 引物組。樣品1為對照引物組(擴增長度127bp)，其包含F(xiàn)_AP_C0NT引物(核苷酸序列 5' -CGT GTT TGT GCC TGT CCTGG-3‘，序列編號 10)和 R_AP_C0NT 引物(核苷酸序列 5' -CCG CTT CTTGTC CTG CTT GC-3'，序列編號11)。樣品2為通過在3‘端取代1個核苷 酸、由對照引物組制備的引物組，其包含F(xiàn)_AP_C0NT_3-1N引物(核苷酸序列5' -CGT GTT TGT GCC TGT CCT GN-3'，序列編號 12)禾口 R_AP_C0NT_3_1N 弓丨物(核苷酸序列5' -CCG CTT CTT GTC CTG CTTGN-3'，序列編號13)。樣品3為通過在內(nèi)部序列中取代1個核苷酸、 由對照引物組制備的引物組，其包引物(核苷酸序列5' -CGT GTT TGT GCN TGT CCT GG-3'，序列編號 14)禾口 R_AP_C0NT_I_1N 引物(核苷酸序列5' -CCG CTT CTT GTN CTG CTTGC-3'，序列編號15)。樣品4為通過在內(nèi)部序列中取代2個核苷酸并 向3'端加入5個互補核苷酸、由對照引物組制備的引物組，其包含F(xiàn)_AP_C0NT_I-2N_3+5M 引物(核苷酸序列5' -CGT GTT TNT GCN TGTCCT GGGAGA G-3'，序列編號 16)禾口 R_AP_C0NT_I-2N_3+5M引物(核苷酸序列5' -CCG CTT NTT GTN CTG CTT GCT TAC C-3'，序列 編號17)。樣品5為通過在內(nèi)部序列中取代3個核苷酸并向3'端加入5個互補核苷酸、由 對照引物組制備的引物組，其包含F(xiàn)_AP_C0NT_I-3N_3+5M引物(核苷酸序列5 ‘ -CGT GTT TNT GCN TGT NCT GGG AGA G-3'，序列編號 18)和 R_AP_C0NT_I_3N_3+5M 引物(核苷酸序 列5' -CCG CTTNTT GTN CTG NTT GCT TAC C-3'，序列編號19)。樣品6為通過在內(nèi)部序 列中取代1個核苷酸并向3'端加入1個互補核苷酸由對照引物組制備的引物組，其包含 F_AP_C0NT_I-1N_3+1M引物(核苷酸序列5' -CGTGTT TGT GCN TGT CCT GGG-3‘，序列編 號 20) *R_AP_C0NT_1N_3+1M 引物(核苷酸序列5' -CCG CTT CTT GTN CTGCTT GCT-3 ‘， 序列編號21)。樣品7為通過在內(nèi)部序列中取代1個核苷酸并向3'端加入3個互補核苷 酸由對照引物組制備的引物組，其包含F(xiàn)_AP_C0NT_I-1N_3+3M引物(核苷酸序列5' -CGT GTT TGT GCN TGTCCT GGG AG-3'，序列編號 22)和 R_AP_C0NT_I_1N_3+3M(核苷酸序列 5' -CCG CTT CTT GTN CTG CTT GCT TA-3'，序列編號23)。樣品8為通過在內(nèi)部序列中 取代1個核苷酸并向3'端加入5個互補核苷酸由對照引物組制備的引物組，其包 C0NT_I-1N_3+5M引物(核苷酸序列5' -CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AGA G-3'，序列 編號 24)禾口 R_AP_C0NT_I-1N_3+5M 引物(核苷酸序列5' -CCG CTT CTT GTNCTG CTT GCT TAC C-3'，序列編號25)。使用Klen Taq聚合酶(0. 4U/20 yl反應(yīng)混合物)作為用于PCR的酶。此外， 加入dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP，每種2. 5mM)作為用于所述反應(yīng)的添加劑 (2 u 1/20 u 1 反應(yīng)混合物)。加入 lOOmM 的 Tris_HCl、400mM 的 KC1 禾P 15mM 的 MgCl2 作為 用于Klen Taq聚合酶的10x反應(yīng)緩沖液(pH 9.0,2u 1/20 u 1反應(yīng)混合物)。按下述步驟進行PCR 在94°C預(yù)變性5分鐘；在94°C變性30秒；在55°C -70°C或 46°C -61°C退火50秒；在72°C延伸50秒；從變性到延伸進行40個循環(huán)；以及在72°C最終 延伸5分鐘。所述PCR的結(jié)果用含有2. 0%瓊脂糖的0. 5x TBE緩沖液通過電泳進行證實。圖5和圖6為顯示用PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的電泳照片，所述PCR在 Klen Taq的存在下，使用8種不同的引物組進行。M的說明與實施例1中相同。在圖5中，1-8道表示通過使用樣品1引物組在不同的退火溫度下得到的結(jié)果， 所述退火溫度為 59. 4°C、61. 4°C、63. 3°C、65. 3°C、67. 6°C、69°C、69. 7°C 和 70. 2°C。9-16 道表示通過使用樣品2引物組在不同的退火溫度下得到的結(jié)果，所述退火溫度為55. 5°C、 56. 3°C、57. rC、59. 4°C、61. 4°C、63. 3°C、65. 3°C和 67. 6°C。17-24 道表示通過使用樣品 3 引物組在不同的退火溫度下得到的結(jié)果，所述退火溫度為46. 1°C、46. 5°C、47. 3°C、48. 7°C、 50. 4°C、52. 4°C、54. 3°C和56. 3°C。25-32道表示通過使用樣品4引物組在不同的退火溫 度下得到的結(jié)果，所述退火溫度為 48. 7°C、50. 4°C、52.4°C、54. 3°C、56. 3°C、58. 6°C、60°C和 60. 7°C。M表示lOObp DNA長度的標記物。在圖6中，1-8道表示通過使用樣品5引物組在不同的退火溫度下得到的結(jié)果， 所述退火溫度為 46. 1°C、46. 5°C、47. 3°C、48. 7°C、50. 4°C、52. 4°C、54. 3°C和 56. 3°C。9-16 道表示通過使用樣品6引物組在不同的退火溫度下得到的結(jié)果，所述退火溫度為46. 1°C、 46. 5°C、47. 3°C、48. 7°C、50. 4°C、52. 4°C、54. 3°C和 56. 3°C。17-24 道表示通過使用樣品 7 引物組在不同的退火溫度下得到的結(jié)果，所述退火溫度為46. 1°C、46. 5°C、47.3°C、48. 7°C、 50. 4°C、52. 4°C、54. 3°C和56. 3°C。25-32道表示通過使用樣品8引物組在不同的退火溫度下得到的結(jié)果，所述退火溫度為 48. 7°C、50. 4°C、52.4°C、54. 3°C、56. 3°C、58. 6°C、60°C和 60. 7°C。如圖5和圖6所示，樣品1引物組在直至63. 3°C的退火溫度下擴增出PCR產(chǎn)物。 樣品2引物組在61. 4°C 63. 3°C的退火溫度范圍內(nèi)擴增出PCR產(chǎn)物。樣品3引物組、樣品 5引物組和樣品6引物組被證實無PCR產(chǎn)物。樣品4引物組在直至52. 4°C的退火溫度下擴 增出PCR產(chǎn)物。樣品7引物組在直至47. 3°C的退火溫度下擴增出PCR產(chǎn)物。樣品8引物組 在直至52. 4°C的退火溫度下擴增出PCR產(chǎn)物。上述結(jié)果表明，通過在3'端取代1個核苷酸由對照引物組制備的引物(樣品2)、 以及在內(nèi)部序列中取代2個核苷酸并向3'端加入5個互補核苷酸由對照引物組制備的引 物(樣品4)可誘導(dǎo)PCR擴增，并且與對照引物組相比，此時反應(yīng)溫度降低了大約11°C和 10°C。通過在內(nèi)部序列中取代1個核苷酸并向3'端加入3個互補核苷酸由對照引物組制 備的引物(樣品7)以及在內(nèi)部序列中取代1個核苷酸并向3'端加入5個互補核苷酸由對 照引物組制備的引物(樣品8)可誘導(dǎo)PCR擴增，并且與對照引物組相比，此時反應(yīng)溫度降 低了大約16°C和irc0_仿丨丨4 誦i寸■傭體通過熔解曲線測定在實施例3中確定的8個無嘌呤(apurine)引物組的每個 Tm。將0. 3nmol/20u 1反應(yīng)混合物的互補反向引物(核苷酸序列5' -G GTAAGC AAG CAG GAC AAG AAG CGG-3'，序列編號26)分別加入下述引物實施例3中樣品1的正向引物 0. 3nmol (核苷酸序列5' -CGT GTT TGT GCC TGT CCT GG-3'，序列編號 10)、樣品 2 的正 向引物0. 5nmol (核苷酸序列5' -CGT GTT TGT GCC TGT CCT GN-3'，序列編號12)、樣品 3的正向引物1. Onmol (核苷酸序列5' -CGT GTT TGT GCNTGT CCT GG-3'，序列編號14)、 樣品 4 的正向引物0. 5nmol (核苷酸序列5' -CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AGA G-3'， 序列編號16)、樣品5的正向引物1. Onmol (核苷酸序列5' -CGT GTT TNT GCN TGT NCTGGG AGA G-3'，序列編號18)、樣品6的正向引物1. Onmol (核苷酸序列5' -CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG-3‘，序列編號20)、樣品7的正向引物1. Onmol (核苷酸序列5' -CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGGAG-3 ‘，序列編號22)、以及樣品8的正向引物0. 5nmol (核苷酸序 列5' -CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AGA G-3'，序列編號 24)。加入 10x 反應(yīng)緩沖液 (lOOmM 的 Tris-HCl、400mM 的 KCl、50mM 的MgCl2，pH 9. 0) (2 u 1/20 u 1 反應(yīng)混合物)和 2 ii 1 的10x SYBR Green作為用于所述反應(yīng)的添加劑。SYBR Green為嵌入雙鏈DNA鏈小溝中的 熒光染料。如果溫度較低，雙鏈會大量形成，此時所述熒光染料被大量嵌入，從而產(chǎn)生高熒 光。相反，如果溫度較高，雙鏈解開為單鏈，因而所述熒光染料不容易嵌入其間，從而造成難 以測定熒光。通過實時基因擴增儀(EXiCyClerTM，Bi0neer公司)繪制熔解曲線。此時的反 應(yīng)條件如下在94°C誘導(dǎo)預(yù)變性5分鐘，并在20°C保持5分鐘。然后，當將溫度以1攝氏度 的步幅從30°C升高到97°C時，將所述混合物在每個溫度保持10秒。圖7為顯示熔解曲線的圖，所述熔解曲線根據(jù)對照引物組(樣品1)中無嘌呤部分 (apurine part)取代的位置作出。線1表示樣品1引物組(對照組)的熔解曲線，線2表 示樣品2引物組的熔解曲線，線3表示樣品3引物組的熔解曲線。圖8為顯示熔解曲線的 圖，所述熔解曲線根據(jù)內(nèi)部序列中被取代的核苷酸數(shù)目作出。線1表示樣品1引物組(對 照組)的熔解曲線，線2表示樣品8引物組的熔解曲線，線3表示樣品4引物組的熔解曲線，線4表示樣品5引物組的熔解曲線。圖9為顯示熔解曲線的圖，所述熔解曲線根據(jù)加入 至3'端互補核苷酸的數(shù)目以及對照引物組的內(nèi)部序列中有1個核苷酸被取代而作出。線 1表示樣品1引物組(對照組)的熔解曲線，線2表示樣品8引物組的熔解曲線，線3表示 樣品7引物組的熔解曲線，線4表示樣品6引物組的熔解曲線，線5表示樣品3引物組的熔 解曲線。根據(jù)上述結(jié)果，當在對照引物組的3'端有1個核苷酸被無堿基部分取代時，Tm 降低了大約1.5°C。當在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被無堿基部分取代時，Tm降低了大約 8°C(參見圖7)。同時，與對照引物組相比，當向3'端加入5個互補核苷酸并且在內(nèi)部序 列中有1個、2個或3個核苷酸被無堿基部分取代時，Tm分別降低了 4°C、10°C和18°C (參 見圖8)。當在內(nèi)部序列中有1個核苷酸被無堿基部分取代并且向3'端加入核苷酸時，每 加入2個核苷酸，Tm增加0. 5°C (參見圖9)。_仿丨丨5:_對咸躬丨編衍0^就_弓丨_過龍、兒秘_干躺_ (HBV)S某因多杰t牛的內(nèi)部序歹II中取代1個核苷酸講行制各對使用無堿基引物以及與其相對應(yīng)的探針進行PCR的功效進行了研究，所述引 物通過在顯示乙型肝炎病毒S基因的多態(tài)性的內(nèi)部序列中取代1個核苷酸進行制備。還 研究了不同種類的dSpacer是否會產(chǎn)生不同的結(jié)果。為此，使用dSpacer和1'-甲氧 基-dSpacer構(gòu)建具有相同序列的無堿基引物(參見圖10)。所構(gòu)建的引物和探針的核苷 酸序列如表2所示。將所述探針的5'端用FAM熒光染料進行標記，將所述探針的3'端用 TAMRA熒光染料進行標記。表2 使用Applied Biosystems 7500FAST 實時 PCR 系統(tǒng)(AppliedBiosystems，美國)， 用所述無堿基引物和探針進行實時PCR。特別地，將lyl正向引物(10pmol)、lia反向引 物(lOpmol)、1 ii 1探針(5pmol)以及1U的Taq混合制得20 u 1反應(yīng)混合物。此外，還向其 中加入1 P 1的dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP，每種2. 5mM) (1 u 1/20 u 1反應(yīng)混合 物)。加入 200mM 的 Tris-HCl、350mM 的 KC1 以及 15mM 的 MgCl2 (pH 9.0) (2 u 1/20 u 1 反應(yīng) 混合物)作為用于Taq聚合酶的10x反應(yīng)緩沖液。按下述步驟進行PCR (1)在95°C進行 12分鐘；(2)在95°C進行20秒；(3)在57°C進行40秒；(4)將步驟(2) (3)進行40個 循環(huán)。所得結(jié)果如圖11和圖12所示。如圖11所示，內(nèi)部序列中有1個核苷酸被dSpacer取代的引物和內(nèi)部序列中有1 個核苷酸被1' _甲氧基-dSpacer取代的引物顯示出相等的Ct值。如圖12所示，內(nèi)部序列中有1個核苷酸被1' _甲氧基-dSpacer取代的引物和沒有被取代的正常引物顯示出相 等的Ct值。上述結(jié)果表明，本發(fā)明所述的無堿基引物可有效地用于乙型肝炎病毒的檢測。序列表在此一并附上序列表。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會明了的是，可容易地利用上述說明書中公開的概念和具體實 施方式，作為改進或設(shè)計實現(xiàn)與本發(fā)明用途相同的其他實施方式的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員 還將明了的是，這類等同的實施方式?jīng)]有脫離如所附權(quán)利要求書中闡明的本發(fā)明的精神和 范圍。
權(quán)利要求
一種用于PCR擴增的引物，所述引物包含無堿基部分。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其中，所述無堿基部分選自于由下列物質(zhì)組成的組: dSpacer(5' -0-二甲氧基三苯甲基_1 ‘ ,2' -二脫氧核糖-[ (2-氰乙基)-(N，N-二 異丙基)]-亞磷酰胺)、1'-甲氧基-dSpaCer(5' -0-二甲氧基三苯甲基-1'-甲氧 基-2' -二脫氧核糖-3' -[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺)、PC Spacer Phosphoamidite([4-(4,4' -二甲氧基三苯甲氧基)丁酰胺基甲基)-1_(2_硝基苯基)-乙 基]-2-氰乙基 _(N，N-二異丙基)-亞磷酰胺)、rSpacer CE Phosphoamidite (5 ‘ -0-二 甲氧基三苯甲基-1'-脫氧核糖-2' -0-三異丙基甲硅氧基甲基-3' -[(2-氰乙 基)-(N，N- 二異丙基)]-亞磷酰胺)、SpacerC12 CE Phosphoamidite (12- (4,4' -二甲 氧基三苯甲氧基)-十二烷基-1- [ (2-氰乙基)-(N, N- 二異丙基)]-亞磷酰胺)、Spacer Phosphoamidite 18 (18-0- 二甲氧基三苯甲基六甘醇，1_[ (2-氰乙基)-(N，N- 二異丙 基)]-亞磷酰胺)、Spacer Phosphoamidite 9 (9_0_ 二甲氧基三苯甲基-三甘醇，1_[ (2_氰 乙基)-(N，N_ 二異丙基)]-亞磷酰胺)以及 Spacer Phosphoamidite C3(3_(4，4' -二甲 氧基三苯甲氧基)丙基-1- [ (2-氰乙基)-(N，N- 二異丙基)]-亞磷酰胺)。
3.如權(quán)利要求1所述的引物，其中，所述引物中的所述無堿基部分的數(shù)目為1-10。
4.如權(quán)利要求3所述的引物，其中，所述引物中的所述無堿基部分的數(shù)目為1-3。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的引物，其中，向所述引物的末端加入與模板互補的 核苷酸，以補償由無堿基部分所降低的Tm。
6.如權(quán)利要求1所述的引物，其中，所述無堿基部分為與將要進行雜交的核酸模板的 突變核苷酸相對應(yīng)的區(qū)域。
7.如權(quán)利要求1所述的引物，其中，所述無堿基部分為與將要進行雜交的核酸模板的 多態(tài)性核苷酸相對應(yīng)的區(qū)域。
8.一種用于PCR擴增的組合物，所述組合物包含反應(yīng)緩沖液、4種dNTP、DNA聚合酶、以 及權(quán)利要求1-7中任一項所述用于PCR擴增的任何引物。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，所述組合物進一步包含染料和/或穩(wěn)定劑。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述染料為選自于由溴酚藍、二甲苯青、溴甲酚 紅和甲酚紅所組成的組中的一種或多種化合物。
11.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述穩(wěn)定劑為選自于由明膠、牛血清白蛋白、 Thesit、PEG-8000和多元醇所組成的組中的一種或多種化合物。
12.一種用于PCR擴增的方法，所述方法包括下述步驟將用于PCR擴增的組合物與核 酸模板混合，所述組合物包含權(quán)利要求1-7中任一項所述的引物；以及用所述混合物進行 PCR。
13.如權(quán)利要求12所述的用于PCR擴增的方法，其中，所述方法為共同擴增不同的核酸 模板，所述核酸模板在它們的核苷酸序列中具有突變位點。
14.如權(quán)利要求12所述的用于PCR擴增的方法，其中，所述方法為共同擴增不同的核酸 模板，所述核酸模板在它們的核苷酸序列中具有多態(tài)性位點。
15.如權(quán)利要求12所述的用于PCR擴增的方法，其中，所述用于PCR擴增的引物組中的 一個引物為權(quán)利要求1-7中任一項所述的引物，所述引物組中的另一引物為不包含無堿基 部分的正常引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及引物序列內(nèi)包含無堿基部分的、用于PCR擴增的引物，還涉及使用該引物進行PCR擴增的方法。更確切地說，本發(fā)明涉及能夠擴增不同模板、并且具有與模板DNA的突變位點或多態(tài)性位點互補的無堿基部分的引物；本發(fā)明還涉及一種用于PCR擴增的方法，所述方法包括下述步驟將包含所述引物的用于PCR擴增的組合物與核酸模板混合；以及用所述混合物進行PCR。本發(fā)明所述用于PCR擴增的引物在其核苷酸序列中包含無特定編碼信息的無堿基部分，從而使其能同時擴增具有突變位點的不同模板。
文檔編號C12Q1/68GK101861402SQ200880116493
公開日2010年10月13日 申請日期2008年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月5日
發(fā)明者吉埈模, 樸海埻, 樸翰悟, 金成烈, 金鉉培 申請人:株式會社百奧尼