專利名稱：通過共表達(dá)真核Ⅰ型干擾素反應(yīng)抑制劑從而提高來自基于細(xì)菌傳遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及細(xì)菌的傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過抑制先天的I型干擾素反應(yīng)可促進(jìn)提高在真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。特別地，本發(fā)明提供了重組細(xì)菌傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)向真核 細(xì)胞傳遞i)轉(zhuǎn)基因和ii)真核I型干擾素反應(yīng)的抑制劑。
背景技術(shù)：
人們已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種病原菌的活的減毒的突變體作為潛在的用于通過粘膜途徑 傳遞異源抗原的疫苗載體。這些活的載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以以單一的口服、鼻腔內(nèi)或吸入劑 量的方式將大分子靶向釋放至哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織，從而同時(shí)刺激系統(tǒng)免疫反應(yīng)和粘膜免 疫反應(yīng)。極具潛力的細(xì)菌調(diào)節(jié)的編碼疫苗抗原和/或治療性分子的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移已經(jīng)在傳 染性疾病、腫瘤和基因缺乏的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中被顯明。不幸的是，用于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)外源蛋白或抑制性RNAs的以細(xì)菌為載體的過 客RNA/DNA及其他分子的釋放會(huì)導(dǎo)致I型干擾素(IFN)反應(yīng)。寄主對(duì)于侵入性病原體的監(jiān) 測(cè)系統(tǒng)的中心成分是識(shí)別受體的病原體(PRR)的進(jìn)化保守家族，該受體可結(jié)合模式微生物 /病毒配體，所述配體的范圍包括從細(xì)胞壁成分至核酸。PRR信號(hào)會(huì)導(dǎo)致激活轉(zhuǎn)錄因子比如 核因子B(NF-B)和干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)，提供炎癥情況(inflammatory context)用于 快速的激活寄主防線(host defense)。NF-B路徑控制著促炎(proinflammatory)細(xì)胞因子 比如IL-I和腫瘤壞死因子-α的表達(dá)，而IRF-3路徑會(huì)導(dǎo)致I型干擾素(IFN- α和IFN- β ) 的產(chǎn)生。這種最初產(chǎn)生的“第一波” IFN觸發(fā)表達(dá)相關(guān)因子IRF-7，其通常以非常低的濃度 存在于大多數(shù)細(xì)胞中(Sato Μ.等，Immunity，13 (4) 539-548，2000)。IRF-3 很可能與 IRF-7 相配合，并且決定著陽(yáng)性反饋回路(positive feed back loop)，該陽(yáng)性反饋回路啟動(dòng)數(shù)種 作為〃第二波〃 IFNs 的 IFN-α 亞型的合成(Marie et al.，EMBO J 17 (22)，6660-6669 ； 1998 andSato M et al. ,FEBS Lett 441(1) 106-110 ；1998) I 型 IFNs 通過發(fā)出自分泌和 旁泌性信號(hào)(ISGs)而激活數(shù)百個(gè)被IFN刺激的基因(de Veer et al.，J Leukocyte Biol 69(6)912-920,2001 ；Der et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(26) 15623-15628 ；1998), 其中一些基因編碼抗病毒蛋白。迄今為止，已經(jīng)穩(wěn)固地建立起三個(gè)受IFN刺激的路徑。這 些路徑包括蛋白激酶 R(PKR) (Williams，Oncogene 18 (45) 6112-6120 ； 1999)、2 ‘ -5'寡腺 苷酸合成酶(2 ‘ -5' OAS) (Silverman. , J Interferon Res 14 (3) 101-104 ; 1994)和 Mx 蛋白(HalIer and Kochs, Traffic 3(10)710-714 ；2002)。這種 I 型 IFN 反應(yīng)利用 PKR 禾口 2' -5' OAS限制了外源基因或抑制性RNAs的表達(dá)。激活的PKR通過真核生物的起動(dòng)因 子eIF2的α -亞基的磷酸化阻斷翻譯。另一方面，2-5Α合成酶產(chǎn)生短的、可激活RNA酶L 的與2' -5' OAS相關(guān)的寡腺苷酸，RNA酶L是單鏈特異性的可消化mRNA和核蛋白體RNA 的核糖核酸內(nèi)切酶。在用特定的RNA病毒感染后存活的寄主中Mx蛋白的重要性已經(jīng)被充 分地顯明(Hefti et al.，J Virology 73(8)6984-6991 ； 1999)，但是精確的作用方式仍然 是未知的。這種I型IFN反應(yīng)因此通過減少RNA產(chǎn)量和穩(wěn)定性的機(jī)制限制了外來核酸的表達(dá)，并且還抑制了細(xì)菌載體傳遞的來自過客核酸的信息的翻譯。細(xì)菌載體的多種成分在寄主細(xì)胞中引起IFN反應(yīng)。細(xì)菌本身能夠通過Toll樣受 體而引發(fā)IFN反應(yīng)。在轉(zhuǎn)錄期間由過客核酸產(chǎn)生的雙鏈RNA不僅誘導(dǎo)I型IFNs，而且直接 激活PKR和2' -5' OAS。質(zhì)粒DNA—旦傳遞進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)就往往含有隱藏 的可產(chǎn)生反義RNA的啟動(dòng)子，該反義RNA與mRNA退火而形成dsRNA。細(xì)菌載體的所有這些 成分因此減弱了細(xì)菌載體作為生物醫(yī)學(xué)工具的效果。美國(guó)專利6，525，029 (Falck-Perersen等，2003年2月25日)描述了抑制對(duì)重組 載體比如腺病毒載體的免疫反應(yīng)的方法。然而，這些技術(shù)的目的在于抑制對(duì)于被載體編碼 的基因長(zhǎng)期表達(dá)的體液(例如抗體)反應(yīng)、以及載體被免疫系統(tǒng)清除，而沒有闡明抑制對(duì)于 細(xì)菌載體或其過客核酸的I型IFN反應(yīng)。
現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域因此遠(yuǎn)不能提供可除去或削弱寄主細(xì)胞的I型IFN反應(yīng)的細(xì)菌載 體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了可成功地除去或削弱I型IFN反應(yīng)的重組細(xì)菌表達(dá)載體，該I型IFN 反應(yīng)通常被哺乳動(dòng)物寄主細(xì)胞在響應(yīng)細(xì)菌表達(dá)載體侵入時(shí)發(fā)動(dòng)。該重組細(xì)菌表達(dá)載體通過 編碼抑制或壓制在寄主細(xì)胞中的I型IFN反應(yīng)的因子而阻遏普通的IFN反應(yīng)。該IFN抑制 劑或者i)在用于傳遞的細(xì)菌細(xì)胞中作為蛋白質(zhì)被表達(dá)；或者ii)在真核細(xì)胞中由被細(xì)菌細(xì) 胞傳遞的核苷酸序列表達(dá)。IFN反應(yīng)的抑制允許被細(xì)菌載體傳遞的過客基因更穩(wěn)固的表達(dá)， 并且表達(dá)僅在I型IFN反應(yīng)已被抑制的真核細(xì)胞中增強(qiáng)。例如，當(dāng)本發(fā)明的重組細(xì)菌表達(dá) 載體將編碼抗原的過客核苷酸序列傳遞至期望有免疫反應(yīng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，由哺乳動(dòng)物 細(xì)胞產(chǎn)生的那些抗原很少或不受寄主IFN系統(tǒng)抑制(或者抑制程度被降低)，抗原被表達(dá)， 并且可以產(chǎn)生期望的對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。作為另一種選擇，當(dāng)過客核酸序列用于編碼期望 的蛋白質(zhì)產(chǎn)物比如酶、激素、或治療性或食療性(nutraceutic)因子時(shí)，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞生 產(chǎn)這些蛋白質(zhì)產(chǎn)物可很少或不受寄主IFN系統(tǒng)抑制。本發(fā)明的目的在于提供一種基因工程細(xì)菌，其包含編碼i) 一個(gè)以上過客基因的 核酸序列；以及ii)編碼一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列。編碼一個(gè) 以上過客基因的核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng)子上，并且編碼一個(gè)以上可抑制 哺乳動(dòng)物I型干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng)子或原核生 物啟動(dòng)子上。在又一個(gè)實(shí)施方式中，可表達(dá)的編碼一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因 子的核酸序列存在于基因工程細(xì)菌的染色體上。在另一個(gè)實(shí)施方式中，i)編碼所述一個(gè)以 上過客基因的核酸序列(其中，核酸序列可在真核細(xì)胞中表達(dá))與ii)編碼所述一種以上 抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列中的一個(gè)或兩者存在于質(zhì)粒上。另外，一種以 上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子可以起源于病毒。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)以上過客基 因編碼結(jié)核病或瘧疾抗原。在另一個(gè)實(shí)施方式中，基因工程細(xì)菌是志賀菌(痢疾桿菌)或 分枝桿菌。另外過客基因可以是異源的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種提高所關(guān)注的一種以上基因產(chǎn)物在細(xì)胞或組織中的產(chǎn) 量的方法。該方法包括下述步驟將包含編碼i)所關(guān)注的一種以上基因產(chǎn)物和ii) 一種 以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列的基因工程細(xì)菌施用于細(xì)胞或組織。編碼一個(gè)以上過客基因的核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng)子上，并且編碼一個(gè)以上可抑制哺乳動(dòng)物I型干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng)子或原 核生物啟動(dòng)子上。施用步驟在如下條件下進(jìn)行其允許基因工程細(xì)菌侵入細(xì)胞或組織、并且 允許基因工程細(xì)菌在細(xì)胞或者組織內(nèi)部產(chǎn)生所關(guān)注的一種以上基因產(chǎn)物和一種以上因子。 在一種實(shí)施方式中，可表達(dá)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄受真核生物啟動(dòng)子控制。在另一個(gè)實(shí)施方式 中，可表達(dá)的編碼一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列的轉(zhuǎn)錄受原核生物 啟動(dòng)子控制。在又一個(gè)實(shí)施方式中，可表達(dá)的編碼一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因 子的核酸序列存在于基因工程細(xì)菌的染色體上。在另一個(gè)實(shí)施方式中，i)可表達(dá)的編碼所 關(guān)注的一種以上基因產(chǎn)物的核酸序列與ii)可表達(dá)的編碼一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素 反應(yīng)的因子的核酸序列中的一個(gè)或兩者存在于質(zhì)粒上。另外，一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾 素反應(yīng)的因子可以起源于病毒。在一些實(shí)施方式中，所關(guān)注的一種以上基因產(chǎn)物可以是結(jié) 核病抗原。在另一個(gè)實(shí)施方式中，基因工程細(xì)菌是志賀菌或分枝桿菌。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)所關(guān)注的抗原的免疫反應(yīng) 的方法。該方法包括下述步驟將包含編碼所關(guān)注的抗原的核酸序列以及編碼一種以上抑 制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列的基因工程細(xì)菌施用于哺乳動(dòng)物。該編碼一個(gè)以 上過客基因的核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng)子上，并且編碼一個(gè)以上可抑制哺 乳動(dòng)物I型干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng)子或原核生物 啟動(dòng)子上。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所關(guān)注的抗原是結(jié)核分枝桿菌抗原。在一些實(shí)施 方式中，可表達(dá)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄受真核生物啟動(dòng)子控制。在其他實(shí)施方式中，可表達(dá)的編 碼一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列的轉(zhuǎn)錄受原核生物啟動(dòng)子控制。在 另一些實(shí)施方式中，可表達(dá)的編碼一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列存 在于基因工程細(xì)菌的染色體上。在一些實(shí)施方式中，i)可表達(dá)的編碼所關(guān)注的抗原的核酸 序列與ii)可表達(dá)的編碼一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列中的一個(gè) 或者兩者存在于質(zhì)粒上。在另一些實(shí)施方式中，一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子 起源于病毒。


圖1.在用攜帶有編碼β-半乳糖苷酶真核表達(dá)的質(zhì)粒的弗氏志賀菌 NCDKShigellaflexneri NCD1)侵染Hela或ΒΗΚ-21細(xì)胞(IFN缺陷型)之后細(xì)胞裂解液的 β -半乳糖苷酶活性。黑色柱子指示來自于用含有編碼IacZ基因的質(zhì)粒的菌株侵染后細(xì)胞 的半乳糖苷酶活性；白色柱子指示來自于用不含IacZ質(zhì)粒的菌株侵染后細(xì)胞的β-半 乳糖苷酶活性。圖2.在用含有編碼β-半乳糖苷酶的質(zhì)粒的弗氏志賀菌NCDl侵染后、以及在用 編碼腺病毒衍生的PKR抑制劑(與腺病毒有關(guān)的I，VAI)的弗氏志賀菌NCDl共侵染后Hela 細(xì)胞裂解液的β-半乳糖苷酶活性。圖3.免疫印跡顯示了綠色熒光蛋白(GFP)在用弗氏志賀菌菌株MPC511侵染后 Hela細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，菌株MPC51僅攜帶有真核GFP報(bào)告基因(泳道4)、或者攜帶有 GFP加NSl (泳道5)或NSPl (泳道2)。泳道1 陽(yáng)性對(duì)照；泳道3 未侵染的Hela細(xì)胞。圖4.在Hela細(xì)胞中NSl蛋白質(zhì)IFN-α/β路徑的影響。NSl抑制(黑色柱子)了被志賀菌(灰色柱子)誘導(dǎo)的IFN相關(guān)基因的表達(dá)。圖5.VAI RNA基因IFN-a /日路徑在Hela細(xì)胞中的影響。VAI RNA基因抑制(黑 色柱子)了被志賀菌(白色柱子)誘導(dǎo)的IFN相關(guān)基因的表達(dá)。圖6.編碼IFN拮抗劑的報(bào)告載體的示意圖。IFN拮抗劑基因在GFP報(bào)告載體主鏈 中的克隆。用于受RNA聚合酶III啟動(dòng)子控制的VAI RNA基因的轉(zhuǎn)錄、并用于寄主細(xì)胞經(jīng) 由啟動(dòng)子Pef表達(dá)GFP基因的單一質(zhì)粒系統(tǒng)。圖7.用攜帶有編碼GFP的質(zhì)粒(pGFP)或編碼GFP和VAI IFN抑制劑的質(zhì)粒 (pAdgfp)的弗氏志賀菌侵染Hela細(xì)胞。使用兔抗GFP抗血清通過免疫印跡分析確定GFP 的表達(dá)。觀察到在被同時(shí)含有GFP和VAI RNA基因(pAdgfp)的志賀菌侵染的Hela細(xì)胞中 增強(qiáng)的GFP蛋白表達(dá)。顯示了兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖8.用攜帶有編碼分枝結(jié)核桿菌(Mtb)抗原85A的RNA、并且攜帶有和未 攜帶編碼IFN抑制劑NS1的質(zhì)粒的志賀菌侵染的BHK21細(xì)胞的裂解液的蛋白質(zhì)印跡 (Westernblot)。泳道 1，51 MS85A 28 ；泳道 2，51 MS85A 37 ；泳道 3，51 MS85A pNSl 28 ；泳 M 4,51 MS85A pNSl 37;泳道5，51 MS85A pNSl 37 ；泳道 6，弗氏志賀菌 NCD pcDNA_85A ； 泳道7，MPC51 pLM2653 ；泳道8，BHK21細(xì)胞；泳道9，用pcDNA_85A轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞。圖9A-C為抗病毒免疫反應(yīng)抑制劑的序列。A，來自于流感病毒的NS1的DNA序列 (SEQ ID NO 1) ；B，來自于輪狀病毒的NSP1的DNA序列(SEQ ID NO 2) ；C，來自于腺病毒的 VAI 的 RNA 基因序列(SEQ ID NO :3)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的重組細(xì)菌表達(dá)載體經(jīng)基因工程化而編碼因子，所述因子可除去、削弱或 抑制通常被哺乳動(dòng)物寄主細(xì)胞在響應(yīng)細(xì)菌侵染時(shí)發(fā)動(dòng)的I型干擾素反應(yīng)。這些因子可以被 細(xì)菌載體細(xì)胞表達(dá)，或者可以被編碼在被真核寄主細(xì)胞翻譯的核酸中。減弱或消除在真核 寄主細(xì)胞中的IFN反應(yīng)允許有效地由被載體導(dǎo)入的核酸轉(zhuǎn)錄和翻譯所關(guān)注的蛋白質(zhì)和多 肽。這些被攜帶的分子可以編碼對(duì)于細(xì)菌繁殖和存活所必需的肽和蛋白質(zhì)、以及包含在細(xì) 菌內(nèi)部的所關(guān)注的“過客”分子。所關(guān)注的過客核酸的例子包括但不限于，例如，細(xì)菌已經(jīng) 被基因工程化而可對(duì)其編碼的抗原。因?yàn)檎婧思闹骷?xì)胞的I型IFN反應(yīng)被削弱，所以抗原 仍被持續(xù)地表達(dá)，并且表達(dá)水平足以引起寄主細(xì)胞發(fā)動(dòng)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的細(xì)菌 表達(dá)載體因此理想的是用于疫苗制備。本發(fā)明的細(xì)菌表達(dá)載體經(jīng)基因工程化從而編碼可除去、削弱、抑制或壓制I型IFN 反應(yīng)的因子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，許多病毒可以編碼IFN反應(yīng)的標(biāo)靶特異性的調(diào) 節(jié)劑的因子。這些因子能夠被認(rèn)為是IFN反應(yīng)拮抗劑。在最具特征性的病毒標(biāo)靶中有蛋白 激酶R(PKR)、可激活RNA酶L的(2' -5')寡腺苷酸合成酶和干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)的蛋 白質(zhì)家族。對(duì)于術(shù)語(yǔ)“抑制”或“壓制”免疫反應(yīng)，我們指的是在真核細(xì)胞內(nèi)部引起的典型的 或正常的免疫反應(yīng)被完全地或者部分地抑制、減輕、降低、阻礙等。這樣的抑制可以被以本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的數(shù)種方式中的任一方式檢測(cè)并測(cè)量，這些方式包括但不限于檢測(cè)標(biāo) 志物質(zhì)的含量、活性或表征的降低，所述標(biāo)志物質(zhì)為免疫反應(yīng)特有或者與之相關(guān)(例如， IFNa、IFN0等)。抑制水平一般至少是約25%，優(yōu)選約50%，更優(yōu)選約60%、70%、80%、90%或100%。典型地通過檢測(cè)一種以上在已經(jīng)用本發(fā)明的載體(編碼一個(gè)以上轉(zhuǎn)基因加 上一種以上免疫系統(tǒng)抑制劑的載體)轉(zhuǎn)染的寄主細(xì)胞中所產(chǎn)生的物質(zhì)與在對(duì)照細(xì)胞(用編 碼一個(gè)以上轉(zhuǎn)基因、但不編碼免疫系統(tǒng)抑制劑的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)中產(chǎn)生的相同物質(zhì)含量 相比在含量之間的差異而測(cè)量抑制水平。類似地，術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)的”或“提高的”的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，一般指的是在用本發(fā)明的載體 轉(zhuǎn)染的寄主細(xì)胞內(nèi)部與對(duì)照細(xì)胞相比時(shí)被表達(dá)(即轉(zhuǎn)錄并翻譯)的轉(zhuǎn)基因含量的提高、增 加等。這樣的增強(qiáng)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的數(shù)種方法中的任何一種方法來測(cè)量，例 如檢測(cè)由載體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的含量、活性或特征的提高；檢測(cè)產(chǎn)生的與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物 有關(guān)的物質(zhì)(例如mRNA、物質(zhì)或轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物產(chǎn)生的影響、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的抗體等)的含量、活 性或特征的提高。增強(qiáng)水平一般至少是約25%，優(yōu)選約50%，更優(yōu)選約60%、70%、80%、 90%或100%，或更高。 適合本發(fā)明中使用的抑制免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)可被多種病毒編碼，病毒的例子包括 但不限于輪狀病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白I(NSPl)；甲型流感病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白I(NSl)；腺病毒相 關(guān)RNA I和II(VAI和VAII)；牛痘病毒E3L或vIFN-α/β Rc蛋白；丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu) 性蛋白5A(NS5A)或NS3/4A蛋白酶；猴腎病毒V蛋白；仙臺(tái)病毒C蛋白；鼠痘病毒C12R蛋 白；腺病毒ElA蛋白、副粘病毒C蛋白、或人乳頭瘤病毒(HPV)E6癌蛋白。通過發(fā)現(xiàn)許多病毒編碼拮抗IFN誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)的基因產(chǎn)物，進(jìn)一步顯示了 IFN系統(tǒng)作為寄主抗病毒感染防御的基本重要性。這些病毒利用數(shù)種不同的策略來阻斷 IFN誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)和作用。DNA病毒和RNA病毒兩者都編碼可削弱IFN信號(hào)路徑活 性的蛋白質(zhì)。顯然涉及到多種機(jī)制。其中之一是模仿。有數(shù)個(gè)例子，其中病毒編碼模仿IFN 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中的細(xì)胞組分的產(chǎn)物。這種分子模仿能夠?qū)е翴FN信號(hào)處理的拮抗作用。痘 病毒，例如，編碼可溶性的IFN受體同系物(vIFN-Rc)。這些vIFN-Rc同系物被從受痘病毒 感染的細(xì)胞中分泌出來并且結(jié)合IFNs，從而防止它們通過它們的天然受體起作用以引起抗 病毒反應(yīng)。vIFN-α/β Rc蛋白被牛痘病毒和數(shù)種其他正痘病毒分泌。vIFN-α/β受體同 系物一在西方儲(chǔ)備菌株(Western Reserve strain)中的B18R基因產(chǎn)物和在哥本哈根菌 株(Copenhagenstrain)中的B19R產(chǎn)物結(jié)合數(shù)種不同的IFN-α亞種以及IFN-β，并且和阻 斷IFN-α/β信號(hào)活動(dòng)。三種額外的影響IFN信號(hào)的DNA病毒是腺病毒、乳頭瘤病毒、以及 人類皰疹病毒8 (HHV-8)。腺病毒ElA蛋白可阻斷在ISGF-3活化的上游點(diǎn)處IFN介導(dǎo)的信 號(hào)傳導(dǎo)。ISGF-3的DNA結(jié)合活性被ElA抑制。SeV的C蛋白(SeV)，即在寄主細(xì)胞質(zhì)中復(fù) 制的副粘病毒通過干涉IFN誘導(dǎo)的細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄活化而阻遏了 IFN誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。 就仙臺(tái)病毒而言，C蛋白以至少兩種方式干涉IFN作用。C蛋白抑制了 STAT-I的合成，并 且它們還誘導(dǎo)STAT-I提高的轉(zhuǎn)化。人乳頭瘤病毒(HPV)E6癌蛋白選擇性地結(jié)合于IRF-3， 但是僅非常弱地結(jié)合于其他的細(xì)胞IRFs包括IRF-2和IRF-9。E6與IRF-3的結(jié)合抑制反 式激活(transactivation)，從而為HPV提供阻遏IFN反應(yīng)的機(jī)制。腺病毒ElA蛋白還通 過取決于ElA結(jié)合p300的能力的機(jī)制來抑制IRF-3調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄活化。HHV-8，與卡波西肉 瘤(Kaposi's sarcoma)有關(guān)的、皰疹病毒合成具有IFN-α / β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化阻遏物功 能的IRF同系物(vIRF)。被HHV-8編碼的vIRF蛋白質(zhì)還抑制IRF-I調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄活化。兩 種其他的皰疹病毒，即水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)和巨細(xì)胞病毒(CMV)，還破壞了 IFN信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的功能。VZV抑制STAT-I和JAK-2蛋白的表達(dá)，但是對(duì)JAK-I幾乎沒有影響。拮抗作用的不同策略發(fā)生在受CMV感染的細(xì)胞中，其中MHC II類表達(dá)也被抑制。由于在受 CMV感染的成纖維細(xì)胞中蛋白質(zhì)降解增強(qiáng)，所以在JAK-1水平上有特定的降低。數(shù)種非節(jié) 段(nonsegmented)負(fù)鏈RNA病毒編碼可拮抗IFN受體調(diào)節(jié)的由I型IFN受體發(fā)出的信號(hào) 傳導(dǎo)的基因產(chǎn)物。例如，感染猿猴病毒5或腮腺炎病毒會(huì)導(dǎo)致受蛋白體調(diào)節(jié)的STAT-1降解 的提高，反之，在用副流感病毒類型2感染的細(xì)胞中則存在STAT-2的降解。埃博拉病毒的 VP35蛋白，一種負(fù)鏈RNA病毒，具有I型IFN拮抗劑的功能，雖然還沒有定義精確的拮抗作 用的生物化學(xué)機(jī)制。VP35抑制IFN-0啟動(dòng)子的病毒誘導(dǎo)、和dsRNA調(diào)節(jié)的及病毒調(diào)節(jié)的受 ISRE驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)的活化。編碼三個(gè)示例性抑制劑(來自流感病毒的NS1、來自輪狀病 毒的NSP1、以及來自腺病毒的VAI)的核酸序列顯示在圖9A-C中。IFN抑制因子還可以由其他的非病毒來源得到，例如，從寄主細(xì)胞(例如細(xì)胞因子 信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑(S0CS)、顯性負(fù)性的PKR和顯性負(fù)性的RNA酶L)得到，并且可以在本發(fā)明 的實(shí)施方式中使用。任何可抑制或衰減IFN反應(yīng)、并且被能夠經(jīng)基因工程化進(jìn)入細(xì)菌表達(dá) 載體并成功地由該細(xì)菌表達(dá)載體表達(dá)的核酸序列所編碼的的因子(例如抗受干擾素刺激 的基因的siRNA)可以在本發(fā)明的實(shí)施方式中使用。其例子包括，但不限于，如上所述的那 些因子、以及各種自分泌IFN誘導(dǎo)的效應(yīng)因子和對(duì)I型IFNs的抗病毒作用所必需的調(diào)節(jié)劑 蛋白質(zhì)，比如RNA依賴性蛋白激酶(PKR) ；2, 5'-寡腺苷酸合成酶(OAS) ；RNA酶L ；Mx蛋白 GTP酶；IFN誘導(dǎo)的RNA特異性的腺苷脫氨酶(ADAR1) ；IFN調(diào)節(jié)因子比如IRF-5和IRF-7 ； (IRF)家族的轉(zhuǎn)錄因子比如TLR3、TLR4、TLR7和TLR9 ；因子比如IRAK1/4和TRAF6 ；RLR、 MyD88、TAK1、TOLLIP、TIFA 等。對(duì)于術(shù)語(yǔ)“細(xì)菌表達(dá)載體”，我們指的是已被經(jīng)基因工程化而包含并傳遞和/或表 達(dá)所關(guān)注的核酸序列的細(xì)菌細(xì)胞。能夠用這樣的方式被使用的細(xì)菌的例子包括，但不限于 彎曲菌屬、奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、氣單孢菌屬、弗朗西絲菌屬、耶爾森菌屬、克雷伯桿菌屬、 博代桿菌屬、軍團(tuán)桿菌屬、棒狀桿菌屬、枸櫞酸菌屬、衣原體屬、布魯菌屬、假單胞菌屬、螺旋 菌屬、或弧菌屬。使用的特定的彎曲菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的?？梢栽诒景l(fā)明中使 用的彎曲菌菌株的例子包括但不限于C. jejuni (ATCC Nos. 43436、43437、43438)、 C. hyointestinalis(ATCC No. 35217)、胎兒彎曲菌(C. fetus) (ATCC No. 19438)、糞彎曲菌 (C. fecalis) (ATCCNo. 33709)、C. doylei (ATCC No. 49349)以及 C. coli (ATCC Nos. 33559、 43133)。使用的特定的耶爾森菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的?？梢栽诒景l(fā)明中使用 的耶爾森菌菌株的例子包括小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Y. enterocolitica) (ATCC No. 9610) 或鼠疫耶爾森菌(Y.pestis) (ATCC No. 19428)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Y. enterocolitica) Ye03-R2(al Hendy 等，Infect. Immun. ,60 870 ； 1992)或小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 (Y. enterocolitica) aroA(0' Gaora Micro. Path. ,9 105 ； 1990)。使用的特定的克雷伯桿菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的。可以在本發(fā)明中使用 的克雷伯桿菌菌株的例子包括K. pneumoniae (ATCC No. 13884)。使用的特定的博代桿菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的。可以在本發(fā)明中使用 的博代桿菌菌株的例子包括百日咳博代桿菌(B. pertussis)、以及支氣管敗血性博代桿菌 (B.bronchiseptica)(ATCC No. 19395)。
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使用的特定的奈瑟菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的?？梢栽诒景l(fā)明中使用 的奈瑟菌菌株的例子包括腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis) (ATCC No. 13077)和淋病奈 瑟菌(N. gonorrhoeae) (ATCC No. 19424)、淋病奈瑟菌(N. gonorrhoeae)MSI 1 aro 突變體 (Chamberlain 等，Micro. Path. ，15 51-63 ； 1993)。使用的特定的氣單孢菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的。可以在本發(fā)明中 使用的氣單孢菌菌株的例子包括殺鮭氣單孢菌(A. salminocida) (ATCC No. 33658)、 A. schuberii (ATCCNo. 43700)、嗜水氣單孢菌(A. hydrophila)、A. eucrenophila (ATCC No. 23309)。使用的特定的弗朗西絲菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的?？梢栽诒景l(fā)明中使用 的弗朗西絲菌菌株的例子包括土拉熱弗朗西絲菌(F. tularensis) (ATCC No. 15482)。使用的特定的棒狀桿菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的?？梢栽诒景l(fā)明中使用的 棒狀桿菌菌株的例子包括假結(jié)核棒狀桿菌(C. pseudotuberculosis) (ATCC No. 19410)。使用的特定的枸櫞酸菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的?？梢栽诒景l(fā)明中使用的 枸櫞酸菌菌株的例子包括弗氏枸櫞酸菌(C. freundii) (ATCC No. 8090)。使用的特定的衣原體菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的。可以在本發(fā)明中使用的衣 原體菌株的例子包括 C. pneumoniae (ATCC No. VR1310)。使用的特定的嗜血桿菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的?？梢栽诒景l(fā)明中使用 的嗜血桿菌菌株的例子包括流感嗜血桿菌(H. influenzae) (Lee等。J. Biol. Chem. 270 27151；1995)、H. somnus(ATCC No. 43625)。使用的特定的布魯菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的。可以在本發(fā)明中使用的布 魯菌菌株的例子包括流產(chǎn)布魯菌(B. abortus) (ATCC No. 23448)。使用的特定的軍團(tuán)桿菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的?？梢栽诒景l(fā)明中使用的 軍團(tuán)桿菌菌株的例子包括L. pneumophila (ATCC No. 33156)、或L. pneumophila mip突變體 (Ott, FEMS Micro. Rev.，14 161 ； 1994)。使用的特定的假單孢菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的。可以在本發(fā)明中使用的假 單孢菌株的例子包括綠膿假單孢菌(P. aeruginosa) (ATCC No. 23267)。使用的特定的螺旋菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的?？梢栽诒景l(fā)明中使用 的螺旋菌菌株的例子包括幽門螺旋菌(H. pylori) (ATCC No. 43504)、H. mustelae (ATCC No. 43772)。使用的特定的弧菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的?？梢栽诒景l(fā)明中使 用的弧菌菌株的例子包括霍亂弧菌(Vibrio cholerae) (ATCC No. 14035)、Vibrio cincinnatiensis(ATCC No. 35912)、霍亂弧菌(V. cholerae)RSI 毒性突變體(Taylor 等， J. Infect. Dis.，170 1518-1523 ； 1994)和霍亂弧菌(V. cholerae) ctxA、ace、zot、c印突變 體(ffaldor 等，J Infect. Dis.，170 :278_283 ； 1994)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在本發(fā)明中由其開發(fā)出載體菌株的菌株包括有潛力具 有既作為載體又作為疫苗載體作用的細(xì)菌，比如腸桿菌科，包括但不限于埃希桿菌屬、志 賀菌屬、以及沙門菌屬。格蘭氏陽(yáng)性和耐酸的載體菌株能夠類似地由產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌 或分枝桿菌構(gòu)建。使用的特定的埃希桿菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的。可以在本發(fā)明中使用的埃希桿菌菌株的例子包括大腸桿菌菌株DH5a、HBlOU HS-4、4608_58、1184-68、 53638-C-17、13-80、以及6_81(參見，例如Sambrook等，參見前述；Grant等，參見前述； Sansonetti等，Ann. Microbiol.(巴斯德研究所)，132A :351 ；1982)、腸毒性的大腸桿菌 (參見，例如Evans等，Infect. Immun. ,12 656 ；1975)、致腸病的大腸桿菌(參見，例如 Donnenberg 等，J. Infect. Dis.，169 831 ； 1994)、腸侵入性(enteroinvasive)大腸桿菌 (參見，例如 Small 等，Infect. Immun. ,55 1674 ； 1987)和腸出血性(enterohemorrhagic) 大腸桿菌(參見，例如 McKee 和 O' Brien, Infect. Immun. ,63 2070 ； 1995)。使用的特定的沙門菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的。可以在本發(fā)明中使用的 沙門菌菌株的例子包括傷寒沙門菌(S. typhi)(參見，例如ATCC No. 7251)、鼠傷寒沙門菌 (S. typhimurium)(參見，例如 ATCC No. 13311)、Salmonella galinarum(ATCC No. 9184)、 腸炎沙門菌(Salmonella enteriditis)(參見，例如ATCC No. 4931)和鼠傷寒沙門菌 (Salmonellatyphimurium)(參見，例如 ATCC No. 6994)、傷寒沙門菌(S. typhi)aroc、arod 雙重突變型(參見，例如Hone等，Vacc.，9 :810_816 ； 1991)、鼠傷寒沙門菌(S. typhimurium aroA)突變體(參見，例如 Mastroeni 等，Micro. Pathol.，13 :477_491 ；1992)。使用的特定的志賀菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的。可以在本發(fā)明中使用的志賀菌菌株的例子包括弗氏志賀菌(Shigella flexneri)(參見，例如ATCC No. 29903)、弗 氏志賀菌 CVD1203(參見，例如 Noriega 等，Infect. Immun. ,62 5168 ； 1994)、弗氏志賀菌 15D(參見，例如 Sizemore 等，科學(xué)，270 299 ；1995)、宋內(nèi)志賀菌(Shigella sonnei)(參 見，例如ATCC No. 29930)、以及志賀痢疾桿菌(參見，例如ATCC No. 13313)。使用的特定的分枝桿菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的。可以在本發(fā)明中使 用的分枝桿菌菌株的例子包括結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)⑶C1551菌株(參見， 例如 Griffith 等，Am. J. Respir. Crit. Care Med.八月；152 (2) 808 ； 1995)、結(jié)核分枝 桿菌北京菌株(Soolingen等，1995)H37Rv菌株(ATCC# :25618)、結(jié)核分枝桿菌泛酸鹽 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株(Sambandamurthy0 Nat. Med.，20028 (10) :1171 ;2002)、結(jié)核分枝桿菌 rpoV 突變株(Collins 等。Proc. Natl. Acad. Sci. USA，92 (17) :8036 ； 1995)、結(jié)核分枝桿 菌亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株(Hondalus 等，Infect. Immun. , 68 (5) 2888 ；2000), Bacille Calmette-Gu6rin (卡介苗)丹麥菌株(ATCC#35733)、卡介苗日本菌株(ATCC#35737)、卡 介苗芝加哥菌株(ATCC#27289)、卡介苗哥本哈根菌株(ATCC # :27290)、卡介苗巴斯德菌株 (ATCC# 35734)、卡介苗葛蘭素菌株(ATCC # :35741)、卡介苗干諾(Connaught)菌株(ATCC# 35745)、卡介苗蒙特利爾菌株(ATCC # 35746)。使用的特定的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌菌株對(duì)于本發(fā)明而言是不關(guān)鍵的?？梢栽诒?發(fā)明中使用的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌菌株的例子包括產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌菌株10403S(例 如，Stevens等，J.Virol. ,78 =8210-8218 ；2004)或突變體產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌株比如 (i) actAplcB(Peters φ, FEMS Immunology and Medical Microbiology, 35 243-253 ；2003) ； (Angelakopoulous等，Infect and Immunity, 70 3592-3601 ；2002) ； (ii) 用于丙氨酸消旋酶基因和D-型氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因的dal dat雙重突變型(Thompson等， Infect andlmmunity,66 :3552_3561 ；1998)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，細(xì)菌尤其是志賀菌屬種類、特別是侵入性削弱的弗 氏志賀菌2a。這些菌株MPC51和NCDl是弗氏志賀菌菌株2457T的衍生物，其內(nèi)已經(jīng)導(dǎo)入了 asd和murl缺失突變。asd缺失由被表達(dá)載體編碼的asd等位基因補(bǔ)足，并且murl突變 導(dǎo)致菌株不能合成D-谷氨酸。因此，這些菌株在沒有二氨基庚二酸和D-谷氨酸的情況下 不能合成適當(dāng)?shù)募?xì)胞壁，這會(huì)促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞在真核細(xì)胞侵染之后的溶解。當(dāng)通過慶大霉素 保護(hù)測(cè)定法測(cè)量時(shí)，Hela細(xì)胞受A asd、A murl雙重突變型MPC51侵染的狀態(tài)與親本菌株 受MPC51pYA3342 (編碼asd的質(zhì)粒)侵染的狀態(tài)相似。該菌株已經(jīng)通過除去預(yù)先插入染色 體asd基因座的卡那霉素抗性基因而被進(jìn)一步修飾。得到的菌株一弗氏志賀菌NCD1因此 不含抗生素抗性標(biāo)記，仍然保持asd和murl基因的染色體缺失，并且在當(dāng)前的調(diào)節(jié)需求下 適用于人體內(nèi)的藥學(xué)應(yīng)用。N⑶1也已被顯示可以類似于親本菌株的方式侵入HeLa細(xì)胞和 Caco-2細(xì)胞中。一般地，本發(fā)明的細(xì)菌表達(dá)載體經(jīng)基因工程化而編碼并同時(shí)傳遞IFN抑制因子和 一個(gè)以上其他所關(guān)注的基因，即過客基因。該過客基因典型地是來源于另一種生物體的異 源轉(zhuǎn)基因，比如來源于另一種細(xì)菌或病原體，并且可以是來源于任何生物體。然而，“過客基 因”還可以是天然存在于細(xì)菌載體本身中的基因(即，來源于充當(dāng)載體的細(xì)菌)，但是在細(xì) 菌載體中一個(gè)以上額外的拷貝經(jīng)基因工程化而受啟動(dòng)子控制，該啟動(dòng)子例如可將轉(zhuǎn)錄水平 提高高于一般的細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄水平，或者該啟動(dòng)子對(duì)特定類型的寄主細(xì)胞或組織(例如肺、 淋巴結(jié)、樹狀細(xì)胞等)是特異的。另外，“過客基因”不僅是指整個(gè)“基因”，而且是指任何編 碼所關(guān)注的肽、多肽、蛋白質(zhì)、或核酸的序列。即，可以不包括整個(gè)“基因”自身，而是包括編 碼所關(guān)注的多肽或肽例如抗原性肽的基因部分。另外，多種其他構(gòu)建體可以被過客基因編 碼，例如嵌合蛋白、或氨基酸序列的多種突變體(天然產(chǎn)生或基因工程)形式。另外，自然 界未出現(xiàn)的完全人工合成的氨基酸序列也可以被編碼。細(xì)菌表達(dá)載體經(jīng)基因工程化而包含 一個(gè)或多個(gè)這樣的“過客基因”，并且還可以編碼多拷貝的單個(gè)過客基因。該重組細(xì)菌表達(dá) 載體具有載體功能，以便將過客基因運(yùn)載進(jìn)入被細(xì)菌侵染的寄主細(xì)胞，在其中基因產(chǎn)物被 表達(dá)，即，基因序列是可以表達(dá)的，并且基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯發(fā)生在被細(xì)菌侵染的寄 主細(xì)胞內(nèi)部。編碼過客基因的序列被可操作地(可實(shí)施操作地)連接于表達(dá)控制序列、特 別是允許在細(xì)菌和/或真核寄主細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)的表達(dá)控制序列。對(duì)于“可操作地連接”，我 們是指，編碼過客基因的核酸序列易于在合適的寄主細(xì)胞比如細(xì)菌載體或哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi) 部成功地轉(zhuǎn)錄并翻譯。特別是，這些過客基因可以編碼一種以上作為期望其引起免疫反應(yīng)的抗原的肽 或蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，存在各式各樣這樣的抗原，包括但不限于與傳染 劑比如多種病毒、細(xì)菌、真菌、多種寄生蟲等有關(guān)的抗原。由其衍生病毒抗原的病毒性病 原體包括但不限于正粘病毒，比如流感病毒(分類學(xué)編號(hào)59771)；逆轉(zhuǎn)錄病毒，比如比 RSV、HTLV-1 (分類學(xué)編號(hào)39015)、以及HTLV-II (分類學(xué)編號(hào)11909)；乳頭瘤病毒，比 如HPV(分類學(xué)編號(hào)337043)、皰疹病毒，比如EBV(分類學(xué)編號(hào)10295) ；CMV(分類學(xué)編 號(hào)=10358)或單純皰疹病毒(ATCC # :VR-1487)；慢病毒，比如HIV-1 (分類學(xué)編號(hào)12721) 和HIV-2(分類學(xué)編號(hào)11709)；棒狀病毒，比如狂犬??；小RNA病毒，比如脊髓灰質(zhì)炎病毒 (分類學(xué)編號(hào)12080)；痘病毒，比如牛痘(分類學(xué)編號(hào)10245)；輪狀病毒(分類學(xué)編號(hào) 10912)；以及細(xì)小病毒，比如腺病毒相關(guān)病毒1 (分類學(xué)編號(hào)85106)。能夠在該組中發(fā)現(xiàn)的病毒抗原的例子包括但不限于艾滋病毒抗原Nef(過敏癥 和傳染病HIV國(guó)家研究所入藏目錄號(hào)183 ；GenBank登記號(hào)AF238278) ；Gag ；Env(過敏癥和傳染病HIV國(guó)家研究所入藏目錄號(hào)2433 ；GenBank登記號(hào)U39362) ；Tat (過敏癥和傳染病HIV國(guó)家研究所入藏目錄號(hào)827 ；GenBank登記號(hào)M13137) ；Tat突變衍生物比如 Tat-31-45 (Agwale 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 10037 ；2002) ；Rev (過敏癥和傳染病 HIV國(guó)家研究所入藏目錄號(hào)2088 ；GenBank登記號(hào)114572)；以及Pol (過敏癥和傳染病 HIV 國(guó)家研究所入藏目錄號(hào)238 ；GenBank 登記號(hào)AJ237568) ；gp 120 (Hanke 和 McMichae 1， AIDS Immunol Lett. 66 177 ； 1999) ； (Hanke 等，Vaccine. 17 589 ； 1999)的 T 細(xì)胞和 B 細(xì) 胞表位；(Palker 等，J. Immunol.，142 =36123619 ； 1989)HIV-IEnv 與 gpl20 的嵌合衍生物， 比如但是不限于gpl20和CD4之間融合的嵌合衍生物(Fouts et al，J Virol2000,74 11427-11436 ；2000) ；HIV-IEnv的平截或修飾的衍生物，比如但是不限于gp 140 (Stamatos 等，J Virol. 72 =9656-9667 ； 1998)，或者 HIV-IEnv 和 / 或其 gpl40 的衍生物(Binley 等， J Virol. 76 :2606_2616 ；2002) ； (Sanders 等，J Virol. 74 :5091_5100 (2000) ； (Binley 等， 等，J Virol. 76 :2606_2616 ；2002) ； (Sanders 等，J Virol. 74 :5091_5100 (2000) ； (Binley 等，J Virol. 74 627-643 ；2000)；乙型肝炎表面抗原(GenBank 登記號(hào)AF043578) ； (Wu 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA. 86 47264730 ； 1989)；輪狀病毒抗原，比如 VP4(GenBank 登記號(hào)AJ293721) ； (Mackow 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA. 87 518 522 ；1990)和 VP7 (GenBank 登記號(hào)AY003871) ； (Green 等，J Virol. 62 1819 1823 ； 1988)；流感病毒抗 原，比如血凝集素或(GenBank 登記號(hào)AJ404627) ； (Pertmer 和 Robinson, Virology. 257 406 ； 1999)；核蛋白(GenBank 登記號(hào)AJ289872) ； (Lin 等，Proc Natl Acad Sci. 97 9654-9658 ；2000)單純皰疹病毒抗原比如胸苷激酶(GenBank登記號(hào)AB047378)； (Whitley等，《新一代疫苗》，第825-854頁(yè))。由其衍生細(xì)菌性抗原的細(xì)菌性病原體包括但不限于分枝桿菌屬、幽門螺旋菌、沙 門菌屬、志賀菌屬、大腸桿菌、立克次體屬、李斯特菌屬、肺炎軍團(tuán)菌、假單胞菌屬、弧菌屬、 炭疽桿菌和伯疏氏螺旋體。細(xì)菌性病原體的保護(hù)性抗原的例子包括腸毒性的大腸桿菌的菌體抗原，比如 CFA/1 菌毛抗原(Yamamoto 等，Infect. Immun. 50 925 928 ；1985)和不耐熱的毒素的無 毒的 B 亞基(等，Infect. Immun. ,40 :888_893 ； 1983)；百日咳桿菌粘著素(pertactin) (Roberts等，Vacc.，10 43-48 ； 1992)；百日咳桿菌的腺苷酸環(huán)化酶溶血素(Guiso等， Micro. Path. ,11 :423_431 ； 1991)、破傷風(fēng)桿菌的破傷風(fēng)毒素片段 C (Fairweather 等， Infect. Immun. ,58 13231326 ； 1990)、伯疏氏螺旋體的 OspA(Sikand et al, Pediatrics, 108 123-128 ；2001) ； (Wallich 等，Infect. Immun. 69 :2130_2136 ；2001)，普氏立克次體 和地方性斑疹傷寒立克次體的保護(hù)性擬晶體表面層蛋白(Carl等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA0,87 =8237-8241 ；1990)；產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的李斯特菌溶胞素(亦稱“Llo”和 “Hly”)和 / 或過氧化物歧化酶(亦稱 “S0D” 和 “p60”) (Hess, J 等，Infect. Immun. ,65 1286-92 ； 1997) ； (Hess, J 等，Proc. Natl. Acad. Sci. ,93 :1458_1463 ； 1996) ； (Bouwer 等， J. Exp. Med.，175 :1467_71 ； 1992)；幽門螺旋菌的尿素酶(Gomez-Duarte 等，Vaccine. 16， 460-71 ； 1998) ； (Corthesy-Theulaz 等，Infection& Immunity. 66,581-6 ； 1998)；以及炭疽 桿菌保護(hù)性抗原和致死因子受體結(jié)合性結(jié)構(gòu)域(Price等，Infect. Immun.，69，4509-4515 ； 2001)。由其衍生出寄生性抗原的寄生性病原體包括但不限于瘧原蟲屬，比如惡性瘧原蟲(ATCC# 30145)；錐體蟲屬，比如克氏錐蟲(ATCC# 50797)；賈第鞭毛蟲屬，比如蘭氏賈 第鞭毛蟲(ATCC# :30888D)；方頭蜱屬；巴貝蟲屬，比如田鼠巴貝蟲(ATCC# 30221)；內(nèi)變 形蟲屬，比如痢疾內(nèi)變形蟲(ATCC# 30015)；艾美球蟲屬，比如巨型艾美耳球蟲(ATCC# 40357)；利什曼原蟲屬(分類學(xué)編號(hào)38568)；血吸蟲屬；布魯格絲蟲屬；吸蟲屬；惡絲蟲 屬；吳策線蟲屬；以及盤尾絲蟲屬。寄生病原體的保護(hù)性抗原的例子包括瘧原蟲的環(huán)子孢子抗原(Sadoff等， Science. 240 336 337 ；1988)，比如伯氏瘧原蟲的環(huán)子孢子抗原或惡性瘧原蟲的環(huán)子孢 子抗原；瘧原蟲屬的裂殖性孢子表面抗原(Spetzler等，Int. J. P印t. Prot. Res.，43 351-358 ； 1994)；痢疾內(nèi)變形蟲的半乳糖特異性凝集素(Marm等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,88 3248-3252 ；1991)、利什曼原蟲屬的 gp63 (Russell et al, J. Immunol.，140 1274 1278 ； 1988) ； (Xu 禾口 Liew，Immunol.，84 173-176 ； 1995)，大型利什曼原蟲(Leishmania major)的 gp46 (Handman 等，Vaccine. 18 :3011_3017 ；2000)馬來絲蟲的副肌球蛋白(Li 等，Mol. Biochem. Parasitol. ,49 :315_323 ；1991)；曼氏裂體吸蟲的磷酸丙糖異構(gòu)酶 (Shoemaker 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA. ,89 1842 1846 ； 1992)；蛇形毛圓線蟲的分泌 球蛋白樣蛋白(Frenkel 等，Mol. Biochem. Parasitol. ,50 :27_36 ； 1992)；牛羊肝吸蟲的谷 胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Hillyer等，Exp. Parasitol. ,75 176-18 6 ； 1992)；牛血吸蟲和日本牛 血吸蟲(Bashir等，Trop. Geog. Med. ,46 :255_258 ； 1994)；以及牛血吸蟲和日本牛血吸蟲的 KLH(Bashir 等，參見前述，1994)?？蛇x地，其可以被期望引起對(duì)于與傳染劑無關(guān)的抗原的免疫反應(yīng)，該抗原例如與 癌細(xì)胞、阿爾茨海默氏病、類型1糖尿病、心臟病、局限性回腸炎、多發(fā)性硬化等有關(guān)的抗原。另外，被細(xì)菌攜帶的過客基因不必編碼抗原，但是可以編碼任何所關(guān)注的肽或蛋 白質(zhì)。例如，本發(fā)明的方法可以用于傳遞用于糾正遺傳性紊亂的過客分子。例如，這樣的基 因?qū)ㄈ睋p基因比如用于囊性纖維化的囊性纖維化橫跨膜傳導(dǎo)調(diào)控子(CFTR)基因的 替代者；或者新基因比如用于治療HIV的整合酶反義基因的導(dǎo)入物；或者用于增強(qiáng)I型T細(xì) 胞反應(yīng)的基因比如白介素-27(IL-27)；或者用于調(diào)節(jié)特定受體、代謝產(chǎn)物或激素比如膽固 醇和膽固醇受體以及胰島素和胰島素受體的表達(dá)的基因；或者用于編碼能夠殺死癌細(xì)胞的 產(chǎn)物比如與腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)的基因；或者天 然產(chǎn)生的抑制骨吸收的蛋白質(zhì)護(hù)骨蛋白(OPG)；或者用于有效地表達(dá)全長(zhǎng)的人源化抗體例 如作用于癌細(xì)胞上HER2/neu(erbB2)受體的人源化單克隆抗體。另外，過客基因可以編碼抑制性RNAs比如“小抑制性(small inhibitory) ” siRNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，這樣的RNAs與所關(guān)注的mRNA是互補(bǔ)的，并且 可結(jié)合并抑制mRNA的翻譯，例如作為抑制基因產(chǎn)物表達(dá)的工具。類似的方法可以用于傳遞過客分子來下調(diào)免疫系統(tǒng)，以便抑制或者控制自身免疫 疾病或其他免疫系統(tǒng)疾病。其例子包括糖尿病、多發(fā)性硬化、紅斑狼瘡和局限性回腸炎以及 關(guān)節(jié)炎和皮膚病的抑制或治療。其他例子包括干涉特定免疫反應(yīng)的免疫反應(yīng)的精細(xì)調(diào)諧， 比如下調(diào)免疫反應(yīng)將治療性免疫反應(yīng)引向癌癥及其疾病。例如，當(dāng)Thl反應(yīng)適合于抑制并 治療癌癥、利什曼病、肺結(jié)核、以及HIV時(shí)，下調(diào)Th2反應(yīng)。這能夠利用現(xiàn)有技術(shù)、通過操縱 免疫系統(tǒng)的免疫抑制本性與表達(dá)合適細(xì)胞因子環(huán)境的能力相結(jié)合的而實(shí)現(xiàn)，用于刺激適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)并且抑制不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種用于將IFN抗性基因?qū)爰闹骷?xì)胞的 方法。這樣一種方法將包括如下步驟將期望的IFN抗性基因與編碼所關(guān)注的基因或核酸 序列的序列一起導(dǎo)入基于的細(xì)菌傳遞系統(tǒng)，以使得一旦將細(xì)菌施用于寄主所關(guān)注的IFN抗 性蛋白和核酸序列就被表達(dá)。該IFN抑制劑能夠被細(xì)菌(例如志賀菌)或被寄主細(xì)胞生產(chǎn)。 換句話說，IFN抗性基因能夠被從原核生物啟動(dòng)子或從真核生物啟動(dòng)子表達(dá)。所關(guān)注的基 因或核酸序列(過客基因)在寄主細(xì)胞內(nèi)部被表達(dá)。另外，所有遺傳序列可以被組成性地 表達(dá)或者瞬時(shí)表達(dá)或者被誘導(dǎo)。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于將I型IFN抗性基因與一個(gè) 以上所關(guān)注基因一起在體外導(dǎo)入細(xì)胞中的方法。這樣一種方法將包含如下步驟將編碼 一種以上所關(guān)注的蛋白質(zhì)的基因與一個(gè)以上IFN抗性基因一起導(dǎo)入例如減毒的或減毒的 /滅活的志賀菌中，以使得期望的蛋白質(zhì)/肽一旦將志賀菌施用于細(xì)胞就被生產(chǎn)出來。志 賀菌可感染數(shù)種類型不同的細(xì)胞比如BHK(幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)、HeLa (人類宮頸上皮癌瘤)、 Caco-2 (人類結(jié)腸腺癌)，因此能夠?qū)⑵谕倪^客分子傳遞進(jìn)入細(xì)胞。在被志賀菌感染的細(xì) 胞中的基因表達(dá)被I型IFN反應(yīng)抑制劑增強(qiáng)。在核酸釋放后，細(xì)胞能夠被移植，用于治療性 目的、用于基因治療或者用作診斷分析試劑。在一些情況中，細(xì)菌通過將編碼期望物質(zhì)的核酸序列傳遞至細(xì)胞、并調(diào)節(jié)該物 質(zhì)在細(xì)胞中的產(chǎn)生而用作“基因療法”試劑。例如，能夠考慮通過使用志賀菌載體將編碼 CXCR4/或CCR5結(jié)合性趨化因子的基因傳遞入腸管而用于治療HIV-1感染。用于基因工 程化細(xì)菌的工藝是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，并且用于進(jìn)行這種工藝的規(guī)程是眾所周知 的。用于大腸桿菌、沙門菌、分枝桿菌、志賀菌、以及李斯特菌的減毒方法是本領(lǐng)域技術(shù)人 員所熟知的(Evans 等，J. of Immuno.，120，1978，p 1423) ； (Noriega 等，Infect. Immun.， 62(11) 5168-5172 1994) ； (Hone 等，Vacc.，9 :810_816 ； 1991)。例如，一種用于將期望的基因傳遞入細(xì)胞的方法可以包括將所關(guān)注的基因?qū)爰?xì) 菌菌株中。根據(jù)本發(fā)明，抗IFN反應(yīng)基因能夠通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法而被導(dǎo) 入細(xì)菌染色體或毒性質(zhì)粒，或者可選地能夠在可復(fù)制的或非復(fù)制性質(zhì)粒中被攜帶。例如， 經(jīng)由轉(zhuǎn)化、電穿孔技術(shù)、轉(zhuǎn)染、結(jié)合等方式，所關(guān)注的載體能夠被導(dǎo)入細(xì)菌中。在構(gòu)建菌株 和細(xì)菌載體中使用的重組DNA的工藝包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、限制性內(nèi)切酶 (在此稱作“RE”)消化、DNA連接、瓊脂糖凝膠電泳、DNA純化、以及雙脫氧核苷酸測(cè)序(在 下屬文獻(xiàn)中有描述(Miller，細(xì)菌遺傳學(xué)簡(jiǎn)要過程，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約 州；1992) ； (Bothwell等編，克隆方法和真核生物基因分析，瓊斯和巴特利特出版公司，波 士頓，麻州，1990)以及(Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2 10. 8. 1-10. 8. 13、1992))、噬菌體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)((de Boer 等，Cell. ,56 :641_649 ； 1989)； (Miller，參見前述，1992)和(Ausubel等，參見前述))、或者化學(xué)方法(Bothwell等，參見 前述)；(Ausubel等，參見前述)；(Feigner等，參見前述)；以及(Farhood，參見前述)、電 穿孔技術(shù)((Bothwell等，參見前述)；(Ausubel等，參見前述)；(Sambrook，分子克隆實(shí)驗(yàn) 室手冊(cè)。冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約州；1992))以及物理轉(zhuǎn)化技術(shù)(Bothwell等， 參見前述)。這些基因能夠被并入噬菌體(de Boer等，參見前述)、質(zhì)粒載體(Curtiss，《新 一代疫苗》分子方法，Marcel Dekker公司，紐約，紐約州，第161-188和269-288頁(yè)，1989)或者拼接入目標(biāo)菌株的染色體(Hone等，參見前述)。應(yīng)用例如APPLYBIOSYSTEM ABI 900高通量DNA合成儀(Foster市，加州，94404， 美國(guó))采用制造商提供的工藝規(guī)程，能夠通過合成方法制備基因序列。為了合成大序列，即 大于約200bp，通過PCR產(chǎn)生全長(zhǎng)序列的一系列片段，并且通過使用本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的 工藝連接一起形成全長(zhǎng)序列。然而，較小序列，即小于約200bp，能夠在單輪步驟中被合成出來。通過電穿孔技術(shù)，使用例如BioRad Gene基因脈沖器，可以將重組質(zhì)粒導(dǎo)入菌株 中。通過標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)測(cè)序技術(shù)(例如，使用APPLY BIOSYSTEM自動(dòng)測(cè)序儀，373A型)，可以完 成用于檢驗(yàn)cDNA序列的核苷酸序列測(cè)定。用于DNA測(cè)序和聚合酶鏈反應(yīng)(在此稱作“PCR”) 的DNA引物可以通過合成方法生產(chǎn)出來。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，基因工程化的細(xì)菌是侵入性削弱的弗氏志賀菌，并 且被導(dǎo)入細(xì)菌的基因是腺病毒VAI基因、輪狀病毒的NSP1、和/或流感病毒的NS1，這些基 因被克隆得受控于真核生物啟動(dòng)子之下并且通過電穿孔技術(shù)導(dǎo)入細(xì)菌。本發(fā)明還提供了制品，用于施用本發(fā)明的重組細(xì)菌表達(dá)載體。例如，提供的疫苗制 品用于引起免疫反應(yīng)。該制品包括在此描述的至少一種基因工程化的細(xì)菌菌株、以及藥理 學(xué)上合適的載體。這樣的組合物(例如，用作疫苗)的制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。典 型地，這樣的組合物或者作為液體溶液制備或者作為懸浮液制備，然而，也期待固體形式比 如藥片、丸劑、粉末等。還可以制備在施用之前呈適合于溶于或懸浮在液體中的固體形式。 該制品還可以被乳化?？梢詫⒒钚猿煞峙c藥學(xué)可接受的、并且與活性成分相容的賦形劑混 合。合適的賦形劑例如是水、鹽水、葡萄糖、棉子糖、甘油、乙醇等、或其組合。另外，組合物 可以含有較小含量的輔助物質(zhì)比如潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖劑等。本發(fā)明的疫苗制品可以 進(jìn)一步包含佐劑，其合適的例子包括但不限于S印pic、Quil A.Alhydrogel等。如果希望口服形式施用該組合物，則可以加入各種增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化 劑、分散助劑或者粘合劑等。本發(fā)明的組合物可以含有任何這些附加的成分，以便以適合施 用的形式提供該組合物。在配方中重組細(xì)菌的最終含量可以變化。然而，一般來講，在配方 中的含量是約1-99%。另外，本發(fā)明的制品可以含有單一類型的重組細(xì)菌、或者一種以上類 型的重組細(xì)菌。最初，細(xì)菌載體菌株的施用劑量為約102-109cfu(菌落形成單位)，并且通 過合適的途徑施用。取決于單個(gè)載體菌株的效價(jià)、以及被編碼的所關(guān)注重組產(chǎn)物的效價(jià)、特 定的用途等，施用次數(shù)可以變化。就疫苗制品而言，本發(fā)明還提供了引起對(duì)被細(xì)菌編碼的抗原的免疫反應(yīng)的方法， 并且提供為哺乳動(dòng)物接種抗與這些抗原有關(guān)的疾病或病況的疫苗的方法。對(duì)于“引起免疫 反應(yīng)”，我們指的是，施用本發(fā)明的疫苗制品引起特異性抗體的合成(滴度范圍為1至lxlO6 之間、優(yōu)選lxlO3，更優(yōu)選范圍為約lxlO3至約lxlO6，并且最優(yōu)選大于lxlO6)并且/或者細(xì) 胞的增殖(例如通過3h胸腺嘧啶脫氧核苷并入法測(cè)量)。該方法涉及將在藥理學(xué)可接受 的載體中包含本發(fā)明細(xì)菌菌株的組合物施用于哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的疫苗制品可以通過本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知的許多合適方法中的任何一種施用，包括但不限于注射、口服、鼻飼、吸 入、含有重組細(xì)菌的食品攝入等。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，施用模式是口服、皮下注射、皮內(nèi)注 射或肌內(nèi)注射。通過下述非限制性實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
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實(shí)施例
實(shí)施例1.通過重組志賀菌載體在寄主細(xì)胞中誘導(dǎo)I型干擾素反應(yīng)細(xì)菌在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)1型干擾素反應(yīng)的能力被測(cè)試，并且分析了反應(yīng)的性 質(zhì)。實(shí)驗(yàn)條件如下所述在37°C、在6孔板中感染復(fù)數(shù)(MOI)為100下，將Hela細(xì)胞的半融 合的單細(xì)胞層暴露于載有RNA過客分子的弗氏志賀菌1小時(shí)。細(xì)胞用Dulbecco改性Eagles 培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modified Eagles' s Medium,DMEM)洗滌兩次。將含有 150yg/mL 慶 大霉素的培養(yǎng)基加至細(xì)胞1小時(shí)，以殺死胞外細(xì)菌。接著，洗滌細(xì)胞兩次，加入含有10%胎 牛血清(FBS)的DMEM，并且使受感染的細(xì)胞孵育20h。然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌 細(xì)胞兩次，并且使用RNeasy微型試劑盒(Qiagen公司)分離總RNA。使用人干擾素和受體 RT2Profiler PCR陣列(Superarray Biosciences公司)來鑒定84個(gè)干擾素相關(guān)基因表 達(dá)的上調(diào)或下調(diào)。結(jié)果顯示于表1中?？梢钥闯觯举R菌載體侵染入人類細(xì)胞導(dǎo)致了 I型IFNs和 IFN刺激的諸如-5'-寡腺苷酸合成酶(2' -5' -OAS)的基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)。在89個(gè)調(diào)查 的基因中，有74個(gè)顯示出轉(zhuǎn)錄提高了 2倍以上。另外，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，與具有完整IFN系統(tǒng)的細(xì)胞相比，來自被志賀菌傳遞入 IFN-α/β缺乏型細(xì)胞的質(zhì)粒DNA過客分子的報(bào)告基因的表達(dá)被增強(qiáng)了(圖1)。這些結(jié)果表明，受IFN刺激的基因抑制了來自被通過細(xì)菌載體傳遞至哺乳動(dòng)物細(xì) 胞的過客分子的基因的表達(dá)。表1.差別的IFN相關(guān)基因表達(dá)志賀菌侵染的Hela細(xì)胞對(duì)比未被侵染的Hela細(xì) 胞。
實(shí)施例2.可抑制對(duì)被細(xì)菌載體傳遞的過客核酸表達(dá)的I型IFN反應(yīng)的細(xì)菌傳遞 系統(tǒng)的構(gòu)建該實(shí)施例描述了可抑制I型IFN反應(yīng)及其對(duì)過客核酸表達(dá)的影響的兩個(gè)細(xì)菌傳遞 系統(tǒng)的構(gòu)建和應(yīng)用。在兩種情況下，通過電穿孔技術(shù)使核酸經(jīng)基因工程化進(jìn)入減毒的、侵入 性弗氏志賀菌菌株中。選擇弗氏志賀菌的原因是因?yàn)槠湓谠S多組織培養(yǎng)細(xì)胞系和動(dòng)物模型 中天然地具有侵入性。該志賀菌菌株攜帶有導(dǎo)入的染色體突變，該突變會(huì)在侵染真核細(xì)胞 后引起細(xì)胞溶解并且從內(nèi)吞囊泡中逃逸，能夠使過客分子釋入真核細(xì)胞胞質(zhì)中。在第一組實(shí)驗(yàn)中，使用可在市場(chǎng)上買到的大腸桿菌β _半乳糖苷酶表達(dá)報(bào)告載體 pcDNA3. l/His/lacZ(Invitrogen 公司)制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)(electro-competent)弗氏志賀菌 菌株NCD1，并且進(jìn)行電穿孔。報(bào)告載體pcDNA3. Ι/His/lacZ在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)受控于 人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子下的大腸桿菌半乳糖苷酶，允許在傳遞載體之后進(jìn)行簡(jiǎn)易的哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)的基因表達(dá)的分析。在該實(shí)驗(yàn)中使用的干擾素抗性基因是與腺病毒有關(guān)的 I (VAI)RNA基因。已知在腺病毒感染之后，腺病毒RNA基因大量地被RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄 (Reich et al.，J. Mol. Biol. 17，428，1966 ；Price et al.，J. Virol. 9，62，1972 ；Weinmann et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 71, 3426 ；Soderlund et al, Cell 7,585,1976) 腺病 毒利用病毒編碼的與病毒有關(guān)的RNA，通過阻斷干擾素誘導(dǎo)的被雙鏈RNA激活的蛋白激酶 PKR的活化，從而作為對(duì)抗細(xì)胞抗病毒反應(yīng)的防御手段(Galabru J，Katze MG, Robert N， Hovanessian AG. Eur J Biochem. 1989Jan 2 ； 178 (3) :581_9)。在 1，724bp 插入物上含有腺 病毒與病毒有關(guān)的 I (Adenovirus Virus-Associated I，VAI) RNA 基因的 pAdVAntage 載體 也經(jīng)電穿孔而進(jìn)入弗氏志賀菌NCDl菌株中。按照在實(shí)施例1中描述的方法，通過電穿孔技 術(shù)用弗氏志賀菌菌株侵染Hela細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，為了測(cè)試VAI基因的抗干擾素作用，Hela細(xì) 胞或者用1)含有β-半乳糖苷酶報(bào)告載體(pcDNA3. Ι/His/lacZ)的弗氏志賀菌NCDl和含 有pAdVAntage載體的弗氏志賀菌NCDl感染；或者用2)僅含有β -半乳糖苷酶報(bào)告載體的 弗氏志賀菌NCDl菌株感染。在24小時(shí)后，使用β-半乳糖苷酶分析試劑(Stratagene公 司)，既用于細(xì)胞溶解，也用于測(cè)定細(xì)胞抽提物中的半乳糖苷酶活性。結(jié)果顯示于圖2 中?？梢钥闯觯诒煌瑫r(shí)含有半乳糖苷酶活性報(bào)告載體和VAI抗干擾素載體的志賀菌 侵染的Hela細(xì)胞中，觀察到β -半乳糖苷酶活性有極大的提高。
類似地，在第二組實(shí)驗(yàn)中，含有攜帶報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)的重組雙鏈RNA 核殼體(rdsRN)的志賀菌載體菌株經(jīng)電穿孔而具有克隆入真核表達(dá)載體pcDNA 3. lzeo(+) (Invitrogen)中的編碼甲型流感NSl或輪狀病毒NSPl的序列。得到的志賀菌菌株因此便同 時(shí)含有在RNA核殼體(rdsRN)中的GFP基因和在pcDNA中的NSPl或NSl。BHK-21和Hela 細(xì)胞用含有GFP和NSPl或NSl表達(dá)質(zhì)粒的志賀菌菌株感染、或者用僅含有GFP表達(dá)質(zhì)粒的 志賀菌菌株感染。在16小時(shí)后，測(cè)試被侵染的Hela細(xì)胞的綠色熒光，并且通過免疫印跡分 析Hela細(xì)胞裂解液中的GFP蛋白。熒光結(jié)果顯示，與被僅具有GFP基因的志賀菌菌株侵染 的細(xì)胞相比，在用含有NSl或NSPl表達(dá)質(zhì)粒的志賀菌菌株侵染的細(xì)胞中的GFP蛋白表達(dá)得 到增強(qiáng)(數(shù)據(jù)未顯示)。由真核細(xì)胞產(chǎn)生的總蛋白的免疫印跡證實(shí)了在用含有NSl或NSPl 表達(dá)質(zhì)粒的志賀菌菌株侵染的細(xì)胞中更高的GFP表達(dá)(圖3)。這些發(fā)現(xiàn)顯示，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部通過細(xì)菌載體來表達(dá)編碼I型干擾素反應(yīng)抑 制劑的基因(例如VAI、NS1或NSP1)可增強(qiáng)編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)(例如半乳糖苷酶或 GFP)的轉(zhuǎn)基因的共表達(dá)。該實(shí)施例中描述的結(jié)果是第一個(gè)顯示如下情形的證據(jù)使用基于 細(xì)菌的傳遞系統(tǒng)通過減弱IFN反應(yīng)可以增強(qiáng)所關(guān)注的蛋白質(zhì)的表達(dá)。實(shí)施例3.通過重組志賀菌載體在哺乳動(dòng)物寄主細(xì)胞中對(duì)I型干擾素反應(yīng)的誘導(dǎo) 被干擾素拮抗劑抑制。該實(shí)施例描述了干擾素拮抗劑抑制在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被細(xì)菌誘導(dǎo)的干擾素刺激 基因(ISGs)的表達(dá)的能力。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的弗氏志賀菌菌株攜帶有在其侵入真核細(xì) 胞后引起細(xì)胞溶解的染色體突變。志賀菌在寄主細(xì)胞中存活足夠長(zhǎng)的時(shí)間從而逃逸內(nèi)吞囊 泡，使含有干擾素拮抗劑的質(zhì)粒分子能夠釋入哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞質(zhì)。志賀菌菌株含有并且表 達(dá)編碼報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)的重組核殼體。弗氏志賀菌菌株用已經(jīng)分別克隆入質(zhì) 粒載體 pcDNA3. 1 zeo(+)和 pCR-Bluntll-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，加州)的甲型流感 NSl基因或腺病毒VAI RNA基因進(jìn)行電穿孔。這些含有NSl基因或VAI RNA基因的弗氏志賀菌菌株被用于研究在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)條件如下所述在37°C、在6孔板中感染復(fù)數(shù)(M0I)為100下，將Hela細(xì)胞 的半融合的單細(xì)胞層暴露于載有IFN抑制基因的弗氏志賀菌1小時(shí)。用Eagle最低必需培 養(yǎng)基(EMEM)洗滌細(xì)胞兩次，并且將含有150 u g/mL慶大霉素的EMEM加至細(xì)胞1小時(shí)，以便 殺滅胞外細(xì)菌。接著，洗滌細(xì)胞兩次，加入新鮮的EMEM，并且使受侵染的細(xì)胞孵育20h。然 后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞兩次，并且使用RNeasy微型試劑盒(Qiagen公司)分 離總RNA。使用人干擾素和受體RT2Profiler PCR陣列(SuperarrayBiosciences公司) 來鑒定84個(gè)干擾素相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)。結(jié)果顯示于表2中。可以看出，弗氏志賀菌侵入人類細(xì)胞導(dǎo)致了 I型IFNs和IFN 刺激的比如2' -5'-寡腺苷酸合成酶(2' -5' -OAS)的基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)。被誘導(dǎo)的基 因與弗氏志賀菌所載的過客核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯的抑制有關(guān)。然而，如圖4所示，與單獨(dú)被弗 氏志賀菌侵染的細(xì)胞相比，用載有干擾素拮抗劑NS1基因的弗氏志賀菌菌株侵染的Hela細(xì) 胞顯示出ISGs的低水平表達(dá)。這些結(jié)果表明，NS1抑制了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過細(xì)菌誘導(dǎo) 的ISGs表達(dá)。實(shí)施例4.干擾素拮抗劑對(duì)干擾素刺激的基因(ISGs)表達(dá)的抑制該實(shí)施例描述了干擾素拮抗劑抑制在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被細(xì)菌誘導(dǎo)的干擾素刺激 基因(ISGs)的表達(dá)的能力。在該實(shí)驗(yàn)中使用的志賀菌菌株攜帶有導(dǎo)入的染色體突變，該突 變會(huì)在侵染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后引起細(xì)胞溶解并且從內(nèi)吞囊泡中逃逸，能夠使含有干擾素拮抗 劑的過客質(zhì)粒分子釋入哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞質(zhì)中。弗氏志賀菌菌株NCD用已經(jīng)分別克隆入質(zhì) 粒載體 pcDNA3. 1 zeo(+)和 pCR-Bluntll-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，加州)的甲型流感 NS1基因或腺病毒VAI RNA基因進(jìn)行電穿孔。如此含有NS1基因或VAI RNA基因的志賀菌 菌株被用于研究I型IFN反應(yīng)的誘導(dǎo)和抑制。實(shí)驗(yàn)條件如下所述在37°C、在6孔板中感染復(fù)數(shù)(M0I)為100下，將Hela細(xì)胞的 半融合的單細(xì)胞層暴露于載有IFN抑制基因(NS1或VAI)的弗氏志賀菌1小時(shí)。用Eagle 最低必需培養(yǎng)基(EMEM)洗滌細(xì)胞兩次，并且將含有150 u g/mL慶大霉素的新鮮EMEM加至 細(xì)胞1小時(shí)，以便殺滅胞外細(xì)菌。接著，用EMEM洗滌Hela細(xì)胞兩次，加入新鮮的EMEM，并且 在侵入后使受侵染的細(xì)胞孵育20h。然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌Hela細(xì)胞兩次，并 且使用RNeasy微型試劑盒(Qiagen公司)分離總RNA。使用人干擾素和受體RT2Profiler PCR陣列(Superarray Biosciences公司)來鑒定84個(gè)干擾素相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)或下 調(diào)。由表2可以看出，與未被侵染的細(xì)胞相比，志賀菌載體侵染入人類細(xì)胞導(dǎo)致了 I型IFNs 和IFN刺激的諸如'-5'-寡腺苷酸合成酶(2' -5' -OAS)的基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)。然而， 如圖4所示，與單獨(dú)被志賀菌侵染的細(xì)胞相比，用載有I型干擾素拮抗劑NS1基因的志賀菌 菌株侵染的Hela細(xì)胞顯示出ISGs的低水平表達(dá)。這些結(jié)果表明，NS1的確抑制了通過細(xì) 菌誘導(dǎo)的ISGs表達(dá)。類似地，用可表達(dá)腺病毒VAI RNA基因的志賀菌感染的Hela細(xì)胞的 qRT-PCR表達(dá)研究表明，ISGs比如CXCL10和MX2的表達(dá)也被干擾素拮抗劑抑制(圖5)。上 述結(jié)果顯示了抑制IFN反應(yīng)的基礎(chǔ)的分子機(jī)制，其允許被細(xì)菌載體編碼的異源過客基因的 更穩(wěn)定的表達(dá)。這些結(jié)果顯示，來自細(xì)菌載體的I型IFN反應(yīng)的病毒抑制劑的表達(dá)抑制了受感染 細(xì)胞的IFN反應(yīng)。
表2.與抑制志賀菌所載過客核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)的分子的過表達(dá)志賀菌侵 染的Hela細(xì)胞與未侵染的Hela細(xì)胞的對(duì)比 實(shí)施例5.通過共表達(dá)IFN拮抗劑而改進(jìn)的基于細(xì)菌的轉(zhuǎn)基因表達(dá)傳遞系統(tǒng)的 構(gòu)建構(gòu)建質(zhì)粒載體以表達(dá)報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)。使用Accuprime DNA聚合酶 (Invitrogen公司，Carlsbad，加州)和包括HpaI和NotI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物對(duì)GFP 基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增序列的大小，并且使用QIAquick PCR純 化試劑盒按照生產(chǎn)廠商(Qiagen，目錄編號(hào)28106，巴倫西亞市，加州)的說明書進(jìn)行純化。 GFP基因被克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒pShooter(Invitrogen，Carlsbad，加州)的HincII和 NotI位點(diǎn)(新英格蘭實(shí)驗(yàn)室公司，Beverly，馬薩諸塞州)。在pShooter載體中的表達(dá)被 強(qiáng)大的、組成型人EF-I α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在該實(shí)驗(yàn)中使用的干擾素抗性基因是與腺病毒有關(guān) 的I (VAI) RNA基因，其由RNA聚合酶III啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。對(duì)編碼RNA聚合酶III啟動(dòng)子的VAI RNA基因下游的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且克隆入GFP pShooter載體的EcoRI位點(diǎn)。得到的構(gòu)建體示圖如圖6所示。對(duì)含有合適的插入物的重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，并且將新穎的質(zhì)粒稱為pAdgfp。將 pAdgfp載體經(jīng)電穿孔導(dǎo)入弗氏志賀菌NCD1菌株。按照在實(shí)施例3中描述的方法進(jìn)行Hela 細(xì)胞的侵染。簡(jiǎn)言之，為了測(cè)試VAI基因的表達(dá)增強(qiáng)作用，用含有pAdgfp質(zhì)粒(編碼GFP 和VAI)的弗氏志賀菌NCD1、或者用載有僅編碼GFP(pGFP)的pShooter質(zhì)粒的弗氏志賀菌 NCD1菌株侵染Hela細(xì)胞。在24小時(shí)后，來自每個(gè)孔的細(xì)胞被裂解并通過免疫印跡法用GFP 特異性抗血清進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于圖7中?？梢钥闯觯诒煌瑫r(shí)含有GFP和抗干擾素VAI RNA基因的志賀菌侵染的Hela細(xì)胞中觀察到GFP表達(dá)有提高。實(shí)施例6.當(dāng)被減毒的表達(dá)流感干擾素抑制劑NS1的弗氏志賀菌傳遞進(jìn)入真核細(xì) 胞時(shí)質(zhì)粒編碼的半乳糖苷酶的增強(qiáng)的表達(dá)在CMV啟動(dòng)子(pcDNA-lacZ)的翻譯控制之下的編碼0 -半乳糖苷酶的質(zhì)粒經(jīng)電 穿孔導(dǎo)入弗氏志賀菌NCD內(nèi)。編碼甲型流感NS1基因(pEF NS1)的第二種質(zhì)粒也經(jīng)電穿 孔導(dǎo)入單獨(dú)的弗氏志賀菌NCD菌株內(nèi)。在pEF NS1載體中，NS1基因表達(dá)被強(qiáng)大的、組成 型人EF-la啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。按照在實(shí)施例1中描述的方法用弗氏志賀菌菌株對(duì)Hela細(xì)胞 進(jìn)行侵染。簡(jiǎn)言之，為了測(cè)試NS1基因的抗干擾素作用，用含有半乳糖苷酶報(bào)告載體 (pcDNA3. 1/His/lacZ)的弗氏志賀菌NCD和含有pEF NS1載體的弗氏志賀菌NCD對(duì)Hela細(xì) 胞進(jìn)行共侵染，或者用單獨(dú)的弗氏志賀菌NCD(不含載體)侵染Hela細(xì)胞。在18小時(shí)后， 使用半乳糖苷酶分析試劑(Stratagene)用于溶解Hela細(xì)胞和測(cè)定細(xì)胞抽提物中的
半乳糖苷酶活性。結(jié)果顯示在表3中。可以看出，在被同時(shí)含有半乳糖苷酶報(bào)告載 體和NS1基因的志賀菌共侵染的Hela細(xì)胞中觀察到0 -半乳糖苷酶活性有極大的提高。表3.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的0 -半乳糖苷酶活性 實(shí)施例7.當(dāng)被減毒的表達(dá)流感干擾素抑制劑NS1的弗氏志賀菌傳遞時(shí)病毒殼體 編碼的分支結(jié)核桿菌抗原85A的表達(dá) 構(gòu)建重組核殼體以便同時(shí)在S RNA片段和M RNA片段(51 MS85A)上表達(dá)結(jié)核分枝 桿菌抗原85A。使用表達(dá)這些該病毒殼體士流感NS1基因的弗氏志賀菌和表達(dá)受CMV啟動(dòng) 子控制下的哺乳動(dòng)物質(zhì)粒上的抗原85A在(pCDNA-85A)的弗氏志賀菌菌株進(jìn)行侵染測(cè)定。 在28°C或者37°C下培養(yǎng)細(xì)菌至對(duì)數(shù)期早期，并且在37°C下靜置孵育lhr以便誘導(dǎo)弗氏志賀菌病原性基因的表達(dá)。將細(xì)菌重懸浮在Eagle最低必需培養(yǎng)基(EMEM)中，并且在下述條件 下孵育Ihr :37°C +5% CO2、與已經(jīng)接種在IO6個(gè)細(xì)胞/孔的6孔板中的BHK21細(xì)胞一起MOI 為100。用PBS洗滌細(xì)胞3次，并且用EMEM+慶大霉素(150 μ g/mL)孵育以便殺滅任何胞外 細(xì)菌。然后用PBS洗滌細(xì)胞3次，并且在EMEM培養(yǎng)基中孵育20hr。細(xì)胞用PBS洗滌一次， 并且用250 μ L MPER哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)萃取試劑(Pierce公司)溶解。將30 μ L的每個(gè)細(xì)胞 抽提物在SDS-PAGE凝膠上走膠、轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上、并且用抗抗原85Α的抗血清進(jìn)行 免疫印跡分析(圖8)。在僅處于含有表達(dá)NSl基因(MS85ApNSl)的質(zhì)粒、在28°C下培養(yǎng)的 85A病毒殼體菌株MS85A中的BHK-21細(xì)胞中可看到抗原85A的表達(dá)(泳道3)。從于28°C 或37°C下培養(yǎng)的不含pNSl的MS85A中、或者從于37°C下培養(yǎng)的MS85A pNSl中沒有看到表 達(dá)(泳道1、2、和4)。這顯示，NSl蛋白的表達(dá)對(duì)于表達(dá)由弗氏志賀菌菌株傳遞的被重組核 殼體編碼的抗原是必需的。實(shí)施例8.同時(shí)在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)干擾素抗性基因、以及僅在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中表達(dá)所關(guān)注蛋白質(zhì)的表達(dá)載體的構(gòu)建 構(gòu)建質(zhì)粒載體以便表達(dá)HIV-I的免疫顯性的Gag肽。由合成的gag基因?qū)?00bp 片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Accuprime DNA聚合酶(Invitrogen公司，Carlsbad，加州)和包 括HpaI和NotI RE位點(diǎn)的引物對(duì)序列進(jìn)行擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增序列的大 小，并且使用QIAquick PCR純化試劑盒按照生產(chǎn)廠商(Qiagen，目錄編號(hào)28106，巴倫西亞 市，加州)的說明書進(jìn)行純化。該600bp的gag基因被克隆入表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3. Izeo (+) (Invitrogen, Carlsbad,加州)的EcoRV和NotI位點(diǎn)(新英格蘭實(shí)驗(yàn)室公司，Beverly,馬 薩諸塞州)。對(duì)含有合適的插入物的重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，并且將新穎的質(zhì)粒稱為PGAG4X。干擾素抗性基因(即，NSl或NSP1)被克隆入受控于合適的真核生物啟動(dòng)子(即， SV40啟動(dòng)子)或原核生物啟動(dòng)子(例如，argl的持家啟動(dòng)子)、或同時(shí)兩者之下的pGAG4X 載體，產(chǎn)生二元表達(dá)載體。(對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在此描述的特定真核生物啟動(dòng)子和 原核生物啟動(dòng)子序列對(duì)于載體的構(gòu)建而言不是關(guān)鍵的，也可以用其他合適的啟動(dòng)子。因此， 這些表達(dá)載體可同時(shí)在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)干擾素抗性基因；然而所關(guān)注的蛋白質(zhì) (例如，HIV-I的Gag)僅在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。該方法改進(jìn)了過客RNA/DNA及其他用于 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所關(guān)注的外源蛋白或抑制性RNAs的分子的轉(zhuǎn)錄及隨后翻譯的穩(wěn)定 性。實(shí)施例9.經(jīng)基因工程化而抑制IFN反應(yīng)的重組細(xì)菌表達(dá)載體作為疫苗的應(yīng)用任何細(xì)菌性活載體疫苗的效力取決于其將足夠的外來抗原提呈至人類免疫系統(tǒng) 從而啟動(dòng)期望的保護(hù)性免疫反應(yīng)的能力。然而，由于寄主防御體系，即IFN反應(yīng)，過客DNA/ RNA分子可能在體內(nèi)變得不穩(wěn)定，導(dǎo)致外源基因的丟失和預(yù)期免疫反應(yīng)的降低。本發(fā)明提供 了一種技術(shù)方案，用于通過減弱的IFN防御體系而在寄主細(xì)胞內(nèi)部合成高水平的抗原。編碼IFN抗性和所關(guān)注抗原的基因的傳遞和表達(dá)可以通過用攜帶有編碼所關(guān)注 轉(zhuǎn)基因和I型IFN反應(yīng)抑制劑的核酸的不致病的或減毒的細(xì)菌疫苗載體接種靶細(xì)胞(組 織、生物體等)而完成。所關(guān)注的生物學(xué)反應(yīng)包括但不限于保護(hù)性或調(diào)節(jié)性免疫反應(yīng)；治 療性反應(yīng)；以及寄主蛋白質(zhì)的基因表達(dá)(例如siRNA)的下調(diào)和基因表達(dá)(例如，細(xì)胞因子 表達(dá))的上調(diào)。一旦不致病的或減毒的細(xì)菌疫苗載體菌株已經(jīng)被選擇，則菌株就被修飾以用作干擾素反應(yīng)抑制菌株。這可以通過使用如上所述必須將一個(gè)以上IFN抗性基因?qū)刖甑牟?略來完成。
為了產(chǎn)生含有I型IFN抗性基因和所關(guān)注抗原的菌株，通過電穿孔技術(shù)將體外合 成的基因?qū)刖?，并且在下述條件下在固體培養(yǎng)基上分離轉(zhuǎn)化體僅允許在重組質(zhì)粒中 含有并表達(dá)陽(yáng)性選擇等位基因的菌株(例如抗生素抗性或營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)型)生長(zhǎng)。一個(gè)通 過活的載體來增強(qiáng)表達(dá)質(zhì)粒遺傳性的方法涉及到構(gòu)建被設(shè)計(jì)成與導(dǎo)入的細(xì)菌染色體中突 變互補(bǔ)的過客核酸。在基于質(zhì)粒的互補(bǔ)系統(tǒng)中，質(zhì)粒在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，可表達(dá)細(xì)菌 生長(zhǎng)和復(fù)制所要求的關(guān)鍵蛋白質(zhì)；這樣的質(zhì)粒的丟失除去了細(xì)菌表達(dá)關(guān)鍵蛋白質(zhì)的能力， 并且導(dǎo)致細(xì)胞死亡。(在細(xì)菌復(fù)制期間質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致所有缺少質(zhì)粒的細(xì)菌死亡， 其也被稱作“分離后殺滅”)。這樣一種系統(tǒng)已經(jīng)成功地在鼠傷寒沙門菌中使用，并且編碼 天冬氨酸β-半醛脫氫酶(Asd)的asd基因表達(dá)為基礎(chǔ)(Galen et al.，Gene 1990 ； 49 29-35)。Asd是一種與為在革蘭氏陰性細(xì)菌中形成細(xì)胞壁所必需的結(jié)構(gòu)性成分的合成有關(guān) 的關(guān)鍵酶。因此，編碼這樣一種關(guān)鍵酶的質(zhì)粒的丟失對(duì)于任何不能由染色體合成Asd的細(xì) 菌而言將是致命的。待被施用的這些重組細(xì)菌的含量依據(jù)個(gè)體種類、以及正在治療的疾病或癥狀而改 變。一般來講，使用的劑量可以是約IO3至IO11個(gè)存活的生物體、優(yōu)選約IO3至IO9個(gè)存活 的生物體。含有DNA/RNA過客分子的細(xì)菌載體一般地與藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑一起施 用。使用的特定的藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑對(duì)于本發(fā)明而言不是關(guān)鍵的。稀釋劑的例子 包括磷酸鹽緩沖鹽水，用于在胃中緩沖抗胃酸的緩沖液，比如含有蔗糖的檸檬酸鹽緩沖液 (pH 7. 0)、單獨(dú)的碳酸氫鹽緩沖劑(pH 10) (Levine et al.，J. Clin. Invest. ,79 :888_902 ； 1987 ；Black et al.，J. Infect. Dis.，155 1260-1265 ； 1987)或含有抗壞血酸、乳糖、以及 任選地阿斯巴特的碳酸氫鹽緩沖劑(pH 7.0) (Levine et al, Lancet, II =467470 ；1988)。 載體的例子包括蛋白質(zhì)，例如在脫脂乳中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)；糖，例如蔗糖；或者聚乙烯吡咯 烷酮。典型地，這些載體將被使用的濃度范圍為約0.1-90% (w/v)，但優(yōu)選1-10% (w/v) 0在合適的動(dòng)物模型(例如小鼠、兔、豚鼠或恒河猴)中評(píng)估載體菌株的生物活性。 最初，細(xì)菌載體菌的施用劑量為102-109cfu(菌落形成單位)，并且通過合適的途徑施用(例 如大腸桿菌、沙門菌和志賀菌能夠經(jīng)胃部或者鼻飼提供)。取決于單個(gè)載體菌株的效價(jià)、以 及被編碼的所關(guān)注重組產(chǎn)物的效價(jià)，施用次數(shù)將變化。在動(dòng)物模型中免疫及其他對(duì)編碼產(chǎn)物的生物學(xué)反應(yīng)的測(cè)量方法是本領(lǐng)域技術(shù)人 員所熟知的。為了測(cè)量血清IgG和IgA對(duì)抗原的反應(yīng)，在疫苗接種以前、以及在疫苗接種后 第10、20、30、40、50、60、70、以及80天收集血清。大約400-500 μ L的血液被收集入單個(gè)的 試管中，并且允許通過在冰上孵育4hr而凝結(jié)。在在微型離心機(jī)中離心五分鐘后，將血清 將轉(zhuǎn)移至新鮮的試管中并且在-80°C下儲(chǔ)存。使用將在疫苗接種前和在疫苗接種后每隔一 定間隔被收集的糞粒和陰道洗滌物，確定黏膜IgG和IgA對(duì)由所關(guān)注基因表達(dá)的抗原的反 應(yīng)(Srinivasan et al. , Biol. ReprocL 53 462 ； 1995) ； (Staats et al. , J. Immuno. 1 157 462 ； 1996)。使用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA來定量在血清和粘膜樣本中IgG和IgA對(duì)所關(guān)注抗原的反 M (Abacioglu et al. ， AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 371 ； 1994) ； (Pincus et al. ， AIDS Res. Hum. Retrovir. 12 1041 ； 1996)。卵清蛋白能夠被包含于每個(gè)ELISA中作為陰性對(duì)照抗 原。另外，視情況而定，每個(gè)ELISA能夠包括陽(yáng)性對(duì)照血清、糞粒或者陰道洗滌樣本。陽(yáng)性對(duì)照樣本是來自被通過鼻飼接種10 μ g被所關(guān)注的基因表達(dá)、并與 ομ g霍亂毒素相混合 的抗原的動(dòng)物的收獲物，如文獻(xiàn)(Yamamoto et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 94 5267 ； 1997) 所述。當(dāng)血清稀釋度產(chǎn)生在490nm處吸光度上升、大于陰性對(duì)照序列的平均值加三個(gè)標(biāo)準(zhǔn) 誤差值時(shí)，取最后的血清稀釋度的倒數(shù)，計(jì)算出終點(diǎn)滴度?？梢酝ㄟ^胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(也稱作胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞計(jì)數(shù))或 者通過ELISPOT 來測(cè)量細(xì)胞免疫性(Letsch A et al.，Methods 31 143-49 ；2003) 兩個(gè)方法都允許定量 抗原特異性的免疫反應(yīng)，雖然ICS(胞內(nèi)細(xì)胞因子染色)也增加了可以同時(shí)通過表型表征抗 原特異性的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞。這些測(cè)定能夠評(píng)估抗原特異性的分泌IL-2、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-IO 和 IFN 的 T 細(xì)胞數(shù)量(Wu et al.，AIDS Res. Hum. Retrovir. 13 1187 ； 1997)。 按照文獻(xiàn)(Wu et al.，Infect. Immun. 63 4933 ； 1995)描述的和以前使用的(Xu-Amano et al.，J. Exp. Med. 178 1309 ； 1993) ； (Okahashi et al.，Infect. Immun. 64 1516 ； 1996)方 法，使用商業(yè)上可購(gòu)買的捕獲和檢測(cè)mAbs (R & D Systems公司和Pharmingen公司)進(jìn)行 ELISPOT測(cè)定。每個(gè)測(cè)定都包括有絲分裂原(Con Α)和卵清蛋白對(duì)照。在此描述的基于抗 IFN細(xì)菌的載體系統(tǒng)與沒有IFN抗性基因的傳遞系統(tǒng)相比具有數(shù)個(gè)優(yōu)點(diǎn)。這些抗原基因以 較高水平、并且以比較長(zhǎng)的時(shí)間周期被表達(dá)，因此誘導(dǎo)更劇烈的免疫反應(yīng)。對(duì)展示出效力、 并且在動(dòng)物模型中無毒的細(xì)菌性載體進(jìn)一步在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估。實(shí)施例10.結(jié)核疫苗的開發(fā)卡介苗細(xì)菌按照在此描述的方法經(jīng)基因工程化而包含編碼下述的核酸1)作為 過客基因的一種以上結(jié)核病抗原、以及2)可抑制或干涉哺乳動(dòng)物寄主細(xì)胞I型干擾素反應(yīng) 的一種以上因子。當(dāng)施用于哺乳動(dòng)物寄主(例如人類)時(shí)，基因工程卡介苗侵入寄主細(xì)胞、 逃脫內(nèi)體，并且被溶解來釋放過客基因，從而產(chǎn)生一種以上結(jié)核病抗原。另外，卡介苗還產(chǎn) 生一種以上可抑制寄主細(xì)胞IFN反應(yīng)的因子。這些因子削弱寄主細(xì)胞IFN反應(yīng)，否則IFN 反應(yīng)降低TB抗原的產(chǎn)量。其結(jié)果是，產(chǎn)生足夠的TB抗原從而導(dǎo)致穩(wěn)固的對(duì)TB抗原的免疫 反應(yīng)。雖然本發(fā)明已經(jīng)描述了其優(yōu)選的實(shí)施方式，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，在不違 背本發(fā)明精神和附后的權(quán)利要求的范圍的情況下，本發(fā)明能夠具有各種變型。因此，本發(fā)明 將不會(huì)限于如上所述實(shí)施方式，而是應(yīng)該不違背在此提供的精神和描述的范圍的情況下進(jìn) 一步包括所有的變型和其等效形式。
權(quán)利要求
一種基因工程細(xì)菌，其包含編碼下述的核酸序列一個(gè)以上過客基因；以及一種以上抑制哺乳動(dòng)物I型干擾素反應(yīng)的因子，其中，編碼所述一個(gè)以上過客基因的所述核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng)子，編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物I型干擾素反應(yīng)的因子的所述核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng)子或原核生物啟動(dòng)子。
2.如權(quán)利要求1所述的基因工程細(xì)菌，其特征在于，編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物I 型干擾素反應(yīng)的因子的所述核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求1所述的基因工程細(xì)菌，其特征在于，編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物I 型干擾素反應(yīng)的因子的所述核酸序列被可操作地連接于原核生物啟動(dòng)子。
4.如權(quán)利要求1所述的基因工程細(xì)菌，其特征在于，編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物 干擾素反應(yīng)的因子的所述核酸序列存在于所述基因工程細(xì)菌的染色體上。
5.如權(quán)利要求1所述的基因工程細(xì)菌，其特征在于，下述中的一個(gè)或兩者 i)編碼所述一個(gè)以上過客基因的核酸序列、以及 )編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列 存在于質(zhì)粒上。
6.如權(quán)利要求1所述的基因工程細(xì)菌，其特征在于，所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾 素反應(yīng)的因子來源于病毒。
7.如權(quán)利要求1所述的基因工程細(xì)菌，其特征在于，所述一個(gè)以上過客基因編碼結(jié)核 病抗原。
8.如權(quán)利要求1所述的基因工程細(xì)菌，其特征在于，所述基因工程細(xì)菌是志賀菌。
9.如權(quán)利要求1所述的基因工程細(xì)菌，其特征在于，所述基因工程細(xì)菌是分枝桿菌。
10.如權(quán)利要求1所述的基因工程細(xì)菌，其特征在于，所述一個(gè)以上過客基因是異源轉(zhuǎn)基因。
11.一種提高所關(guān)注的一種以上基因產(chǎn)物在細(xì)胞或組織中的產(chǎn)量的方法，包括下述步驟將包含編碼i)所述被關(guān)注的一種以上基因產(chǎn)物和ii) 一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素 反應(yīng)的因子的核酸序列的基因工程細(xì)菌施用于所述細(xì)胞或組織，其中，編碼所述一個(gè)以上過客基因的所述核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng) 子，編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物I型干擾素反應(yīng)的因子的所述核酸序列被可操作地連 接于真核生物啟動(dòng)子或原核生物啟動(dòng)子，其中所述施用步驟在允許所述基因工程細(xì)菌侵入所述細(xì)胞或組織的條件下進(jìn)行；以及 允許所述細(xì)胞或組織生產(chǎn)所述所關(guān)注的一種以上基因產(chǎn)物。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物I型干擾 素反應(yīng)的因子的所述核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng)子。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物I型干擾 素反應(yīng)的因子的所述核酸序列被可操作地連接于原核生物啟動(dòng)子。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的所述核酸序列存在于所述基因工程細(xì)菌的染色體上。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，下述中的一個(gè)或兩者i)編碼所述所關(guān)注的一種以上基因產(chǎn)物的所述核酸序列、以及ii)編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的所述核酸序列 存在于質(zhì)粒上。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng) 的因子來源于病毒。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述所關(guān)注的一種以上基因產(chǎn)物是結(jié)核 分枝桿菌抗原。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述基因工程細(xì)菌是細(xì)菌選自由志賀菌、 李斯特菌屬、沙門菌、以及卡介苗(BCG)所構(gòu)成的組。
19.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述一個(gè)以上過客基因是異源轉(zhuǎn)基因。
20.一種用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)所關(guān)注的抗原的免疫反應(yīng)的方法，包括下述步驟將基因工程細(xì)菌施用于所述哺乳動(dòng)物，所述基因工程細(xì)菌包含 編碼所述所關(guān)注的抗原的核酸序列；以及 編碼一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的核酸序列；其中，編碼所述一個(gè)以上過客基因的所述核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng) 子，編碼所述一種以上可抑制哺乳動(dòng)物I型干擾素反應(yīng)的因子的所述核酸序列被可操作地 連接于真核生物啟動(dòng)子或原核生物啟動(dòng)子；并且允許所述哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞或組織生產(chǎn)所述所關(guān)注的抗原，借此引起抗所述所關(guān)注抗 原的免疫反應(yīng)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述所關(guān)注的抗原是結(jié)核分枝桿菌抗原。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物I型干擾 素反應(yīng)的因子的所述核酸序列被可操作地連接于真核生物啟動(dòng)子。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物I型干擾 素反應(yīng)的因子的所述核酸序列被可操作地連接于原核生物啟動(dòng)子。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素 反應(yīng)的因子的所述核酸序列存在于所述基因工程細(xì)菌的染色體上。
25.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，下述中的一個(gè)或兩者i)編碼所述所關(guān)注的抗原的所述核酸序列、以及ii)編碼所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng)的因子的所述核酸序列 存在于質(zhì)粒上。
26.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述一種以上抑制哺乳動(dòng)物干擾素反應(yīng) 的因子來源于病毒。
27.一種重組細(xì)菌載體，其包含 用下述進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌一個(gè)以上用于編碼寄主細(xì)胞或組織1型干擾素(IFN)反應(yīng)抑制因子的基因工程化的核 酸序列、以及一個(gè)以上用于編碼一個(gè)以上寄主細(xì)胞或組織活性氨基酸序列的基因工程化的核酸，其中，一旦所述細(xì)菌侵入所述寄主細(xì)胞或組織，所述一個(gè)以上用于編碼所述一個(gè)以上 寄主細(xì)胞或組織活性氨基酸序列的基因工程化的核酸就被過量表達(dá)。
28.如權(quán)利要求27所述的重組細(xì)菌載體，其特征在于，所述寄主細(xì)胞或組織1型IFN反 應(yīng)抑制因子是輪狀病毒NSP1或流感病毒NS1。
29.如權(quán)利要求27所述的重組細(xì)菌載體，其特征在于，所述一個(gè)以上寄主細(xì)胞或組織 活性的氨基酸序列選自結(jié)核病抗原和瘧疾抗原。
30.如權(quán)利要求27所述的重組細(xì)菌載體，其特征在于，所述一個(gè)以上寄主細(xì)胞或組織 活性的氨基酸序列包括一個(gè)以上免疫刺激性氨基酸序列，所述免疫刺激性氨基酸序列來源 于下述中的一個(gè)或多個(gè)輪狀病毒、流感病毒、鼠痘病毒、肝炎病毒、牛痘病毒、腺病毒、副粘 病毒、HPV、HIV、HTLV、腸道病毒、皰疹病毒、EEE、VEE、西尼羅河病毒、諾沃克病毒、細(xì)小病毒、 登革熱病毒、以及出血熱病毒。
31.如權(quán)利要求27所述的重組細(xì)菌載體，其特征在于，所述一個(gè)以上寄主細(xì)胞或組織 活性的氨基酸序列選自激素、酶、抗癌劑、以及凋亡因子。
32.如權(quán)利要求27所述的重組細(xì)菌載體，其特征在于，所述寄主細(xì)胞或組織1型IFN 反應(yīng)抑制因子選自下組輪狀病毒NSP1、流感病毒NS1、鼠痘病毒C12R蛋白、丙型肝炎病毒 NS3/4A蛋白酶、牛痘病毒vIFN- a / 0 Rc蛋白、腺病毒E1A蛋白、副粘病毒C蛋白、以及人乳 頭瘤病毒(HPV)E6癌蛋白。
全文摘要
提供了具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的細(xì)菌傳遞系統(tǒng)。該重組細(xì)菌傳遞系統(tǒng)將所關(guān)注的轉(zhuǎn)基因和真核I型干擾素反應(yīng)的抑制劑傳遞至真核細(xì)胞。真核I型干擾素反應(yīng)的抑制允許改進(jìn)表達(dá)被編碼的轉(zhuǎn)基因。
文檔編號(hào)C12N15/74GK101874114SQ200880116402
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日
發(fā)明者小約翰·F·富爾克松, 拉維·P·阿南達(dá), 杰拉爾德·C·薩多夫, 穆罕默德·法可魯丁-賈米魯丁 申請(qǐng)人:Aeras全球Tb疫苗基金會(huì)