核糖體多核苷酸和相關(guān)表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】核糖體多核苷酸和相關(guān)表達(dá)系統(tǒng)
[0001] 對優(yōu)先權(quán)文件的引用
[0002] 根據(jù)美國法典第35篇第119條（e)款，本申請要求2012年5月21日提交的美 國臨時(shí)專利申請序列號61/649, 453和2013年3月12日提交的美國臨時(shí)專利申請序列號 61/778, 194的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益。在此要求上述申請日的優(yōu)先權(quán)，并且上述臨時(shí)專利申請的公 開內(nèi)容在此以引用的方式整體并入本文。
[0003] 序列表的并入
[0004] 本申請含有同此經(jīng)由EFS網(wǎng)站以電子方式提交的序列表的電子等同紙質(zhì)副本 以及同此經(jīng)由EFS網(wǎng)站以電子方式提交的序列表的計(jì)算機(jī)可讀形式，并且含有文件名為 "37651506001W0SequenceListing.txt"的文件，該文件的大小為30, 874字節(jié)并且創(chuàng)建于 2013年5月20日，這些序列表以引用的方式整體并入本文。
[0005] 關(guān)于政府支持的聲明
[0006] 本文描述的工作得到了美國國立衛(wèi)生研宄院（NationalInstitutesofHealth) NIH合同號GM078071的支持。美國政府享有所述主題的某些權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0007] 核糖體是細(xì)胞中催化蛋白質(zhì)合成的大分子結(jié)構(gòu)。它們普遍由兩個(gè)亞基組成，這兩 個(gè)亞基由眾多蛋白質(zhì)和若干RNA構(gòu)成。蛋白質(zhì)促成了亞基的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和活性。然而，一 般而言，難以將具體功能歸屬于各核糖體蛋白，這是因?yàn)樵S多核糖體蛋白對于核糖體功能 并不是必需的或者具有另外的核糖體外功能。相比之下，核糖體RNA(rRNA)負(fù)責(zé)核糖體亞 基的整體形狀以及催化蛋白質(zhì)合成的酶活性。有越來越多的證據(jù)表明rRNA還可能影響蛋 白質(zhì)合成的其它方面，包括mRNA的募集、特定mRNA的翻譯效率的調(diào)節(jié)、以及促進(jìn)核糖體支 路（ribosomal shunting)〇
[0008] 如果想要能夠研宄rRNA在核糖體組裝、蛋白質(zhì)合成以及rRNA功能的非典型方面 中的作用，則需要能夠改變r(jià)RNA序列并且監(jiān)測修飾的核糖體亞基在體內(nèi)的活性。對rRNA 加工、核糖體組裝以及高等真核生物rRNA功能的分析因缺少能夠使rRNA得到修飾、然后進(jìn) 行功能檢測的表達(dá)系統(tǒng)而受到阻礙。
[0009] 本領(lǐng)域迫切需要用于表達(dá)修飾的rRNA以及進(jìn)行功能分析的有效系統(tǒng)，特別是哺 乳動(dòng)物系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 在一個(gè)方面，提供了編碼具有密旋霉素（pactamycin)抗性的哺乳動(dòng)物18S rRNA 的合成或分離的多核苷酸。在這些多核苷酸中，密旋霉素抗性是由18S rRNA序列中的一個(gè) 或多個(gè)單殘基替代賦予的。還提供了這些多核苷酸的帶有所述替代的片段、互補(bǔ)序列以及 基本上相同的序列。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸中賦予密旋霉素抗性的單殘基替代 在對應(yīng)于小鼠18S rRNA(SEQ ID N0:23)的G963、A964、C1065或C1066的位置。在一些優(yōu) 選的實(shí)施方案中，所述單殘基替代在對應(yīng)于SEQ ID N0:23的位置G963的位置。這些多核 苷酸中的一些含有對應(yīng)于SEQ ID N0:23中的G963A替代的單殘基替代。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼具有密旋霉素抗性的人18S rRNA或小鼠 18S rRNA。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:23,但具有G963A替代。在一 些相關(guān)方面，提供了由所述合成或分離的多核苷酸編碼的哺乳動(dòng)物18S rRNA分子。在另一 個(gè)方面，提供了帶有所述編碼密旋霉素抗性18S rRNA的多核苷酸的載體。在這些載體中的 一些中，所述多核苷酸可進(jìn)一步包括rDNA序列的5'端ETS和ITS1。在一些實(shí)施方案中，所 述載體進(jìn)一步包括P〇l-I啟動(dòng)子或巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，所述載 體進(jìn)一步包括3'端ETS或SV40多聚腺苷酸化（poly (A))信號。在另一個(gè)相關(guān)方面，本文 公開了帶有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0012] 在另一個(gè)方面，提供了鑒定18S rRNA中改變核糖體功能的突變的方法。這些方法 需要：(a)向編碼具有密旋霉素抗性的哺乳動(dòng)物18S rRNA的合成多核苷酸中引入另外的突 變，其中所述密旋霉素抗性是由18S rRNA序列中的一個(gè)或多個(gè)單殘基替代賦予的，（b)在 密旋霉素的存在下使帶有所述另外的突變的合成多核苷酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)，以及（c)檢 測所述宿主細(xì)胞的核糖體相對于對照細(xì)胞的核糖體的變化，所述對照細(xì)胞表達(dá)沒有所述另 外的突變的合成多核苷酸。這些步驟使得能夠?qū)⑺隽硗獾耐蛔冭b定為改變核糖體功能的 突變。典型地，所述合成多核苷酸存在于被引入到宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方 案中，所述密旋霉素抗性18S rRNA在對應(yīng)于小鼠18S rRNA(SEQ ID N0:23)的G963、A964、 C1065或C1066的位置帶有單殘基替代。舉例來說，18S rRNA可帶有對應(yīng)于SEQ ID N0:23 中的G963A替代的替代。一些方法使用包含SEQ ID N0:23但具有G963A替代的合成多核 苷酸。
[0013] 在另一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有提高的翻譯效率的核糖體的方 法。這些方法需要：(a)向編碼具有密旋霉素抗性的哺乳動(dòng)物18S rRNA的合成多核苷酸中 引入另外的突變，其中所述密旋霉素抗性是由18S rRNA序列中的一個(gè)或多個(gè)單殘基替代賦 予的，（b)將帶有所述另外的突變的合成多核苷酸引入到宿主哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，（c)在密旋 霉素的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，以及（d)檢測所述細(xì)胞中相對于對照細(xì)胞的翻譯效率提高的 翻譯效率，所述對照細(xì)胞表達(dá)沒有所述另外的突變的合成多核苷酸。通過這些方法，可以獲 得具有提高的翻譯效率的核糖體。典型地，這些方法中使用的合成多核苷酸存在于被引入 到宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方案中，所述密旋霉素抗性18S rRNA在對應(yīng)于小 鼠18S rRNA(SEQ ID N0:23)的G963、A964、C1065或C1066的位置帶有單殘基替代。一些 方法使用了具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 23中的G963A替代的單殘基替代的編碼18s rRNA的合 成多核苷酸。舉例來說，這些方法可使用包括SEQ ID NO: 23但具有G963A替代的合成多核 苷酸。在各種實(shí)施方案中，可通過測量宿主細(xì)胞中特定多肽的水平來確定翻譯效率。
[0014] 在另一個(gè)方面，提供了包含表達(dá)載體的試劑盒，所述表達(dá)載體包含編碼具有密旋 霉素抗性的哺乳動(dòng)物18S rRNA的合成多核苷酸，其中所述密旋霉素抗性是由18S rRNA序 列中的一個(gè)或多個(gè)單殘基替代賦予的，如本文所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步 包括含有所述表達(dá)載體的細(xì)胞。
[0015] 在另一個(gè)方面，提供了優(yōu)先翻譯重組mRNA的方法，該方法包括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 表達(dá)編碼具有密旋霉素抗性的哺乳動(dòng)物18SrRNA的多核苷酸，其中所述編碼18SrRNA的 多核苷酸已經(jīng)被進(jìn)一步改變以引入一個(gè)或多個(gè)另外的突變，所述一個(gè)或多個(gè)另外的突變使 重組mRNA與由所述多核苷酸編碼的18S rRNA優(yōu)先結(jié)合，該方法進(jìn)一步包括向細(xì)胞提供所 述重組mRNA并且使細(xì)胞暴露于密旋霉素，所述密旋霉素的量足以減少或消除來自細(xì)胞內(nèi) 源性40S核糖體亞基的蛋白質(zhì)合成，從而很大程度上將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成限制于包含由 所述多核苷酸編碼的18S rRNA的40S核糖體亞基并且優(yōu)先翻譯所述重組mRNA。
[0016] 可通過參考本說明書的其余部分以及權(quán)利要求書來進(jìn)一步理解本文描述的系統(tǒng)、 方法和試劑盒的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0017] 圖la-lc示出了根據(jù)一個(gè)實(shí)現(xiàn)方式的rRNA轉(zhuǎn)錄物加工通路和rRNA表達(dá)系統(tǒng)。（a) rRNA表達(dá)平臺的示意圖?；疑耐鈬砑?xì)胞，并且含有與以黑線指示的mRNA -起的多 聚核糖體和以圓形指示的核糖體亞基（60S亞基用大圓指示；40S亞基用小圓指示）。顏色 更深的40S亞基是抗生素敏感性內(nèi)源性亞基；白色的40S亞基含有合成的18S rRNA，并且 具有抗生素抗性。使用不同的顏色來指示這些亞基是完全可區(qū)分的。細(xì)胞滲透性抗生素結(jié) 合內(nèi)源性40S亞基并且阻斷其活性。合成的40S亞基不受影響，并且能夠在這些條件下進(jìn) 行翻譯。（b)小鼠47S初級rRNA轉(zhuǎn)錄物。以水平線示意性地指示47S rRNA。不同的區(qū)段 代表編碼的rRNA。18S rRNA是40S核糖體亞基的RNA組分，并且28S rRNA和5. 8S rRNA 是60S亞基的RNA組分。黑線代表外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（5'端ETS和3'端ETS)和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間 隔區(qū)（ITS1和ITS2)，如圖所示。轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)中的切割位點(diǎn)以垂直線指示并且被標(biāo)記。（c) rRNA轉(zhuǎn)錄物加工通路。對前體轉(zhuǎn)錄物的加工牽涉到許多蛋白質(zhì)和RNA因子，并且已在多種 生物體中進(jìn)行了廣泛的研宄。小鼠47S前體rRNA由RNA聚合酶I在核仁中轉(zhuǎn)錄，并且隨后 通過兩種可能的通路加工。切割沿著從47S向18S rRNA、5. 8S rRNA以及28S rRNA的箭頭 方向進(jìn)行；45S rRNA可由如所示的兩種通路加工成18S rRNA，這兩種通路產(chǎn)生不同的中間 產(chǎn)物。在每個(gè)切割步驟處都指示了加工位點(diǎn)以及由18S rRNA成熟產(chǎn)生的主要切割產(chǎn)物。 5. 8S rRNA和28S rRNA的加工牽涉到另外的切割步驟和中間產(chǎn)物（未示）。
[0018] 圖2a-2c示出了對rRNA構(gòu)建體的加工的分析。（a)由構(gòu)建體pl8S. 1-. 6表達(dá)的RNA 的示意圖。構(gòu)建體含有P〇l-I啟動(dòng)子和3'端ETS、或者CMV啟動(dòng)子和SV40多聚腺苷酸化信 號。5'端ETS和ITS1以粗黑線指示，18S rRNA以黃條指示，并且缺失的間隔區(qū)序列以細(xì)虛 線指示。示出了切割位點(diǎn)。（b)對18S rRNA加工的RNA印跡分析。如方法部分中所述，用 所示的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞并且通過RNA印跡分析RNA。在印跡的左邊示出了單鏈RNA大 小標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸位置。這一印跡含有以下對照：A:100ng 18S WT轉(zhuǎn)錄物，B:100ng 18S加 標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄物，C :來自用未加標(biāo)簽的pl8S. 1 (Pol-1)轉(zhuǎn)染的N2a細(xì)胞的2 y g總RNA，D :來 自模擬物轉(zhuǎn)染的N2a細(xì)胞的2 y g總RNA，E :來自N2a細(xì)胞的2 y g總RNA。通過使用a -標(biāo) 簽探針與插入的標(biāo)簽序列雜交來檢測合成的rRNA。上部的條帶（星號）對應(yīng)于全長和經(jīng)部 分加工的轉(zhuǎn)錄物。示出了成熟的18S rRNA的位置。（c)來自構(gòu)建體pl8S. l(Pol-l)的18S rRNA積聚的時(shí)間過程。對于這些實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞并且在如所示的轉(zhuǎn)染后各個(gè)時(shí)間收獲 RNA。對照與（b)中的對照相同。
[0019] 圖3a-3c示出了對5'端ETS序列對于18S rRNA加工的影響進(jìn)行的分析。（a)如 圖2中的構(gòu)建體的示意圖。構(gòu)建體含有pol-I啟動(dòng)子和3'端ETS。（b)18S rRNA加工的 RNA印跡分析。如方法部分中所述，用所示的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞并且通過RNA印跡分析 RNA。通過使用a-標(biāo)簽探針與插入的標(biāo)簽序列雜交來檢測合成的rRNA。星號指示全長和 經(jīng)部分加工的轉(zhuǎn)錄物。示出了成熟的18S rRNA的位置。這一印跡的對照如圖2中所述。 (c)頂部：示意件示出 了 U3snoRNA 5' 端鉸鏈區(qū)（SEQ ID NO: 25)與 pl8S. 1 (SEQ ID NO: 26)、 口185.8八（5￡〇10勵(lì):27)、和卩185.8111(5￡〇10勵(lì):28)的比較；突出顯示了與？185.1相匹 配的互補(bǔ)序列。底邈:RNA印跡示出了來自用所示的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的N2a細(xì)胞的合成rRNA的 表達(dá)。如圖（b)中，使用a-標(biāo)簽探針與該印跡雜交。該印跡的對照如圖2中所述。
[0020] 圖4a-4d示出了對N2a細(xì)胞中的密旋霉素抗性突變的分析。（a)表達(dá)野生型或突 變型18S rRNA構(gòu)建體的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)。細(xì)胞是未經(jīng)過轉(zhuǎn)染的（NT)或者是經(jīng)過表達(dá) 野生型（WT)18S rRNA或含有所示的點(diǎn)突變的18S rRNA的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的