專利名稱：定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程生物制品領(lǐng)域，涉及一種利用基因工程方法生產(chǎn)出的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素(Endostatin)的體內(nèi)活性的定量測(cè)定方法，以及這種方法在依賴血管生成疾病的抗血管生成治療中的應(yīng)用。本發(fā)明術(shù)語涉及重組人內(nèi)皮抑素蛋白、重組人內(nèi)皮抑素蛋白活性片段和PEG化長(zhǎng)效重組人內(nèi)皮抑素及活性片段。
背景技術(shù)：
人內(nèi)皮抑素重組蛋白可從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)純化得到，不同途徑產(chǎn)生的或不同制備方法產(chǎn)生的重組人內(nèi)皮抑素活性往往不相同。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組人內(nèi)皮抑素是99％不溶性蛋白，需經(jīng)復(fù)性處理使之可溶。由于制備工藝及來源不同，重組人內(nèi)皮抑素蛋白有的報(bào)道有高活性，有的報(bào)道活性低，有的報(bào)道則無活性，有時(shí)體外表現(xiàn)有活性，體內(nèi)則又無活性或低活性。所以工業(yè)化制備重組人內(nèi)皮抑素蛋白用于廣泛抗血管生成臨床治療中，必須解決該產(chǎn)品體內(nèi)定量活性測(cè)定方法，以保證獲得高活性可溶的重組人內(nèi)皮抑素蛋白使之在臨床上顯示較好的療效。
目前用于內(nèi)皮抑素活性體內(nèi)測(cè)定的方法有雞胚尿囊膜血管形成試驗(yàn)，但這種方法量效關(guān)系不很明顯，一般僅能定性，難以定量。通常采用對(duì)有豐富血管的實(shí)體瘤進(jìn)行抑瘤率活性驗(yàn)證體內(nèi)活性，但抑瘤率如何換算成該產(chǎn)品的定量活性單位，這是重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性定量測(cè)量的主要關(guān)鍵技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法，采用抑制血管生成的抑瘤率換算成活性單位作為體內(nèi)活性定量測(cè)定體系，從而建立了一種規(guī)范的重組人內(nèi)皮抑素蛋白體內(nèi)活性定量測(cè)定體系，以確保產(chǎn)品的高活性、高療效和質(zhì)量可控，促進(jìn)該產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)和在抗血管生成治療中的廣泛應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法，其特征在于采用血管豐富的實(shí)體腫瘤作為動(dòng)物模型，將抑瘤水平定量換算成活性單位，測(cè)定時(shí)將對(duì)照品和待測(cè)品分別按不同劑量組平行進(jìn)行動(dòng)物抑瘤實(shí)驗(yàn)，按照藥理學(xué)方法進(jìn)行對(duì)照品ED50的計(jì)算，并計(jì)算出對(duì)照品的活性單位，在測(cè)得對(duì)照品的效價(jià)PT之后進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)和可信限計(jì)算，按可信限FL％標(biāo)志檢定結(jié)果的精確度，再按照量反應(yīng)平行線檢定法公式計(jì)算出待測(cè)品效價(jià)PT的可信限FL，從而定量衡量待測(cè)品當(dāng)中重組人內(nèi)皮抑素的體內(nèi)活性。
進(jìn)一步地，上述定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法當(dāng)中，根據(jù)待測(cè)品活性單位結(jié)果的95％可信限范圍確定待測(cè)品效價(jià)的允許范圍。
再進(jìn)一步地，上述定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法當(dāng)中，所述的動(dòng)物模型是腫瘤血管豐富的實(shí)體腫瘤，尤其是腫瘤血管異常十分鼠肝癌H22。
再進(jìn)一步地，上述定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法當(dāng)中，所述重組人內(nèi)皮抑素包括重組人內(nèi)皮抑素蛋白、重組人內(nèi)皮抑素蛋白活性片段和PEG化長(zhǎng)效重組人內(nèi)皮抑素及活性片段等，它們?nèi)∽源竽c桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、真核細(xì)胞或病毒，其表達(dá)系統(tǒng)通過基因工程方法獲得。
本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要體現(xiàn)在同工作對(duì)照品平行比較，可信限FL％及誤差較小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，避免了本品由于結(jié)構(gòu)特殊性體外細(xì)胞活性測(cè)量的不穩(wěn)定性和體外細(xì)胞活性測(cè)量誤差大(一般為50％～250％)的缺點(diǎn)，在沒有體外腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞系作為活性定量測(cè)定的情況下，這種體內(nèi)測(cè)定方法可定量測(cè)活，以反映本品的生物學(xué)定量活性。由于每次采用工作對(duì)照品和待測(cè)樣品平行進(jìn)行，測(cè)量誤差較小(在50％以內(nèi))，結(jié)果較為穩(wěn)定，檢測(cè)時(shí)間為10天左右，所需設(shè)備要求不復(fù)雜，方法建立較容易，重復(fù)性較好，并可避免了本品的特殊性在不同制備方法中有時(shí)會(huì)產(chǎn)生體外有活性而體內(nèi)無活性的缺點(diǎn)，確保控制產(chǎn)品質(zhì)量和臨床效果。該測(cè)定方法對(duì)于重組人內(nèi)皮抑素的工業(yè)化生產(chǎn)及其在臨床抗血管生成治療方面的應(yīng)用，均具有很好的指導(dǎo)作用。


圖1～圖6分別為重組人內(nèi)皮抑素對(duì)照品實(shí)驗(yàn)1～6的抑瘤效果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及不同來源不同制備方法所獲得的重組人內(nèi)皮抑素蛋白、重組人內(nèi)皮抑素蛋白活性片段和PEG化長(zhǎng)效重組人內(nèi)皮抑素及活性片段，它們活性不相同，有的甚至沒有活性，有的出現(xiàn)體外有活性體內(nèi)無活性的問題。由于人內(nèi)皮抑素的主要作用是抑制異常增殖的腫瘤血管及其它相關(guān)疾病中血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，但體外試驗(yàn)是用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞作活性測(cè)定材料，沒有辦法采用腫瘤血管或其它相關(guān)疾病血管內(nèi)皮細(xì)胞作為活性測(cè)定材料，因此這種體外測(cè)定方法有時(shí)會(huì)產(chǎn)生體外有活性體內(nèi)沒有活性的情況，并且測(cè)定誤差大。為了確保重組人內(nèi)皮抑素臨床療效，體內(nèi)定量測(cè)定活性則是臨床療效的關(guān)鍵所在，并可取代體外活性測(cè)定。
本發(fā)明選用血管特別豐富的鼠肝癌H22作為體內(nèi)測(cè)定活性的動(dòng)物模型，但也不排除其它實(shí)體瘤作為動(dòng)物模型，將生物檢定統(tǒng)計(jì)法中量反應(yīng)平行線測(cè)定法作為定量換算方法，建立了重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)定量活性測(cè)定方法。
小鼠肝癌H22動(dòng)物模型的建立是公眾知曉的通用技術(shù)，故描述從略。將H22小鼠腹水0.2ml注射到小鼠右前肢腋下的皮下，接種后第2天開始給藥，連續(xù)尾靜脈給藥7天，每次每只小鼠尾靜脈注射0.5ml，第10天引頸處死小鼠，小心分離腫瘤、拍照、稱量各組瘤重，按公式計(jì)算抑瘤率。
抑瘤率(％)＝(陰性對(duì)照組平均瘤重-待檢品組平均瘤重)/陰性對(duì)照組平均瘤重×100％按照生物檢定統(tǒng)計(jì)法(中國(guó)藥典2005年版第二部附錄XIV中量反應(yīng)平行線測(cè)定法)計(jì)算出ED50，并計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差。為了每批活性測(cè)定中有一陽性標(biāo)準(zhǔn)作標(biāo)尺，在沒有標(biāo)準(zhǔn)品情況下，首先確定重組人內(nèi)皮抑素定量測(cè)定工作對(duì)照品，按上述常規(guī)抑瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行6次單獨(dú)的對(duì)照品活性測(cè)定，每次測(cè)定均設(shè)陰性對(duì)照組(注射樣品緩沖液)和高、中、低劑量(20mg/kg，10mg/kg，5mg/kg)三組對(duì)照品實(shí)驗(yàn)組，分別求出不同劑量組的抑瘤率，以抑瘤率對(duì)劑量作回歸曲線，通過回歸曲線，可求出相關(guān)系數(shù)。通過公式y(tǒng)＝a+bx，在計(jì)算ED50時(shí)，y取值為50，a為截距，b為斜率，將低、中、高三個(gè)劑量的抑瘤率輸入公式，求出截距a和斜率b，則可計(jì)算出對(duì)照品的ED50。為了能定量確定重組人內(nèi)皮抑素的活性單位，ED50定義為“1ED50為1個(gè)活性單位(U)”，按每只小鼠20g體重計(jì)算，每瓶樣品中重組人內(nèi)皮抑素蛋白含量為確定數(shù)值，則樣品效價(jià)(U)＝每瓶樣品蛋白含量(mg)/ED50(mg/kg)×鼠重0.02kg＝X mg/ED50×0.02這樣將每批對(duì)照品的ED50代入上述樣品效價(jià)公式則可求出6批對(duì)照品實(shí)驗(yàn)的不同效價(jià)，求出6次實(shí)驗(yàn)的效價(jià)平均值和SD，按95％可信限確定對(duì)照品的效價(jià)95％可信限。
由于目前國(guó)內(nèi)外尚無重組人內(nèi)皮抑素的標(biāo)準(zhǔn)品，可以用上述活性測(cè)定工作對(duì)照品進(jìn)行重組人內(nèi)皮抑素活性定量測(cè)定的效價(jià)計(jì)算，得出對(duì)照品的體內(nèi)活性測(cè)定標(biāo)示效價(jià)為80u±50％，這不僅比文獻(xiàn)報(bào)道的體外活性誤差50％～250％誤差要小得多，而且代表了該產(chǎn)品體內(nèi)真正意義上的生物學(xué)活性。有了對(duì)照品作為體內(nèi)活性測(cè)定的效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以后，在對(duì)三批待測(cè)樣品進(jìn)行活性測(cè)定中，仍對(duì)每一批次待測(cè)樣品進(jìn)行2次單獨(dú)活性測(cè)定試驗(yàn)，共獲得6次抑瘤實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，每批待測(cè)樣品每次試驗(yàn)時(shí)均設(shè)陰性對(duì)照組(溶劑)，低劑量組(5mg/kg)，中劑量組(10mg/kg)和高劑量組(20mg/kg)，另設(shè)對(duì)照組也按低、中、高三個(gè)劑量組并進(jìn)行活性測(cè)定平行試驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)共設(shè)7組，每組動(dòng)物數(shù)為10只，按對(duì)照品活性測(cè)定方法進(jìn)行體內(nèi)活性測(cè)定，得到一組陰性對(duì)照組、三組對(duì)照品、三組待測(cè)樣品的動(dòng)物瘤重，采用量反應(yīng)平等線測(cè)定法，以活性測(cè)定對(duì)照品(S)標(biāo)示效價(jià)(U)，以待測(cè)品(T)和對(duì)照品(S)在相同實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)進(jìn)行抑瘤試驗(yàn)比較，通過對(duì)比，計(jì)算出它們的等反應(yīng)劑量比值(R)，計(jì)算得出待測(cè)品T的效價(jià)PT。其中R是S和T等反應(yīng)劑量(ds、dT)的比值，即R＝ds/dT，設(shè)M是S和T的對(duì)數(shù)等反應(yīng)劑量(XS、ST)之差，即M＝lgds-lgdt＝XS-ST，R＝antlgM。待測(cè)品效價(jià)PT是通過檢定測(cè)得待測(cè)品T的效價(jià)含量，稱為T的測(cè)得效價(jià)，并將效價(jià)比值(R)用T的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)AT校正之后，得PT＝AT·antlgM。
在測(cè)得待測(cè)品T的效價(jià)PT后，進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)和可信限的計(jì)算，按可信限(FL％)標(biāo)志檢定結(jié)果的精確度，并按量反應(yīng)平行線檢定法公式計(jì)算出效價(jià)PT的可信限FL。這樣得出待測(cè)樣品效價(jià)值和可信限，由于重組人內(nèi)皮抑素待測(cè)樣品同對(duì)照品在同等條件下進(jìn)行活性測(cè)定比較后所得效價(jià)同對(duì)照品效價(jià)比較的誤差較小，可信限及測(cè)量方法均比較穩(wěn)定，F(xiàn)L％在8％以內(nèi)，所得數(shù)值可真實(shí)反映待測(cè)樣品的定量活性。三批待測(cè)樣品6次實(shí)驗(yàn)的效價(jià)同對(duì)照品比較，誤差較小，各批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，避免了本品由于結(jié)構(gòu)特殊性體外細(xì)胞活性測(cè)量的不穩(wěn)定性和體外細(xì)胞活性測(cè)量誤差大(50％～250％)的缺點(diǎn)，反映了本品體內(nèi)生物學(xué)定量活性。由于每次采用工作對(duì)照品和待測(cè)樣品平行進(jìn)行，每批實(shí)驗(yàn)分7組進(jìn)行，測(cè)量誤差較小，結(jié)果較為穩(wěn)定，檢測(cè)時(shí)間為10天左右，所需設(shè)備要求不復(fù)雜，方法建立較容易，重復(fù)性較好，可確?？刂飘a(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效。
下面通過具體實(shí)例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1重組內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性測(cè)定的動(dòng)物模型建立重組內(nèi)皮抑素抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和其他異常增殖血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)是其主要功能，體內(nèi)活性測(cè)定時(shí)考慮到腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖最快，血管密度最大的組織為首選，而肝癌血管密度大，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖快，并有明顯遷移現(xiàn)象，所以選擇小鼠肝癌作為體內(nèi)測(cè)活的動(dòng)物模型是比較合適的。但也不排除其它實(shí)體瘤作為體內(nèi)定量測(cè)定活性的動(dòng)物模型作為本專利保護(hù)范圍。
(1)小鼠肝癌H22(腹水型)瘤種的傳代取已經(jīng)成熟的小鼠腹水，直接注射0.2mL(約1-2×107細(xì)胞)到20±1克的小鼠腹腔中，正常飼養(yǎng)7天后，同樣方法傳代。
(2)瘤種的保存取已經(jīng)成熟的小鼠腹水，1000rpm離心5分鐘，棄上清，加入凍存液(30％小牛血清1640，10％DMSO)，凍存方法和普通細(xì)胞一樣，保存在-70℃冰箱(只能保存一年)或液氮中。(注每毫升腹水凍5支)(3)瘤種的復(fù)蘇取出凍存的細(xì)胞快速投入37℃水浴中，融化后1000rpm離心5分鐘，棄上清，用0.5mL1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液注射到20±1克的健康小鼠腹腔中，7天后即可收取腹水。(注首次復(fù)蘇的腹水要再傳一次才能用于接種移植瘤)(4)動(dòng)物昆明種小鼠，約8周齡，體重20±1克，同性別。
(5)劑量設(shè)置20mg/kg，10mg/kg，5mg/kg。
(6)供試樣品制備陰性對(duì)照為樣品緩沖液(NaAc/HAc緩沖液，pH5.0，5％甘露醇，0.004％Tween-80)，除菌過濾。待檢品為待檢重組人內(nèi)皮抑素樣品，用樣品緩沖液稀釋至0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml。對(duì)照品為重組人內(nèi)皮抑素對(duì)照品，用樣品緩沖液稀釋至0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml。
(7)接種移植瘤取已經(jīng)成熟的小鼠腹水，以1∶4用生理鹽水稀釋，注射0.2ml(約2-4×106細(xì)胞)到小鼠右前肢腋下的皮下。(注細(xì)胞很快沉降，接種的過程中要不停的混勻，使每個(gè)小鼠接種細(xì)胞量基本相同)。
(8)給藥接種的小鼠隨機(jī)分組，待檢品3個(gè)劑量組、對(duì)照品3個(gè)劑量組及陰性對(duì)照組共7個(gè)組，每組10只，接種后第2天開始給藥，連續(xù)給藥7天，每次每只小鼠尾靜脈注射0.5ml(重組人內(nèi)皮抑素待檢品及對(duì)照品濃度均為0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml，與此對(duì)應(yīng)的劑量為20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg)，陰性對(duì)照組注射0.5ml樣品緩沖液。
(9)解剖以接種當(dāng)日算作第0天，第1天至第7天給藥，第10天解剖。引頸處死小鼠，小心分離瘤體，拍照。稱量各組瘤重，記錄數(shù)據(jù)。
實(shí)施例2重組人內(nèi)皮抑素活性定量測(cè)定工作對(duì)照品的ED50和效價(jià)的確定(1)抑瘤率的測(cè)定按上述重組人內(nèi)皮抑素活性測(cè)定方法采用對(duì)照品進(jìn)行了6次單獨(dú)的活性測(cè)定，并得到了6次抑瘤率測(cè)定結(jié)果(見表1)，6次對(duì)照品抑瘤效果照片見圖1～圖6。
(2)對(duì)照品6次實(shí)驗(yàn)的ED50和效價(jià)計(jì)算以抑瘤率對(duì)劑量作回歸曲線，x為ED50時(shí)的實(shí)際劑量，單位mg/kg，當(dāng)計(jì)算ED50時(shí)，y取值為50，則公式為y＝a+bx，其中a為截距，b為斜率，通過回歸曲線，并可求出相關(guān)系數(shù)r。以對(duì)照品實(shí)驗(yàn)1的結(jié)果為例，用計(jì)算器或微機(jī)分別輸入劑量5和對(duì)應(yīng)的抑瘤率33.25數(shù)值，按貯存鍵，再重復(fù)輸入劑量10和對(duì)應(yīng)的抑瘤率45.59，劑量20和對(duì)應(yīng)的抑瘤率64.71后，這樣通過低、中、高三個(gè)劑量的上述數(shù)值的輸入后可求出截距a為22.79，斜率b為2.122，相關(guān)系數(shù)r為0.996。將a、b代入公式y(tǒng)＝a+bx，并取ED50時(shí)y的取值為50，則50＝22.79+2.122xx＝(50-22.79)/2.122＝12.82該值則代表對(duì)照品實(shí)驗(yàn)1的ED50為12.82mg/kg。
為了能定量確定重組人內(nèi)皮抑素的活性單位，按ED50測(cè)定法定義1ED50＝1活性單位(U)，并設(shè)定樣品效價(jià)公式中每只鼠重按20g計(jì)算，每瓶重組人內(nèi)皮抑素裝量為15mg，則樣品效價(jià)計(jì)算公式為 以對(duì)照品實(shí)驗(yàn)1結(jié)果為例，ED50為12.82mg/kg，代入上述公式則對(duì)照品實(shí)驗(yàn)1的活性單位效價(jià)計(jì)算為15mg/(12.82(mg/kg)×0.02kg)＝58.50(U)。按此示例可分別計(jì)算出對(duì)照品6次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的ED50和效價(jià)，見表2。
(3)對(duì)照品效價(jià)及重組人內(nèi)皮抑素注射液標(biāo)示效價(jià)的確定由于目前尚無國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，申請(qǐng)人采用活性測(cè)定工作參照品作為對(duì)照品進(jìn)行了重組人內(nèi)皮抑素活性定量測(cè)定的效價(jià)計(jì)算，對(duì)照品6次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)定義1ED50為1個(gè)活性單位時(shí)，通過每次單獨(dú)試驗(yàn)采用低、中、高三個(gè)劑量，并每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照組情況下可得到ED50數(shù)值，并以樣品效價(jià)公式計(jì)算出每一單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的同一種對(duì)照品的效價(jià)，6次實(shí)驗(yàn)取其平均值和計(jì)算出SD，從而可得到95％可信限，從表2結(jié)果可得出如下結(jié)論重組人內(nèi)皮抑素定量活性測(cè)定用對(duì)照品的效價(jià)定為86.2U。
實(shí)施例3重組人內(nèi)皮抑素待測(cè)品體內(nèi)活性測(cè)定效價(jià)計(jì)算按量反應(yīng)平行線測(cè)定隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)法進(jìn)行重組人內(nèi)皮抑素效價(jià)測(cè)定(抑瘤試驗(yàn)法)，得到重組人內(nèi)皮抑素效價(jià)測(cè)定中抑瘤試驗(yàn)結(jié)果(瘤重，見表3)，通過公式計(jì)算出活性測(cè)定效價(jià)。其中S為重組人內(nèi)皮抑素活性對(duì)照品，效價(jià)為86.2U，稀釋液ds10.2mg/ml，ds20.4mg/ml，ds30.8mg/ml；T為重組人內(nèi)皮抑素成品，標(biāo)示效價(jià)為80U，稀釋液dt10.2mg/ml，dt20.4mg/ml，dt30.8mg/ml，r＝0.8∶0.4＝2，I＝lgr＝lg2＝0.3010。計(jì)算后的結(jié)果見下表(抑瘤重量為陰性對(duì)照組平均瘤重減去各個(gè)瘤重)反應(yīng)(y)抑瘤重量(g)

隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)(3.3)法，K＝6，不同小鼠(鼠間)是劑量組內(nèi)所加的因級(jí)限制，共10只小鼠，m＝10。
(1)計(jì)算各項(xiàng)差方和差方和(總)＝∑y2-(∑y)2/mK＝0.622+0.542+…+1.352+1.432-58.552/(10×6)＝6.8409f(總)＝mK-1＝10×6-1＝59差方和(劑間)＝∑[∑y(k)]2/m-(∑y)2/mK＝(5.802+9.532+…+9.862+14.012)/10-58.552/(10×6)＝6.6870f(劑間)＝K-1＝6-1＝5差方和(鼠間)＝∑[∑ym]2/K-(∑y)2/mK＝(5.952+5.682+…+6.122+6.052)/6-58.552/(10×6)＝0.0416f(鼠間)＝m-1＝10-1＝9差方和(誤差)＝差方和(總)-差方和(劑間)-差方和(鼠間)＝6.8409-6.6870-0.0416＝0.1123f(誤差)＝(K-1)(m-1)＝(6-1)(10-1)＝45(2)劑間變異分析及可靠性測(cè)驗(yàn)分別見下表劑間變異分析
可靠性測(cè)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)論回歸非常顯著(P＜0.01)，偏離平行、二次曲線、反向二次曲線均不顯著(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。
(3)效價(jià)(PT)及可信限(FL)計(jì)算r＝0.8∶0.4＝2，I＝lgr＝lg2＝0.3010，s2＝0.002496，f＝45，t＝2.01(P＝0.95)V＝(5.61+9.86+14.01-5.80-9.53-13.74)/3＝0.1367W＝(14.01-5.61+13.74-5.80)/4＝4.085g＝t2s2m/4W2＝2.012×0.002496×10/4×4.0852＝0.001511R＝D×antilg(IV/W)＝(0.8/0.8)antilg(0.3010×0.1367/4.085)＝1.0235PT＝R×對(duì)照品效價(jià)＝1.0235×86.2U＝88.2U。
實(shí)施例4重組人內(nèi)皮抑素待測(cè)品體內(nèi)活性測(cè)定的可信限計(jì)算按公式計(jì)算SM＝I(ms2((1-g)AW2+BV2))1/2/W2(1-g)其中查表得A＝2/3，B＝1/4SM＝0.3010×(10×0.002496×((1-0.001511)2/3×4.0852+1/4×0.13672))1/2/4.0852×(1-0.001511)＝0.009514R的FL＝antilg[lgR/(1-g)±tSM]＝antilg[lg1.0235/(1-0.001511)±2.01×0.009514]＝0.979～1.070PT的FL＝對(duì)照品效價(jià)×antilg[lgR/(1-g)±tSM]＝86.2×antilg[lg1.0235/(1-0.001511)±2.01×0.009514]＝84.4～92.2UPT的FL％＝[(92.2-84.4)/2×88.2]×100％＝4.4％因此獲得PT的可信限FL％為4.4％。
按照上述方法可分別計(jì)算獲得不同批次待測(cè)品的效價(jià)值和可信限，它們代表了與重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)生物學(xué)作用相一致的體內(nèi)活性定量表示和測(cè)量誤差?？傊景l(fā)明首先建立了重組人內(nèi)皮抑素活性測(cè)定工作參照品，將工作參照品6次單獨(dú)試驗(yàn)低、中、高三種劑量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果按藥理學(xué)的方法進(jìn)行ED50的計(jì)算，并分別計(jì)算活性單位，并將6次實(shí)驗(yàn)分別得到的活性單位結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，得出其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，根據(jù)活性單位結(jié)果的95％可信限范圍確定工作對(duì)照品的效價(jià)為86.2U，重組人內(nèi)皮抑素注射液的標(biāo)示效價(jià)范圍為80U±50％。同工作對(duì)照品比較，可信限FL％及誤差較小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，避免了本品由于結(jié)構(gòu)特殊性體外細(xì)胞活性測(cè)量的不穩(wěn)定性和體外細(xì)胞活性測(cè)量誤差大的缺點(diǎn)，在沒有體外腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞素作為活性定量測(cè)定的情況下，這種體內(nèi)測(cè)定方法可定量測(cè)活，以反映本品的生物學(xué)定量活性。
由于每次采用工作對(duì)照品和待測(cè)樣品平行進(jìn)行，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案測(cè)量誤差較小，結(jié)果較為穩(wěn)定，檢測(cè)時(shí)間為10天左右，所需設(shè)備要求不復(fù)雜，方法建立較容易，重復(fù)性較好，并可避免由于本品的特殊性導(dǎo)致在不同制備方法中有時(shí)會(huì)產(chǎn)生體外有活性而體內(nèi)無活性的缺點(diǎn)。該方法可以促進(jìn)重組人內(nèi)皮抑素產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)及其在抗血管生成治療中的廣泛應(yīng)用，確保產(chǎn)品的高活性、高療效和質(zhì)量可控。
表1重組人內(nèi)皮抑素對(duì)照品6次抑瘤率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2重組人內(nèi)皮抑素對(duì)照品6次抑瘤實(shí)驗(yàn)的ED50和效價(jià)

表3重組人內(nèi)皮抑素效價(jià)測(cè)定中抑瘤試驗(yàn)結(jié)果(瘤重)

權(quán)利要求
1.定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法，其特征在于采用血管豐富的實(shí)體腫瘤作為動(dòng)物模型，將抑瘤水平定量換算成活性單位，測(cè)定時(shí)將對(duì)照品和待測(cè)品分別按不同劑量組平行進(jìn)行動(dòng)物抑瘤實(shí)驗(yàn)，按照藥理學(xué)方法進(jìn)行對(duì)照品ED50的計(jì)算，并計(jì)算出對(duì)照品的活性單位，在測(cè)得對(duì)照品的效價(jià)PT之后進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)和可信限計(jì)算，按可信限FL％標(biāo)志檢定結(jié)果的精確度，再按照量反應(yīng)平行線檢定法公式計(jì)算出待測(cè)品效價(jià)PT的可信限FL，從而定量衡量待測(cè)品當(dāng)中重組人內(nèi)皮抑素的體內(nèi)活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法，其特征在于根據(jù)待測(cè)品活性單位結(jié)果的95％可信限范圍確定待測(cè)品效價(jià)的允許范圍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法，其特征在于所述的動(dòng)物模型是腫瘤血管豐富的實(shí)體腫瘤。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法，其特征在于所述的動(dòng)物模型是鼠肝癌H22。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法，其特征在于所述重組人內(nèi)皮抑素包括，重組人內(nèi)皮抑素蛋白、重組人內(nèi)皮抑素蛋白活性片段和PEG化長(zhǎng)效重組人內(nèi)皮抑素及活性片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的定量測(cè)定重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性的方法，其特征在于所述重組人內(nèi)皮抑素取自大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、真核細(xì)胞或病毒，其表達(dá)系統(tǒng)通過基因工程方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用基因工程方法生產(chǎn)出的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素(Endostatin)的體內(nèi)活性的定量測(cè)定方法。采用血管豐富的鼠肝癌H
文檔編號(hào)C12N15/09GK101045167SQ20061003924
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者徐根興, 朱浩文, 徐家明, 榮志剛, 趙延發(fā), 鐘慎政 申請(qǐng)人:江蘇省基因藥物工程技術(shù)研究中心