專利名稱：一種能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑及其在制備治療腫瘤的藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能分泌內(nèi)皮抑素(endostatin)的細(xì)胞制劑，以及該制劑在制備治療腫瘤的藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在已有的腫瘤臨床治療中，抑制腫瘤新生血管的生成已成為重點(diǎn)之一。其中又以內(nèi)皮抑素為主要使用的抑制因子。目前，作為國家生物制品一類創(chuàng)新藥物重組人血管內(nèi)皮抑素注射液已獲得了國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的臨床批件，成為我國第一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的從大腸桿菌生產(chǎn)的天然人源結(jié)構(gòu)的人內(nèi)皮抑素注射液。
但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮抑素產(chǎn)生作用所需的蛋白量很大，反復(fù)注射用藥很不方便，且非常昂貴；同時(shí)內(nèi)皮抑素的性質(zhì)不穩(wěn)定，其活性蛋白難以獲得，難以達(dá)到理想的治療效果。
采用基因治療的方法，在體內(nèi)直接表達(dá)內(nèi)皮抑素，可避免其體外失活快和需反復(fù)注射的缺點(diǎn)；使用普通的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效率偏低，而腺病毒載體與其他載體系統(tǒng)相比較而言，有宿主范圍廣、感染率高、理化性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)；但腺病毒的非整合性使之不能持續(xù)表達(dá)所需產(chǎn)物，需反復(fù)給予；腺病毒注射入體內(nèi)后感染細(xì)胞的效率要比體外感染差，且很不穩(wěn)定，分泌的內(nèi)皮抑素受各種因素的影響在體液中的濃度也不能達(dá)到腫瘤治療所需水平，而且容易引起肌體免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑在在制備治療腫瘤的藥中的應(yīng)用。
所說的能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑，其特征是在體外，用分泌性內(nèi)皮抑素的重組腺病毒載體感染原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞而制得。
具體地，所說的細(xì)胞制劑由以下步驟制得1)構(gòu)建含有信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素序列，2)用上述1)中得到的序列構(gòu)建分泌性內(nèi)皮抑素的重組腺病毒載體，3)用上述2)中得到的重組腺病毒載體感染預(yù)先原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，即得到能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑。
本發(fā)明更進(jìn)一步的方案是，上述步驟3)為用重組腺病毒感染載體預(yù)先原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，體外培養(yǎng)至感染率達(dá)90％以上。
上述步驟1)構(gòu)建含有信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素過程中，所說的信號(hào)肽優(yōu)選與宿主表達(dá)細(xì)胞同源的分泌信號(hào)，包括但不限于下列TIMP-1基因的信號(hào)肽、人胰島素信號(hào)肽、人IGF-II信號(hào)肽、人膠原collagen，type IV信號(hào)肽、人膠原collagen，typeX信號(hào)肽、人膠原collagen，typeIV，alpha6信號(hào)肽、人interleukin-2(IL-2)信號(hào)肽。
本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)方案是能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑，在制備治療腫瘤的藥中的應(yīng)用。制得的藥劑輸入體內(nèi)后，能在體內(nèi)直接高濃度表達(dá)內(nèi)皮抑素，明顯地提高了抑制腫瘤生長的效率。在臨床應(yīng)用中，最好是取患者的成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，并進(jìn)一步制成能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑，用于對(duì)患者的治療，這樣能避免了機(jī)體的免疫反應(yīng)。
在體外用分泌性內(nèi)皮抑素的腺病毒載體高效地感染原代成纖維細(xì)胞，制備出的能分泌活性內(nèi)皮抑素的原代成纖維細(xì)胞制劑。并將該制劑用于制備治療腫瘤的藥物，能避免內(nèi)皮抑素體外易失活和需反復(fù)注射的缺點(diǎn)，能起到在體內(nèi)直接表達(dá)內(nèi)皮抑素，分泌出細(xì)胞，明顯抑制腫瘤生長的作用。特別是用取自患者自體的成纖維細(xì)胞制得的藥劑，能避免了機(jī)體的免疫反應(yīng)。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
圖1是含有信號(hào)肽的內(nèi)皮抑素構(gòu)建電泳圖；其中1和2是連接產(chǎn)物條帶；3是無信號(hào)肽的內(nèi)皮抑素條帶；4是2000的MARK。
圖2是重組腺病毒pATC-endo的構(gòu)建電泳圖；其中1endostatin條帶；2信號(hào)肽條帶；32000MARK；415000MARK；5同源重組子用PACI酶切放出特異條帶。
圖3是Western blot圖；其中1.第一天上清；2.第二天上清；3.第三天上清；4.陰性對(duì)照；5.不帶信號(hào)肽的表達(dá)上清；6.endostatin陽性對(duì)照；7.蛋白定量MARKER；8.第三天上清。
圖4是細(xì)胞增殖抑制情況；其中1.對(duì)照液組；2.10μL上清組；3.20μL上清組；4.40μL上清組；5.40μL上清+2μL內(nèi)皮抑素多抗組。
圖5是體外血管生成實(shí)驗(yàn)的照片。
圖6是感染腺病毒的原代成纖維細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的表達(dá)；其中系列1注射感染含有信號(hào)肽腺病毒的原代成纖維細(xì)胞；系列2注射感染不含有信號(hào)肽腺病毒的原代成纖維細(xì)胞；系列3注射相同體積PBS。
圖7是抑瘤實(shí)驗(yàn)的實(shí)物照片；其中系列1-3同圖6。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
本發(fā)明中所說的分泌性內(nèi)皮抑素的重組腺病毒載體可以是已公知的，如楊芳，何援利等構(gòu)建的分泌性內(nèi)皮抑素重組腺病毒載體?！度朔置谛蛢?nèi)皮抑素質(zhì)粒的構(gòu)建》發(fā)表在《醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)》第18卷第1期2005年1月；張子祥，李德春等構(gòu)建的分泌性內(nèi)皮抑素重組腺病毒載體《內(nèi)皮抑素重組腺病毒載體的構(gòu)建及制備》發(fā)表在《蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)》2004；24(5)；也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)或者參照本說明書而構(gòu)建。
下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照附圖和數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
實(shí)施例一能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑的制備例1、構(gòu)建含有信號(hào)肽的內(nèi)皮抑素序列根據(jù)不含信號(hào)肽內(nèi)皮抑素序列(如SEQ ID NO1所示)及TIMP-1基因的信號(hào)肽基因序列(Atg gcc ccc ttt gag ccc ctg gct tct ggc atc ctg ttg ttg ctg tgg ctg ata gccccc agc agg gcc)，設(shè)計(jì)引物，在信號(hào)肽上下游分別引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGGCCCCCTTTGAGCC-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACGGCCCTGCTGGG-3′)；在內(nèi)皮抑素上下游引入Sall(引物E35′-ACGCGTCGACATGCACAGCCACCGC-3′)，XbaI(引物E45′-CTAGTCTAGAGATTCCCTACTT-3′)酶切位點(diǎn)。以不含分泌肽的內(nèi)皮抑素序列為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出內(nèi)皮抑素序列；以TIMP-1基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR，擴(kuò)增出信號(hào)肽序列。然后兩者都用SalI酶切，回收得到的基因按5∶1比例用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物再用E1與E4 PCR擴(kuò)增。連接產(chǎn)物與對(duì)照內(nèi)皮抑素電泳鑒定，電泳步驟參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，薩姆布魯克著，1993年)，結(jié)果如圖1所示，連接產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的1、2條帶在645bp出現(xiàn)條帶，表明構(gòu)建成功，連接產(chǎn)物即含有信號(hào)肽的內(nèi)皮抑素(其序列如SEQ ID NO2所示)2、分泌性內(nèi)皮抑素重組腺病毒載體的構(gòu)建含有信號(hào)肽的內(nèi)皮抑素和病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle(pAdTrack-CMV)都用BglII與XbaI雙酶切，按2∶1比例用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH-5α細(xì)菌，得到重組產(chǎn)物pATC-endo。重組產(chǎn)物用PmeI酶切，使之線形化，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌內(nèi)同源重組，重組DNA轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌、挑克隆、小提質(zhì)粒、PacI酶切鑒定；酶切后，大量制備重組質(zhì)粒pAdlEasy/pShuttle-Endostatin(方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，薩姆布魯克著，1993年)。
重組質(zhì)粒pAdlEasy/pShuttle-Endostatin分別用BglII、SalI雙酶切，SalI、XbaI雙酶切及PacI單酶切。酶切產(chǎn)物電泳鑒定在640bp處有特異性條帶出現(xiàn)，說明人內(nèi)皮抑素基因已成功構(gòu)建腺病毒載體上；在80bp處有特異性條帶出現(xiàn)，說明信號(hào)肽序列也已構(gòu)建在了載體里(圖2)；PacI單酶切放出兩條特異性條帶(約30kb和3kb)，標(biāo)志構(gòu)建成功。
取20μg質(zhì)粒用PacI酶切，酚/氯仿抽提純化，乙醇沉淀，沉淀物晾干后溶于200μl無菌水中，備用。包裝細(xì)胞293A用含10％新生牛血清DMEM培養(yǎng)基，按常規(guī)的無菌技術(shù)在5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)。293A細(xì)胞傳至Φ60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，次日長至約70％的匯合度，換新鮮的完全培養(yǎng)液4.5ml培養(yǎng)4-5h。用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將50μl質(zhì)粒(約5μg)轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞293A(方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，薩姆布魯克著，1993年)。
在35℃、3％CO2中培養(yǎng)16h后，換液，再于37℃、5％CO2培養(yǎng)7-10天，觀察細(xì)胞病變現(xiàn)象和病毒的產(chǎn)生。等待293A細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象后，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融三次，5000rpm離心10min，收集上清于-70℃保存，即制成分泌性人內(nèi)皮抑素的重組腺病毒載體。
3、原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)取剛出生1-2周的小鼠處死，75％乙醇?xì)⒕?0-20分鐘。去皮，切出大小為2mm×2mm×2mm的肌肉組織，均勻致密地平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)皿中。組織塊浸泡在含10％胎牛血清的DMEM中，于37℃、5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，約1-2周見細(xì)胞長出組織塊后，代其長滿細(xì)胞培養(yǎng)皿后消化傳代。
4、腺病毒轉(zhuǎn)染原代成纖維細(xì)胞原代成纖維細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待長到70％-80％滿時(shí)，感染分泌性內(nèi)皮抑素重組腺病毒，24小時(shí)后在熒光顯微鏡下看到90％細(xì)胞以上表達(dá)熒光，即制成通過腺病毒表達(dá)內(nèi)皮抑素抑制腫瘤生長的原代成纖維細(xì)胞制劑，即能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑。
細(xì)胞再培養(yǎng)48-72小時(shí)，分別于第一天，第兩天及第三天收集上清。分別用于下述檢測(cè)或分析。
Western Blot檢測(cè)取第一天，第兩天及第三天收集上清，Western Blot檢測(cè)培養(yǎng)上清液中內(nèi)皮抑素蛋白含量。結(jié)果如圖3所示，顯示隨時(shí)間推移，內(nèi)皮抑素表達(dá)出體外有一個(gè)增強(qiáng)的過程，在第三天時(shí)達(dá)到最大。
體外細(xì)胞增殖測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的內(nèi)皮抑素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制作用將生長良好的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)接種于96孔培養(yǎng)板，4000個(gè)/孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)24h，分別加入10，20，40μl上清，40μl上清+2μl內(nèi)皮抑素多抗以及對(duì)照液，培養(yǎng)72h，MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，分析制得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的內(nèi)皮抑素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長產(chǎn)生的抑制作用。
結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的人內(nèi)皮抑素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長產(chǎn)生了抑制作用，其中40μl上清組達(dá)到32％。
血管生成實(shí)驗(yàn)(雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn))取九天的雞胚，37℃培養(yǎng)。于血管較疏處粘上一5毫米直徑的濾紙片，滴加10微升適當(dāng)濃度的bFGF，生長一天后，分為三組(每組5個(gè)樣本)分別滴加10微升PBS，5微升三天上清液，10微升三天上清液。再培養(yǎng)三天，觀察貼濾紙片周圍血管生長情況。
結(jié)果如圖5所示，PBS組血管正常生長；5ul組對(duì)比PBS組血管生長較慢，生長不充分；10ul組對(duì)比PBS組血管生長明顯慢，生長受抑制。表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的人內(nèi)皮抑素對(duì)動(dòng)物體內(nèi)血管內(nèi)皮生長產(chǎn)生抑制作用。
小鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)取15只四周左右小鼠，按清潔級(jí)飼養(yǎng)，每只在一側(cè)鼠鼷部接種約1×107個(gè)B16細(xì)胞，約一周后腫瘤長至平均大小4×5mm左右，將小鼠分為三組，分別注射1×107個(gè)感染含有信號(hào)肽腺病毒的原代成纖維細(xì)胞(由實(shí)施例一制得)，1×107個(gè)感染不含有信號(hào)肽腺病毒的原代成纖維細(xì)胞，及相同體積PBS，第六天時(shí)再注射一次。每隔三天測(cè)量腫瘤大小。十五天時(shí)處死小鼠，取瘤稱重，拍片。
結(jié)果如圖6及圖7所示，在圖7中第一行為感染含有信號(hào)肽腺病毒的原代成纖維細(xì)胞組(即本發(fā)明細(xì)胞制劑組)平均重量0.7056g；第二行為感染不含有信號(hào)肽腺病毒的原代成纖維細(xì)胞組，平均重量2.3235g；第三行PBS陰性對(duì)照組平均重量2.5586g。從圖6及圖7可知，本發(fā)明的細(xì)胞制劑，在體內(nèi)分泌內(nèi)皮抑素對(duì)腫瘤的生長有明顯的抑制作用。
實(shí)施例二與實(shí)施例一基本相同，不同之處在于信號(hào)肽選取人胰島素信號(hào)肽基因序列(atggccctgtggatgcgcctcctgcccctgctggcgctgctggccctctggggacctgacccagccgcagcc)，設(shè)計(jì)引物，在信號(hào)肽上下游分別引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGGCCCTGTGG-3′)，SalI(引物E2為5′-TCAGTAACGCGTCGACGGCTGCGGC-3′)。
實(shí)施例三與實(shí)施例一基本相同，不同之處在于信號(hào)肽選取人IGF-II信號(hào)肽基因序列(Atgggaatcccaatggggaagtcgatgctggtgcttctcaccttcttggccttcgcctcgtgctgcattgct)，設(shè)計(jì)引物，在信號(hào)肽上下游分別引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGGGAATCCCA-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACAGCAATGC-3′)。
實(shí)施例四與實(shí)施例一基本相同，不同之處在于信號(hào)肽選取人膠原collagen，type IV信號(hào)肽基因序(Atgcttataaacaagttgtggctgctcctggttacgttgtgcctgaccgaggaactggcagca)，設(shè)計(jì)引物，在信號(hào)肽上下游分別引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGCTTATAAAC-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACTGCTGCCAG-3′)。
實(shí)施例五與實(shí)施例一基本相同，不同之處在于信號(hào)肽選取及人膠原collagen，typeX信號(hào)肽基因序列(atgctgccacaaataccctttttgctgctagtatccttgaacttggttcatgga)，設(shè)計(jì)引物，在信號(hào)肽上下游分別引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGCTACCACAAATA-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACTCCATGAAC-3′)。
實(shí)施例六與實(shí)施例一基本相同，不同之處在于信號(hào)肽選取人膠原collagen，typeIV，alpha6信號(hào)肽基因序列(Atgcaccctgggttgtggctgctcctggttacgttgtgcctgaccgaggaactggcagca)，設(shè)計(jì)引物，在信號(hào)肽上下游分別引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGCACCCTGGG-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACTGCTGCCAG-3′)。
實(shí)施例七與實(shí)施例一基本相同，不同之處在于信號(hào)肽選取人interleukin-2(IL-2)信號(hào)肽基因序列(Atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagt)，設(shè)計(jì)引物，在信號(hào)肽上下游分別引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGTACAGGATG-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACACTGTTTGT-3′)。
SEQUENCE LISTING<110>南京師范大學(xué)<120>一種能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑及其在制備治療腫瘤的藥中的應(yīng)用<160>2<210>1<211>561<212>DNA<213>人種(Homo sapiens)<220>
<223>內(nèi)皮抑素序列<400>1atgcacagcc accgcgactt ccagccggtg ctccacctgg ttgcgctcaa cagccccctg60tcaggcggca tgcggggcat ccgcggggcc gacttccagt gcttccagca ggcgcgggcc120gtggggctgg cgggcacctt ccgcgccttc ctgtcctcgc gcctgcagga cctgtacagc180atcgtgcgcc gtgccgaccg cgcagccgtg cccatcgtca acctcaagga cgagctgctg240tttcccagct gggagactct gttctcaggc tctgagggtc cgctgaagcc cggggcacgc300atcttctcct ttgacggcaa ggacgtcctg aggcacccca cctggcccca gaagagcgtg360tggcatggct cggaccccaa cgggcgcagg ctgaccgaga gctactgtga gacgtggcgg420acggaggctc cctcgaccac gggccaggcc tcctcgctgc tggggggcag gctcctgggg480cagagtgccg cgagctgcca tcacgcctac atcgtgctct gcattgagaa cagcttcatg540actggctcca agtagggaat c 561<210>2<211>645<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig_peptide<222>(1)…(84)<400>2ggaagatcta tggccccctt tgagcccctg gcttctggca tcctgttgtt gctgtggctg60atagccccca gcagggccgt cgacatgcac agccaccgcg acttccagcc ggtgctccac120ctggttgcgc tcaacagccc cctgtcaggc ggcatgcggg gcatccgcgg ggccgacttc180cagtgcttcc agcaggcgcg ggccgtgggg ctggcgggca ccttccgcgc cttcctgtcc240tcgcgcctgc aggacctgta cagcatcgtg cgccgtgccg accgcgcagc cgtgcccatc300gtcaacctca aggacgagct gctgtttccc agctgggaga ctctgttctc aggctctgag360ggtccgctga agcccggggc acgcatcttc tcctttgacg gcaaggacgt cctgaggcac420
cccacctggc cccagaagag cgtgtggcat ggctcggacc ccaacgggcg caggctgacc480gagagctact gtgagacgtg gcggacggag gctccctcga ccacgggcca ggcctcctcg540ctgctggggg gcaggctcct ggggcagagt gccgcgagct gccatcacgc ctacatcgtg600ctctgcattg agaacagctt catgactggc tccaagtagg gaatc64權(quán)利要求
1.一種能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑，其特征在于在體外，用分泌性內(nèi)皮抑素的重組腺病毒載體感染原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞而制得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑，其特征在于由以下具體步驟制得1)構(gòu)建含有信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素序列，2)用上述1)中得到的序列構(gòu)建分泌性內(nèi)皮抑素的重組腺病毒載體，3)用上述2)中得到的重組腺病毒載體感染預(yù)先原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，即得到能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所說能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑，其特征在于所說的步驟3)為用重組腺病毒載體感染預(yù)先原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，體外培養(yǎng)至感染率達(dá)90％以上。
4.權(quán)利要求1-3所說的能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑，在制備治療腫瘤的藥中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利4所說的能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑在制備治療腫瘤的藥中的應(yīng)用，其特征在于其中所說的成纖維細(xì)胞來源于腫瘤患者自體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能分泌內(nèi)皮抑素的細(xì)胞制劑，以及該制劑在治療腫瘤中的應(yīng)用。所說的細(xì)胞制劑，是在體外，用分泌性內(nèi)皮抑素的重組腺病毒載體感染原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞而制得。該細(xì)胞制劑用于制備治療腫瘤的藥物，此藥物的應(yīng)用，可以避免內(nèi)皮抑素體外易失活和需反復(fù)注射的缺點(diǎn)，能起到在體內(nèi)直接表達(dá)內(nèi)皮抑素，分泌出細(xì)胞，明顯抑制腫瘤生長的作用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1872347SQ200610039268
公開日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2006年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月3日
發(fā)明者李朝軍, 陸上蘇, 王毅謙 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)