W138。
[0064] 除了哺乳動物細胞之外，用于表達如本文所述的合成18SrRNA的宿主細胞還可 以是酵母細胞或植物細胞?？赏ㄟ^將編碼18SrRNA的多核苷酸經(jīng)由酵母或植物表達載體 引入到宿主中來將適于穩(wěn)定整合和表達轉基因的酵母或植物細胞用于這些應用中。合適 的昆蟲細胞的實例包括果蠅幼蟲的細胞。當使用昆蟲細胞時，可通過合適的表達載體將 多核苷酸引入到細胞中。舉例來說，可如本領域所述使用桿狀病毒載體（Jasny，Science 238:1653, 1987 ;以及 Miller 等，Genetic Engineering (《基因工程》）（1986)，Setlow，J. K.等編著，Plenum，第8卷，第277-297頁）。當使用昆蟲細胞作為宿主時，可在用 于引入多核苷酸的表達載體中任選地使用果幡 -醇脫氫酶啟動子（Rubin, Science 240:1453-1459, 1988)。
[0065] 可使用任何方便的方案將表達具有密旋霉素抗性的18S rRNA的載體在體外或體 內(nèi)引入到宿主細胞中，這取決于宿主細胞的位置。在一些實施方案中，將表達載體瞬時轉染 到宿主細胞（例如培養(yǎng)的細胞系，如N2a)中，如下文實施例中所舉例說明。這可通過常規(guī) 實施的方法來完成，例如通過遵循本文舉例說明的方案。在其它一些實施方案中，表達載體 可穩(wěn)定整合到宿主基因組中。典型地，在進行合適的限制性酶消化以產(chǎn)生與宿主染色體同 源的自由端之后，然后可將多核苷酸轉染到宿主細胞中?？赏ㄟ^本領域常規(guī)實施的標準方 案將表達載體引入到宿主細胞中。舉例來說，可以通過磷酸鈣共沉淀、通過常規(guī)機械程序， 如顯微注射或電穿孔、通過插入被封入到脂質(zhì)體中的質(zhì)粒、以及通過病毒載體將載體轉染 到宿主細胞中。這些技術都是本領域公知的并且常規(guī)實施的技術，例如Freshney (同上）； Sambrook等（同上）；以及Brent等（同上）?？捎幂d體上存在的選擇標記物來鑒定和分 離帶有轉染的重組表達載體的宿主細胞。然后可在能夠選擇含有載體的細胞的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)大量的受體細胞。
[0066] 在一些實施方案中，當宿主細胞是分離的細胞時，可在允許宿主細胞存活的細胞 培養(yǎng)條件下，例如通過使用標準的轉化技術將表達載體直接引入到細胞中。這些技術包括 但未必限于：病毒感染、轉染、綴合、原生質(zhì)體融合、電穿孔、粒子槍技術、磷酸鈣沉淀、直接 顯微注射、病毒載體遞送等。方法的選擇一般取決于被轉化的細胞的類型和進行轉化的環(huán) 境（即體外（in vitro)、離體（ex vivo)、或體內(nèi)（in vivo))。對這些方法的一般性論述可 參見例如Brent等（同上）。
[0067] 或者，當宿主細胞是多細胞生物體的一部分時，可以使得靶向載體能夠進入到宿 主細胞中的方式，例如通過體內(nèi)或離體方案，將靶向載體給予生物體或宿主。"體內(nèi)"指將 靶構建體給予活的動物體。"離體"指在體外修飾細胞或器官。通常使這些細胞或器官返 回到活體內(nèi)。給予核酸構建體的方法是本領域公知的。舉例來說，核酸構建體可用下述方 式來遞送：陽離子脂質(zhì)（Goddard 等，Gene Therapy, 4:1231-1236, 1997 ;Gorman 等，Gene Therapy 4:983-992, 1997 ;Chadwick等，Gene Therapy 4:937-942, 1997 ;Gokhale 等，Gene Therapy 4:1289-1299, 1997 ;Gao 和 Huang, Gene Therapy 2:710-722, 1995);利用病毒載 體（Monahan 等，Gene Therapy 4:40-49, 1997 ;0nodera 等，Blood 91:30-36, 1998);通 過攝取"裸DNA"等?？捎帽绢I域公知用于細胞轉染的技術（參見上文論述）來離體給予 核酸構建體。可憑經(jīng)驗選擇確切的制劑、給予途徑和劑量。參見例如Fingl等，1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics(《治療學的藥理學基礎》），第1章第1頁。
[0068] VI.伸rRNA涫奪以實現(xiàn)提高的翻譯效率或改奪的核糖體功能
[0069] 本文所述的編碼合成的哺乳動物18S rRNA的多核苷酸或相關表達載體可用于鑒 定產(chǎn)生改進的或改變的核糖體功能和翻譯活性的突變（例如在18s rDNA序列中）。本文描 述的18S rRNA表達系統(tǒng)還可用于對18S rRNA中的天然變異進行功能分析。它們還適用于 使rRNA序列演變以產(chǎn)生具有改進的特性（例如提高的翻譯效率）的核糖體。舉例來說，為 了增加所關注的特定多肽的表達，可將特定的突變引入到18SrRNA中以使rRNA和編碼所 關注的多肽的mRNA之間的堿基配對相互作用增強。通過關閉內(nèi)源性18SrRNA功能，本文 描述的具有密旋霉素抗性的18SrRNA表達系統(tǒng)允許篩選和選擇18SrRNA中將增加所關注 的蛋白質(zhì)表達的突變。類似地，可以使rRNA序列、特別是18SrRNA演變并且選擇產(chǎn)生具有 改變的組裝或增強的翻譯活性（不限于任何特定mRNA(例如與tRNA相互作用））的核糖體 的經(jīng)過修飾的序列。
[0070] 因此，提供了研宄18SRNA序列中突變或天然變異的功能性后果的方法。在一些 實施方案中，通過使用本文所述的表達系統(tǒng)來檢測18SrRNA序列中天然變異的影響。典型 地，修飾帶有天然變異的多核苷酸序列（例如本文所述的小鼠或人變體18SrRNA序列）以 引入如本文所公開的密旋霉素抗性，例如引入對應于SEQIDNO: 23中的G963A的替代。然 后將存在于表達載體中的修飾的多核苷酸引入到宿主細胞中以在密旋霉素存在下對rRNA 加工和核糖體功能進行功能分析。所檢測到的活性相對于野生型或參考18SrRNA序列（例 如SEQIDNO: 23)活性的任何差別將表明序列變異與所觀察到的rRNA加工和/或核糖體 活性方面的改變之間的結構-功能關系。
[0071] 在一些其它實施方案中，用18SrRNA表達系統(tǒng)來篩選18SrRNA序列中引起改變 的核糖體功能和/或翻譯活性的突變。在這些實施方案中，通過隨機或位點特異性誘變來 進一步修飾編碼具有密旋霉素抗性的哺乳動物18SrRNA序列或其片段的多核苷酸序列以 產(chǎn)生候選的18SrDNA序列。在引入到宿主細胞中之后，然后對候選或變體18SrDNA序列 進行篩選和選擇以鑒定賦予了提高的翻譯效率或改變的核糖體功能的突變。可用本文所述 的標準分子生物學技術來進行誘變和隨后的選擇。
[0072] 本文描述的再另外一些實施方案涉及使18S rRNA序列演變以使所關注的特定多 肽的表達增強。在這些實施方案中，將隨機或位點特異性突變引入到編碼具有密旋霉素抗 性的18S rRNA的多核苷酸序列中，條件是這些突變不影響所編碼的18S rRNA的密旋霉素 抗性活性?？捎帽绢I域公知的方法來產(chǎn)生rRNA編碼序列的隨機突變。舉例來說，可容易地 用Stemmer (Nature 370:389-391，1994)中所述的DNA改組將隨機誘變引入到rDNA序列中。 或者，可用易錯擴增來引入隨機突變，例如如Bartell和Szostak，Science 261:1411，1993 中所述。還可以使用另外的用于產(chǎn)生隨機突變的技術。舉例來說，還可通過以下方式來使 18S rRNA編碼序列突變：盒式誘變（Hutchison 等，Methods Enzymol. 202:356-390, 1991)、 遞歸整體誘變（Arkin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815, 1992)、指數(shù)整體誘 變（Delegrave 等，Biotechnol. Res. 11:1548-1552, 1993)，以及有性 PCR 誘變（Stemmer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751，1994) 〇
[0073] 除了隨機誘變之外，還可以通過靶向或位點特異性誘變來產(chǎn)生要針對增強的翻譯 活性或改變的核糖體功能進行選擇和篩選的候選18SrDNA序列變體?？捎帽绢I域公知的 方法，例如ArnoldCurr.OpinionBiotechnol4:450-455, 1993,在 18SrDNA序列中進行定 點誘變。在一些實施方案中，用寡核苷酸定向誘變來產(chǎn)生位點特異性突變以產(chǎn)生18SrDNA 序列變體。寡核苷酸誘變描述于例如Reidhaar-Olson,Science241:53_57, 1988中。簡而 言之，合成帶有將要被引入到克隆的DNA中的一個或多個突變的多個雙鏈寡核苷酸，并且 將它們插入到所要誘變的克隆的DNA中?；厥蘸姓T變的DNA的克隆，然后評估它們所編 碼的rRNA的活性。產(chǎn)生變體18S rDNA序列的另一種方法是通過裝配PCR。裝配PCR包括 用小DNA片段的混合物組裝PCR產(chǎn)物。在同一個小瓶中同時進行大量不同的PCR反應，一 種反應的產(chǎn)物引發(fā)另一種反應的產(chǎn)物。裝配PCR描述于例如美國專利號5, 965, 408中。
[0074] 為了篩選和選擇具有所需表型的突變，然后通過本文所述的表達載體將編碼具有 密旋霉素抗性的18S rRNA并且進一步帶有位點特異性突變或隨機突變的變體18S rDNA序 列引入到宿主細胞中。然后在密旋霉素的存在下培養(yǎng)細胞并且評估所關注的多肽的表達水 平或組裝的核糖體的其它翻譯活性。為了鑒定使特定多肽的表達增強的修飾的18S rRNA， 檢測細胞中該特定多肽的表達水平并且與對照細胞中相同多肽的表達水平比較，所述對照 細胞表達具有密旋霉素抗性的18S rRNA，但在18S rRNA中不含有其它突變。18S rRNA中 的突變使得所關注的多肽的翻譯水平提高（相對于在沒有該突變的情況下的翻譯水平）表 明宿主細胞產(chǎn)生了使所關注的多肽的表達增強的核糖體。如下文所述，本文描述的方法適 用于提高各種所關注的多肽或蛋白質(zhì)的表達水平。所關注的多肽可以是宿主細胞內(nèi)源性的 或外源性的。
[0075] 除了選擇賦予所關注的多肽提高的表達水平的修飾的18S rRNA序列之外，本 文描述的18S rRNA表達系統(tǒng)還可用于產(chǎn)生具有其它改變的功能的核糖體。在這些實施 方案中，可在宿主細胞中針對由突變引起的任何改變的核糖體活性對編碼具有密旋霉 素抗性的18S rRNA并且進一步帶有上文所述的位點特異性突變或隨機突變的多核苷酸 進行檢測?？杀O(jiān)測的核糖體活性包括例如核糖體組裝、與tRNA和/或mRNA的相互作 用、翻譯起始、以及延長和終止?？捎帽绢I域中常規(guī)實施的技術或測定法來監(jiān)測各種核 糖體功能。舉例來說，可用例如以下文獻中所述的技術來檢測哺乳動物細胞的rRNA成 熟和核糖體組裝：Pestov 等，Curr. Protoc. Cell Biol. 2008，第 22 章：第 22. 11 單元； Champney, Methods Mol. Med. 142:63-73,2008 ;以及 Klostermeier 等，Nucleic Acids Res. 32:2707-15, 2004?？捎妙愃朴诶?Day 等，J. Bacteriol. 186:6864-6875, 2004 中所 述的測定法來研宄與mRNA結合的核糖體?？捎美鏟rinz等，EMBO J. 19:1900-1906, 2000 和Kalies等，J. Cell Biol. 126:925-934, 1994中所述的測定法來監(jiān)測在蛋白質(zhì)易 位過程中與ER膜結合的核糖體。氨酰-tRNA與核糖體的結合可根據(jù)本領域公知 的標準結合測定法來檢測，例如Agafonov等，EMBO Rep. 2:399-402, 2001 ;Ashraf 等，RNA.5:188-194，1999;以及 Lill 等，Methods Enzymol. 164:597-611,1988。18S rRNA突變對蛋白質(zhì)合成的其它方面（例如翻譯起始、延長、終止和肽釋放）的潛在影 響還可用常規(guī)實施的測定法監(jiān)測。參見例如Burakovsky等，RNA. 16:1848-53, 2010 ; Sternberg 等，Nat. Struct. Mol. Biol. 16:8