胱硫醚β-合酶的純化的制作方法
【專利說明】胱硫醚（3-合酶的純化
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用 本申請要求保護(hù)2012年3月26日提交的美國臨時申請?zhí)?1/615, 629和2013年3月 14日提交的美國申請?zhí)?3/830, 494的權(quán)益，其各自的公開內(nèi)容通過引用并入。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明一般涉及用于純化胱硫醚e -合酶（CBS)，尤其是其截短變體的方法。本發(fā) 明亦涉及通過所述純化方法產(chǎn)生的基本上純的CBS的組合物。
[0003] 發(fā)明背景 胱硫醚合酶（CBS)在真核生物的高半胱氨酸（Hey)代謝中起重要作用（Mudd等， 2飲，遺傳病的代謝和分子基礎(chǔ)（TheMetabolicandMolecularBasesofInherited/T/seaseO，第 8 版，第 2007-2056 頁，McGraw-Hill，New York)。所述 CBS 酶催化絲氛酸和 高半胱氨酸的5' -磷酸吡哆醛（PLP ;維生素B6)_依賴性縮合以形成胱硫醚，所述胱硫醚 隨后用于通過另一種PLP-依賴性酶（胱硫醚Y-裂解酶）產(chǎn)生半胱氨酸。在具有轉(zhuǎn)硫作 用（transsulfuration)途徑的哺乳動物細(xì)胞中，CBS在Hey再甲基化為甲硫氨酸或其在 半胱氨酸的生物合成中的備選用途之間占據(jù)了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)位置。這兩個競爭性途徑之間 的相對通量大致相等，并通過胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet)濃度來控制（Finkelstein 和 Martin，1984, 7；沒io/. ^6?. 259:9508-13) cAdoMet 使哺乳動物 CBS 酶激活多達(dá) 5 倍，表觀解離常數(shù)為 15剛（Finkelstein 等，1975，Tfes.Commun.66: 81-87 ;Roper 等，1992，ArcA 298: 514-521 ;Kozich 等，1992，Z/應(yīng). Mutation!'.113-123) 〇
[0004] 人CBS的C端調(diào)節(jié)域由約140個氨基酸殘基組成（Kery等，1998, ArcA 沒io/成355: 222-232)。該區(qū)對于人的酶的四聚體化和AdoMet激活而言為必需的（Kery 等，1998,同上）。所述C端調(diào)節(jié)區(qū)亦包含先前定義的"CBS結(jié)構(gòu)域"（Bateman，1997, 沒iocAe?. 5bi. 22: 12-13)。分別跨越 SEQ ID NO: 1 的氨基酸殘基 416-468 和 486-543 的 這些疏水序列（CBS 1和CBS 2)，在大范圍的其它不相關(guān)的蛋白質(zhì)中為保守的。盡管熱誘導(dǎo) CBS激活的急劇轉(zhuǎn)變以及此結(jié)構(gòu)域中的突變可組成性激活酶的觀察結(jié)果表明這些序列在所 述C端區(qū)的自動抑制功能中起作用，但其功能仍未知（Janos ik等，2001，try 40: 10625-33 ;Shan 等，2001,及皿 #〇乂 10: 635-643 ;Miles 和 Kraus，2004,7；沿〇乂 泛￡皿279: 29871-4)。在酵母CBS的C端區(qū)中亦存在兩個非常保守的CBS結(jié)構(gòu)域，所述酵 母CBS與人的酶的長度幾乎相同。
[0005] 在健康的正常個體中，CBS介導(dǎo)的從Hey到胱硫醚的轉(zhuǎn)化為從甲硫氨酸（Met)代 謝成半胱氨酸（Cys)的限速中間步驟。維生素&為此過程的必需輔酶。在CBS酶中具有 某些基因突變的患者中，從Hey到胱硫醚的轉(zhuǎn)化變慢或缺失，導(dǎo)致在酶底物（Hey)的血清濃 度上的升高以及在酶產(chǎn)物（胱硫醚）的血清濃度上的相應(yīng)降低。升高的Hey血清水平及其 并發(fā)的向尿中的排泄的臨床病況，統(tǒng)稱為高胱氨酸尿癥。
[0006] CBS缺乏為遺傳性高胱氨酸尿癥的最常見原因，所述高胱氨酸尿癥為一種嚴(yán) 重的威脅生命的疾病，其導(dǎo)致血漿、組織和尿中嚴(yán)重升高的高胱氨酸水平。對于高胱氨 酸尿癥的患病率的估計差異很大。通過新生兒篩查的確認(rèn)和臨床確認(rèn)已指出范圍為 1:200, 000-1:335, 000 的患病率（Mudd 等，1995,邊崔病游/f 琢分f基破（ andMolecularBasisofInheritedDiseases) ,McGraw-Hill: New York，第 1279 頁）。 與CBS缺陷型高胱氨酸尿癥（CBSDH)相關(guān)的主要健康問題包括：具有易染血栓形成傾向的 心血管疾病，導(dǎo)致未經(jīng)治療和經(jīng)局部治療的患者中的高死亡率；以進(jìn)行性近視和晶狀體脫 位影響視覺系統(tǒng)的結(jié)締組織問題；影響骨骼的結(jié)締組織問題，其特征為馬方綜合征、骨質(zhì)疏 松和脊柱側(cè)凸；以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)問題，其包括智力遲鈍和癲癇。癥狀包括脫位的眼晶狀 體、骨骼病癥、智力遲鈍以及過早的動脈硬化和血栓形成（Mudd等，2001，同上）。純合的CBS 缺乏與大量的臨床癥狀相關(guān)聯(lián)，這些癥狀包括智力遲鈍、骨質(zhì)疏松、脊柱后側(cè)凸、中風(fēng)、心肌 梗死、晶狀體異位和肺栓塞。所述疾病的心血管并發(fā)癥（尤其是動脈和靜脈血栓形成），為 早期死亡率的主要促因。
[0007] CBS缺乏的病理生理學(xué)無疑為復(fù)雜的，但意見一致的是，終末器官損傷的根本誘因 (instigator)為血清Hey的極度升高，所述Hey為CBS的底物，其因缺乏其經(jīng)CBS催化的 與L-絲氨酸縮合形成胱硫醚而在組織和血液中積累。在Hey的血液和組織濃度上的極大 升高的毒性可因Hey本身的分子反應(yīng)性和生物效應(yīng)而產(chǎn)生，或者可因其影響大量生物過程 的代謝物（例如Hey-硫代內(nèi)酯）而產(chǎn)生（Jakubowski等，2008，/^?你/ 22: 4071-6)。在 慢性血小板聚集中的異常、在血管參數(shù)中的改變以及內(nèi)皮機(jī)能障礙均已在患有高胱氨酸尿 癥的患者中描述。
[0008] 目前對于CBSDH的治療存在三種治療選項： 1) 在維生素^響應(yīng)的患者中使用藥理學(xué)劑量的維生素B6來增加CBS活性的殘余活性； 2) 通過嚴(yán)格限制Met攝入的飲食來降低血清Hey ;和 3) 通過甜菜堿介導(dǎo)的將Hey轉(zhuǎn)化成Met來解毒，從而降低血清Hey濃度。
[0009] 這3種療法各自目的均為降低血清Hey濃度。對于受維生素響應(yīng)的CBSDH所 累的個體的標(biāo)準(zhǔn)治療由補(bǔ)充以代謝配方和呈半胱氨酸形式的Cys (其在此情況下變?yōu)闂l件 必需氨基酸）的Met-限制飲食組成。肉、乳制品以及富含天然蛋白質(zhì)的其它食物的攝入為 禁止的。需要每日消耗不美味的含氨基酸和微量營養(yǎng)物的合成代謝配方，以防止繼發(fā)性營 養(yǎng)不良。補(bǔ)充甜菜堿（商品名：Cystadane?，同義詞：三甲基甘氨酸）亦為標(biāo)準(zhǔn)療法，其中 甜菜堿充當(dāng)用于在肝中通過甜菜堿-高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化的將Hey再甲基化成Met 的甲基供體（Wilcken等，1983,況份取/. J ifet/.309: 448-53)。即便在其中提供最佳護(hù) 理和資源的醫(yī)療中心中，飲食遵從性通常亦很差，并且這種非遵從性對于高胱氨酸尿癥的 威脅生命的并發(fā)癥的發(fā)展具有較大牽連。
[0010] 為了使患有高胱氨酸尿癥的患者享有不受限制得多的飲食（例如每日攝入限于2 g蛋白質(zhì)/kg，其為容易實現(xiàn)的），并且具有從長遠(yuǎn)來看導(dǎo)致臨床改善的顯著降低的Hey血漿 水平，用于增加酶活性的策略為如在共同待審的美國臨時專利申請系列號61/758, 138中 所闡述的治療提供可能性。最有效的治療策略為增加酶活性，如在對維生素B6響應(yīng)的高胱 氨酸尿癥患者給予R比哆醇（pyridoxone)時所證實。然而，因突變的性質(zhì)所致，此策略對于 維生素B 6無響應(yīng)的患者為不可能的。作為增加這些患者中的酶活性的方式的酶替代療法 (ERT)需要外源酶，所述外源酶在本領(lǐng)域中不存在并因此在本領(lǐng)域中提出對用于以用