豆蔻?；?、異戊稀化、棕櫚?；╬almitation)、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇。 與天然存在的蛋白質(zhì)或肽相比，同源物可具有增強、減少、改變或基本上類似的性質(zhì)。同源 物可包括蛋白質(zhì)的激動劑或蛋白質(zhì)的拮抗劑。
[0052] 同源物可以是自然等位基因變異或自然突變的結(jié)果。編碼蛋白質(zhì)的核酸的天然存 在的等位基因變體為這樣的基因，其與編碼這類蛋白質(zhì)的基因存在于基因組中基本上相同 的基因座上，但因例如突變或重組引起的自然變異所致而具有類似但不完全相同的序列。 等位基因變體通常編碼這樣的蛋白質(zhì)，其具有類似于與其進行比較的基因編碼的蛋白質(zhì)的 活性。因遺傳密碼的簡并性所致，一類等位基因變體可編碼相同的蛋白質(zhì)但具有不同的核 酸序列。等位基因變體亦可包含在基因的5'或3'非翻譯區(qū)（例如調(diào)控區(qū)）中的改變。等 位基因變體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0053] 同源物可使用本領(lǐng)域已知的用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的技術(shù)產(chǎn)生，包括但不限于對分離 的天然存在的蛋白質(zhì)的直接修飾、直接的蛋白質(zhì)合成、或者使用例如產(chǎn)生隨機或定向誘變 的經(jīng)典或重組DNA技術(shù)對編碼蛋白質(zhì)的核酸序列進行修飾。CBS變體描述于美國專利號 8, 007, 787,其通過引用以其整體并入到本文中；在具體和優(yōu)選的實施方案中，本文所述的 本發(fā)明的試劑和方法優(yōu)選包括人CBS蛋白的天然存在的截短變體或經(jīng)化學(xué)切割或基因工 程改造的截短物。根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID NO: 3的具體截短形式包括N端缺失變體、C端缺 失變體以及N端和C端雙缺失的變體。
[0054] 本文所用的"基本上純的"是指允許蛋白在體外、離體或體內(nèi)的有效使用的純度。 對于可用于體外、離體或體內(nèi)的蛋白質(zhì)，優(yōu)選其基本上不含可干擾或者會干擾其使用、或者 至少不希望包含在CBS蛋白（包括其同源物）中的污染物、其它蛋白質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。
[0055] 本文所用的CBS富化的溶液為已經(jīng)歷一個或多個純化步驟的溶液。
[0056] 蛋白質(zhì)的純度可通過計算倍數(shù)純化（即提供純化的溶液與更少純化的溶液或未 加工的提取物相比高多少的量度的公式）來確定。倍數(shù)純化使用下式來計算： 最終部分的比活/未加工部分的比活。
[0057] 評價純度的另一種量度為"比活"，其計量酶的純度。比活可使用下式來計量：
【主權(quán)項】
1. 一種用于純化脫硫離e-合酶（CB巧蛋白的方法，其中所述CBS蛋白為天然存在 的、經(jīng)化學(xué)切割的或經(jīng)基因工程改造的截短CBS蛋白，所述方法包括W下步驟： (a)提供包含一種或多種雜質(zhì)的含CBS的溶液；和 化）使用離子交換色譜柱和金屬親和色譜（IMAC)樹脂進行所述含CBS溶液的色譜分 離，其中因此去除雜質(zhì)。
2. 權(quán)利要求1的方法，其進一步包括使用疏水相互作用色譜化1C)柱進行色譜分離的 步驟。
3. 權(quán)利要求1-2的方法，其進一步包括使用陶瓷哲磯灰石樹脂進行色譜分離的步驟。
4. 權(quán)利要求1-3的方法，其中所述離子交換色譜柱為弱陰離子交換柱。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述弱陰離子交換柱為DEAE-瓊脂糖凝膠FF柱。
6. 權(quán)利要求1-5的方法，其中使所述金屬親和色譜（IMC)樹脂荷載上二價金屬陽離 子。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述二價金屬陽離子為鑲、銅、鉆或鋒。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述二價金屬離子為鋒。
9. 權(quán)利要求1-8的方法，其進一步包括用含咪挫的洗脫緩沖液將CBS從所述金屬親和 色譜（IMAC)樹脂上洗脫。
10. 權(quán)利要求1-9的方法，其中所述截短的CBS蛋白具有由SEQ ID NO: 3確定的氨基 酸序列。
11. 權(quán)利要求1-10的方法，其中所述含CBS的溶液為澄清的CBS溶液。
12. 權(quán)利要求1-11的方法，其中所述CBS在重組細(xì)胞中產(chǎn)生。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述重組細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述含CBS的溶液通過將表達(dá)重組構(gòu)建體的重組細(xì)菌細(xì) 胞均質(zhì)化來獲得，所述重組構(gòu)建體包含編碼CBS的核酸序列。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述CBS核酸編碼截短的CBS蛋白。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中將所述截短的CBS蛋白截短至來自SEQ ID NO: 2的 382-532、382-550或543-550的氨基酸殘基之一的末端位置。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述CBS核酸序列包含SEQ ID NO: 4。
18. 權(quán)利要求12-17的方法，其中所述重組細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
19. 權(quán)利要求16的方法，其中編碼所述截短的CBS蛋白的核酸序列針對在大腸桿菌細(xì) 胞中的表達(dá)最優(yōu)化。
20. -種通過權(quán)利要求1-9的方法產(chǎn)生的基本上純化的CBS溶液。
21. 在藥學(xué)上可接受的載體中配制的權(quán)利要求20的基本上純化的CBS溶液。
22. -種用于產(chǎn)生CBS富化的溶液的方法，其中所述CBS蛋白為天然存在的、其經(jīng)化學(xué) 切割或基因工程改造的截短物，所述方法包括： (a)提供包含一種或多種雜質(zhì)的含CBS的溶液；和 化）使用荷載有二價金屬離子的固定化金屬親和色譜（IMAC)樹脂進行所述含CBS溶液 的色譜分離，其中因此去除雜質(zhì)。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述二價金屬陽離子為鑲、銅、鉆或鋒。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述二價金屬離子為鋒。
25. 權(quán)利要求22-24的方法，其中所述截短的CBS蛋白具有由SEQ ID NO: 3確定的氨 基酸序列。
26. 權(quán)利要求22-25的方法，其中所述CBS溶液為澄清的CBS溶液。
27. 權(quán)利要求22-26的方法，其中所述CBS在重組細(xì)胞中產(chǎn)生。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中所述重組細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述CBS溶液通過將表達(dá)重組構(gòu)建體的重組細(xì)菌細(xì)胞均 質(zhì)化來獲得，所述重組構(gòu)建體包含編碼CBS的核酸序列。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述CBS編碼截短的CBS蛋白。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中將所述截短的CBS蛋白截短至來自SEQ ID NO: 2的 382-532或543-550的氨基酸殘基之一的末端位置。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中所述CBS核酸序列包含SEQ ID NO: 4。
33. 權(quán)利要求22-32的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
34. 權(quán)利要求22-33的方法，其中編碼所述截短的CBS蛋白的核酸序列針對在大腸桿 菌細(xì)胞中的表達(dá)最優(yōu)化。
35. -種通過權(quán)利要求22-34的方法產(chǎn)生的CBS富化的溶液。
【專利摘要】本發(fā)明提供用于純化胱硫醚β-合酶(CBS)蛋白、尤其是其截短的變體的色譜法以及自其制備的組合物和藥物組合物。
【IPC分類】C12N9-88
【公開號】CN104540940
【申請?zhí)枴緾N201380027463
【發(fā)明人】G. 卡里洛 R., P. 克勞斯 J., 馬坦 T., 納維 D.
【申請人】科羅拉多州大學(xué)評議會
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2013年3月25日
【公告號】CA2867719A1, EP2831229A1, US20130251700, WO2013148580A1