專利名稱:從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及植物提取物的分離純化領(lǐng)域,具體是一種從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法。
(二)技術(shù)背景紫杉醇是近二十年來(lái)世界上發(fā)現(xiàn)的最有希望的抗癌藥物,對(duì)治療乳腺癌、卵巢癌、食道癌、肺癌、肝癌等癌癥均有良好療效,對(duì)癌細(xì)胞有極強(qiáng)的殺傷力,而毒副作用極小。因此成為目前藥品行業(yè)研究的重點(diǎn)。
紫杉醇屬于二萜類生物堿。最開始是從天然植物紅豆杉中提取分離紫杉醇。紅豆杉是珍稀物種,天然紅豆杉資源極為有限,而且紅豆杉生長(zhǎng)緩慢,天然紅豆杉無(wú)法滿足紫杉醇生產(chǎn)的需要量。為了開辟紫杉醇的新的來(lái)源,人們研究了從人工種植的曼地亞紅豆杉中提取分離紫杉醇、紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及多種生物合成、半合成、全合成紫杉醇工藝。無(wú)論采用何種工藝,由于紫杉醇合成率低、成本高,所以紫杉醇價(jià)格昂貴。另外從多種結(jié)構(gòu)相近的衍生物、同系物的混合物中分離純化出紫杉醇藥物,特別是紫杉醇與三尖杉寧堿的分離,是很困難的工作。分離純化過(guò)程中收率稍有升降,即意味著珍貴的紫杉醇的得失多少,效益上將有巨大差異。所以如何改進(jìn)紫杉醇的分離純化工藝,是目前普遍重視的課題。
目前的分離方法主要有硅膠柱層析法、氧化鋁柱層析法,純化方法主要有C18柱層析、氟苯基柱層析等反相層析法和硅膠柱層析正相層析法。
有關(guān)紫杉醇的分離純化工藝的專利申請(qǐng)有多件,如加拿大植原藥物公司1999年申請(qǐng)的中國(guó)專利99815315.X“從含紫杉醇物質(zhì)生產(chǎn)紫杉醇的高產(chǎn)率提取方法”用丙酮/水沉淀法制備高純度紫杉醇,復(fù)旦大學(xué)1998年申請(qǐng)的中國(guó)專利“一種清潔純化紫杉醇的方法”使用填充色譜柱正構(gòu)烷烴淋洗純化紫杉醇粗產(chǎn)物,梅縣梅雁生物工程研究所2001申請(qǐng)的中國(guó)專利“從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法”將大孔吸附樹脂與試液充分混合進(jìn)行吸附富集,有機(jī)溶劑洗脫被樹脂吸附的紫杉醇,濃縮得到高含紫杉醇的濃縮物。
現(xiàn)有的分離純化方法的不足之處在于,紫杉醇一次收率(即從投料開始,經(jīng)過(guò)按順序的工藝流程,而得到的產(chǎn)出物收得率,以有效成份紫杉醇計(jì)算。不包括副產(chǎn)出物的反復(fù)投入)僅為70%;而且要使用易燃、易爆或有毒溶劑,如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等,對(duì)人體有害,污染環(huán)境,生產(chǎn)操作過(guò)程危險(xiǎn)性高;此外上樣量小,一般硅膠柱層析時(shí)硅膠與樣品的比例為150比0.9~1.0。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種收率高、且生產(chǎn)操作安全的從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法。
本發(fā)明的從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法,包含下述步驟①紫杉醇含量為9~20%的紫杉醇粗產(chǎn)品為原料樣品;②用大孔吸附樹脂作固定相,大孔吸附樹脂與樣品的重量比為10比0.9~1.4;③用能與水混溶的、濃度為40~70%極性溶劑水溶液為流動(dòng)相;④用柱層析法分離純化紫杉醇,樣品溶液從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣;⑤流動(dòng)相洗脫時(shí),層析柱內(nèi)流出液流速為0.6~1.5升/小時(shí);⑥按時(shí)間分段收集經(jīng)層析后的流出液,每小時(shí)收集1份,至HPLC檢測(cè)紫杉醇濃度低于0.2毫克/毫升時(shí)終止,按時(shí)間段收集的流出液分為三部分;⑦第I部分流出液中基本無(wú)紫杉醇,集中處理,回收溶劑;⑧第II部分流出液中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品A;⑨第III部分流出液中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品B。
本發(fā)明從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法的優(yōu)點(diǎn)為1、分離純化效果好,很方便地將紫杉醇含量為9~20%的紫杉醇粗產(chǎn)品純化為含紫杉醇40~60%的紫杉醇中間產(chǎn)品;2、收率高,紫杉醇一次性收率高達(dá)80%左右;3、操作安全,不使用易燃、易爆或有毒溶劑;4、上樣量大,大孔吸附樹脂與樣品的重量比高達(dá)10比0.9~1.5,是一般硅膠柱層析時(shí)硅膠上樣量的15倍;5、可除去紫杉醇粗產(chǎn)品中的水溶性雜質(zhì)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1①原料樣品中紫杉醇含量為15.6%的紫杉醇粗產(chǎn)品100克,其中紫杉醇凈含量15.6克;
②紫杉醇樣品原料溶于300毫升95%(V/V)極性溶劑乙醇中,然后加水至乙醇濃度為60%(V/V),樣品與乙醇水溶液重量比約為1比5;③大孔吸附樹脂AB-8 1000克,與樣品的重量比為10比1,裝入外徑6厘米可充填高度100厘米的玻璃層析柱內(nèi);④從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣,即將樣品溶液倒入層析柱中,調(diào)節(jié)層析柱出口閥門,控制層析柱內(nèi)溶液流速為1升/小時(shí);⑤ 按時(shí)間分段收集經(jīng)層析后的流出液,每小時(shí)收集1份,至HPLC檢測(cè)紫杉醇濃度為0.2毫克/毫升時(shí)終止;⑥1~4份流出液為第I部分,其中基本無(wú)紫杉醇,集中處理,回收溶劑;⑦5~20份流出液為第II部分,其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品A8.35克,其中含紫杉醇37.4%,即紫杉醇凈含量為3.12克,占原料中紫杉醇的20%;⑧21~終止的流出液為第III部分,其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品B 18.2克,其中含紫杉醇54.2%,即紫杉醇凈含量為9.86克,占原料中紫杉醇的63.2%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量共為12.98克,占原料中紫杉醇的83.2%,即紫杉醇的一次性收率為83.2%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量平均為48.9%。
實(shí)施例2使用大孔吸附樹脂D101,①~⑥步其它條件與實(shí)施例1相同;⑦5~20份流出液為第II部分,其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品A8.55克,其中含紫杉醇38.5%,即紫杉醇凈含量為3.29克,占原料中紫杉醇的21.09%;⑧21~終止的流出液為第III部分,其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品B 17.5克,其中含紫杉醇53.5%,即紫杉醇凈含量為9.36克,占原料中紫杉醇的60.01%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量共為12.65克,占原料中紫杉醇的81.1%,即紫杉醇的一次性收率為81.1%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量平均為48.6%。
實(shí)施例3使用大孔吸附樹脂D201,①~⑥步其它條件與實(shí)施例1相同;⑦5~20份流出液為第II部分,其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品A8.765克,其中含紫杉醇40.2%,即紫杉醇凈含量為3.52克,占原料中紫杉醇的22.57%;⑧21~終止的流出液為第III部分,其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品B 18.5克,其中含紫杉醇50.2%,即紫杉醇凈含量為9.19克,占原料中紫杉醇的59.53%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量共為12.81克,占原料中紫杉醇的82.1%,即紫杉醇的一次性收率為82.1%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量平均為47.0%。
實(shí)施例4使用大孔吸附樹脂AK-9,①~⑥步其它條件與實(shí)施例1相同;⑦5~20份流出液為第II部分,其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品A8.60克,其中含紫杉醇37.8%,即紫杉醇凈含量為3.25克,占原料中紫杉醇的20.84%;⑧21~終止的流出液為第III部分,其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品B17.4克,其中含紫杉醇51.2%,即紫杉醇凈含量為8.91克,占原料中紫杉醇的57.11%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量共為12.16克,占原料中紫杉醇的77.9%,即紫杉醇的一次性收率為77.9%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量平均為46.8%。
實(shí)施例5①與實(shí)施例1相同;②紫杉醇樣品原料溶于200毫升極性溶劑丙酮中,然后加水至丙酮濃度為40%(V/V),樣品與丙酮水溶液重量比約為1比6;③~⑤與實(shí)施例1相同;⑥1~2份流出液為第I部分,其中基本無(wú)紫杉醇,集中處理,回收溶劑;⑦3~6份流出液為第II部分,其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品A11.5克,其中含紫杉醇30.2%,即紫杉醇凈含量為3.59克,占原料中紫杉醇的23.0%;⑧17~終止的流出液為第III部分,其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品B 19.7克,其中含紫杉醇48.3%,即紫杉醇凈含量為9.52克,占原料中紫杉醇的61.0%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量共為12.11克,占原料中紫杉醇的42.0%,即紫杉醇的一次性收率為42.0%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量平均為84.0%。
實(shí)施例6①原料樣品中紫杉醇含量為9.5%的紫杉醇粗產(chǎn)品140克,其中紫杉醇凈含量13.3克;②紫杉醇樣品原料溶于300毫升95%(V/V)極性溶劑乙醇中,然后加水至乙醇濃度為70%(V/V),樣品與乙醇水溶液重量比約為1比4;③與實(shí)施例1相同;④從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣,即將樣品溶液倒入層析柱中,調(diào)節(jié)層析柱出口閥門,控制層析柱內(nèi)溶液流速為0.6升/小時(shí);⑤與實(shí)施例1相同;⑥第1份流出液為第I部分,其中基本無(wú)紫杉醇,集中處理,回收溶劑;⑦2~16份流出液為第II部分,其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品A8.72克,其中含紫杉醇30.2%,即紫杉醇凈含量為2.63克,占原料中紫杉醇的19.8%;⑧16~終止的流出液為第III部分,其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品B 20.55克,其中含紫杉醇41.8%,即紫杉醇凈含量為8.59克,占原料中紫杉醇的64.59%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量共為11.22克,占原料中紫杉醇的84.4%,即紫杉醇的一次性收率為84.4%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量平均為38.3%。
實(shí)施例7①原料樣品中紫杉醇含量為11.8%的紫杉醇粗產(chǎn)品95克,其中紫杉醇凈含量11.2克;②紫杉醇樣品原料溶于300毫升95%(V/V)極性溶劑乙醇中,然后加水至乙醇濃度為50%(V/V),樣品與乙醇水溶液重量比約為1比6;③與實(shí)施例1相同;④從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣,即將樣品溶液倒入層析柱中,調(diào)節(jié)層析柱出口閥門,控制層析柱內(nèi)溶液流速為1.5升/小時(shí);⑤與實(shí)施例1相同;⑥1~6份流出液為第I部分,其中基本無(wú)紫杉醇,集中處理,回收溶劑;⑦7~23份流出液為第II部分,其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品A4.59克,其中含紫杉醇36.1%,即紫杉醇凈含量為1.66克,占原料中紫杉醇的14.79%;
⑧24~終止的流出液為第III部分,其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品B 11.98克,其中含紫杉醇56.2%,即紫杉醇凈含量為6.73克,占原料中紫杉醇的60.1%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量共為8.39克,占原料中紫杉醇的74.9%,即紫杉醇的一次性收率為74.9%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量平均為50.6%。
實(shí)施例8①原料樣品中紫杉醇含量為18.6%的紫杉醇粗產(chǎn)品120克,其中紫杉醇凈含量22.32克;②紫杉醇樣品原料溶于300毫升95%(V/V)極性溶劑乙醇中,然后加水至乙醇濃度為65%(V/V),樣品與乙醇水溶液重量比約為1比4.5;③與實(shí)施例1相同;④從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣,即將樣品溶液倒入層析柱中,調(diào)節(jié)層析柱出口閥門,控制層析柱內(nèi)溶液流速為1.2升/小時(shí);⑤與實(shí)施例1相同;⑥1~3份流出液為第I部分,其中基本無(wú)紫杉醇,集中處理,回收溶劑;⑦4~18份流出液為第II部分,其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品A 11.31克,其中含紫杉醇38.3%,即紫杉醇凈含量為4.33克,占原料中紫杉醇的19.41%;⑧19~終止的流出液為第III部分,其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品B 27.34克,其中含紫杉醇52.9%,即紫杉醇凈含量為14.46克,占原料中紫杉醇的64.8%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量共為18.79克,占原料中紫杉醇的84.2%,即紫杉醇的一次性收率為84.2%。
紫杉醇中間產(chǎn)品A和B中的紫杉醇凈含量平均為48.6%。
權(quán)利要求
1 一種從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法,包含下述步驟①紫杉醇含量為9~20%的紫杉醇粗產(chǎn)品為原料樣品;②用大孔吸附樹脂作固定相,大孔吸附樹脂與樣品的重量比為10比0.9~1.4;③用能與水混溶的、濃度為40~70%極性溶劑水溶液為流動(dòng)相;④用柱層析法分離純化紫杉醇,樣品溶液從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣;⑤流動(dòng)相洗脫時(shí),層析柱內(nèi)流出液流速為0.6~1.5升/小時(shí);⑥按時(shí)間分段收集經(jīng)層析后的流出液,每小時(shí)收集1份,至HPLC檢測(cè)紫杉醇濃度低于0.2毫克/毫升時(shí)終止;⑦流出液中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品A;⑧流出液中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品B。
2 如權(quán)利要求1所述的從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法,其特征為其中的所述的大孔吸附樹脂為AB-8、或D101、或D201、或AK-9。
3 如權(quán)利要求1或2所述的從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法,其特征為其中所述的極性溶劑為乙醇、或丙酮。
4 如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法,其特征為其中所述的極性溶劑水溶液的濃度為55~65%。
5 如權(quán)利要求4所述的從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法,其特征為其中所述的極性溶劑水溶液的濃度為58~62%。
6 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法,其特征為其中所述的大孔吸附樹脂與樣品的重量比為10比0.9~1.2。
7 如權(quán)利要求6所述的從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法,其特征為其中所述的大孔吸附樹脂與樣品的重量比為10比0.95~1.05。
8 如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法,其特征為其中所述的層析柱內(nèi)流出液流速為0.8~1.2升/小時(shí)。
9 如權(quán)利要求8所述的從紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化紫杉醇的方法,其特征為其中所述的層析柱內(nèi)流出液流速為0.9~1.1升/小時(shí)。
全文摘要
本法用大孔吸附樹脂如AB-8、D101、D201、AK-9作固定相,40~70%極性溶劑如乙醇、丙酮的水溶液為流動(dòng)相,柱層析法分離純化紫杉醇,流出液流速為0.6~1.5升/小時(shí),每小時(shí)收集1份,至紫杉醇濃度低于0.2毫克/毫升時(shí)終止,按時(shí)間分段收集流出液;流出液中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品A;流出液中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量,濃縮干燥得紫杉醇中間產(chǎn)品B。本法便于將9~20%的紫杉醇粗產(chǎn)品分離純化為40~60%的紫杉醇中間產(chǎn)品;一次性收率高達(dá)80%;操作安全,不使用易燃、易爆或有毒溶劑;上樣量大,大孔吸附樹脂與樣品的重量比高達(dá)10比0.9~1.5,是一般層析上樣量的15倍;可除去粗產(chǎn)品中的水溶性雜質(zhì)。
文檔編號(hào)C07D305/00GK1526708SQ0313591
公開日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2003年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月22日
發(fā)明者丁志堅(jiān), 徐位坤 申請(qǐng)人:丁志堅(jiān)