增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽(Growth?Inhibitory?Peptide-36，GIP-36)，其在普通型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽(Growth?Inhibitory?Peptide-34，GIP-34)的羧基端添加氨基酸GQ，以使其羧基端的GVGQ能夠形成類(lèi)似離子通道的結(jié)構(gòu)，易于其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而更易發(fā)揮生物學(xué)作用。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的不同類(lèi)型肝癌細(xì)胞，可以有針對(duì)性地使肝癌細(xì)胞發(fā)生大量凋亡而不傷及正常細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)和MTT實(shí)驗(yàn)均顯示增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽較之普通型生長(zhǎng)抑制肽抑癌效果具有明顯的增強(qiáng)作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，分子生物學(xué)技術(shù)，特別涉及一種增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制妝。
【背景技術(shù)】
[0002]肝癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一。死亡率高，在惡性腫瘤死亡順位中僅次于肺癌而居第二位，在部份地區(qū)的農(nóng)村中則占據(jù)第一位。我國(guó)肝癌占全球肝癌的一半以上，全球每年54.1萬(wàn)新發(fā)肝癌患者中有31.8萬(wàn)發(fā)生在中國(guó)。我國(guó)每年死于肝癌約11萬(wàn)人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。目前肝癌治療仍以手術(shù)切除為主，但術(shù)后多有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，死亡率居高不下。腫瘤的基因治療是從上個(gè)世紀(jì)后期開(kāi)始興起的新的生物治療手段，美國(guó)生物技術(shù)有關(guān)公司投資基因治療研究和臨床約10億美元，占總的研究經(jīng)費(fèi)的60%以上，我國(guó)在基因治療方面起步較晚，處于相對(duì)滯后狀態(tài)，肝癌基因治療尚未見(jiàn)成功的研究報(bào)道。且近十幾年的研究表明，血清中高AFP的肝癌病人，術(shù)后預(yù)后較之AFP低的病人要差很多，在分子機(jī)制方面，有研究表明AFP在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。而增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽從甲胎蛋白中衍生改造而來(lái)，與甲胎蛋白有極高的同源性，在發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的同時(shí)，可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制甲胎蛋白在胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，使作用效果倍增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]根據(jù)上述現(xiàn)有技術(shù)中所涉及的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種增強(qiáng)型的肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽。通過(guò)基因工程和分子生物學(xué)的手段將增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽和普通型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽克 隆到三重flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)，使用兩種質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的不同肝癌細(xì)胞系，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和MTT進(jìn)行檢測(cè)，確證增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑具有針對(duì)性殺滅肝癌細(xì)胞而不傷害正常細(xì)胞的特點(diǎn)，且作用效果遠(yuǎn)勝于普通型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽。且實(shí)驗(yàn)中還涉及到肺癌、前列腺癌、乳腺癌等細(xì)胞系，增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑對(duì)其他腫瘤細(xì)胞系也具有良好的殺傷作用，而普通型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑則不具備此特點(diǎn)。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽從肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物甲胎蛋白中衍生而出，較之其他外來(lái)藥物更不易發(fā)生排異反應(yīng)而更易于被細(xì)胞攝取吸收，在不殺傷正常細(xì)胞的情況下，可以高效地殺滅肝癌細(xì)胞。從甲胎蛋白高分泌的肝癌細(xì)胞中提取高質(zhì)量RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增普通生長(zhǎng)抑制肽片段，然后對(duì)其進(jìn)行改造，增加兩個(gè)氨基酸GQ，從而在羧基端可形成類(lèi)似離子通道的結(jié)構(gòu)，然后將兩片段分別克隆至帶有三重flag標(biāo)簽的pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入不同的肝癌細(xì)胞系中，培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，以流式細(xì)胞術(shù)觀察肝癌細(xì)胞的凋亡情況以判斷兩種肽分別的抑癌效果:
[0005]構(gòu)建帶有三重flag標(biāo)簽的普通型生長(zhǎng)抑制肽，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物:
[0006]Forward5' -CCAAGCTTGGCTCAGTGAGGACAAACT-3'[0007]Rewards' -GCTCTAGAGCAACACCAGGGTTTACTGGA-3 '，運(yùn)用 PCR 的方法擴(kuò)增普通型生長(zhǎng)抑制肽的序列，其序列如下:
[0008]普通型生長(zhǎng)抑制肽序列
[0009]CTCAGTGAGGACAAACTATTGGCCTGTGGCGAGGGAGCGGCTGACATTATTATCGGACACTTATGTATCAGACATGAAATGACTCCAGTAAACCCTGGTGTT
[0010]GIP-34蛋白質(zhì)序列
[0011 ] LSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEMTPVNPGV
[0012]構(gòu)建普通型生長(zhǎng)抑制肽用于對(duì)照，以凸顯出增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽的優(yōu)勢(shì)。
[0013]增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽，其特征是對(duì)普通型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽進(jìn)行改造，增加氨基酸序列，在肽段的羧基末端形成類(lèi)似離子通道的結(jié)構(gòu)，使得增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽更易在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，較之普通型提高了殺傷癌細(xì)胞的效率，同時(shí)還可以作用于肝癌細(xì)胞以外的諸如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等癌癥細(xì)胞，對(duì)它們均有殺傷作用。讓肝癌細(xì)胞特異性表達(dá)增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽，設(shè)計(jì)特殊引物，對(duì)普通型生長(zhǎng)抑制肽進(jìn)行氨基酸添加，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽的全序列，擴(kuò)增引物分別為:
[0014]Forward5' -CCAAGCTTGGCTCAGTGAGGACAAACT-3'
[0015]Rewards' -GCTCTAGAGCCTGGCCAACACCAGGGTTT-3'
[0016]增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽全序列
[0017]CTCAGTGAGGACAAACTATTGGCCTGTGGCGAGGGAGCGGCTGACATTATTATCGGACACTTATGTATCAGACATGAAATGACTCCAGTAAACCCTGGTGTTGGCCAG
[0018]GIP-36蛋白質(zhì)序列
[0019]LSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEMTPVNPGVGQ，將此序列克隆到真核表達(dá)載體。
[0020]增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽，可以通過(guò)體外化學(xué)合成，以水溶液的形式對(duì)肝癌細(xì)胞給藥，不同的肝癌細(xì)胞系給藥濃度范圍在10_6M~10_9M，給藥的時(shí)間為間隔給藥，在2d、4d、6d分別給藥，第7d收集細(xì)胞做MTT檢測(cè)，增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽可以有效抑制多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌等。
[0021]通過(guò)基因工程和分子生物學(xué)手段，將普通型生長(zhǎng)抑制肽和增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入不同的肝癌細(xì)胞系，使其在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄翻譯成生長(zhǎng)抑制肽，并發(fā)揮其生物學(xué)功能抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，使其發(fā)生凋亡。收集轉(zhuǎn)染36h后的肝癌細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和MTT對(duì)比觀察增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽的效果遠(yuǎn)勝于普通型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽。
[0022]采用本發(fā)明的增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽，可高效、特一性地殺滅肝癌細(xì)胞，而不傷及正常細(xì)胞。輔以其他治療手段可以為肝癌的治療開(kāi)辟一條新的途徑。同時(shí)增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽另一個(gè)普通型所無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)即，增強(qiáng)型還可以殺滅除肝癌細(xì)胞以為的其他癌癥細(xì)胞，包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌等等。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]1、圖1是在H印G2、HLE、PLC、HuH7、MCF-7、PC-3M等六個(gè)不同的癌細(xì)胞系中同時(shí)轉(zhuǎn)染vector、GIP-34和GIP-36后的流式細(xì)胞術(shù)顯示的細(xì)胞凋亡結(jié)果。
[0024]2、圖2是H印G2、HLE、PLC、HuH7、MCF-7、PC-3M等六個(gè)不同細(xì)胞系給予重組表達(dá)質(zhì)粒后的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的柱狀圖表示。[0025]3、圖 3 是在H印G2、HLE、PLC、HuH7、MCF-7、PC-3M、PG-BEl 等七個(gè)不同癌細(xì)胞系中直接給藥化學(xué)合成的GIP-34和GIP-36后的MTT結(jié)果柱狀圖表示。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0027]依照本發(fā)明的技術(shù)方案，從甲胎蛋白高分泌的肝癌細(xì)胞中提取高質(zhì)量RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增普通生長(zhǎng)抑制肽片段，然后對(duì)其進(jìn)行改造，增加兩個(gè)氨基酸，從而在碳端可形成類(lèi)似離子通道的結(jié)構(gòu)，然后將兩片段分別克隆至帶有三重flag標(biāo)簽的pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入不同的肝癌細(xì)胞系中，培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，以流式細(xì)胞術(shù)觀察肝癌細(xì)胞的凋亡情況以判斷兩種肽分別的抑癌效果:
[0028]構(gòu)建帶有三重flag標(biāo)簽的普通型生長(zhǎng)抑制肽，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物:
[0029]Forward5' -CCAAGCTTGGCTCAGTGAGGACAAACT-3'
[0030]Rewards' -GCTCTAGAGCAACACCAGGGTTTACTGGA-3 '，運(yùn)用 PCR 的方法擴(kuò)增普通型生長(zhǎng)抑制肽的序列，其序列如下:
[0031]普通型生長(zhǎng)抑制肽序列
[0032]CTCAGTGAGGA CAAACTATTGGCCTGTGGCGAGGGAGCGGCTGACATTATTATCGGACACTTATGTATCAGACATGAAATGACTCCAGTAAACCCTGGTGTT
[0033]GIP-34蛋白質(zhì)序列
[0034]LSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEMTPVNPGV
[0035]構(gòu)建普通型生長(zhǎng)抑制肽用于對(duì)照，以凸顯出增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽的優(yōu)勢(shì)。
[0036]增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽，其特征是對(duì)普通型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽進(jìn)行改造，增加氨基酸序列，在肽段的羧基末端形成類(lèi)似離子通道的結(jié)構(gòu)，使得增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽更易在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，較之普通型提高了殺傷癌細(xì)胞的效率，同時(shí)還可以作用于肝癌細(xì)胞以外的諸如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等癌癥細(xì)胞，對(duì)它們均有殺傷作用。讓肝癌細(xì)胞特異性表達(dá)增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽，設(shè)計(jì)特殊引物，對(duì)普通型生長(zhǎng)抑制肽進(jìn)行氨基酸添加，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽的全序列，擴(kuò)增引物分別為:
[0037]Forward5' -CCAAGCTTGGCTCAGTGAGGACAAACT-3'
[0038]Reward5' -GCTCTAGAGCCTGGCCAACACCAGGGTTT-3'
[0039]增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽全序列
[0040]CTCAGTGAGGACAAACTATTGGCCTGTGGCGAGGGAGCGGCTGACATTATTATCGGACACTTATGTATCAGACATGAAATGACTCCAGTAAACCCTGGTGTTGGCCAG
[0041]GIP-36蛋白質(zhì)序列
[0042]LSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEMTPVNPGVGQ，將此序列克隆到真核表達(dá)載體。
[0043]通過(guò)基因工程和分子生物學(xué)手段，將表達(dá)普通型生長(zhǎng)抑制肽和增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入不同的肝癌細(xì)胞系，使其在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄翻譯成生長(zhǎng)抑制肽，并發(fā)揮其生物學(xué)功能抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，使其發(fā)生凋亡。收集轉(zhuǎn)染36h后的肝癌細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果遠(yuǎn)勝于普通型生長(zhǎng)抑制肽。同時(shí)增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽也可以通過(guò)體外化學(xué)合成，以水溶液的形式對(duì)肝癌細(xì)胞給藥，不同的肝癌細(xì)胞系給藥濃度范圍在10_6M~10_9M，給藥的時(shí)間為間隔給藥，在2d、4d、6d分別給藥，第7d收集細(xì)胞做MTT檢測(cè)，增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽可以有效抑制多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌等。
[0044]本發(fā)明的增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽具有以下優(yōu)點(diǎn):(I)安全性，即該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞或者制劑以水溶液形式給藥都只殺傷肝癌細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)殺傷力作用；因?yàn)樵谡８渭?xì)胞中并不表達(dá)甲胎蛋白AFP，只有在發(fā)生癌變的細(xì)胞，已經(jīng)沉默的AFP基因才會(huì)重新啟動(dòng)編碼表達(dá)AFP，從而AFP也被一直用作肝癌的診斷標(biāo)志物。(2)靶向性，該生長(zhǎng)抑制肽從甲胎蛋白AFP衍生改造而來(lái)，與甲胎蛋白具有較高同源性，可以特異性地參與肝癌細(xì)胞中的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；(3)易吸收，該生長(zhǎng)抑制肽僅有36個(gè)氨基酸，分子量的大小不足5KD，不論是胞內(nèi)轉(zhuǎn)染還是體外給藥，都易于吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)；(4)滅癌高效性，它可以通過(guò)a、使細(xì)胞由S期-G2期發(fā)生阻滯b、防止細(xì)胞周期抑制劑降解C、保護(hù)P53不被磷酸化而失活d、阻斷由雌二醇和表皮生長(zhǎng)因子所打開(kāi)的K+通道等途徑來(lái)促使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0045]實(shí)施例1
[0046](一 )分別構(gòu)建帶有三重flag標(biāo)簽的普通型和增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽，并確保其在真核細(xì)胞中表達(dá)。
[0047]1、從甲胎蛋白高分泌的肝癌細(xì)胞中提取高質(zhì)量RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增普通型生長(zhǎng)抑制肽的序列。再將其克隆到帶有flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染進(jìn)入培養(yǎng)的不同類(lèi)型的肝癌細(xì)胞中，提取總蛋白，使用flag標(biāo)簽抗體檢測(cè)，證明該短肽在細(xì)胞中表達(dá)良好。
[0048]2、以普通 型生長(zhǎng)抑制肽為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)原生長(zhǎng)抑制肽進(jìn)行改造，在其羧基端增加甘氨酸和谷氨酰胺，從而使末端的GVGQ易于成形一個(gè)類(lèi)似于離子通道的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其在細(xì)胞內(nèi)的作用效果。同樣轉(zhuǎn)染不同癌細(xì)胞，提取總蛋白，使用flag標(biāo)簽抗體檢測(cè)，證實(shí)增強(qiáng)型抑制肽在細(xì)胞中表達(dá)良好。
[0049]3、化學(xué)合成純品普通型和增強(qiáng)型癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽，以水溶液形式給培養(yǎng)的癌細(xì)胞加藥。
[0050]( 二)以流式細(xì)胞術(shù)對(duì)比檢測(cè)，觀察普通型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽和增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽在促進(jìn)細(xì)胞凋亡的差異。
[0051]a、將兩種質(zhì)粒以及空載分別轉(zhuǎn)染進(jìn)培養(yǎng)的不同種類(lèi)肝癌細(xì)胞中，收取30h后的細(xì)胞。
[0052]b、用胰酶消化(切忌消化過(guò)度)，加入血清終止反應(yīng)，吧細(xì)胞吹散成細(xì)胞懸液。
[0053]c、3000rpm x5min,棄上清，沉淀用預(yù)冷的 PBS洗漆兩次，Iml PBS, 1000rpm x4min,
棄上清。
[0054]d、加入300ul預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再緩慢加入預(yù)冷(_20°C )的無(wú)水乙醇700 μ 1，4°C固定過(guò)夜(最長(zhǎng)可至兩周)*此步中可在PBS中加入1%無(wú)血清1640培養(yǎng)基，防止細(xì)胞粘連
[0055]e> 1000rpm x4min,棄上清，用預(yù)冷的 PBS 洗漆兩次，lml, 1000rpm x4min。
[0056]f、用已添加RNase的PBS (PBS =RNase = 500:1)將細(xì)胞調(diào)至合適濃度(一般500 μ I) ο 37。。，30min,消化 RNA。
[0057]g、過(guò)300目細(xì)胞篩,將過(guò)細(xì)胞篩的溶液轉(zhuǎn)移至tube管中。[0058]h、加入PI (終濃度調(diào)整為50 μ g/ml)冰浴染色30min或室溫IOmin (避光)。
[0059]流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)顯示:在H印G2、HLE、PLC、HuH7 (以上四種均為肝癌細(xì)胞系)、MCF-7(乳腺癌細(xì)胞)、PC-3M(前列腺癌細(xì)胞)等不同細(xì)胞系中，增強(qiáng)型生長(zhǎng)抑制肽(GIP-36)較之普通型(GIP-34)所引起的凋亡率絕對(duì)量分別上升19.01%、19.77%,17.5%, 18.46 %、12.97 %、12.38 % ;而凋亡率的相對(duì)增長(zhǎng)率則分別上升高達(dá)204.6 %、319.9%、152.0%、262.2%、14L 0%、145.5%，增強(qiáng)型較之普通型在促進(jìn)細(xì)胞凋亡上表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。在說(shuō)明書(shū)附圖中有流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果和數(shù)據(jù)的表格(表1)及柱狀圖分析(圖2)。
[0060]
【權(quán)利要求】
1.增強(qiáng)型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽，其特征在于，所述抑制肽的序列如下所示: LSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEMTPVNPGVGQ。
2.編碼權(quán)利要求1所述生長(zhǎng)抑制肽的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2所述核苷酸序列的表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求3所述載體，其特征在于所述載體為真核表達(dá)載體。
5.構(gòu)建權(quán)利要求1所述生長(zhǎng)抑制肽的方法，其特征在于: a)從分泌甲胎蛋白的肝癌細(xì)胞中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增獲得普通型肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制肽核苷酸序列； b)在普通型生長(zhǎng)抑制肽核苷酸序列的羧基端添加氨基酸GQ的編碼序列； c)將步驟b)獲得的核苷酸序列構(gòu)建入載體，真核表達(dá)； d)引物序列為
Forward5' -CCAAGCTTGGCTCAGTGAGGACAAACT-3'
Reward5' -GCTCTAGAGCAACACCAGGGTTTACTGGA-3'； e)普通型生長(zhǎng)抑制肽序列為
CTCAGTGAGGACAAACTATTGGCCTGTGGCGAGGGAGCGGCTGACATTATTATCGGACACTTATGTATCAGACATGAAATGACTCCAGTAAACCCTGGTGTT。
6.權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟b)是通過(guò)特異引物設(shè)計(jì)進(jìn)行羧基端添加氨基酸GQ的編碼序列的，所述特異引物序列為:
Forward5' -CCAAGCTTGGCTCAGTGAGGACAAACT-3'
Reward5' -GCTCTAGAGCCTGGCCAACACCAGGGTTT-3'。
7.權(quán)利要求1所述抑制肽在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述癌為肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌。
9.含有權(quán)利要求1所述抑制肽的藥物，其特征在于所述藥物包括權(quán)利要求1所述抑制肽及藥學(xué)上可接受的載體。
10.權(quán)利要求3或4所述載體在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK103965344SQ201410166756
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】張超, 蔣衛(wèi), 李慧, 侯雯婷, 李剛 申請(qǐng)人:北京大學(xué)