源于油菜花粉的具有ace抑制活性的多肽化合物及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽LAVNLIPFP制備抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)及降血壓中的應 用。
【背景技術】
[0002] 高血壓藥物研究的一個祀點是抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE)，ACE是存在于血管內(nèi)皮細胞、上皮吸收細胞、神經(jīng)上皮細胞、雄性生殖細胞中 的一種含鋅的二肽羧酶。在人體腎素一血管緊張素系統(tǒng)（RAS)和激肽酶釋放酶一激肽系 統(tǒng)（KKS)中，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE)對機體血壓和心血管功能起著重要的調(diào)節(jié)作用（如圖 1)。在RAS中，ACE是起限速作用，ACE可將不具活性的十肽血管緊張素I轉(zhuǎn)化為具有強烈收 縮血管作用的八肽血管緊張素II，同時血管緊張素II還能刺激醛固酮的分泌進而促進腎 臟對水、鈉、鉀的重吸收，引起鈉貯量和血容量的增加，使血壓升高。在KKS中，ACE還能催化 與心血管系統(tǒng)具有相互作用的神經(jīng)肽、腦啡肽和P物質(zhì)等的降解。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE) 抑制劑是目前常規(guī)應用的六大類降壓藥物之一，ACE抑制劑不僅僅用于治療高血壓，同時已 證實可以防止心力衰竭，減少心肌梗死、腦卒中、糖尿病和腎損害發(fā)生的危險。ACE抑制劑 對心血管疾病的防治具有兩個明顯的特征：確切的降壓療效和獨特的心臟及血管保護。ACE 抑制劑可能通過阻止心房的電重構和解剖重構，預防了心房纖顫(房顫，AF)的發(fā)生。多肽是 一類重要的ACE抑制劑，天然蛋白質(zhì)的酶解肽是ACE抑制劑肽的主要來源(文獻2 :LieSel〇t Vercruysse1JohnVanCamp,GuySmagghe,J.Agric.FoodChem2005, 53:8106-8115)。血管 緊張素轉(zhuǎn)化酶對于機體血壓和心血管功能起著重要的調(diào)節(jié)作用，因此抑制ACE活性的藥物 在心血管、心力衰竭等疾病的治療中發(fā)揮重要作用。多肽類的ACE抑制劑在降血壓的同時 不會引起常見降壓藥物的干咳等副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供多肽LAVNLIPFP在抑制ACE活性中的應用；多肽LAVNLIPFP 具有ACE抑制活性，作為高血壓、心臟病和心血管病的保健品和藥物先導化合物具有良好 的應用前景。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以所述多肽LAVNLIPFP為抑制ACE活性的有效成份。
[0005] 其具有序列表SEQIDNO: 1中氨基酸序列；多肽LAVNLIPFP為ACE抑制劑的活性 成份，其中可添加藥物學上可接受的載體或輔料。
[0006] 具有抑制ACE活性的多肽化合物LAVNLIPFP的氨基酸序列為Leu-Ala-Val-Asn-Le u-IIe-Pro-Phe-Pro。單鏈線性結構，分子量為983. 2Da，白色粉末狀，易溶于水，對ACE活性 具有很強的抑制作用，IC5tl為23. 3iiM。
[0007] 多肽LAVNLIPFP具備ACE抑制劑所要求的特征：
[0008]I.ACE傾向于C末端三肽的每個位置含有疏水性氨基酸的底物或抑制劑，C末端為 Try，Phe，Tyr和Pro而N端為支鏈氨基酸的肽段具有較強的ACE抑制活性。多肽LAVNLIPFP 的C末端三肽均為疏水性氨基酸分別為Pro、Phe和Pro,C末端為Pro,N末端為帶有支鏈 的氨基酸Leu，因此完全滿足ACE抑制劑的構象要求。
[0009] 2.肽的疏水性是影響其抑制活性的重要原因，抑制活性高的肽都含有較多的疏水 氨基酸。多肽LAVNLIPFP的疏水氨基酸有Ala，Val，Leu，Phe，lie，Pro,含有較多的疏水氨 基酸。
[0010]經(jīng)ACE抑制活性檢測，多肽LAVNLIPFP的IC5tl為23. 3i!M。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下有益效果：
[0012] 本發(fā)明首次從油菜花粉中獲得并確定了活性化合物的結構，化合物具有較好的抑 制ACE的活性，因此作為治療高血壓、心臟病等心血管疾病藥物和保健品的先導化合物具 有良好的潛力和應用前景。
【附圖說明】
[0013] 圖IACE對血壓的調(diào)節(jié)作用框圖。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1多肽LAVNLIPFP的制備
[0015] 20g油菜蜂花粉加入液氮研磨破壁后，加入pH=7. 4、50mMTris-HCl緩沖液150ml, 超聲提取三次(一次：400W，超聲4s，停4s，80個循環(huán)）；提取結束后于4°C、25000g離心lh， 取上清液，加入上清液4倍體積的混合溶劑(丙酮：乙醇：乙酸=50:50:0. 1 (體積比））沉淀 過夜；沉淀結束后將所有樣品于4°C、25000g離心30分鐘，棄去上清，取沉淀用丙酮洗滌脫 色，然后于4°C、25000g離心15分鐘，棄去上清，沉淀繼續(xù)用丙酮反復洗滌直至上清無色，最 后用體積濃度75%乙醇洗滌沉淀并于4°C、25000g離心10分鐘，棄上清，取沉淀物冷凍干 燥，得凍干蛋白。凍干蛋白用含有8M尿素的pH=7.4、100mMNH4HC03緩沖液復溶，以酶：蛋 白=1:25 (w/w)比例加入胰蛋白酶，37°C酶解20小時。上述酶解產(chǎn)物經(jīng)制備色譜分離，色 譜柱為C18 (20X250mm，10iim)，所用的流動相A為質(zhì)量濃度0. 1%甲酸/水溶液，流動相 B為質(zhì)量濃度0. 1%的甲酸/乙腈溶液，流速為2mL/min，洗脫過程如下：5%B- 35%B(V/V) - 80%B(V/V)。將在280nm下所檢測到的色譜峰分別收集得到的不同組分冷凍干燥，為乳白色 粉末狀樣品。
[0016] 所得樣品經(jīng)反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（RPLC-MS/MS)分析：將冷凍干燥后的酶 解樣品用體積濃度〇. 1%甲酸溶液配制為〇.4yg/yL，進樣20yL進行LTQ線性離子阱質(zhì)譜 (配置納升級電噴霧源)分析。利用Xcalibur軟件（Thermo)進行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)收集。實 驗得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)結果分別在honeybee,BrassicacampestrisL.蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http:// www.uniprot.org/)中進行檢索，技術重復3次，數(shù)據(jù)庫檢索軟件為SEQUEST。獲得序列為 Leu-Ala-Val-Asn-Leu-IIe-Pro-Phe-Pro的多膚。
[0017] 實施例2多肽LAVNLIPF的ACE抑制活性檢測
[0018]ACE在37°C、PH8. 3的條件下催化分解血管緊張素I的模擬底物Hippuryl-L-His tidyl-L-Leucine(HHL)產(chǎn)生馬尿酸，該物質(zhì)在228nm處有特征紫外吸收峰。當加入ACE抑 制物時，ACE對HHL的催化作用受到抑制，馬尿酸的生成量會減少。通過測定加入抑制劑前 后的馬尿酸紫外吸收值可以計算出抑制活性的大小。
[0019] 反應體系
[0020]緩沖液為 0? 05M，PH8. 3 硼酸鹽緩沖液；底物為Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine (HHL)，MW429. 47,用上述緩沖液配成 5mM;ACE(angiotensin-convertingenzyme)用上述 緩沖液配成〇.lU/ml。
[0021] ODa(對照組，為不存在抑制劑但存在酶時的吸光值):50ill緩沖液+50ulHHL+50ill 緩沖液于37°C水浴5min，然后加入50iUACE，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl終止 反應，再加入Iml乙酸乙酯萃取產(chǎn)物馬尿酸，振蕩15S，3500r/min離心5min，取0. 8ml上清， 90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為0Da。
[0022] ODb (多肽樣品組，為存在抑制劑和酶時的吸光值）：50ill樣品+50iilHHL+50ill 緩沖液于37°C水浴5min，然后加入50illACE，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl終 止反應，再加入Iml乙酸乙酯萃取產(chǎn)物馬尿酸，振蕩15S，3500r/min離心5min，取0. 8ml上 清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為0Db。
[0023] 0DC(空白組，為不存在抑制劑和酶時的吸光值):50ill緩沖液+50iilHHL+50ill緩 沖液于37°C水浴5min，然后加入50ill緩沖液，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl終 止反應，再加入Iml乙酸乙酯萃取產(chǎn)物馬尿酸，振蕩15S，3500r/min離心5min，取0. 8ml上 清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為0DC。
[0024]ACE抑制率（％)= (ODa-ODb)AODa-ODc)X100%
[0025]分別用 0? 5mg/ml, 0?lmg/ml, 0?Olmg/ml, 0? 001mg/ml，0? 0001mg/ml的多膚濃度， 按上述方法進行ACE抑制活性檢測。結果如下表：
[0026]
【主權項】
1. 源于油菜花粉的具有ACE抑制活性的多肽化合物，其特征在于：所述多肽為 LAVNLIPFP，具有序列表SEQ ID NO :1中氨基酸序列；該多肽的氨基酸序列具體為，Leu-Ala -Val-Asn-Leu-IIe-Pro-Phe-Pro〇
2. -種權利要求1所述多肽在制備ACE抑制劑或心血管藥物中的應用。
3. 按照權利要求2所述的應用，其特征在于：所述ACE抑制劑及降血壓藥物是以多肽 LAVNLIPFP為活性成份，其中可添加藥物學上可接受的載體或輔料。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種源于油菜花粉的具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting？enzyme,ACE）活性的多肽化合物LAVNLIPFP，其氨基酸序列分別為Leu-Ala-Val-Asn-Leu-IIe-Pro-Phe-Pro。多肽LAVNLIPFP具有ACE抑制活性，作為高血壓、心臟病和心血管病的保健品和藥物先導化合物具有良好的應用前景。
【IPC分類】A61P9-00, A61P9-12, A61K38-08, C07K7-06
【公開號】CN104558109
【申請?zhí)枴緾N201310497239
【發(fā)明人】鄒漢法, 靳艷, 郭靜
【申請人】中國科學院大連化學物理研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月21日