專(zhuān)利名稱(chēng)：油菜花粉中抗前列腺癌有效成分的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在油菜花粉中提取抗前列腺癌有效成分的方法。
背景技術(shù)：
油菜花粉是一種含有豐富營(yíng)養(yǎng)素和眾多生理活性成分的天然產(chǎn)物。80年代以來(lái)，油菜花粉營(yíng)養(yǎng)藥理學(xué)作用的研究和作為保健品與藥品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用得到迅速發(fā)展。許多臨床實(shí)驗(yàn)證明，油菜花粉及其粗提物對(duì)多種前列腺疾病具有良好的治療效果，但所需劑量很大。主要原因在于花粉及其粗提物中有效作用成分含量很低，少量服用效果不明顯。為了解決這一問(wèn)題，許多學(xué)者進(jìn)行了研究，并基本解決了花粉的破壁問(wèn)題。但是對(duì)于破壁后有效成分的提取，特別是防治前列腺癌的有效成分的提取未有相關(guān)專(zhuān)利和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種工藝簡(jiǎn)單、效果好的油菜花粉中抗前列腺癌有效成分的提取方法。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過(guò)這樣的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的提供一種油菜花粉中抗前列腺癌有效成分的提取方法，此方法的提取步驟依次如下1)浸提在油菜花粉破壁液中加入8-12倍體積的4-6％蔗糖溶液，浸提4-6小時(shí)，真空抽濾，分別得液體A和濾渣；在所述濾渣中加入5-8倍體積的5％蔗糖溶液，浸提4-6小時(shí)，真空抽濾，得液體B和殘?jiān)?)層析分離合并所述液體A和液體B，用濃氨水調(diào)節(jié)pH至5.8-6.0；上大孔樹(shù)脂柱，接著用去離子水洗脫，至無(wú)色，再用45％堿性乙醇洗脫、收集。
將層析分離步驟后的產(chǎn)物進(jìn)行減壓濃縮、噴干。
45％堿性乙醇是用濃氨水調(diào)濃度為45％乙醇至PH為9.0-10.0。
用本發(fā)明的方法所提取的有效成分，抗前列腺癌效果非常好，具體實(shí)驗(yàn)方式及數(shù)據(jù)如下。培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞PC-3，用MTT法測(cè)定所得油菜花粉有效成分對(duì)前列腺癌生長(zhǎng)的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-3細(xì)胞，接種于96孔板，每孔190μl，細(xì)胞密度約為105個(gè)/孔，每孔設(shè)只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的平行對(duì)照，培養(yǎng)48小時(shí)后，分別留6個(gè)加入細(xì)胞和加入純培養(yǎng)液的培養(yǎng)孔作陽(yáng)性和陰性對(duì)照，其余每孔加入不同濃度所得有效成分10μl，對(duì)照孔加入10μl培養(yǎng)液。每種藥物每一濃度設(shè)14個(gè)重復(fù)。加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，取出后每孔加入20μl MTT，放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。取出96孔板，2000rpm離心10分鐘，盡量去掉孔內(nèi)液體，注意不要將里面的紫色結(jié)晶倒出，每孔加入150μl DMSO，迅速用水平振蕩器搖動(dòng)，使孔內(nèi)紫色結(jié)晶物充分溶解，但時(shí)間不得超過(guò)30分鐘，然后用酶標(biāo)儀讀取490nm處的吸光度值。每孔的吸光度值減去并列平行孔的吸光度值，得到絕對(duì)吸光度值，陽(yáng)性對(duì)照減去陰性對(duì)照吸光度值，為正常細(xì)胞的絕對(duì)吸光度值，將正常細(xì)胞存活率設(shè)為100％，各孔絕對(duì)吸光度值與正常細(xì)胞絕對(duì)吸光度值之比為各自的細(xì)胞存活率，得IC50為1.5mg/ml。
且本發(fā)明的提取方法，所需要的設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低，易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化；生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)捷、易操作；生產(chǎn)周期短，得率高。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1一種油菜花粉中抗前列腺癌有效成分的提取方法，此方法的提取步驟依次如下1)、浸提在油菜花粉破壁液中加入8倍體積的5％蔗糖溶液，浸提4小時(shí)，真空抽濾，分別得液體A和濾渣；在所述濾渣中加入5倍體積的5％蔗糖溶液，浸提4小時(shí)，真空抽濾，得液體B和殘?jiān)?)、層析分離合并所述液體A和液體B，用濃氨水調(diào)節(jié)pH至5.8，得混合液體；將上述混合液體上大孔樹(shù)脂柱，使混合液體中的有效成分吸附于大孔樹(shù)脂，接著用去離子水洗脫，至無(wú)色；再用45％堿性乙醇進(jìn)行洗脫、收集。此45％堿性乙醇是用濃氨水調(diào)濃度為45％乙醇至PH為9.8。
3)、將層析分離步驟后的產(chǎn)物進(jìn)行減壓濃縮、噴干。
用此種方法提取的有效成分，其抗前列腺癌效果為癌細(xì)胞IC50為1.2mg/ml。
實(shí)施例2一種油菜花粉中抗前列腺癌有效成分的提取方法，此方法的提取步驟依次如下1)、浸提在油菜花粉破壁液中加入10倍體積的5％蔗糖溶液，浸提6小時(shí)，真空抽濾，分別得液體A和濾渣；在所述濾渣中加入5-8倍體積的5％蔗糖溶液，浸提6小時(shí)，真空抽濾，得液體B和殘?jiān)?)、層析分離合并所述液體A和液體B，用濃氨水調(diào)節(jié)pH至6.0，得混合液體；將上述混合液體上大孔樹(shù)脂柱，使混合液體中的有效成分吸附于大孔樹(shù)脂，接著用去離子水洗脫，至無(wú)色；再用45％堿性乙醇進(jìn)行洗脫、收集。此45％堿性乙醇是指用濃氨水調(diào)濃度為45％乙醇至PH為10.0所得。
3)、將層析分離步驟后的產(chǎn)物進(jìn)行減壓濃縮、噴干。
用此種方法提取的有效成分，其抗前列腺癌效果為癌細(xì)胞IC50為1.5mg/ml。
實(shí)施例3一種油菜花粉中抗前列腺癌有效成分的提取方法，此方法的提取步驟依次如下1)、浸提在油菜花粉破壁液中加入12倍體積的5％蔗糖溶液，浸提5小時(shí)，真空抽濾，分別得液體A和濾渣；在所述濾渣中加入5倍體積的5％蔗糖溶液，浸提5小時(shí)，真空抽濾，得液體B和殘?jiān)?)、層析分離合并所述液體A和液體B，用濃氨水調(diào)節(jié)pH至5.9，得混合液體；將上述混合液體上大孔樹(shù)脂柱，使混合液體中的有效成分吸附于大孔樹(shù)脂，接著用去離子水洗脫，至無(wú)色；再用45％堿性乙醇進(jìn)行洗脫、收集。此45％堿性乙醇是指用濃氨水調(diào)濃度為45％乙醇至PH為9.0所得。
3)、將層析分離步驟后的產(chǎn)物進(jìn)行減壓濃縮、噴干。
用此種方法提取的有效成分，其抗前列腺癌效果為癌細(xì)胞IC50為1.1mg/ml。
以上所述僅為本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施方式
，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，還可以作出許多變型和改進(jìn)，例如改變蔗糖溶液的濃度，所有的變型或改進(jìn)均應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種油菜花粉中抗前列腺癌有效成分的提取方法，其特征在于它的提取步驟依次如下1)浸提在油菜花粉破壁液中加入8-12倍體積的4-6％蔗糖溶液，浸提4-6小時(shí)，真空抽濾，分別得液體A和濾渣；在所述濾渣中加入5-8倍體積的5％蔗糖溶液，浸提4-6小時(shí)，真空抽濾，得液體B和殘?jiān)?)層析分離合并所述液體A和液體B，用濃氨水調(diào)節(jié)pH至5.8-6.0；上大孔樹(shù)脂柱，接著用去離子水洗脫，至無(wú)色，再用45％堿性乙醇洗脫、收集。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油菜花粉中抗前列腺癌有效成分的提取方法，其特征在于它的提取步驟依次如下1)浸提在油菜花粉破壁液中加入10倍體積的5％蔗糖溶液，浸提5小時(shí)，真空抽濾，分別得液體A和濾渣；在所述濾渣中加入5倍體積的5％蔗糖溶液，浸提5小時(shí)，真空抽濾，得液體B和殘?jiān)?)層析分離合并所述液體A和液體B，用濃氨水調(diào)pH至6.0；上大孔樹(shù)脂柱，接著用去離子水洗脫，至無(wú)色，再用45％堿性乙醇洗脫、收集。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的油菜花粉中抗前列腺癌有效成分的提取方法，其特征在于將層析分離步驟后的產(chǎn)物進(jìn)行減壓濃縮、噴干。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的油菜花粉中抗前列腺癌有效成分的提取方法，其特征在于所述45％堿性乙醇是用濃氨水調(diào)濃度為45％乙醇至PH為9.0-10.0。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了油菜花粉中提取抗前列腺癌有效成分的方法，此方法的提取步驟依次如下1)浸提在油菜花粉破壁液中加入8－12倍體積的4－6％蔗糖溶液，浸提4－6小時(shí)，真空抽濾，分別得液體A和濾渣；在所述濾渣中加入5－8倍體積的5％蔗糖溶液，浸提4－6小時(shí)，真空抽濾，得液體B和殘?jiān)?)層析分離合并所述液體A和液體B，用濃氨水調(diào)節(jié)pH至5.8－6.0；上大孔樹(shù)脂柱，接著用去離子水洗脫，至無(wú)色，再用45％堿性乙醇洗脫、收集。用本發(fā)明的方法所提取的有效成分，抗前列腺癌效果非常好；且本方法所需設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)捷、易操作、生產(chǎn)周期短、得率高。
文檔編號(hào)A61P13/00GK1557420SQ20041001636
公開(kāi)日2004年12月29日 申請(qǐng)日期2004年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月13日
發(fā)明者沈生榮, 于海寧, 白驊, 許重陽(yáng) 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)