Pcbp1基因制備放療增敏試劑盒的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了PCBP1基因在制備放療增敏試劑盒中的應(yīng)用，具體涉及PCBP1基因在制備包括重離子射線在內(nèi)的電離輻射作為腫瘤放療增敏試劑盒中的應(yīng)用。其中所述PCBP1基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1，其構(gòu)建在真核表達(dá)質(zhì)粒中。PCBP1協(xié)同重離子束，調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)的CD44v6基因表達(dá)，抑制了HeLa腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲；顯著下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1，促使細(xì)胞發(fā)生G0／G1期阻滯，增加HeLa細(xì)胞中對(duì)輻射敏感性；此外，上調(diào)促凋亡蛋白Tap73、線粒體凋亡通路MCL表達(dá)，下調(diào)抑制凋亡DelNp73蛋白，誘發(fā)更多HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。
【專利說(shuō)明】PCBP1基因制備放療增敏試劑盒的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多聚胞啼陡結(jié)合蛋白I (poly C binding proteinl，PCBPl，或 heterogeneous nuclear ribonuclear protein El, hnRNP El 或 a-complex proteinl, a CPI)基因的新用途，具體涉及PCBPl基因在制備放療增敏藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是我國(guó)常見(jiàn)的女性生殖道惡性腫瘤之一。宮頸癌發(fā)病率已成為大中城市中 死亡率增長(zhǎng)最快的癌癥，且發(fā)病年齡表現(xiàn)為逐漸年輕化，已成為嚴(yán)重危害我國(guó)婦女健康的 疾病之一。
[0003] 放射治療是腫瘤治療的常規(guī)手段之一，70%?80%的惡性腫瘤患者在治療過(guò)程中 需接受放療。同化療一樣，放療還是重要的姑息治療手段。依據(jù)循證醫(yī)學(xué)的資料嚴(yán)格估算， 52%的腫瘤患者在其腫瘤治療過(guò)程中會(huì)接受至少一次放射治療。常規(guī)外照射對(duì)各類實(shí)體腫 瘤的局控率是不相同的，同一病理類型腫瘤放療的有效率也不一致。臨床上將其主要?dú)w因 于腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在放射抵抗性、放射后腫瘤細(xì)胞加速再增殖、總體腫瘤負(fù)荷和氧合狀態(tài)等 因素。如何提高放射治療療效已成為放療領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)話題，藥物增敏已有多年的歷史， 但其療效和穩(wěn)定性方面一直不是很理想。由于分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，腫瘤基因放射治 療是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的具有良好前景的抗腫瘤治療新方法。該方法是將放射治療與基因治 療聯(lián)合起來(lái)應(yīng)用于腫瘤治療。在對(duì)腫瘤實(shí)施局部放療的同時(shí)誘導(dǎo)治療基因的表達(dá)，射線和 基因?qū)δ[瘤形成聯(lián)合殺傷。基因放射治療具有提商腫瘤治療基因的局部表達(dá)量、降低有效 照射劑量、減輕受照部位正常組織的放射損傷等諸多優(yōu)點(diǎn)。而該方法面臨的難題之一是如 何篩選到輻射敏感相關(guān)的靶基因。將放射治療與基因治療相結(jié)合，事半功倍，已成為腫瘤治 療研究的重要方向之一。因此開(kāi)展新的基因的研究是當(dāng)前惡性腫瘤基因-放射治療的研究 重點(diǎn)之一。
[0004] 近年來(lái)，多聚胞啼陡結(jié)合蛋白I (poly C binding proteinl, PCBP1,或 heterogeneous nuclear ribonuclear protein El, hnRNP El 或 a-complex proteinl, a CPI)的研究進(jìn)展為我們這項(xiàng)發(fā)明的提出提供了契機(jī)。PCBPl功能多樣，在多個(gè)水平廣泛 參與了基因的表達(dá)調(diào)控，調(diào)控的靶基因涉及細(xì)胞增殖、物質(zhì)代謝、細(xì)胞分化、造血調(diào)控、胚胎 發(fā)育和病毒復(fù)制等多方面，它的異常會(huì)引起這些靶基因的表達(dá)水平的改變，從而導(dǎo)致如腫 瘤等。目前，國(guó)內(nèi)外科研工作者對(duì)RNA結(jié)合蛋白，尤其是對(duì)PCBPl的研究取得了一些初步的 進(jìn)展。通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了 8個(gè)PCBPl相互作用蛋白，提示這些PCBPl可能參與細(xì) 胞周期、白噬、免疫應(yīng)答等過(guò)程[酵母雙雜交系統(tǒng)3篩選人源核不均一核糖核蛋白El的功 能伙伴.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù).2010年第14期]。PCBPl或其保守序列未發(fā)生變 化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制備預(yù)防或治療帕金森病藥物中具有 重要的應(yīng)用[參見(jiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?01210555379. 3的發(fā)明專利申請(qǐng)，其發(fā)明名稱為"多聚胞嘧啶 結(jié)合蛋白1在制備預(yù)防及治療帕金森病藥物中的應(yīng)用"]。在慢性粒細(xì)胞白血病急性發(fā)作 期BCR / ABL融合基因的表達(dá)增高，導(dǎo)致PCBPl蛋白水平升高。而PCBPl能夠抑制該基因 的表達(dá)，最終抑制細(xì)胞分化，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。PCBPl可參與STAT3介導(dǎo)的對(duì)NF-κ B活化通 路的抑制作用，有利于細(xì)胞處于抗凋亡狀態(tài)[核不均一核糖核蛋白（hnRNPs)與腫瘤關(guān)系的 研究進(jìn)展.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2007年第35期]。在人肝癌細(xì)胞中，PCBPl調(diào)控細(xì)胞表面粘 連分子CD44基因的選擇性剪接[PCBP1調(diào)控人肝癌細(xì)胞CD44選擇性剪接參與的腫瘤細(xì)胞 的侵襲.FEBSLett. 2012年第586期，第10卷，頁(yè)碼：431-438]。Cancer Cell上發(fā)表文章， PCBPl調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)[PCBP1抑制和腫瘤侵襲相關(guān)的PRL-3蛋白磷酸化.Cancer Cell. 2010年第18期，第1卷，頁(yè)碼：52-62]。這些研究的發(fā)現(xiàn)給大家提供了治療腫瘤疾病 的新線索。通過(guò)調(diào)節(jié)這些能夠與腫瘤相關(guān)基因的mRNA3或者5非編碼區(qū)相結(jié)合的PCBPl蛋 白，抑止或者上調(diào)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)水平而達(dá)到阻礙腫瘤疾病的發(fā)生與發(fā)展的目的。那 么PCBPl是否是一個(gè)新的腫瘤增敏的靶標(biāo)？這方面的研究目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本研究率 先展開(kāi)直接將PCBPl在人的宮頸癌細(xì)胞HeLa中過(guò)表達(dá)，研究該基因在輻射增敏中的作用， 從而可望提高宮頸癌病人的生存率。因此，本發(fā)明提供了 PCBPl基因制備放療增敏藥物的 潛在應(yīng)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供PCBPl (poly C binding proteinl，多聚胞啼陡結(jié)合蛋白1)基 因的新功能，即PCBPl基因在制備放療增敏試劑盒中的應(yīng)用。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是=PCBPl基因在制備放療增敏試劑盒 中的應(yīng)用。具體地，脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3-PCBP1在制備放療增敏試劑盒中的 應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)一種放療增敏試劑盒，所述放療增敏試劑盒的活性成分包括 攜帶PCBPl基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述攜帶PCBPl基因的真核 表達(dá)質(zhì)粒為脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3-PCBP1。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-PCBP 1增強(qiáng)腫 瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感性的方法。所述方法包括：放療前將脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3-PCBPl導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，使PCBPl基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，然后進(jìn)行放療。
[0009] 上述技術(shù)方案中，真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3_PCBPl的制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，可以參見(jiàn) 文獻(xiàn)：張林、侯艷紅、王孟薇、吳本儼、李楠.中華腫瘤防治雜志.2008 (16)。
[0010] 其中所述的PCBPl基因來(lái)源于人，基因文庫(kù)中的標(biāo)號(hào)為NM006196。其基因序列為：
[0011] atggatgccggtgtgactgaaagtggactaaatgtgactctcaccattcggcttcttatgcacggaaag gaagtaggaagcatcattgggaagaaaggggagtcggttaagaggatccgcgaggagagtggcgcgcggatcaacat ctcggaggggaattgtccggagagaatcatcactctgaccggccccaccaatgccatctttaaggctttcgctatga teatcgacaagctggaggaagatatcaacagctccatgaccaacagtaccgcggccagcaggcccccggtcaccctg aggctggtggtgccggccacccagtgcggctccctgattgggaaaggcgggtgtaagatcaaagagatccgcgagag tacgggggcgcaggtccaggtggcgggggatatgctgcccaactccaccgagcgggccatcaccatcgctggcgtgc cgcagtctgtcaccgagtgtgtcaagcagatttgcctggtcatgctggagacgctctcccagtctccgcaagggaga gtcatgaccattccgtaccagcccatgccggccagctccccagtcatctgcgcgggcggccaagatc ggtgcagc gac gctgc gggctacccccatgccacccatgacctggagggaccacctctagatgcctactcgattcaaggaca acacaccatttctccgctcgatctggccaagctgaaccaggtggcaagacaacagtctcactttgccatgatgcac ggcgggaccggattcgccggaattgactccagctctccagaggtgaaaggctattgggcaagtttggatgcatcta ctcaaaccacccatgaactcaccattccaaataacttaattggctgcagtaatcgggcgccaaggcgccaacatta atgagatccgccagatgtccggggcccagatcaaaattgccaacccagtggaaggctcctctggtaggcaggtta ctatcactggctctgctgccagtattagtctggcccagtatctaatcaatgccaggctttcctctgagaagggca tggggtgcagctag(SEQ ID Ν0·1)〇
[0012] 上述技術(shù)方案中，所述腫瘤細(xì)胞包括但不限于宮頸癌細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明還提供一種增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性的方法。所述方法包括：在放療 之前，向所述腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染包含PCBPl的真核表達(dá)載體；待PCBPl在轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞中表達(dá) 后，對(duì)所述腫瘤細(xì)胞施加放療。
[0014] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的"放療"是指重離子輻照療法。并且，所 述腫瘤細(xì)胞包括但不限于宮頸癌細(xì)胞。
[0015] 由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：
[0016] (I)PCBPl協(xié)同重離子束，調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)的-⑶44ν6基因表達(dá)，抑制了 HeLa腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。
[0017] (2)PCBPl協(xié)同重離子束，顯著下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1，促使細(xì)胞發(fā)生 GO / Gl期阻滯，增加 HeLa細(xì)胞中對(duì)輻射的敏感性。
[0018] (3)PCBPl協(xié)同重離子束，上調(diào)促凋亡蛋白Tap73、線粒體凋亡通路MCL的表達(dá)，下 調(diào)抑制凋亡DelNp73的蛋白，誘發(fā)了更多的HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0019] 本發(fā)明所述PCDNA3-PCBP1轉(zhuǎn)染聯(lián)合放療對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用高 于單一放療組，呈現(xiàn)明顯放療增敏協(xié)同效應(yīng)。因此，本發(fā)明從腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、周 期阻滯和凋亡的多個(gè)層面上提供了 PCBPl基因制備放療增敏試劑盒的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0020] 綜上所述，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案：
[0021] I. PCBPl基因在制備放療增敏試劑盒中的應(yīng)用。
[0022] 2.根據(jù)第1項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述PCBPl基因構(gòu)建在真核表達(dá)質(zhì)粒中，其中所述 PCBPl基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
[0023] 3.根據(jù)第2項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述PCBPl基因構(gòu)建在pcDNA3質(zhì)粒中。
[0024] 4.根據(jù)第1項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述試劑盒用于治療宮頸癌。
[0025] 5.根據(jù)第1項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述放療為重離子輻照治療。
[0026] 6. -種放療增敏試劑盒，其中所述放療增敏試劑盒的活性成分包括攜帶PCBPl基 因的真核表達(dá)質(zhì)粒。
[0027] 7.根據(jù)第6項(xiàng)所述的放療增敏試劑盒，其中所述PCBPl基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
[0028] 8.根據(jù)第6項(xiàng)所述的放療增敏試劑盒，其中所述攜帶PCBPl基因的真核表達(dá)質(zhì)粒 為脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3-PCBP1。
[0029] 9.根據(jù)第6項(xiàng)所述的放療增敏試劑盒，所述試劑盒用于治療宮頸癌。
[0030] 10.根據(jù)第6項(xiàng)所述的放療增敏試劑盒，其中所述放療是重離子輻照療法。
[0031] 11. 一種增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性的方法，所述方法包括：在放療之前，向所 述腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染包含PCBPl的真核表達(dá)載體；待PCBPl在轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)后，對(duì)所述 腫瘤細(xì)胞施加放療。
[0032] 12.根據(jù)第11項(xiàng)所述的方法，其中所述包含PCBPl的真核表達(dá)載體為包含PCBPl 的pcDNA3載體，其中所述PCBPl墓因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
[0033] 13.根據(jù)第11項(xiàng)所述的方法，其中所述放療為重離子輻照療法。
[0034] 14.根據(jù)第11項(xiàng)所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞為宮頸癌細(xì)胞。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035] 從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中：
[0036] 圖1是PCBPl細(xì)胞模型的建立。PCBPl在人宮頸癌HeLa細(xì)胞中調(diào)控抑制凋亡蛋白 DeltaNp73的表達(dá)。NC表示無(wú)重離子輻照，且有空載體導(dǎo)入；siPCBPl表示PCBPl基因表達(dá) 受到干擾，降低表達(dá)；overEpl表示PCBPl超表達(dá)；overEp2表示PCBPl超表達(dá)。與對(duì)照組比 較：*，Ρ〈0· 05。**，Ρ〈0· 01 ;***，Ρ〈0· 001。
[0037] 圖2是PCBPl協(xié)同重離子輻射抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖。A圖顯示通過(guò)結(jié)晶 紫染色方法觀察PCBPl協(xié)同重離子輻射對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響。B圖顯示通過(guò)羅 氏細(xì)胞增殖試劑盒分析PCBPl協(xié)同重離子輻射對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響。A圖中， NC表示無(wú)重離子輻照，且有空載體導(dǎo)入；NC+IR表示4Gy重離子照射劑量，且有空載體導(dǎo)入； over Exp表示有PCBPl基因的超表達(dá)；IR+over Exp表示4Gy的重離子照射，且有PCBPl基 因的超表達(dá)。B圖中以吸光值為縱坐標(biāo)，處理為橫坐標(biāo)。NC表示無(wú)重離子輻照；NC+Control 表示無(wú)重離子福照，且有空載體導(dǎo)入；4Gy表示重離子照射劑量；4Gy+over Exp表示4Gy的 重離子照射，且有PCBPl基因的超表達(dá)。
[0038] 圖3是PCBPl協(xié)同重離子輻射降低了人宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲、周期阻滯以及凋亡 基因的表達(dá)。NC表示無(wú)重離子輻照，且有空載體導(dǎo)入；siPCBPl表示PCBPl基因表達(dá)受到干 擾，降低表達(dá)；overEpl表示PCBPl超表達(dá)；overEp2表示PCBPl超表達(dá)。與對(duì)照組比較：*， Ρ〈0·05〇 #，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001〇
[0039] 圖4是PCBPl協(xié)同重離子抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。NC表示無(wú)重離子輻照，且有空載 體導(dǎo)入；over Exp表示有PCBPl基因的超表達(dá)。
[0040] 圖5是PCBPl協(xié)同重離子輻射降低了人宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲力。NC表示無(wú)重離 子福照，且有空載體導(dǎo)入；IR表示4Gy的重離子照射,且有空載體的導(dǎo)入；IR+over Exp表示 4Gy的重離子照射，且有PCBPl基因的超表達(dá)。
[0041] 圖6是激光共聚焦顯微鏡觀察PCBPl協(xié)同重離子輻射促進(jìn)凋亡蛋白Tap73的表達(dá) (IOOx)。藍(lán)色熒光為DAPI復(fù)染的細(xì)胞核；紅色熒光為PCBPl的熒光染色；綠色熒光為Tap73 的免疫染色。
[0042] 圖7是激光共聚焦顯微鏡觀察PCBPl協(xié)同重離子輻射降低了抑制凋亡蛋白 DeltaNp73的表達(dá)。藍(lán)色熒光為DAPI復(fù)染的細(xì)胞核；紅色熒光為DeltaNp73的熒光染色。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面參照具體的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā) 明并不限于這些具體的實(shí)施例。
[0044] 實(shí)施例I. PCBPl協(xié)同重離子射線對(duì)人宮頸癌HeLa腫瘤的輻射增效作用
[0045] 1.實(shí)驗(yàn)材料
[0046] 人宮頸癌HeLa細(xì)胞最初購(gòu)白中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心（目 錄號(hào)：TCHul87)，之后在本實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)和保存；D-MEM培養(yǎng)基干粉、小牛血清、胰酶粉末購(gòu) 白Gibco公司；碘化丙啶（PI)購(gòu)白江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；二甲基亞砜（DMSO)、瓊脂 糖和Tween-20購(gòu)白上海高科技生物工程有限公司；抗PCBP1、Tap73、和DeltaNp73等抗體 購(gòu)白美國(guó)SantaCruzs生物技術(shù)公司。Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)白美國(guó)Invitrogen 公司。分別用重離子輻照細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料。用中國(guó)科學(xué)院蘭州近代物理研究所的高能12C重 離子束作為射線來(lái)源。
[0047] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0048] 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
[0049] 按照常規(guī)重組質(zhì)粒構(gòu)建方法構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3_PCBPl，構(gòu)建方法可 參見(jiàn)文獻(xiàn)：張林、侯艷紅、王孟薇、吳本儼、李楠.中華腫瘤防治雜志.2008 (16)。插入片段 PCBPl的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0050] HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100萬(wàn)U / L青霉素和鏈霉素的 D-MEM培養(yǎng)基。細(xì)胞置于5% C02,37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2-3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì) 胞用于實(shí)驗(yàn)。
[0051] 轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞用胰酶消化、計(jì)數(shù)，以合適的密度接種6孔板，置于CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)過(guò)夜，使轉(zhuǎn)染當(dāng)日細(xì)胞融合度為70%?90%。在鋪板和轉(zhuǎn)染期間避免使用抗生素。 轉(zhuǎn)染溶液配制：按照質(zhì)粒：Lipofectamine2000用量比為Iyg /孔：2. 5μ1/孔。2yg/ 孔 DNA 加入 100 μ 1 / 孔 D-MEM 混勻，室溫靜置 5min，備用；5 μ 1 / 孔 Lipofectamine2000 加入100 μ 1 /孔基礎(chǔ)D-MEM混勻，室溫靜置5min，備用；將稀釋的DNA同稀釋的脂質(zhì)體試 劑混合，在室溫保溫30min后，加入800 μ 1 /孔基礎(chǔ)D-MEM備用。用PBS及無(wú)抗生素的基 礎(chǔ)DMEM洗滌細(xì)胞，每孔加入Iml轉(zhuǎn)染混合液，5% C02, 37°C培養(yǎng)5h。5h后，棄去含轉(zhuǎn)染試劑 的培養(yǎng)液，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)后，72h內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)即為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后通過(guò) 熒光定量PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)染鑒定。
[0052] 2. 2輻照處理
[0053] 12C6+離子束照射在蘭州重離子加速器研究裝置（HIRFL，中國(guó)科學(xué)院近代物理研究 所）的深層腫瘤治療終端上進(jìn)行。坪區(qū)照射，能量為250MeV，劑量吸收率為IGy / min，照 射劑量為4Gy(空氣電離室檢測(cè)劑量）。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于輻照。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)24h后進(jìn)行 重離子輻照，輻照48h收樣。
[0054] 2. 3RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR
[0055] 首先按RNA抽提操作手冊(cè)（大連寶生物工程公司）的方法提取對(duì)照和處理樣品 RNA，提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm與280nm 吸光度值而計(jì)算RNA的純度與濃度。然后通過(guò)寶生物的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。PCR反應(yīng) 體系如下：SYBR Pre mix ExTaqTMlOy 1，F(xiàn)orward Primer (10 μ mol / 1)0. 4 μ 1，Reverse ?1^1^1(1(^111〇1/1)0.4 4 1，。0嫩模板2.(^1，蒸餾水加至2(^1。采用祀〇-1^(1105實(shí) 時(shí)定量PCR儀進(jìn)行應(yīng)，反應(yīng)條件為：95°C變性30s，60°C退火30s，95°C延伸5s，共40個(gè)循環(huán)。
[0056] 表1熒光定量PCR引物
[0057]

【權(quán)利要求】
1. PCBP1基因在制備放療增敏試劑盒中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述PCBP1基因構(gòu)建在真核表達(dá)質(zhì)粒中，其中所述 PCBP1基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述PCBP1基因構(gòu)建在pcDNA3質(zhì)粒中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述試劑盒用于治療宮頸癌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述放療為重離子輻照療法。
6. -種放療增敏試劑盒，其中所述放療增敏試劑盒的活性成分包括攜帶PCBP1基因的 真核表達(dá)質(zhì)粒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的放療增敏試劑盒，其中所述PCBP1基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的放療增敏試劑盒，其中所述攜帶PCBP1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒 為脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3-PCBP1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的放療增敏試劑盒，所述試劑盒用于治療宮頸癌。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的放療增敏試劑盒，其中所述放療為重離子輻照療法。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104338150SQ201410005151
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】狄翠霞, 張紅, 周鑫, 孫超, 司婧, 甘露, 劉圓圓 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所