痰熱清在制備破壞細菌生物膜的產(chǎn)品中的新用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了痰熱清在制備破壞細菌生物膜的產(chǎn)品中的一種新用途。本發(fā)明提供了痰熱清在制備降解細菌生物膜的產(chǎn)品中的應用。本發(fā)明還保護痰熱清在制備破壞細菌生物膜的產(chǎn)品中的應用。本發(fā)明還保護痰熱清在制備抑制細菌生物膜形成的產(chǎn)品中的應用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，痰熱清不僅能抑制細菌生物膜的形成，還能降解成熟的細菌生物膜。本發(fā)明對于公共健康事業(yè)具有重大價值。
【專利說明】痰熱清在制備破壞細菌生物膜的產(chǎn)品中的新用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及痰熱清在制備破壞細菌生物膜的產(chǎn)品中的一種新用途。
【背景技術】
[0002]細菌生物膜是指由附著于惰性或者活性實體表面的細菌細胞和包裹著細菌的水合性基質所組成的結構性細菌群落。細菌生物膜廣泛存在于含水和潮濕的各種表面上，包括自來水管道，工業(yè)管道、通風設備、醫(yī)療器械甚至病理狀態(tài)下的人體組織器官，據(jù)專家估計幾乎所有的細菌在一定的條件下都可以形成生物膜。生物膜中細菌的代謝活動除了能夠腐蝕管道和金屬表面外，更可導致動植物及人類疾病發(fā)生。由于細菌在生物膜狀態(tài)有著比游走態(tài)高出千百倍的抗藥性，使得生物膜在臨床更易引發(fā)難治性慢性感染，嚴重威脅人類健康。
[0003]痰熱清注射液是由上海凱寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)、具有獨家知識產(chǎn)權的國家中藥二類新藥，由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹等科學組方，嚴格按照中藥指紋圖譜生產(chǎn)而成，有清熱解毒、化痰、解痙、抑茵、抗病毒、解熱、免疫調(diào)節(jié)等作用。臨床主要可用于肺炎、支氣管炎、肝炎、病毒性腦炎、傳染性單核細胞增多癥等多種痰病的治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供痰熱清在制備破壞細菌生物膜的產(chǎn)品中的一種新用途。
[0005]本發(fā)明提供了痰 熱清在制備降解細菌生物膜的產(chǎn)品中的應用。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCC? Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射 液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。
[0006]本發(fā)明還保護痰熱清在制備破壞細菌生物膜的產(chǎn)品中的應用。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCC'" Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。
[0007]本發(fā)明還保護痰熱清在制備抑制細菌生物膜形成的產(chǎn)品中的應用。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCC? Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。
[0008]本發(fā)明還保護一種降解細菌生物膜的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCC? Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。
[0009]本發(fā)明還保護一種破壞細菌生物膜的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCCs Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。
[0010]本發(fā)明還保護一種抑制細菌生物膜形成的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCCs Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述痰熱清可為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。所述痰熱清注射液具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的痰熱清注射液。 [0011]本發(fā)明以金黃色葡萄球菌為例，利用微孔板法、激光共聚焦、Bioflux剪切力模型等研究了痰熱清對細菌生物膜形成的不同時期、不同狀態(tài)的影響。從微孔板法實驗結果來看:痰熱清、青霉素鈉均對細菌生物膜的形成過程有影響，均能夠抑制細菌生物膜的生物總量，并有效減少細菌生物膜中的活菌數(shù)量；當細菌生物膜成熟后，只有痰熱清能夠抑制細菌生物膜的生物總量，并有效減少細菌生物膜中的活菌數(shù)量，青霉素鈉失去上述作用?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人推測痰熱清破壞了細菌生物膜結構，為了驗證這一猜測，發(fā)明人通過檢測經(jīng)痰熱清處理后的濾膜(濾膜上有成熟的細菌生物膜)的抗生素的滲透量的多少，來間接反映痰熱清對細菌生物膜結構的破壞，實驗結果表明，經(jīng)痰熱清處理后的濾膜的抗生素滲透量增大，而對照組和青霉素鈉處理組檢測不到抗生素的滲透。為了直觀觀察痰熱清對細菌生物膜的影響，用熒光染料對生物膜進行活菌(syto-9)、死菌(PI)及細菌外基質(matrix)三標后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，青霉素鈉(陽性對照)、痰熱清對于細菌生物膜的形成過程有顯著效果，只有痰熱清對成熟的細菌生物膜有效果，這與微孔板的結果一致。為了模擬體內(nèi)生物膜所處環(huán)境，發(fā)明人采用了 Bioflux剪切力模型。從bioflux結果來看:給細菌生物膜施加青霉素鈉后，其狀態(tài)和電子密度及體積均無明顯改變；給細菌生物膜施加痰熱清30min后即出現(xiàn)空洞，Ih時生物膜開始與管道剝離，到5h生物膜變得松散，IOh時生物膜消散、破解；此結果與微孔板結果和激光共聚焦顯微鏡觀察的結果一致，均說明了痰熱清對成熟的細菌生物膜有破壞作用，而青霉素鈉對成熟的細菌生物膜無作用。
[0012]生物膜成熟后，基質包裹在細菌外表面，形成很有序的結構，因此成熟的細菌生物膜具有很強的耐藥性，所以找到一種能降解成熟的細菌生物膜的藥物顯得非常必要。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，痰熱清不僅能抑制細菌生物膜的形成，還能降解成熟的細菌生物膜。本發(fā)明對于公共健康事業(yè)具有重大價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為實施例1的步驟一的結果。
[0014]圖2為實施例1的步驟二的結果。
[0015]圖3為實施例1的步驟三的結果(硫酸卡那霉素)。
[0016]圖4為實施例1的步驟四的結果(鹽酸萬古霉素)。
[0017]圖5為實施例2的步驟一的結果。
[0018]圖6為實施例2的步驟二的結果。
[0019]圖7為實施例3的步驟一的結果。
[0020]圖8為實施例3的步驟二的結果。
[0021]圖9為實施例4的結果。【具體實施方式】
[0022]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。LIVE, DHAD? BacLight Bacterial Viability 試劑盒:美國 MolecularProbes公司)。激光共聚焦顯微鏡:0LYMPUS，F(xiàn)V1000。數(shù)控剪切流活細胞自動分析平臺:BioFlux200systerm。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus): ATCCT Number 為 25923。
[0023]LB培養(yǎng)基:取胰蛋白胨IOg(英國OXOID公司)、酵母提取物5g(英國OXOID公司)、NaCllOg (北京市慶盛達化工技術有限公司)，溶于去離子水并用去離子水定容至1L?；A培養(yǎng)液為含0.25g/100mL葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司)的LB培養(yǎng)基。LB固體培養(yǎng)基為含2g/100mL瓊脂的LB培養(yǎng)基。
[0024]痰熱清注射液(上海凱寶藥業(yè)股份有限公司):為由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹五味中藥提取物，國藥準字Z20030054 ;使用時，將痰熱清注射液冷凍干燥得到干粉；實施例中將干粉溶于基礎培養(yǎng)液，痰熱清的濃度以每毫升培養(yǎng)液中含有的干粉微克數(shù)計。
[0025]青霉素鈉注射液，又稱注射用青霉素鈉:華北制藥股份有限公司，批號X1108105 ；使用時，將青霉素鈉注射液冷凍干燥得到干粉；實施例中將干粉溶于基礎培養(yǎng)液，青霉素鈉的濃度以每毫升培養(yǎng)液中含有的干粉微克數(shù)計。
[0026]硫酸卡那霉素注射 液，又稱硫酸卡那霉素，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，產(chǎn)品目錄號DH1774 ;使用時，將硫酸卡那霉素注射液冷凍干燥得到干粉；實施例中將干粉溶于基礎培養(yǎng)液，硫酸卡那霉素的濃度以每毫升培養(yǎng)液中含有的干粉微克數(shù)計。
[0027]鹽酸萬古霉素注射液，又稱注射用鹽酸萬古霉素，購自Eli Lilly JapanK.K, Seishin Laboratories,產(chǎn)品目錄號C008056 ;使用時，將鹽酸萬古霉素注射液冷凍干燥得到干粉；實施例中將干粉溶于基礎培養(yǎng)液，鹽酸萬古霉素的濃度以每毫升培養(yǎng)液中含有的干粉微克數(shù)計。
[0028]實施例1、微孔板法檢測痰熱清對細菌生物膜的影響
[0029]為觀察痰熱清對細菌生物膜的影響，本實施例分別選取了細菌生物膜形成前期及細菌生物膜形成后期兩個階段，觀察痰熱清對細菌生物膜生物總量(生物總量包括活菌、死菌和細胞外基質)的影響和痰熱清對細菌生物膜內(nèi)活菌數(shù)的影響。
[0030]一、微孔板法檢測痰熱清對細菌生物膜形成的影響[0031 ] 1、分組處理(每組設置5個重復處理)
[0032]第一組至第十組:將金黃色葡萄球菌接種至培養(yǎng)液(第一組至第十組的培養(yǎng)液依次為:含 16500 μ g/ml、8250 μ g/ml、4125 μ g/ml、2063 μ g/ml、1032 μ g/ml、516 μ g/ml、258μ g/ml、129l.! g/ml、65l.! g/ml或33 μ g/ml痰熱清的基礎培養(yǎng)液)，使初始OD600nm值為0.05，37。。靜置24小時；
[0033]第十一組至第二十組:將金黃色葡萄球菌接種至培養(yǎng)液(第十一組至第二十組的培養(yǎng)液依次為:含 20 μ g/ml、10 μ g/ml>5 μ g/ml、2.5 μ g/ml、1.25 μ g/ml、0.625 μ g/ml、0.31 μ g/ml、0.15 μ g/ml、0.075 μ g/ml或0.038 μ g/ml青霉素鈉的基礎培養(yǎng)液)，使初始OD600nm 值為 0.05，37°C 靜置 24 小時；[0034]第二^^一組(陰性對照):將金黃色葡萄球菌接種至基礎培養(yǎng)液，使初始OD6tltol值為0.05，37。。靜置24小時；
[0035]實驗在96孔板中進行。
[0036]2、取完成步驟I的96孔板，用0.9%生理鹽水清洗2次(以去除孔中未粘附的細菌)。
[0037]3、取完成步驟2的96孔板，采用結晶紫染色法檢測每孔中的生物總量，結果見圖1A (*P<0.05)ο
[0038]4、取完成步驟2的96孔板，采用XTT染色法檢測每孔中的活菌量，結果見圖1B(*Ρ〈0.05)。
[0039]圖1的結果表明:在細菌生物膜形成階段，痰熱清和青霉素鈉均可降低其生物總量，痰熱清的有效作用濃度為1032-16500 μ g/ml，青霉素鈉的有效作用濃度為 0.038-20 μ g/ml ;在細菌生物膜形成階段，痰熱清和青霉素鈉均可降低其活菌量，青霉素鈉的有效作用濃度為0.038-20 μ g/ml，痰熱清的有效作用濃度為129-16500 μ g/ml。各組中，5個重復處理的結果一致。
[0040]二、微孔板法檢測痰熱清對成熟細菌生物膜的影響[0041 ] 1、分組處理(每組設置5個重復處理)
[0042]第一組至第十組:將金黃色葡萄球菌接種至基礎培養(yǎng)液，使初始OD6tltol值為0.05，37°C靜置24小時，棄除上清，加入培養(yǎng)液(第一組至第十組的培養(yǎng)液依次為:含16500 μ g/ml、8250 μ g/ml、4125 μ g/ml、2063 μ g/ml、1032 μ g/ml、516 μ g/ml、258 μ g/ml、129 μ g/ml、65 μ g/ml或33 μ g/ml痰熱清的基礎培養(yǎng)液)，37°C靜置24小時；
[0043]第十一組至第二十組:將金黃色葡萄球菌接種至基礎培養(yǎng)液，使初始OD6tltlnm值為0.0 5，3 7 °C靜置2 4小時，棄除上清，加入培養(yǎng)液(第十一組至第二十組的培養(yǎng)液依次為:含 20 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml、2.5 μ g/ml、1.25 μ g/ml、0.625 μ g/ml、0.31 μ g/ml、
0.15 μ g/ml、0.075 μ g/ml或0.038 μ g/ml青霉素鈉的基礎培養(yǎng)液)，37°C靜置24小時；
[0044]第二H^一組(陰性對照):將金黃色葡萄球菌接種至基礎培養(yǎng)液，使初始OD6tltol值為
0.05，37°C靜置24小時，棄除上清，加入基礎培養(yǎng)液，37°C靜置24小時；
[0045]實驗在96孔板中進行。
[0046]2、同步驟一的2。
[0047]3、同步驟一的3，結果見圖2A (*Ρ〈0.05 )。
[0048]4、同步驟一的4，結果見圖2Β (*Ρ〈0.05)。
[0049]圖2的結果表明:對于成熟的細菌生物膜，青霉素鈉對其生物總量無影響作用，而痰熱清可以降低其生物總量，痰熱清的有效作用濃度為33-1032μ g/ml ;對于成熟的細菌生物膜，除了 20 μ g/ml濃度以外，青霉素鈉對其活菌量無影響作用，而痰熱清可以降低其活菌量，有效濃度為65-16500 μ g/ml。各組中，5個重復處理的結果一致。
[0050]本實施例的結果表明，青霉素鈉只對細菌生物膜的形成過程有抑制或降解作用，痰熱清不僅對細菌生物膜的形成過程有抑制或降解作用、對成熟的細菌生物膜也具有抑制或降解作用。
[0051]三、其它藥物對成熟細菌生物膜的影響
[0052]用硫酸卡那霉素代替青霉素鈉進行上述步驟二的實驗，生物總量的結果見圖3A(***Ρ〈0.05),活菌量的結果見圖3Β(***Ρ〈0.05)。用鹽酸萬古霉素代替青霉素鈉進行上述步驟二的實驗，生物總量的結果見圖4Α (#*Ρ〈0.05)，活菌量的結果見圖4Β (#*Ρ〈0.05)。除20 μ g/ml的硫酸卡那霉素對細菌的活菌量有影響外，硫酸卡那霉素和鹽酸萬古霉素對成熟的細菌生物膜的總生物量和活菌量均無顯著影響。
[0053]實施例2、利用抗生素滲透性研究痰熱清對細菌生物膜結構的作用
[0054]一、不同作用時間下究痰熱清對生物膜結構的作用
[0055]1、取6孔板中，每孔加入4ml OD600nm=0.05的金黃色葡萄球菌菌液(菌液是用基礎培養(yǎng)液重懸金黃色葡萄球菌菌體得到的)，然后每孔放入一個15 X 15mm的濾膜，37°C培養(yǎng)48h，以在濾膜上表面形成成熟的細菌生物膜。
[0056]2、分組處理
[0057]第一組:完成步驟I后，將濾膜移至含不同濃度的痰熱清的基礎培養(yǎng)液(分別為含16500 μ g/ml,8250 μ g/ml,4125 μ g/ml 或 2062 μ g/ml 痰熱清的基礎培養(yǎng)液)中 37°C靜置24h ；
[0058]第二組:完成步驟I后，將濾膜移至含不同濃度的青霉素鈉的基礎培養(yǎng)液(分別為含20 μ g/ml、10 μ g/ml,5 μ g/ml或2.5 μ g/ml青霉素鈉的基礎培養(yǎng)液)中37°C靜置24h ；
[0059]第三組(陰性對照):完成步驟I后，將濾膜移至基礎培養(yǎng)液中37°C靜置24h。
[0060]3、完成步驟2后，將濾膜放置于含20 μ g/ml青霉素鈉的LB固體培養(yǎng)基平板上，濾膜上覆蓋一個新的15X15mm的無菌濾膜，形成細菌生物膜三明治，在新的無菌濾膜上再放置一個直徑為6mm的濾紙片，在濾紙片上滴加5 μ I基礎培養(yǎng)液潤濕，37°C靜置2h、4h或6h。
[0061]4、完成步驟3后，取濾紙并放置于涂布有金黃色葡萄球菌的LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)18-24h，觀察抑菌圈。
[0062]步驟2至步驟3中，均保持細菌生物膜向上。
[0063]步驟4中培養(yǎng)24小時后的照片見圖5。第一組進行步驟4后均能觀察到抑菌圈，第二組和第三組進行步驟4后均不能觀察到抑菌圈。
[0064]二、藥敏實驗
[0065]將濾紙放置于涂布有金黃色葡萄球菌的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基平板上,上面滴加5 μ I含青霉素鈉的基礎培養(yǎng)液或滴加5 μ I含痰熱清的基礎培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)18-24h，觀察抑菌圈。培養(yǎng)24小時后的照片見圖6?？梢钥闯?，痰熱清本身并無抑菌圈，而青霉素鈉抑菌圈較大。
[0066]綜合步驟一和步驟二的結果，結論如下:步驟一的2中，第一組為痰熱清處理組，痰熱清破壞了細菌生物膜結構，使得步驟3中的青霉素鈉能夠通過細菌生物膜并滲透到濾紙內(nèi)，從而使得濾紙具有殺菌作用；步驟一的2中，第二組為青霉素鈉處理組，青霉素鈉不能破壞細菌生物膜結構，從而步驟3中的青霉素鈉無法通過細菌生物膜滲透到濾紙內(nèi)，濾紙沒有殺菌作用。結果表明，對于成熟的細菌生物膜，青霉素鈉不具有抑制或降解作用，而痰熱清具有顯著的抑制或降解作用。
[0067]實施例3、通過激光共聚焦顯微鏡觀察痰熱清對細菌生物膜的影響
[0068]一、對細菌生物膜形成的影響
[0069]第一組(痰熱清組): 在小玻璃皿中加入含2063 μ g/ml痰熱清的基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltol值為0.05的體系，37°C靜置24小時，棄去上清，用0.9%生理鹽水清洗兩次(去掉未粘附細菌)，然后進行matrix染料染色(對細胞外基質染色)、PI染色(對死細菌進行染色)和Syto9染色(對活細菌進行染色)，在激光共聚焦顯微鏡上觀察(P1、Syto9、matrix染料所需的激發(fā)波長依次為488nm、559nm和559nm)，利用imaris軟件進行圖像及數(shù)據(jù)分析，結果見圖7。
[0070]第二組(青霉素鈉組):在小玻璃皿中加入含20 μ g/ml青霉素鈉的基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值為0.05的體系，37°C靜置24小時，棄去上清，用0.9%生理鹽水清洗兩次(去掉未粘附細菌)，然后進行matrix染料染色(對細胞外基質染色)、PI染色(對死細菌 進行染色)和Syto9染色(對或細菌進行染色)，在激光共聚焦顯微鏡上觀察(P1、Syto9、matrix染料所需的激發(fā)波長依次為488nm、559nm和559nm)，利用imaris軟件進行圖像及數(shù)據(jù)分析，結果見圖7。
[0071]第三組(對照組):在小玻璃皿中加入基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值為0.05的體系，37°C靜置24小時，棄去上清，用0.9%生理鹽水清洗兩次(去掉未粘附細菌)，然后進行matrix染料染色(對細胞外基質染色)、PI染色(對死細菌進行染色)和Syto9染色(對或細菌進行染色)，在激光共聚焦顯微鏡上觀察(P1、Syto9、matrix染料所需的激發(fā)波長依次為488nm、559nm和559nm),利用imaris軟件進行圖像及數(shù)據(jù)分析，結果見圖7。
[0072]由圖7可以觀察到，在細菌生物膜形成階段，青霉素鈉和痰熱清的殺菌效果都很好，活菌、死菌及細胞外基質的量都大大減少，細菌生物膜變薄、體積變小，這與微孔板的檢測結果一致。每組設置5個重復處理。各組中，5個重復處理的結果一致。
[0073]二、對成熟細菌生物膜的影響
[0074]第一組(痰熱清組):在小玻璃皿中加入基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值為0.05的體系，37°C靜置24小時；棄除上清，加入含2063 μ g/ml痰熱清的基礎培養(yǎng)液，37°C靜置24小時；棄去上清，用0.9%生理鹽水清洗兩次(去掉未粘附細菌)，然后進行matrix染料染色(對細胞外基質染色)、PI染色(對死細菌進行染色)和Syto9染色(對或細菌進行染色)，在激光共聚焦顯微鏡上觀察(P1、Syto9、matriX染料所需的激發(fā)波長依次為488nm、559nm和559nm),利用imaris軟件進行圖像及數(shù)據(jù)分析,結果見圖8。
[0075]第二組(青霉素鈉組):在小玻璃皿中加入基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltlnm值為0.05的體系，37°C靜置24小時；棄除上清，加入含20 μ g/ml青霉素鈉的基礎培養(yǎng)液，37°C靜置24小時；棄去上清，用0.9%生理鹽水清洗兩次(去掉未粘附細菌)，然后進行matrix染料染色(對細胞外基質染色)、PI染色(對死細菌進行染色)和Syto9染色(對或細菌進行染色)，在激光共聚焦顯微鏡上觀察(P1、Syto9、matriX染料所需的激發(fā)波長依次為488nm、559nm和559nm),利用imaris軟件進行圖像及數(shù)據(jù)分析,結果見圖8。
[0076]第三組(對照組):在小玻璃皿中加入基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌，得到2mL初始OD6tltol值為0.05的體系，37°C靜置24小時；棄除上清，加入基礎培養(yǎng)液，37°C靜置24小時；棄去上清，用0.9%生理鹽水清洗兩次(去掉未粘附細菌)，然后進行matrix染料染色(對細胞外基質染色)、PI染色(對死細菌進行染色)和Syto9染色(對或細菌進行染色)，在激光共聚焦顯微鏡上觀察(P1、Syto9、matrix染料所需的激發(fā)波長依次為488nm、559nm和559nm),利用imaris軟件進行圖像及數(shù)據(jù)分析,結果見圖8。
[0077]由圖8可以觀察到:對于成熟的細菌生物膜，痰熱清可使其活菌大大減少，死菌大大增多，細胞外基質減少，使細菌生物膜變薄、體積變?。粚τ诔墒斓募毦锬?，青霉素鈉失去作用。該結論與微孔板的檢測結果相符。每組設置5個重復處理。各組中，5個重復處
理的結果一致。
[0078]由步驟一和步驟二可以得出如下結論:青霉素鈉只對細菌生物膜的形成過程有作用，對成熟的細菌生物膜失去作用，痰熱清不僅對細菌生物膜的形成過程有作用，對成熟的細菌生物膜也具有抑制或降解作用。
[0079]實施例4、BioFlux細菌生物膜模型構建
[0080]1、在 BioFlux Plate 出口加入 200 μ L OD6tltlnm=0.6-0.8 的金黃色葡萄球菌菌液(菌液是用基礎培養(yǎng)液重懸金黃色葡萄球菌菌體得到的)，出口至入口方向給力5dyn/cm2、5min，靜置lh，棄去入口及出口的廢液。
[0081]2、在BioFlux Plate入口加入100 μ L OD6tltlnm=0.6-0.8的金黃色葡萄球菌菌液(菌液是用基礎培養(yǎng)液重懸金黃色葡萄球菌菌體得到的)，出口加入100 μ L OD600nm=0.6-0.8的金黃色葡萄球菌菌液(菌液是用基礎培養(yǎng)液重懸金黃色葡萄球菌菌體得到的)，出口至入口方向給力2dyn/cm2、2s，靜置2_4h，鏡下可見觀察窗內(nèi)布滿細菌，棄去入口及出口的廢液。 [0082]3、在BioFlux Plate入口加入ImL OD600nm=0.6-0.8的金黃色葡萄球菌菌液(菌液是用基礎培養(yǎng)液重懸金黃色葡萄球菌菌體得到的)，出口加入100 μ L OD600nm=0.6-0.8的金黃色葡萄球菌菌液(菌液是用基礎培養(yǎng)液重懸金黃色葡萄球菌菌體得到的)，入口至出口方向給力0.15dyn/cm2,培養(yǎng)2_4d,形成成熟的生物膜。
[0083]4、分組處理
[0084]第一組(痰熱清組):在BioFlux Plate入口加入ImL含2063 μ g/ml痰熱清的基礎培養(yǎng)液，入口至出口方向給力0.15dyn/cm2 ;前半小時每IOmin拍照一次,半小時后每30min拍照一次，觀察痰熱清對生物膜的影響；
[0085]第二組(青霉素鈉組):在BioFlux Plate入口加入ImL含20 μ g/ml青霉素鈉的基礎培養(yǎng)液，入口至出口方向給力0.15dyn/cm2 ;前半小時每IOmin拍照一次,半小時后每30min拍照一次，觀察青霉素鈉對生物膜的影響。
[0086]為了模擬體內(nèi)生物膜所處環(huán)境，本實施例采用了 Bioflux剪切力模型。Bioflux剪切力模型是一種接近于真實狀態(tài)的細菌生物膜模型，在精確的推動力作用下，模擬細菌在機體內(nèi)形成細菌生物膜的動態(tài)過程，所形成的細菌生物膜是真實的細菌生物膜，該模型可動態(tài)、直觀地反應藥物對細菌生物膜的作用過程。
[0087]不同時間后的照片見圖9。加入青霉素鈉后，細菌生物膜的狀態(tài)和電子密度及體積均無明顯改變。加入痰熱清30min后管道中兩個球形生物膜之間的部分開始出現(xiàn)空洞，Ih時生物膜開始與管道剝離，5h時生物膜變得松散、電子密度明顯變小，IOh時管道中右側一團生物膜消散、左側的一團生物膜破解。本實施例的結果與微孔板結果以及激光共聚焦顯微鏡觀察結果一致，均說明了痰熱清對成熟的細菌生物膜有破壞作用，而青霉素鈉對成熟的細菌生物膜無作用。每組設置5個重復處理。各組中，5個重復處理的結果一致。
【權利要求】
1.痰熱清在制備降解細菌生物膜的產(chǎn)品中的應用。
2.痰熱清在制備破壞細菌生物膜的產(chǎn)品中的應用。
3.痰熱清在制備抑制細菌生物膜形成的產(chǎn)品中的應用。
4.如權利要求1至3中任一所述的應用，其特征在于:所述細菌為金黃色葡萄球菌。
5.如權利要求1至5中任一所述的應用，其特征在于:所述痰熱清為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。
6.一種降解細菌生物膜的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。
7.一種破壞細菌生物膜的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。
8.一種抑制細菌生物膜形成的產(chǎn)品，其活性成分為痰熱清。
9.如權利要求6至8中任一所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述細菌為金黃色葡萄球菌。
10.如權利要求6至9中任一所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述痰熱清為痰熱清注射液或痰熱清注射液的凍干品。
【文檔編號】A61K35/32GK103720768SQ201410005060
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權日:2014年1月6日
【發(fā)明者】王毅, 劉沖, 劉紹勇, 劉宜善, 王國明, 王藝竹, 于友華, 李連達 申請人:上海凱寶藥業(yè)股份有限公司