專利名稱：抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph20(t)的SSR標(biāo)記BYL8的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及水稻抗褐飛虱主效基因的分子標(biāo)記，可用于水稻抗褐飛虱種質(zhì)資源的利用和品種的選育及抗蟲性鑒定等等方面。
背景技術(shù)：
褐飛虱是水稻生產(chǎn)區(qū)最嚴(yán)重的害蟲之一(程遐年等，2003 fathak，1972 ;Dyck et al. ,1979 ；Sogawa, 1982) 0實(shí)踐證明，利用品種抗性是防治褐飛虱為害的最佳途徑之一 (Pathak, 1969 ；Sogawa, 1982)。因此，發(fā)現(xiàn)并鑒定新的褐飛虱抗性基因，培育具有持久抗性的水稻品種，是利用品種抗性防治褐飛虱為害的關(guān)鍵所在，對抗性基因的精細(xì)定位，是利用抗性基因的基礎(chǔ)前提。然而，隨著抗蟲水稻品種的推廣應(yīng)用，能夠克服品種抗性的褐飛虱新生物型也隨即出現(xiàn)，成為褐飛虱防治及抗蟲育種工作中面臨的主要難題。上世紀(jì)60年代， 遺傳育種學(xué)家和昆蟲學(xué)家已著手篩選鑒定褐飛虱抗性基因資源，選育抗性水稻品種。迄今為止，已先后鑒定了至少23個(gè)主效抗性基因，其中17個(gè)已被分子定位(蘇昌潮等，2003 ； Yang et al.，2004 ；Yang et al.，2005 ；Chen et al.，2006)。在第 2 染色體上，目前只是定位了 1個(gè)抗性基因Bphl3(t) (Liu et al.，2001)。在第3染色體上，目前已定位了 3個(gè)抗性基因 Bphl3(t)、Bphl4 禾口 bphl9(t) (Renganayaki et al.，2002 ；Huang et al.，2001 ；Chen et al.，2006)。在第4染色體上，已定位了 3個(gè)抗性基因Bph3、Bphl2 (t)和Bph 15 (黃朝鋒 2003，Yang et al.，2002 ；Huang et al.，2001)。在第6染色體上，目前定位了 2個(gè)隱性抗性基因(Kawaguchi et al. ,2001 ；Yang et al. ,2005) 在第9染色體上，到目前為止，只定位了 1個(gè)顯性抗性基因，但尚未給基因命名(Mei et al.，1996)。在第11染色體上，迄今為止，也只定位了 1個(gè)顯性抗性基因，也未給基因定名(Jena et al.，2002)。在第12染色體上，目前已定位的抗性基因是最多的，總共有5個(gè)，即Bphl (Hirabayashi et al.，1995)、 bph2 (Murata et al.，1998)、bph9 (Murai et al.，2001)、BphlO (t) (Ishii et al.，1994) 禾口 Bphl8(t) (Jena et al. ,2005)。目前，部分抗性基因如Bphl、bph2和Bph3，已被成功應(yīng)用在水稻抗性育種上，而且在開始大面積推廣時(shí)的確起到了控制褐飛虱危害的作用。但是，隨著褐飛虱新生物型的出現(xiàn)，由主效基因控制的抗性穩(wěn)定性有所改變(Kenmore et al.，1984)。因此，篩選、尋找更多有用的抗性基因，應(yīng)用于今后的基因聚合，培育出更有效、具有持久廣譜抗性的優(yōu)良品種 (系)，是本發(fā)明的研究目的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供水稻抗褐飛虱基因的分子標(biāo)記方法，通過檢測這些與褐飛虱抗性基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記，可以預(yù)測水稻植株對褐飛虱的抗性，從而為褐飛虱抗性
3育種提供了可能。本發(fā)明通過研究水稻抗性品種RBPHM發(fā)現(xiàn)兩個(gè)抗褐飛虱基因位點(diǎn)，分別是 bph20 (t)和bph21 (t)，它們共同控制水稻抗褐飛虱的抗性。其中，抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph20(t)與下述分子標(biāo)記緊密連鎖SSR 標(biāo)記 BYL7 5，端正向引物序列 AAGCTAGGGAATCAGCGGTTA3，端反向引物序列 TGTGGCATGTCACTCACTCAC或SSR 標(biāo)記 BYL8:5，端正向引物序列 CCCACTTCCACAACCACA3，端反向引物序列 ATGCTCCTAGCTTCCTATTCC擴(kuò)增水稻基因組DNA，如果用引物BYL7能夠擴(kuò)增出142bp的擴(kuò)增片段，或用引物 BYL8擴(kuò)增出190bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻品種含有抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph20 (t)，該基因位于第6染色體的短臂上，與BYL7和BYL8連鎖，且位于BYL7和BYL8兩者之間，與兩者的距離分別為1. 3cM禾口 1. 2cM。本發(fā)明還提供上述抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph20(t)的分子標(biāo)記方法，其是利用SSR標(biāo)記引物BYL7和/或BYL8擴(kuò)增水稻基因組DNA，通過擴(kuò)增結(jié)果判斷該水稻品種是否含有抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph20(t)。其中，抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph21(t)，與下述分子標(biāo)記緊密連鎖SSR 標(biāo)記 RM222 5，端正向引物序列CTTAAATGGGCCACATGCG3，端反向引物序列 CAAAGCTTCCGGCCAAAAG或SSR 標(biāo)記 RM244 5，端正向引物序列 CCGACTGTTCGTCCTTATCA3，端反向引物序列 CTGCTCTCGGGTGAACGT擴(kuò)增水稻基因組DNA，如果用引物RM222能夠擴(kuò)增出213bp的擴(kuò)增片段，或用引物 RM244擴(kuò)增出163bp的擴(kuò)增片段，均標(biāo)志著水稻品種含有抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph21(t)，該基因位于第10染色體的短臂上，與RM222和RM244連鎖，且位于RM222和RM244兩者之間，與兩者的距離分別為7. 9cM和4. OcM0本發(fā)明還提供上述抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph21(t)的分子標(biāo)記方法，其是利用SSR標(biāo)記引物RM222和/或RM224擴(kuò)增水稻基因組DNA，通過擴(kuò)增結(jié)果判斷該水稻品種是否含有抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph20(t)。本發(fā)明還提供篩選上述抗性基因位點(diǎn)標(biāo)記的方法，其包括如下步驟(1)使用水稻品種RBPHM與I^l雜交后復(fù)交兩代再自交而得BC2F2群體，對后代進(jìn)行抗蟲性鑒定，經(jīng)抗性鑒定后抗性表現(xiàn)較好的300個(gè)體作為作圖群體；(2)提取親本及作圖群體的DNA，以BC2F2群體作為作圖群體，從覆蓋水稻基因組的觀40多條SSR引物中，選取間隔10 15cM左右、且均勻分布在水稻12條染色體上的229 對引物進(jìn)行分析，用于親本間多態(tài)性篩選，然后應(yīng)用有多態(tài)性的分子標(biāo)記用于分離群體的分析；(3)根據(jù)分子標(biāo)記多態(tài)性，結(jié)合分離群體抗性表型參數(shù)，用Mapmaker/QTL3. 0作圖軟件進(jìn)行抗蟲基因與分子標(biāo)記的遺傳連鎖分析，LOD ^ 3. 0，獲得連鎖圖譜；(5)根據(jù)連鎖圖譜，確定在RBPHM中的抗性基因bph20(t)與分子標(biāo)記RM435、 RM589、RM586、RM588、RM190、RMR540、BYL7 和 BYL8 連鎖；bph21 (t)與分子標(biāo)記 RM222、 RM311、RM5348 和 RM244 連鎖。因此，RM435、RM589、RM586、RM588、RM190、RMR540、BYL7 和 BYL8為抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph20(t)的分子標(biāo)記引物，而RM222、RM311、RM5348和RM244為抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph21(t)的分子標(biāo)記引物。有益效果(1)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)來源于普通野生稻的抗褐飛虱隱性基因位點(diǎn)bph20(t)和 bph21 (t)，這兩個(gè)基因同時(shí)控制抗性材料RBPH54的抗性，它們對抗性的作用為重復(fù)作用。(2)定位了上述兩個(gè)抗性基因位點(diǎn)，其中bph20 (t)與SSR分子標(biāo)記BYL7和BYL8 連鎖，且位于BYL7和BYL8兩者之間，與兩者的與兩個(gè)標(biāo)記的遺傳距離為1. 3cM和1. 2cM ； bph21 (t)與SSR分子標(biāo)記RM222和RM244連鎖，且位于RM222和RM244兩者之間，與兩者的與標(biāo)記距離分別為7. 9cM和4. OcM0(3)這兩個(gè)抗性基因的發(fā)現(xiàn)與定位，可用于水稻品種抗褐飛虱的選育工作，借助分子標(biāo)記輔助育種，通過基因聚合把多個(gè)基因聚集一起而獲得優(yōu)質(zhì)廣譜抗性育種材料，可大大提高育種效率，同時(shí)延緩品種抗性的喪失。


圖1.水稻品種RBPHM抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph20 (t)與分子標(biāo)記連鎖圖；圖2.水稻品種RBPHM抗褐飛虱基因位點(diǎn)bph21 (t)與分子標(biāo)記連鎖圖。
具體實(shí)施方案本發(fā)明是從抗性材料RBPHM中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)隱性的褐飛虱抗性基因bph20 (t)和 bph21(t)，該抗性材料具有廣譜的抗性，兼抗褐飛虱生物型II及孟加拉型等，廣譜抗性材料的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用在抗性育種中有著重大的作用，而在抗性基因位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及分子標(biāo)記定位基礎(chǔ)上，可借助分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)進(jìn)行有目的的抗蟲基因的聚合，選育抗蟲品種。而本發(fā)明中的抗性材料RBPHM可以作為抗性育種的種質(zhì)資源，同時(shí)應(yīng)用與抗性基因連鎖的分子標(biāo)記對抗蟲育種過程的材料進(jìn)行篩選，可大大提高育種效率。以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1材料與方法1.材料選擇RBPH54抗蟲性鑒定后發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗褐飛虱特性，因此把其作為親本，與感蟲品種Tm雜交，雜交后再回交自交，各代植株均經(jīng)抗蟲性鑒定。(RBPHM和Tm購自廣西農(nóng)科院植保所)2.抗蟲性鑒定
褐飛虱抗性的鑒定方法參照國際水稻研究所使用的標(biāo)準(zhǔn)苗盤篩選法SSST(IRRI， 1988)，并做一定的修改。育苗用的土壤取自稻田表土，經(jīng)初步處理后，取泥質(zhì)均一的土用于育苗。水稻種子在25°C下用水浸泡Mh，洗凈、催芽后播于盛有上述土壤的搪瓷育秧盤中。 每盤播10個(gè)品種，每個(gè)品種播20-30粒種子。中間播抗蟲對照品種ASD7，和感蟲對照I^l。 播種后，覆土，并置于網(wǎng)室內(nèi)生長。育苗期間正常管理。褐飛虱鑒定種群為生物II型。在秧苗3. 5 4葉期，去除弱苗、小苗，剩下留20苗接蟲鑒定。接蟲前把秧盆轉(zhuǎn)移到注有水的水槽中(水要浸過秧苗0.5 Icm深，以保持高濕度，利于秧苗和蟲的生長，并防止螞蟻和蜘蛛等侵入。罩上接蟲鑒定籠，平均每株秧苗接5 7頭1-2齡若蟲，接蟲時(shí)盡量均勻地把蟲釋放于接蟲籠內(nèi)。當(dāng)感蟲對照品種Tm死亡達(dá)100%以上時(shí)，調(diào)查各品種的各株受害情況，受害級別按表1統(tǒng)計(jì)。各水稻品種的平均受害級別采用如下方法計(jì)算累加各水稻品種的各個(gè)植株的最終抗性級別，再除以該品種的總植株數(shù)。根據(jù)平均受害級別，采用廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所修訂的評級標(biāo)準(zhǔn)，確定各品種的抗性級別，即0級免疫；1級高抗(0. 1 1. 9) ；3 級抗(2. 0 3. 9) ；5 級中抗(4. 0 5. 9) ；7 級中感(6. 0 7. 9)； 9級高感(8. 0 9. 0)(韋素美等，1994，1998)。抗性鑒定設(shè)1 3次重復(fù)，分析材料的綜合抗性，并根據(jù)抗性級別推測基因型。表1水稻對褐飛虱抗性的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
權(quán)利要求
1.抗褐飛虱主效基因位點(diǎn)bph20(t)的SSR分子標(biāo)記引物BYL8，其序列為 5，端正向引物序列CCCACTTCCACAACCACA3’ 端反向引物序列 ATGCTCCTAGCTTCCTATTCC。
2.抗褐飛虱主效基因的分子標(biāo)記方法，其特征在于用權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記引物BYL8擴(kuò)增水稻基因組DNA，能夠擴(kuò)增出190bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻品種含有抗褐飛虱主效基因位點(diǎn)bph20 (t)。
3.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記引物BYL8在選育抗褐飛虱水稻品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了抗褐飛虱抗性基因的分子標(biāo)記。本發(fā)明通過抗性親本RBPH54與感性品種TN1雜交回交后得到各后代，分別對各后代株系進(jìn)行抗性鑒定及分子遺傳連鎖分析，獲得抗褐飛虱主效隱性基因bph20(t)，與bph20(t)連鎖的兩側(cè)最近的分子標(biāo)記是自行開發(fā)的SSR標(biāo)記BYL7和BYL8，它們與bph20(t)的距離分別為1.3cM和1.2cM。通過與抗褐飛虱基因連鎖的分子標(biāo)記來檢測抗蟲品種RBPH54及其衍生品種(系)中是否含有上述抗蟲基因位點(diǎn)，可大大提高抗褐飛虱水稻品種或種質(zhì)的選擇效率。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102199596SQ20111005859
公開日2011年9月28日 申請日期2008年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日
發(fā)明者劉馳, 李容柏, 李楊瑞, 楊朗, 韋素美, 黃大輝, 黃立飛 申請人:廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院