專利名稱：表達插入痘病毒基因組中的同源基因的重組痘病毒的制作方法
表達插入痘病毒基因組中的同源基因的重組痘病毒本案是申請日為2003年5月14日、中國申請?zhí)?3811106. 3、發(fā)明名稱為“表達插入痘病毒基因組中的同源基因的重組痘病毒”的發(fā)明申請的分案申請。本發(fā)明涉及能夠表達兩個或多個同源外源基因的重組痘病毒，其中所述基因與病毒基因組異源，但相互之間具有同源性。所述基因尤其來源于微生物非常相關的變種或亞型。本發(fā)明進一步涉及制備這種重組痘病毒的方法以及這種重組痘病毒作為藥物或疫苗的應用。此外，本發(fā)明還提供一種對活體動物包括人的免疫反應進行影響優(yōu)選為誘導的方法。
背景技術：
每一個活生物體經常受感染性或致病因子如細菌、病毒、真菌或寄生蟲的挑戰(zhàn)。生物體的所謂免疫系統(tǒng)能夠阻止它們免受這些致病因子引起的持久感染、疾病或中毒。哺乳動物的免疫系統(tǒng)可分成特異性和非特異性部分，雖然這兩部分緊密交聯(lián)。非特異性免疫反應能夠介導對廣泛不同的病原體或感染因子(agent)的即時防御。特異性免疫反應在當生物體第一次受到物質的挑戰(zhàn)后，于遲滯期后形成。特異性免疫反應主要是因為產生了抗原特異性抗體，并形成巨噬細胞和淋巴細胞，如細胞毒素T-細胞(CTL)。之所以稱為特異性免疫反應，是基于下述事實，生物體個體受到特異性感染后能夠痊愈，但對其它感染病仍然易感。通常，同樣的或非常類似的感染因子的第二次感染引起非常溫和的癥狀或根本沒有發(fā)病的癥狀。這種所謂的免疫持續(xù)非常長的時間，有的甚至持續(xù)終生。這種潛在效果通常稱為免疫記憶，對此可以用于接種疫苗。術語接種疫苗描述一種方法，其中用無毒、部分或失活形式的感染因子攻擊個體， 影響優(yōu)選誘導所述個體的免疫反應，導致即使不是終生但長時間持續(xù)的對特異感染因子的免疫抵抗。人所患的天花疾病是由于天花(Variola)病毒引起的。天花病毒屬于痘病毒科 (Poxviridae)，這是具有復雜DNA大的病毒科，可在脊椎動物和無脊椎動物細胞的細胞質中復制。根據寄生在脊椎動物和昆蟲的不同宿主范圍，可將痘病毒科分成兩個亞科即脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)和昆蟲痘病毒亞科(Entomopoxvirinae)。脊椎動物痘病毒亞科包括正痘病毒屬(Orthopoxviruese)和禽痘病毒屬(Avipoxviruse)以及其它一些屬的病毒(Fields Virology, ed. by Fields B. N. ,Lippincott-Raven Publishers, 3rd edition 1996，ISBN :0-7817-0253_4，Chapter 83)。正痘病毒屬包括引起人患天花的病原即天花病毒，和其它非常重要的病毒，如駱駝痘病毒、牛痘病毒、綿羊痘病毒、山羊痘病毒、猴痘病毒和痘苗病毒。該屬中的所有成員具有遺傳相關性，相似的形態(tài)和宿主范圍。限制性內切酶圖譜甚至表明正痘病毒屬的不同成員之間具有高至90%的序列同一性(Mackett & Archard, [1979], J Gen Virol,45 683-701)。使用了至少100年的針對天花的疫苗接種的疫苗稱為痘苗病毒(VV)。不清楚的是，VV是否是來源于通過延長的連續(xù)傳代的痘苗病毒或牛痘病毒-目前已根除的活的代表物或者是遺傳重組的產物。此外，在W的歷史過程中，形成了許多痘苗株系。不同株系表現出不同的免疫原性，并涉及不同程度的潛在的并發(fā)癥，最嚴重的可引起接種后腦炎。然而， 許多這些株系用于針對天花的接種。例如NYCBOH、Western Reserve或Wyeth株系主要在美國使用，而Ankara、Bern、Copenhagen、Lister和MVA菌株在歐洲使用。WHO在1980年實施的VV不同株系的全球接種計劃而最終宣告天花病毒被成功根除。至今，VV主要在實驗室中使用的實驗菌株，除此之外，仍然被認為是正痘病毒屬的原型，這也是為什么VV成為研究最為詳細的病毒之一的原因所在(Fields Virology, ed. by Fields B. N. , Lippincott-Raven Publishers,3rd edition 1996，ISBN :0-7817-0253-4, Chapter 83 and 84)。VV和其它最近應用的痘病毒已被用于插入和表達外源基因。將外源基因插入到活的感染性痘病毒的基本技術包括，供體質粒上位于側接外源遺傳元件的痘病毒DNA序列與拯救痘病毒中存在的同源序列之間的重組。遺傳重組通常是兩條DNA鏈中的同源部分之間的交換。某些病毒RNA可以取代DNA。核酸的同源部分可以是具有相同核苷酸堿基序列的核酸序列(DNA或RNA)。在被感染的宿主細胞中，新病毒基因組的產生和復制過程中可能自然發(fā)生遺傳重組。因此，宿主細胞被兩個或更多不同病毒或其它遺傳構建體感染時，在病毒的復制循環(huán)過程中，病毒基因之間可能發(fā)生遺傳重組。來自第一基因組的DNA序列部分在構建與第二共感染的病毒中交換使用，其中所述DNA與第一病毒基因組的DNA之間具有同源性。通過修飾感染性病毒而使插入的DNA遺傳序列的成功表達要求兩個條件。第一， 插入在病毒的非必需區(qū)域以使被修飾病毒仍然能夠成活。表達所插入DNA的第二個條件是存在著與插入DNA合適關聯(lián)的啟動子。通常，啟動子位于要表達的DNA序列的上游。利用重組VV表達，如肝炎B病毒表面抗原(HBsAg)、流感病毒血凝素QnfHA)、或諾爾斯氏瘧原蟲孢子體抗原(Plasmodium knowlesi sporozoite antigen)，以作為活性疫苗預防疾病的感染，這些用途已被證實并已有綜述(Smith，et al. [1984]Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2,383-407)。VV的另一個優(yōu)點是單VV基因組能夠攜帶多個外源序列、基因或抗原的能力 (Smith & Moss [1983]，Gene，25(1) :21-28)。而且，已有報道稱用多價疫苗的單次接種能夠激發(fā)對多個異源感染性疾病的免疫(Perkus et al. , [1985], Science, Vol. 229,981-984) 0利用單個VV表達多個抗原的一個實例如Bray等所描述。重組VV能夠表達登革 (Dengue)病毒血清型4的三個不同結構蛋白，即衣殼(C)、pre-membrane (prM)、包膜(E)蛋白，以及登革病毒血清型4的兩個不同的非結構蛋白，即NSl和NS2a，其保護鼠抵抗對同源的登革病毒血清型 4 的攻擊(Bray et al.，[1989]，Virology 2853-2856) 登革病毒有4個血清型，即登革病毒血清型I(Den-I)至登革病毒血清型 4(Den-4)。對于能夠感染人而言，登革病毒是黃病毒(Flavivirus)屬中重要的成員之一。 登革病毒感染導致的疾病范圍可以是從類流感癥狀疾病到嚴重疾病或致死疾病，休克癥狀 (DSS)的登革出血熱(DHF)。登革病毒爆發(fā)仍然是熱帶和亞熱帶人口密集地區(qū)公共健康的主要問題，因為這些地區(qū)有大量的傳播媒介-蚊。由于登革病毒感染和其它由蚊介導黃病毒導致的疾病在全球許多地區(qū)傳播，因此投入很大努力來能阻止登革熱(DF)和登革出血熱(DHF)的登革病毒疫苗的進展，并使接種的個體能夠抵抗由某些或所有蚊介導黃病毒導致的疾病。而DF的大多數情況顯現在4種血清型中任何一種的第一次感染，比較多的DHF病情發(fā)生在被不同于第一次登革病毒感染的血清型的血清型的第二次感染的受試者中。這種現象使得認為，具有對一個登革病毒血清型抗體的個體受不同病毒血清型在適當間隔的連續(xù)感染時，可能導致在相當多的情況下發(fā)生DHF。因而，針對一種血清型接種疫苗，不能產生針對登革病毒感染完全保護，而只能針對的是同一登革病毒株系的感染。更為重要的是，接種了針對一種血清型的人，當該人受到不同血清型登革病毒的感染時更可能發(fā)生嚴重并發(fā)癥如登革出血熱。因此，需求包括針對所有4個登革病毒血清型的多價疫苗。至今有人建議通過一組重組VV制備多價疫苗，其中每一個VV編碼不同病毒的序列(Moss，[1990] Immunology，2，317-327)。然而，這種多價疫苗有幾個缺點。首先，獲得數個獨立的重組VV非常麻煩。除分別的產生程序之外，質量控制和質量保證非常耗費時間。 其次，用表達不同序列的重組病毒的混合物進行感染總是存在感染不是特別平衡的問題。 主要的風險在于只是單個重組體而不是多價疫苗中包含的所有不同的重組體感染靶細胞。 其中一個原因可能是重組病毒分布不均勻。另一個原因是，在感染單細胞時，不同重組病毒之間可能存在干擾。這種干擾現象就是已知的稱為超感染現象。這種情況下，只有某些抗原而不是多價疫苗中的所有不同抗原由被感染細胞最終表達，由此而呈遞到患者的免疫系統(tǒng)。結果，只獲得針對某些抗原的免疫保護，而遠不能提供針對通過多價疫苗呈遞或可呈遞的各種不同抗原的完全免疫保護。在針對登革病毒感染的疫苗中，不同序列的表達量不同或以未知的方式表達，也是使得多價疫苗具有缺點，如登革病毒2的包膜蛋白就顯示有這種情況(Deuble et al., [1988]，J. Virol 65 2853)，故這種接種對患者而言非常危險。利用重組痘苗病毒組的不完全接種，只能提供針對某些而不是所有血清型的登革病毒免疫保護。不幸的還有，在登革病毒的情況下不完全接種非常不能被接受，因為這增加了諸如登革出血熱等致死并發(fā)癥出現的機率。發(fā)明目的因此本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定、有效和可靠的疫苗，可針對由多于一個株系、 分化體(clade)、變種、亞型或血清型的致病微生物引起的感染性疾病的免疫保護。本發(fā)明的進一步的目的是提供一種穩(wěn)定、有效和可靠的針對登革病毒感染的疫苗，針對所有登革病毒血清型提供可靠的接種。本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明是基于來源于不同株系、分化體、變體、亞型或血清型的致感染病微生物包括在痘病毒同源基因中。正如上面已提到的，例如登革病毒的4個組、亞型或血清型均包括同一類型的基因，如編碼衣殼(C)蛋白基因，編碼Pre-Hiembrane(PrM)或包膜(E)蛋白的基因。然而，在4個血清型病毒的同一類型基因的核酸序列之間并不完全相同，也不完全同源，例如登革病毒血清型1、2、3和4(PrMl-4)的PrM基因之間的序列比較(Lasergene 4. 05Magalign,Macintosh)揭示序列同一性為66. 5-72. 9%，即同源性為65-75%。可以設想致感染病微生物的不同亞型的基因之間存在區(qū)別和變異，這是導致針對一種亞型的疫苗接種不能自發(fā)的提供針對同一微生物的其它變種感染的保護。因此，可以產生包括來源于不同株系、分化枝、變種、亞型或血清型的致傳染病微生物的非常相關或同源基因的重組病毒。然而，正如上面已提及的，同源序列之間的同源重組可在病毒生活周期中發(fā)生，甚至不是完全同源的DNA序列部分之間也能發(fā)生。因而，可以預期同源基因的插入到單個病毒基因組中可以引起同源重組，由此，在插入的同源基因中產生缺失。然而，當產生重組痘病病毒，其中包括在其基因組中至少兩個具有至少60%同源性的外源基因時，未料到插入在病毒基因組中的所述同源基因仍然保持穩(wěn)定。甚至優(yōu)選為至少50%同源性的同源基因插入到病毒基因組的不同插入位點，插入在病毒基因組中的所述同源基因仍然保持穩(wěn)定插入到病毒基因組。這種情況中，期望所述同源基因之間發(fā)生的重組事件能夠另外分別導致對于病毒的擴增或病毒生活周期重要的病毒基因的缺失，即期望病毒生活周期將嚴重受到損害。因此，此外，重組頻率與兩個連鎖基因的距離成比例，預期位于不同插入位點的兩個或多個同源基因之間的重組頻率將非常高，且進而導致所述基因的缺失和/或受到嚴重干擾。相應地，非常吃驚的發(fā)現沒有發(fā)生重組事件，而插入在病毒基因組中不同插入位點的所述同源基因仍然保持穩(wěn)定。根據以前技術，包含來自黃病毒，如日本腦炎病毒(Japanese Encaphalitis) (JEV)、黃熱病毒(YFV)和登革病毒的外源DNA的重組痘病毒是已知的(美國5514375)。然而，每個來自黃病毒的基因只單次插入，且在同一個插入位點。此外，用適合的計算機軟件 (Lasergene 4. 05 Magalign, Macintosh)進行序列比較揭示插入到痘病毒基因組中的基因的同源性，表明來自JEV的基因具有20.2% - . 6%、來自YFV的具有四.2% -45. 3%、來自登革病毒的具有22.8% - . 5%。在WO 98/13500中有類似公開，其描述了登革病毒抗原插入到修飾痘苗病毒 (Modified Vaccinia Virus)Ankara(MVA)的同一插入位點，尤其是插入到缺失位點II。美國專利5338683描述了皰疹病毒(herpesvirus)的糖蛋白基因gpl3和14插入到單個痘病毒的兩個不同位點，然而，兩個基因只具有25. 2%的同源性。流感病毒血細胞凝集素和插入到修飾痘苗病毒Ankara (MVA)的同一插入位點(缺失位入點III)核蛋白基因，兩者的序列同源性為49. 1% (美國專利5，676，950 ；Sutter et al.，[1994]，Vaccine 12 :1032)。美國專利5，891，442 披露了包含 infectious bursal disease 的多蛋白 VP2、VP3 和VP4的編碼序列的重組病毒。所述基因經過融合，插入到單個插入位點，所述基因之間的同源性為41. 9% -50. 3% ο最后美國專利6，217，882描述了包含插入到同一個位點，相互之間具有52. 7%的同源性的假狂犬病抗原gp50和gp63的重組豬痘病毒載體?？傊?，根據現有技術可以認為，具有至少50%同源性的同源基因或序列都是插入到病毒基因組的同一個或單個插入位點。根據本發(fā)明，具有至少50%同源性的同源基因或序列，即是指同源性為 50-100%，即至少有50%的核苷酸堿基相同。低于50%同源性的基因或序列被認為是異源的。在本發(fā)明上下文中，術語“同源”或“同源性”是用于描述當基因或序列之間進行比較時的情形，而術語“外源”基因、“外源性”或“異源”序列是當基因或序列與痘病毒基因組進行比較時的情形，即該術語指DNA序列在自然情況下與本發(fā)明使用的痘病毒通常不具有相關性。因此，本發(fā)明涉及包含至少兩個相對于病毒基因組是異源的基因的重組痘病毒，但所述兩個基因相互之間具有同源性。術語“基因”指編碼序列，編碼了如蛋白質、多肽、肽、抗原等。由同源基因翻譯而來的蛋白質、多肽或肽完成相同的作用(task)，且表現出相同的功能特性。同源基因通常來自不同但相關的來源或生物體。根據本發(fā)明的一個實施例，編碼序列的同源性優(yōu)選為70 %至80 %，更優(yōu)選為80 %至90 %或90 %至100 %。最優(yōu)選地，具有 65%至75%的同源性。由于根據本發(fā)明的重組痘病毒，僅在單個感染單元或同一個病毒顆粒中包含了相關的遺傳信息，因此不存在不均勻感染和不同的同源序列的不平衡表達的問題。因而，根據本發(fā)明的重組痘病毒，在一個感染細胞中包含并能表達幾個緊密或甚至非常緊密的相關基因或幾乎完全相同的序列，這對于產生多價疫苗尤其有好處。該好處對于研制針對由幾個緊密相關的株系或血清型的病毒如登革病毒引起的疾病的疫苗中非常有意義。包含不同登革病毒血清型的同源基因的重組痘病毒將在實施例中進行描述。根據本發(fā)明的同源基因或序列可以來源于任何微生物，如除載體病毒之外的任何病毒、任何細菌、真菌或寄生蟲。優(yōu)選地，同源基因或序列來源感染性或病原微生物，最優(yōu)選來源于所述微生物不同的株系或分化枝、變種、亞型或血清型。術語“株系”或“分化枝”作為技術術語，用于描述微生物分類級別，對本領域技術人員而言非常熟知。至今分類體系將所有已鑒定的微生物分類到hierarchic順序，科、 屬、禾中、株系(Fields Virology, ed. by Fields B.N.，Lippincott-Raven Publishers，4th edition 2001)。對科的成員的分類標準是它們的系統(tǒng)發(fā)育關系，屬包括具有共同特性的所有成員，種被定義為多特性類(polythetic class)，組成復制譜系并存在于特定的生態(tài)位。 術語“株系”或“分化枝”用于描述微生物即病毒的分類級別，是指具有共同特性，諸如基本形態(tài)或基因組結構或組織，但生物學性質，如宿主范圍、組織向性、地理分布、減毒或致病性等方面不同。術語“變種”或“血清型”是對同一株系的成員作進一步區(qū)分，也叫“亞型”，對由于微小的基因組變異而表現出單個感染譜或抗原特性不同的成員進行區(qū)分。根據本發(fā)明的進一步實施方式，同源基因或序列選自于病毒，優(yōu)選的是屬于黃病毒屬的病毒，如優(yōu)選但不局限于登革病毒、西尼羅(West Nile)病毒或日本腦炎病毒； 屬于反轉錄病毒(Retroviruses)屬的病毒，如優(yōu)選但不局限于人免疫缺陷病毒(HIV)； 屬于腸道病毒(Enteroviruses)屬的病毒，如優(yōu)選但不局限于手(Hand)、足(Foot)和口腔(Mouth)疾病、EV71;屬于輪狀病毒(Rotaviruses)屬的病毒或屬于正粘病毒 (Orthomyxoviruses)屬的病毒，如優(yōu)選但不局限于流感病毒。最優(yōu)選來源于黃病毒的同源基因。根據本發(fā)明的進一步實施方式，同源基因選自于登革病毒基因，優(yōu)選為C、NS1和/ 或NS2，或優(yōu)選為E，更優(yōu)選為PrM。最優(yōu)選來源于病毒的不同血清型的同源基因，其中所述基因可來自登革病毒所有4個血清型中的1、2、3或4個血清型。根據本發(fā)明的進一步實施方式，同源基因選自不同HIV株系或分化枝。優(yōu)選的同源基因選自gag/pol編碼序列，更優(yōu)選為erw編碼序列或更進一步優(yōu)選為HIV的結構和/ 或調控性編碼序列。本發(fā)明所用的合適病毒載體選自痘病毒，它可容易的在所選擇的宿主細胞如鳥宿主細胞中培養(yǎng)，但在人體或人細胞中高度復制缺陷型或實際上不能復制。根據某些優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的痘病毒選自金絲雀痘(canarypox)病毒 (Plotkin et al. [1995]Dev Biol Stand, vol 84 :pp 165-170. Taylor et al. [1995]Vaccine, Vol 13. No. 6 :pp 539-549)、禽痘病毒(Afonso et al. [2000]J Virol, pp3815-3831. Fields Virology, ed. by Fields B. N. , Lippincott-Raven Publishers, 4th edition 2001, Chapter 85 :page 2916) > 企我鳥 III (penguin pox) (Stannard et al. [1998]J Gen Virol, 79, pp 1637-1649)或它們衍生物。由于這些病毒屬于禽痘病毒 (Avipoxviruses)屬，因而在禽細胞中非常容易培養(yǎng)和增殖。然而，在人體或人細胞中它們屬于復制缺陷型，而基本上不能或幾乎不能產生感染性子代病毒。根據本發(fā)明進一步的實施方式，痘苗病毒，優(yōu)選為減毒痘苗病毒用于產生包含兩個或多個同源基因的重組痘病毒。雖然，已知痘苗病毒(VV)在存在短的同源序列時即可進行產生同源重組，進而缺失同源序列(Howley et al.，[1996]，Gene 172 :233-237)，本發(fā)明提供包括穩(wěn)定插入到其基因組中的同源序列或基因的重組痘苗病毒。該發(fā)現尤其預料不到，因為根據Howely等， 短序列長至300堿基對(bp)即足以誘發(fā)痘苗病毒的基因組重排和同源序列的缺失。因而， 本領域技術人員可以設想更長的序列將會有更大可能性地誘發(fā)重組。然而，根據本發(fā)明甚至包含完全同源基因的序列都能穩(wěn)定的插入到痘苗病毒基因組中。一個痘苗病毒的例子，是高度減毒且宿主范圍受限的痘苗株系，即修飾痘苗病毒 Ankara (MVA) (Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12 :1032-40)，但不局限于該例子。MVA 是通過痘苗病毒Ankara(CVA)株系在雞胚胎纖維原細胞中連續(xù)約570傳代而獲得的(綜述參見Mayr，A.，et al. [1975], Infection3，6-14)。由于長期傳代的CVA缺失了大約 311Λ的基因組序列。所獲得的病毒株系，即MVA，被描述為宿主細胞高度受限(Meyer，H.et AL.，J. Gen. Virol. 72，1031-1038 [1991])。典型 MVA 株系是 MVA 575，保藏于歐洲動物細胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)，其保藏號為 ECACC V00120707。在另一個實施方式中，MVA-Vero株系或其衍生物可以用于本發(fā)明。MVA-Vero株系保藏于歐洲動物細胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏號ECACCV99101431和ECACC 01021411。 MVA-Vero的生物學、化學和物理特性所反應出的安全性可參見國際專利申請PCT/ EP01/02703。與常規(guī)MVA相比，MVA-Vero基因組還有另外一個缺失。根據本發(fā)明，術語病毒的“衍生物”指子代病毒具有與親本病毒相同的特征，但在其基因組中有一或多個部分的差異。根據本發(fā)明的另外實施方式，使用MVA-BN。MVA-BN保藏于歐洲動物細胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏號ECACC V00083008。通過使用MVA-BN或其衍生物，來產生特別安全的病毒疫苗，因為MVA-BN病毒是來自修飾痘苗Ankara病毒，且表現出極其減毒的病毒。因此，在最優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的包含兩個或多個同源基因的MVA-BN或其衍生物用作病毒載體。術語“MVA-BN的衍生物”是指與MVA-BN有相同功能特性的病毒。W002/4M80中描述了 MVA-BN的特征、用于評價MVA是否是MVA-BN或其衍生物的生物學分析方法及產生MVA-BN 或其衍生物的方法(在此將該文獻引入作為參考)。一個簡便的檢測MVA-BN或其衍生物的功能特性的方法是檢測它對人HaCat細胞的減毒特性和在其中缺乏復制。根據本發(fā)明的重組痘病毒，其外源序列表達的控制優(yōu)選通過痘病毒轉錄調控元件，更優(yōu)選通過MVA、金絲雀痘病毒、禽痘病毒或企鵝痘病毒轉錄調控元件，或最優(yōu)選通過痘苗病毒啟動子進行調控。根據本發(fā)明的痘病毒轉錄調控元件進一步包括在痘病毒系統(tǒng)中起作用的每一個轉錄調控元件。根據本發(fā)明，外源序列優(yōu)選插入到病毒基因組的非必需區(qū)域。非必需區(qū)域例如是痘病毒的基因座(loci)或開放閱讀框(ORF)，這些區(qū)域對痘病毒的生活周期不是必需的。 在本發(fā)明中，基因間序列即兩個ORF之間的區(qū)域也認為是非必需區(qū)域。在本發(fā)明的另外實施方式中，外源序列插入到MVA基因組天然發(fā)生的缺失位點(公開于PCT/EP96/(^^6，將其引入本申請作為參考)。插入DNA的方向對本發(fā)明的重組病毒的功能或穩(wěn)定性沒有影響。由于根據本發(fā)明的重組痘病毒，其生長非常有限，因而高度減毒，因此是理想的適合治療哺乳動物包括甚至免疫失常的人的候選疫苗。因此，本發(fā)明也提供一種藥物組合物， 和疫苗，用于誘導活動物體包括人的免疫反應。藥物組合物通常可包括一或多種藥物學可接受和/或認可的載體、添加劑、抗生素、防腐劑(preservative)、佐劑、稀釋劑和/或穩(wěn)定劑。這些輔助成分可以是水、鹽、甘油、 乙醇、潤濕劑(wetting)或乳化劑、pH緩沖物質等。合適的載體典型的是分子量高、代謝緩慢的分子如蛋白質、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸交酯酸(polyglycollic acids)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂質聚集體(lipid aggregates)等。為了制備疫苗，本發(fā)明的重組痘病毒被轉換成一種生理學可接受形式?？苫卺槍μ旎ǖ拿庖呓臃N中使用的痘病毒疫苗的制備經驗來完成這一目的(可見于乂1沙1，!1. et al. [1974]Dtsch. med. ffschr. 99,2386-2392)。例如，純化病毒以 5X10E8 TCID50/ml 的效價， 制成約IOmM Tris,140mM NaCl pH7. 4劑型，于_80°C保存。為制備疫苗顆粒(shot)，如在每一針藥管(ampoule)中，優(yōu)選為玻璃針藥管中將10E2-10E8個病毒顆粒于含有2%蛋白胨和人血蛋白的100ml磷酸鈉緩沖液(PBQ中冷凍。任選地，疫苗顆粒(shot)也可通過逐步凍干制劑中病毒來獲得。這種制劑可以包含額外的適于體內給藥的添加劑，如甘露醇、 右旋糖苷、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或其它酸如抗氧化劑或惰性氣體、穩(wěn)定劑或重組蛋白(例如人血清蛋白)。然后將玻璃針藥管密封，可在4°C至室溫下保存數月。然而， 不需要使用的針藥管優(yōu)選在低于-20°C保存。為了免疫接種或治療之用，凍干物可以溶解于0. 1至0. 5ml水溶液中，優(yōu)選溶于生理鹽水或Tris緩沖液中，可通過系統(tǒng)或局部給藥，即腸胃外給藥、皮下、靜脈、肌肉、通過破皮(scarification)給藥或其它本領域技術人員熟知的方式進行給藥。給藥形式、劑量和給藥次數可通過本領域已知方式來進行優(yōu)化。然而，最常見的接種方式是在第一次接種后， 隔約1月至6周進行第二次接種。本發(fā)明的重組病毒可用于將外源編碼序列導入到靶細胞中。將外源編碼序列導入到靶細胞中可分別產生體外蛋白、多肽、肽、抗原和抗原表位。此外，同源或異源序列導入到細胞中的方法可適用于體外和體內治療。對于體外治療，分離在活體外(ex vivo)被本發(fā)明重組痘病毒感染的細胞，對活體動物給藥以誘導免疫反應。對于體內治療，本發(fā)明重組痘病毒直接對活體動物給藥以誘導免疫反應。在這種情況中，接種位點周圍的細胞直接被本發(fā)明病毒或其重組體所感染。感染之后，細胞合成外源編碼序列編碼的蛋白質、多肽、肽或抗原，繼而這些物質或其部分呈遞在細胞表面。免疫系統(tǒng)的特異性細胞識別上述蛋白質、多肽、肽、抗原和抗原表位的存在，進而啟動特異的免疫反應。獲得重組痘病毒或將外源編碼序列插入痘病毒基因組中的方法是本領域技術人
1員非常熟知的。此外，實施例中也描述了這些方法，并且可以從下述參考文獻中推導出或完全獲得這些方法-Molecular Cloning，A laboratory Manual. Second Edition. By J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989 :描述了標準分子生物學技術及知識，如DNA克隆、DNA和RNA的分離、Western印跡分析、RT-PCR和PCR 擴增技術。-Virology Methods Manual. Edited by Brian WJ Mahy and Hillar OKangro. Academic Press. 1996 描述了處理和操作病毒的技術。-Molecular Virology :A Practical Approach. Edited by AJ Davison and RM Elliott. The Practical Approach Series. IRL Press at Oxtord University Press. Oxford 1993. Chapter 9 :利用痘病毒載體表達基因。-Current Protocols in Molecular Biology. Publisher :John Wiley and Son Inc.1998. Chapter 16,section IV :Expression of proteins in mammalian cells using Vaccinia viral vector :描述了對MVA進行處理、操作和遺傳工程技術及知識。為產生本發(fā)明的重組痘病毒，可以使用不同的方法將欲插入到病毒的DNA序列置于E. coli質粒構建體，該質粒中已插入與痘病毒DNA部分同源的DNA。另外，欲插入的 DNA序列連接有啟動子。啟動子-基因的連鎖在質粒構建體中的方向以使該啟動子-基因連鎖兩側是與包含非必需基因座的區(qū)側接的DNA序列同源的DNA。所獲得的質粒構建體通過在大腸桿菌中生長而擴增和分離。分離出的包含欲插入的DNA基因序列的質粒與痘病毒一起轉染到細胞培養(yǎng)物，如雞胚胎纖維原細胞(CEF)中。質粒中的同源pox DNA與病毒基因組之間發(fā)生重組分別得到含外源DNA序列的修飾痘病毒。根據一個更優(yōu)選的方式，合適的細胞培養(yǎng)物的細胞，如CEF細胞，被痘病毒感染。 被感染的細胞接著用包含外源基因的第一質粒載體進行轉染，其中外源基因優(yōu)選地受痘病毒表達調控元件的轉錄調控。如上所解釋，質粒載體也包括這種序列，該序列能夠指導將外源序列插入到痘病毒基因組中選定部位?？蛇x地，質粒載體也可包括含可操作連接于痘病毒啟動子的標記和/或選擇基因的表達盒。合適的標記或選擇基因例如是編碼綠色熒光蛋白、半乳糖苷酶、新霉素、磷酸核糖基轉移酶或其它標記的基因。使用選擇或標記基因表達盒可簡化對所產生的重組痘病毒的鑒定和分離。然而，也可用PCR技術來鑒定重組痘病毒。接下來，用上述獲得的重組痘病毒對細胞進一步感染并用包含與包括在第一載體中的基因同源的基因的第二載體進行轉染。這種情況中，該基因應當包括在痘病毒的不同的插入位點，第二載體的指導同源基因整合到痘病毒基因組的序列也是不同的。在同源重組發(fā)生后，可以分離包含兩個同源基因的重組病毒。用在先前感染步驟分離到的重組病毒和包括另外的用于轉染的同源基因的另一載體來重復進行感染和轉染，這樣可以將兩個以上的同源基因導入到重組病毒中。任選地，上面描述的感染和轉染步驟可以互換，即可以首先用包含外源基因的質粒載體轉染合適的細胞，再用痘病毒感染該細胞。進一步可選地，也可以將每一個同源基因導入不同病毒，再用所有獲得的重組病毒共感染細胞，再篩選出包括所有同源基因的重組體。本發(fā)明進一步提供包括兩個或更多個質粒載體構建體的試劑盒，可以將可表達的同源基因整合進痘病毒基因組中。除有合適的克隆位點之外，這種質粒載體包括能夠指導外源序列插入到痘病毒選定部位的序列?？蛇x地，這種載體包括選擇或標記基因表達盒。所述試劑盒進一步包括選擇病毒的試劑和說明書，所述病毒是一或多個同源基因的重組體， 并可選地選擇或標記基因，通過所述載體構建體而插入。根據本發(fā)明的另一實施方案，包括來自于或同源于本發(fā)明重組痘病毒的DNA序列或其部分。這種序列至少包括本發(fā)明的至少一個同源基因的片段的外源序列部分和至少包括本發(fā)明痘病毒基因組序列的片段，所述痘病毒基因組序列優(yōu)選側接外源序列。這種DNA序列可以用于鑒定或分離病毒或其衍生物，如利用它們來產生PCR引物、 雜交探針或用于矩陣技術中(array technologies)附圖簡述

圖1 根據實施例1，4個= pre-membrane)基因(血清型1_4)在MVA基因組中的插入位點的示意圖。圖2-9和12-17 顯示插入質粒載體構建體，并注明載體名稱、大小和目的序列位置，如AmpR=氨芐青霉素抗性基因、bfp =藍色熒光蛋白基因、dA=缺失A、dE =缺失E、d2 =缺失2、Ecogpt = Ε. coli鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因、EGFP =增強型綠色熒光蛋白基因、Fl =側翼序列1、F2 =側翼序列2，I4L =間隔區(qū)I4L、IGR =間隔區(qū)、NPT II =新霉素抗性基因、P =痘病毒啟動子、pr7. 5 =痘苗啟動子7. 5,PrM =登革病毒的pre-membrane基因，數值表示來自4個血清型中的哪一個、rpt =重復側翼序列。圖10 對4個不同插入載體(pBN49，PBN50，PBN40，PBN39)的載體克隆技術進行的 PCR驗證。每一個質粒用4個不同PCR引物組合進行檢測。每一個組合特異于整合到一個明顯不同插入位點的一個明顯不同的PrM序列。圖11 包含4個同源登革病毒的PrM基因的重組痘病毒的PCR驗證(實施例1)。 在凝膠的上半部顯示了重組病毒的不同PCR結果，下半部顯示對照質粒的相同PCR反應的結果。包含在質粒中的同源序列分別命名為pBN39、pBN49或pBN50。PrM代表插入的登革病毒pre-membrane基因，其中數值表示它來源于4個血清型中哪一個血型。dA =缺失A、 dE =缺失E、d2 =缺失2、I4L =間隔區(qū)I4L，用于描述外源DNA的插入位點。圖18 根據實施例2，3個PrM基因(血清型2_4)在MVA基因組中的插入位點示意圖。圖19 包含3個同源登革病毒PrM基因插入到間隔區(qū)的重組痘病毒的PCR驗證 (Example 2)。上面凝膠圖顯示特異于PrM2的PCR反應結果，中間的凝膠圖顯示特異于PrM3 的PCR反應結果，最下面的凝膠圖顯示特異于PrM4的PCR反應結果。泳道8顯示對照質粒的相同PCR反應的結果。第2道顯示空載體對照MVA。PrM代表插入的登革病毒pre-membrane 基因，其中數值表示它來源于4個血清型中哪一個血清型。M =分子量標記。下面的實施例將進一步闡明本發(fā)明。本領域技術人員應當理解為所提供的實施例不以任何方式而將對本發(fā)明的應用限制在這些實施例。實施例1插入載體缺失A的插入載體為了在MVA基因組中相應的基因組位置7608-7609處的稱為缺失A或缺失1的位點插入外源序列，構建了包含缺失位點A附近約600bp的側翼序列的質粒載體。用合適的計算機程序(DNAsis，Hitashi software engeneering, San Bruno，USA)來設計合適 PCR 引物，以用于分離來自MVA-BN基因組的側翼序列。這種引物包括延長有限制性酶切位點的突出(extension)，用于將側翼序列克隆到載體質粒上。在側翼序列之間，引入選擇基因表達盒，如受痘病毒啟動子轉錄調控下的NPT II基因(新霉素抗性基因)。此外，具有克隆位點以便插入另外的欲插入到缺失位點A的基因或外源序列。根據本發(fā)明的一個如此載體構建體如圖2所示(ρΒΝΧΙΟ)。缺失E的插入載體為了在MVA基因組中相應的基因組位置170480-170481處的稱為缺失E或缺失4 的位點插入外源序列，構建了包含缺失位點E附近約600bp的側翼序列的載體。按上述類似的方法設計和構建載體。在側翼序列之間置有受痘病毒啟動子轉錄調控下的EGFP基因 (綠色熒光蛋白，Clonetech)。此外，具有克隆位點以便插入另外的欲插入到缺失位點E的基因或序列。根據本發(fā)明的一個如此載體構建體如圖3所示(pBNX32)。缺失2的插入載體為了在MVA基因組中相應于基因組位置120718-20719處的稱為缺失2的位點插入外源序列，構建了包含缺失位點2附近約600bp的側翼序列的載體。按上述類似的方法設計和構建載體。在側翼序列之間置有受痘病毒啟動子轉錄調控下的Iibfp基因(人源化藍色熒光蛋白，Pavalkis GN et al.)。此外，具有克隆位點以便插入另外的欲插入到缺失位點2的基因或序列。根據本發(fā)明的一個如此載體構建體如圖4所示(pBNX36)。間隔區(qū)I4L的插入載體為了在MVA基因組中的間隔區(qū)，即相應于基因組位置為56760處的ORF I3L和I4L 之間插入外源序列，構建了包含在I4L基因座間隔區(qū)附近約600bp的側翼序列的載體。按上述類似的方法設計和構建載體。在側翼序列之間置有受痘病毒啟動子轉錄調控下的Ecogpt 基因(或gpt，代表分離自大腸桿菌的磷酸核糖基轉移酶)。此外，其具有克隆位點以便插入另外的欲插入到I4L ORF之后間隔區(qū)的基因或序列。根據本發(fā)明的一個如此載體構建體如圖5所示(pBNX39)。構建包含在其基因組中整合了數個同源基因的重組痘病毒插入載體為了將分別來自登革病毒4個血清型的4個PrM基因插入到MVA基因組中，使用了 4個單獨的重組載體。如上面的詳細描述，這些載體包含與MVA基因組同源的序列，以便通過同源重組而靶向插入。此外，每一個載體包含選擇或報道基因表達盒。登革病毒的4個血清型的PrM序列是通過寡核苷酸(oligo)退火和PCR擴增而合成的。將PrM序列克隆到痘病毒啟動子元件的下游以形成表達盒。該表達盒接著克隆到相關插入載體構建體中的克隆位點。結果，缺失A的插入載體構建體包含登革病毒血清型2的PrM基因(圖6_pBN39)。 缺失2的插入載體構建體包含登革病毒血清型1的PrM基因(圖7-pBN49)。間隔區(qū)I4L的插入載體包含登革病毒血清型3的PrM基因(圖8-pBN50)。對于缺失E的插入載體包含登革病毒血清型4的PrM基因(圖9-pBN40)
插入載體的PCR驗證為了檢驗克隆策略是否成功，進行了 PCR分析。為進行PCR分析，引物選擇對如下引物組合特異于結合與插入位點相關的側翼序列的引物，第二條引物特異結合登革病毒的高同源性PrM基因之一。對于包含登革病毒血清型2的PrM基因的缺失A的插入載體，所用的篩選引物是oBN93(CGCGGATCCATGCTGAACATCTTGAACAGGAGACGCAGA.SEQ ID NO. 1)禾P oBN477 (CATGATAAGAGATTGTATCAG. SEQ ID NO. :2)。對于包含登革病毒血清型1的PrM基因的缺失2的插入載體，所用的篩選引物是 oBN194(ATGTTGAACATAATGAACAGGAGGAAAAGATCTGTGACCATGCTCCTCATGCTGCTGCCCACAGCCCTGG CGTTCCATCT. SEQ ID NO. 3)和 oBN476(GATTTT GCTATTCAGTGGACTGGATG. SEQ IDN0. :4)。對于包含登革病毒血清型3的PrM基因的間隔區(qū)I4L的插入載體，所用的篩選引物是oBN255(CCTTAATCGAATTCTCATGTCATGGATGGGGTAACCAGCATTAATAGT. SEQ ID NO. 5)和 oBN479(GCTCCCATTCAATTCACATTGG. SEQ ID NO. :6)。對于包含登革病毒血清型4的PrM基因的缺失E的插入載體，所用的篩選引物是 oBN210 (ATCCCATTCCTGAATGTGGTGTTAAAGCTACTGAGCGCTTCTCTCGTCTCCGTTCTCCGCTCTGGGTGCA TGTCCCATAC. SEQ ID NO. 7)和 oBN478 (GTACATGGATGATATAGATATG. SEQ ID NO. :8)。在PCR儀即Thermal cycler GeneAmp 9700 (Perkin Elmer)中，用包含 IOx PCR緩沖液，MgClJl沖液和Taq DNA聚合酶的Taq DNA聚合酶試劑盒(Roche，Cat. no. 201205)或相當物來進行PCR實驗。通常，PCR反應要求在50 μ 1反應總體積中包含45ul的mastermix、 樣品 DNA 和 ddH20。其中應當由 30. 75 μ 1 DdH2O, 5 μ L IOx buffer, 1 μ 1 dNTP 混合物(每一種 IOmM)，2. 5 μ 1 每一種引物(5pmol/ μ 1)，3 μ 1 MgCl2 (25mM)和 0· 25 μ 1 Taq-DNA 聚合酶(5U/y 1)來制備成 mastermix。按如下參數進行擴增反應1)變性4 分鐘 94 °C2) 30 個循環(huán)變性30秒94 °C退火30秒55 °C延伸1-3分鐘 72 °C3)延伸7 分鐘 72 °C4)保存94°C ；根據插入基因的大小，延伸時間至少為1分鐘/kb。圖10中顯示的PCR結果，表明對于單個插入而使用的引物組合具有特異性。oBN194/oBN476引物組合特異于缺失2和插入其中的PrMl。對質粒pBN49進行 PCR擴增的片段預期為678bp(示于第3道，凝膠的上半部)。oBN255/oBN479引物組合特異于間隔區(qū)I4L和插入其中的PrM3。對質粒pBN50進行PCR擴增的片段預期為825bp (示于第9道，凝膠的上半部)。oBN210/oBN478引物組合特異于缺失E和作為插入物的PrM4。對質粒pBN40進行 PCR擴增的片段預期大小為607bp(示于第5道，凝膠的下半部)。oBN93/oBN477引物組合特異于缺失A和插入其中的PrM2。對質粒pBN39進行PCR
14擴增的片段預期為636bp(示于第11道，凝膠的下半部)。經同源重組產生重組MVA為通過重組MVA中表達外源基因，可通過稱為同源重組的方法將需要表達的基因插入到病毒基因組中。為此目的，將目的外源基因克隆到如上所述的插入載體中。再將該載體轉染已被MVA-BN感染的細胞。在被感染和轉染的細胞質中發(fā)生重組。利用包含在插入載體中的選擇和/或報道基因表達盒，可以鑒定和分離出含有重組病毒的細胞。同源重組為進行同源重組，BHK (幼倉鼠腎Baby hamster kidney)細胞或CEF (原生雞胚胎纖維原)細胞在6孔平板上接種培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基是DMEM (Dulbeccc/s Modified Eagles Medium, Gibco BRL)+10%牛胎血清(FCS)或為了無血清生產程序，則用VP-SFM (Gibco BRL) +4mmol/l L-谷氨酸作培養(yǎng)基。為了保持細胞處于生長階段，并因此應當在轉染那天達到60-80 %融合 (confluence)，在進行接種培養(yǎng)之前對細胞計數，作為已知細胞數來確定感染復數(moi)。為了進行感染，MVA母液在DMEM/FCS或VP-SFM/L-谷氨酸中稀釋至500 μ 1稀釋液中大約含有的合適病毒數可獲得0.01的moi。可設想細胞在培種培養(yǎng)后會分裂一次。 去除培養(yǎng)基，于室溫用500 μ 1稀釋病毒液感染1小時。去除接種物后，用DMEM/VP-SFM洗滌。被感染細胞分別置于1. 6mlDMEM/FCS和VP-SFM/L-谷氨酸以用于轉染反應(Qiagen Effectene Kit)。使用“Effectene”轉染試劑盒^jiagen)來進行轉染。1-5 μ g線性化插入載體(多次轉染的總量)于最終體積為150 μ 1的緩沖液EC中而制備轉染混合液。每μ g DNA加入 8. 0 μ 1 Enhancer,旋渦后于室溫培育5分鐘。然后，在旋渦母液試管后，每μ g DNA加入 25 μ 1 Effectene,通過旋渦充分混勻溶液，并于室溫培育10分鐘。分別加入600 μ DMEM/ FCS或VP-SFM/L-谷氨酸，混勻，接著整個轉染混合液加入到已用培養(yǎng)基履蓋的細胞。輕輕搖動平板，混合以進行轉染反應。于37°C和5% CO2條件下培育過夜。第二天去除培養(yǎng)基， 用新鮮DMEM/FCS或VP-SFM/L-谷氨酸代替。持續(xù)培育直到第3天。為了收集細胞，將細胞刮到培養(yǎng)基中進而懸浮，并將細胞懸浮液轉移到適當試管中，若短期保存可于-20°C冷凍保存，若長期保存則在-80°C冷凍保存。將PrM4插入到MVA中在第一輪中，按上述程序用MVA-BN感染細胞，再用包含登革病毒血清型4的PrM 基因和EGPF作為報道基因的插入載體pBN40進行感染。由于轉染載體中含有報道基因 EGFP,因此最遲在第3天即可在被重組病毒感染的細胞中檢測到所合成的蛋白質。獲得的重組病毒用噬斑純化法進行純化。用移液管管尖分離被感染細胞(發(fā)熒光或染色)，在200 μ L PBS或培養(yǎng)基中重懸浮和抽吸，以進行噬斑純化。然后，包含約10Ε6個細胞的新培養(yǎng)皿用100 μ 1重懸浮噬斑進行感染。48小時后，細胞懸浮于300 μ 1 PBS中。從懸浮液中抽提DNA，用PCR分析進行篩選。選擇出顯示預期條帶的克隆，并用該病毒以不同量感染新鮮6孔平板。用瓊脂糖覆蓋住孔以防止病毒的撒布。48小時后即可分離包含重組病毒克隆的被感染細胞。重復該過程，直到用PCR不能檢測到野生型MVA-BN為止。經過4輪噬斑純化后，用能夠選擇性擴增預期插入(如上所述的ΟΒΝ210和0BN478)的引物對進行PCR分析，以鑒定重組病毒即MVA_PrM4，其中對照引物對能特異識別插入位點缺失 E(oBN453 GTTGAAGGATTCACTTCCGTGGA, SEQ ID NO. 9 和 oBN454 GCATTCACAGATTCTATTGTGAGTC, SEQ ID NO. :10)。
將 PrM2 插入到 MVA_PrM4按上面描述的方法用MVA_PrM4感染細胞，并進一步用包含登革病毒血清2的PrM 基因和NPT II (新霉素抗性基因)作為選擇基因的插入載體pBN39進行感染。為了純化表達抗生素抗性基因的重組MVA，推薦最好是病毒在選擇條件下擴增3輪再進行噬斑純化步驟。因此加入G418到培養(yǎng)基中，以選擇新霉素磷酸轉移酶。G418是新霉素的衍生物，通過干擾核糖體的功能而抑制蛋白質的合成。NPT基因的活性可通過磷酸化而使G418失活。在新霉素選擇存在下，進行16輪噬斑純化后，用能夠選擇性擴增預期插入 (如上所述的oBN93和OBN477)的引物進行PCR分析，以鑒定重組病毒即MVA_PrM4/ PrM2，其中對照引物對特異性識別插入位點缺失A (如上的OBN477)和oBN452 GTTTCATCAGAAATGACTCCATGAAA, SEQ IDN0. :11)。此外，PrM4 在缺失 E 的插入用下述引物對進行驗證oBN210-oBN478 和 oBN453_oBN454。將PrMl 插入 MVA在第一輪中，按上述程序用MVA-BN感染細胞，再用含有登革病毒血清型1的PrM 基因和tibfp作為報道基因(人源化藍色熒光蛋白基因)的插入載體PBN49進行轉染。在用重組病毒感染細胞的第3天即可檢測到合成的tibfp蛋白。獲得的重組病毒用噬斑純化法進行純化。經過10輪噬斑純化后，用能夠選擇性擴增預期插入(如上所述的οΒ^94和 0BN476)的引物對進行PCR分析，以鑒定重組病毒即MVA-PrM4，其中對照引物對能特異識別插入位點缺失 2(oBNM :CGGGGTACCCGACGAACAAGGAACTGTAGCAGAGGCATC，SEQ ID NO. :12 禾口 oBN56 :AACTGCAGTTGTTCGTATGTCATAAATTCTTTAATTAT, SEQID NO. 13)。將PrM3 插入 MVA在第一輪中，按上述程序用MVA-BN感染細胞，再用含有登革病毒血清型3的PrM 基因和Ecogpt基因(Ecogpt或簡寫成gpt，代表磷酸核糖基轉移酶基因)作為報道基因的插入載體pBN50進行感染。獲得的重組病毒通過3輪噬斑純化，選擇條件上添加霉酚酸、 葉黃素和次黃嘌呤以對磷酸核糖基轉移酶代謝進行選擇。霉酚酸抑制次黃苷單磷酸脫氫酶，導致嘌呤合成受阻，因而在大部分細胞系中抑制病毒復制?？梢酝ㄟ^組成性啟動子的 Ecogpt的表達以及提供葉黃素和次黃嘌呤作為底物可克服這種受阻。用能夠選擇性擴增預期插入(如上所述的OBN255和oBN479)的引物進行 PCR分析，以鑒定獲得的重組病毒即MVA-PrM3，其中對照引物對能特異識別插入位點 I4L(oBN499 :CAACTCTCTTCTTGATTACC, SEQ ID NO. :14 和 oBN500 :CGATCAAAGTCAATCTA TG, SEQ ID NO. :15)。MVA-PrMl 和 MVA_PrM3 的共感染用等量的按上述方法獲得的MVA-PrMl和MVA_PrM3感染細胞。在用磷酸核糖基轉移酶代謝選擇重組病毒的藍色熒光克隆，如此進行3輪噬斑純化，對純化的重組病毒用引物對(如上述的 OBN255 和 oBN479、oBN499 和 oBN500、oBN194 和 oBN476、oBN54 和 oBN56) 進行PCR分析。獲得的重組病毒稱為MVA-PrMl/PrM3。
MVA-PrMl/PrM3 和 MVA_PrM2/PrM4 的共感染用等量的按上述方法獲得的MVA-PrMl/PrM3和MVA-PrM2/PrM4感染細胞。在用磷酸核糖基轉移酶代謝和新霉素選擇以進行噬斑純化。分離出能產生綠色和藍色熒光的重組病毒，并用引物對(如上述的 OBN255 和 oBN479、oBN499 和 oBN500、oBm94 和 oBN476、oBN54 和 oBN56、oBN93 和 oBN477、oBN477 和 oBN452、oBN210 和 oBN478、oBN453 和 oBN454)進行 PCR分析。如圖11所示，對重組病毒(Clone 20)的PCR分析表明，包含所有4個PrM基因。 凝膠的上半部顯示了對重組病毒進行不同PCR的結果，下半部分顯示對照質粒進行的相同 PCR反應的結果(如所標出的)。第1、10和11道為Ikb和IOObp分子量標記。引物組合oBN210/oBN478特異于缺失E和插入其中的PrM4。對重組病毒和質粒 PBN40進行PCR的擴增片段預期為607bp (示于第2道)。引物組合OBN453/OBN454特異于缺失E。對重組病毒進行PCR的擴增片段預期為 2. 7kp，對于野生型病毒為2. 3kb (示于第3道)。在凝膠上半部也顯示有野生型病毒的特異性條帶。這表明制備的重組病毒還沒有完全去除野生型病毒。有必要進一步進行噬斑純化。引物組合oBN93/oBN477特異于缺失A和插入其中的PrM2。對重組病毒和質粒 PBN39進行PCR的擴增片段預期為636bp (示于第4道)。引物組合OBN477/OBN452特異于缺失A。對重組病毒進行PCR的擴增片段預期為 4. lkb，對于野生型病毒為2. 7kb(示于第5道)。凝膠上部分可以鑒定特異于野生型病毒的條帶。引物組合oBN255/oBN479特異于間隔區(qū)I4L和插入其中的PrM3。對重組病毒和質粒pBN50進行PCR的擴增片段預期為825bp (示于第6道)。引物組合OBN499/OBN500特異于間隔區(qū)I4L。對重組病毒進行PCR的擴增片段預期為1. Okb，對于野生型病毒為0. 3kb (示于第7道)。引物組合οΒ^94/οΒΝ476特異于缺失2和插入其中的PrMl。對重組病毒和質粒 PBN49進行PCR的擴增片段預期為678bp (示于第8道)。引物組合oBN54/oBN56特異于缺失2。對重組病毒進行PCR的擴增片段預期為 1. 6kp，對于野生型病毒為0. 9kb (示于第9道)。在凝膠上半部也顯示鑒定的野生型病毒的特異性條帶。任選地，可以產生4個不同病毒，用這4個病毒共感染的細胞，再篩選出重組體。也可對重組載體進行改善，而包含另外的選擇或抗性標記。實施例2插入載體間隔區(qū)136-137 (IGR136-137)的重組載體為了將外源序列插入到MVA基因組中的相應于基因組位置129940處的稱為間隔區(qū)(IGR) 136-137，構建了包含該插入位點附近約600bp的側翼序列的質粒載體。設計合適的PCR引物以便分離MVA-BN基因組DNA中的側翼序列。這種引物含有限制性酶位點的突出端(extension)，用于將側翼序列克隆到載體質粒上。在側翼序列之間，引入選擇基因表達盒，如受痘病毒啟動子(P)轉錄調控下的NPT II基因(新霉素抗性基因)。此外，具有克
17隆位點以便插入另外的欲插入到IGR 136-137 (PacI)的基因或外源序列。根據本發(fā)明的一個如此載體構建體如圖12所示(pBNX67)。間隔區(qū)07-08 (IGR07-08)的重組載體為了將外源序列插入到MVA基因組中的相應于基因組位置1觀00處的稱為間隔區(qū)(IGR)07-08，構建了包含該插入位點附近約600bp的側翼序列的質粒載體。設計合適的 PCR引物以便分離MVA-BN基因組DNA中的側翼序列。這種引物有限制性酶位點的突出，用于將側翼序列克隆到載體質粒上。在側翼序列之間，引入選擇基因表達盒，如受痘病毒啟動子(P)轉錄調控下的Ecogpt基因(鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因)。此外，具有克隆位點 (PacI)以便插入另外的欲插入到IGR 07-08的基因或外源序列。根據本發(fā)明的一個如此載體構建體如圖13所示(pBNX88)。間隔區(qū)44-45 (IGR 44-45)的重組載體為了將外源序列插入到MVA基因組中的相應于基因組位置37330處的稱為間隔區(qū)(IGR)44-45，構建了包含該插入位點附近約600bp的側翼序列的質粒載體。設計合適的 PCR引物以便分離MVA-BN基因組DNA中的側翼序列。這種引物有限制性酶位點的突出，用于將側翼序列克隆到載體質粒上。在側翼序列之間，引入選擇基因表達盒，如受痘病毒啟動子(P)轉錄調控下的NPT II基因(新霉素抗性基因)。此外，具有克隆位點(PacI)以便插入另外的欲插入到IGR 44-45的基因或外源序列。根據本發(fā)明的一個如此載體構建體如圖 14 所示(pBNX87)。構建在基因組中包含整合了數個同源基因的重組痘病毒插入載體為了將分別來自登革病毒3個血清型即血清型2、3和4的3個PrM基因插入到 MVA基因組中，使用了 3個獨立的重組載體。如上面的詳細描述，這些載體包含與MVA基因組同源的序列，以便通過同源重組而靶向插入。此外，每一個載體包含選擇或報道基因表達盒。登革病毒的3個血清型的PrM序列按實施例1中描述的方法合成。結果，IGR136-137的插入載體構建體包含登革病毒血清型4的PrM基因(圖
15-pBN27)。IGR07-08的插入載體構建體包含登革病毒血清型2的PrM基因(圖
16-pBN34)。IGR44-45的插入載體構建體包含登革病毒血清型3的PrM基因(圖
17-pBN47)。經同源重組產生重組MVA通過同源重組制備重組MVA的方法按實施例1的方法進行。圖18中表明了 PrM4、 PrM3和1 2在MVA基因組中的插入位點。將PrM4 插入到 MVA在第一輪中，按上述程序用MVA-BN感染細胞，再用含有登革病毒血清型4的PrM 基因和EGFP作為報道基因的插入載體PBN27進行轉染。由于被轉染的載體包含報道基因即EGFP，因而最遲在第3天即可在被重組病毒感染的細胞中檢測到其合成的蛋白質。獲得的重組病毒需要按實施例1描述的噬斑純化法進行純化。經過4輪噬斑純化后，用能夠選擇性擴增插入位點IGR136-137的引物對對重組病毒MVA_PrM4進行PCR鑒定(oBN1008 GATACCGATCACGTTCTA. SEQ ID NO. :16 和 oBN1009ggatatgattatgtagag. SEQ ID NO. :17)。
將PrM2 插入到 MVA按上述程序用MVA-PrM4感染細胞，再用含有登革病毒血清型2的PrM基因和BFP 基因作為報道基因的插入載體PBN34進行轉染。由于被轉染的載體包含報道基因BFP，因而最遲在第3天即可在被重組病毒感染的細胞中檢測到其合成的蛋白質。獲得的重組病毒需要按實施例1描述的噬斑純化法進行純化。經過6輪噬斑純化后，重組病毒MVA-PrM4+PrM2 進一步傳代、增殖，并制備粗原液。用能夠選擇性擴增插入位點IGR07-08的引物對對該重組體進行 PCR 鑒定(oBN 903 CTGGATAAATACGAGGACGTG. SEQ ID NO. :18 和 oBN904 GACAATTATCCGACGCACCG；SEQ ID NO. :19)。將PrM3 插入到 MVA按上述程序用MVA_PrM2+4感染細胞，再用含有登革病毒血清型3的PrM基因和 EGFP基因作為報道基因的插入載體pBN47進行轉染。由于被轉染的細胞包含報道基因 EGFP,因而最遲在第3天即可在被重組病毒感染的細胞中檢測到其合成的蛋白質。獲得的重組病毒需要按實施例1描述的噬斑純化法進行純化。經過3輪噬斑純化后，用能夠選擇性擴增插入位點 IGR44-45 的引物對(oBN904 CGTTAGACAACACACCGACGATGG. SEQ IDN0. 20 和 oBN905CGGATGAAAAATTT TTGGAAG. SEQ ID NO. :21)對重組病毒 MVA_PrM4+3+2 進行 PCR 鑒定。對包含3個登革病毒PrM基因重組病毒進行PCR分析，其結果如圖19所示。PCR 實驗按實施例1描述的方式進行。引物組合oBm008和oBm009特異于IGR136-137，其包含PrM4的插入(圖19下面的凝膠圖)。對重組病毒進行PCR，預期擴增片段為11Λ (示于第 4、5和6道)，用質粒作陽性對照(泳道8)。對于不含Prm4的空載體對照，預期擴增片段為 190bp (泳道2、。M泳道為分子量標記，而泳道1、3和7為空。引物組合oBN902和oBN903 特異于IGR07-08，其包含PrM2插入(圖19上部的凝膠圖)。對重組病毒進行PCR，預期片段為960bp (示于泳道4-6)，質粒陽性對照(泳道8)。對于不含Prm2的空載體對照，預期擴增片段為190bp (泳道2、。引物組合OBN904和oBN905特異于IGR44-45，其包含Prm3插入(圖19中間的凝膠圖)。重組病毒預期的PCR片段的大小為932bp (示于泳道4-6)，質粒陽性對照(泳道8)。對于不合Prm2的空載體對照，預期片段為185bp (泳道2)。
申請人或代理人檔案號BN 46 PCT國際申請?zhí)栮P于微生物保藏的說明(細則13 之二)
19
權利要求
1.一種重組痘病毒，至少包含兩個具有至少60 %同源性的同源外源基因，其中每一個所述基因插入到病毒基因組的不同插入位點。
2.根據權利要求1的重組痘病毒，其中所述基因之間具有65-75%的同源性。
3.根據權利要求1所述的重組痘病毒，其中所述基因來自于黃病毒。
4.根據權利要求3的重組痘病毒，其中所述黃病毒是登革病毒。
5.根據權利要求3的重組痘病毒，其中所述基因是至少兩個衍生自至少兩個不同血清型病毒的同源基因。
6.根據權利要求5的重組痘病毒，其中所述基因是至少兩個PrM基因。
7.根據權利要求6的重組痘病毒，其中所述基因是4個PrM基因。
8.根據權利要求1的重組痘病毒，其中所述痘病毒是痘苗病毒。
9.根據權利要求8的重組痘病毒，其中所述痘苗病毒是修飾痘苗Ankara病毒(MVA)。
10.根據權利要求9的重組痘病毒，其中修飾痘苗Ankara病毒是MVA-BN，其保藏于歐洲動物細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，其保藏號為V00083008。
11.根據權利要求5所述的重組痘病毒，其中所述痘病毒在哺乳動物細胞中屬于復制缺陷型或不能復制。
12.根據權利要求11所述的重組痘病毒，其中所述哺乳動物細胞為人細胞。
13.根據權利要求5所述的重組痘病毒，其中所述基因插入在痘病毒基因組中的天然發(fā)生的缺失位點和/或間隔區(qū)。
14.一種疫苗，包含根據權利要求1至13任一項的重組痘病毒。
15.一種藥物組合物，包含根據權利要求1至13任一項的重組痘病毒和藥物學可接受載體、稀釋劑、佐劑和/或添加劑。
16.根據權利要求1至13任一項的重組痘病毒在制備藥物中的應用。
17.根據權利要求1-13任一項的重組痘病毒、根據權利要求14的疫苗或權利要求15 的組合物在制備影響活體動物的免疫反應的藥物中的用途。
18.根據權利要求17的用途，其中所述活體動物為人。
19.包含有根據權利要求1-13任一項所述的重組痘病毒的細胞。
20.一種產生權利要求1-13任一項所述的重組痘病毒的方法，包括如下步驟 -用痘病毒感染細胞；-用第一載體構建體轉染被感染細胞，其中第一載體構建體包含與痘病毒基因組異源的基因和能夠指導異源基因整合到痘病毒基因組中的插入位點的痘病毒基因組序列； -鑒定、分離所產生的重組痘病毒；_用感染細胞的步驟所獲得的重組痘病毒和包含有另外的與痘病毒基因組異源且與第一載體構建體中的基因同源的基因的另一載體構建體重復上述步驟。
21.權利要求20的方法，在鑒定、分離所產生的重組痘病毒步驟中，還包括對其進行純化。
22.—種試劑盒，包括-兩個或更多個載體構建體，每一個構建體包含受痘病毒表達調控元件轉錄調控的基因，其中包含在不同載體中的基因是具有至少60%同源性的同源基因，所述每一個基因側接為能夠指導將所述基因整合到單痘病毒基因組中的痘病毒DNA序列；和-鑒定和/或選擇所述同源基因已整合到其基因組中的重組痘病毒的試劑。
23.根據權利要求22的試劑盒，其中每一個同源基因側接為能夠指導將每一個載體構建體中的所述同源基因整合到痘病毒基因組中不同插入位點的痘病毒DNA序列。
24.來源于權利要求1-13任一項所述重組痘病毒的基因組的DNA序列，其中所述DNA 序列包括至少兩個同源基因和至少部分痘病毒基因組序列。
25.—種體外或在活體外檢測由權利要求1-13任一項所述的重組痘病毒感染的細胞的方法，其中包括將權利要求M的DNA序列給予所述細胞。
26.—種體外或在活體外鑒定權利要求1-13任一項所述的重組痘病毒的方法，其中包括將權利要求M的DNA序列給予所述病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠表達兩個或多個同源外源序列的重組痘病毒載體，其中外源序列來源于微生物的不同變種，之間具有50％或更高的同源性。本發(fā)明進一步涉及制備這種重組痘病毒的方法以及這種重組痘病毒作為藥物或疫苗的應用。此外，本發(fā)明還提供一種影響優(yōu)選為誘導活體動物包括人的免疫反應的方法。
文檔編號C12N1/15GK102199628SQ20111005882
公開日2011年9月28日 申請日期2003年5月14日 優(yōu)先權日2002年5月16日
發(fā)明者保羅·豪利, 桑加·萊勒 申請人:巴法里安諾迪克有限公司