專利名稱：猿猴亞家族E腺病毒SAdV-39、-25.2、-26、-30、-37和-38及其應(yīng)用的制作方法
猿猴亞家族 E 腺病毒 SAdV-39、-25. 2、-26、-30、-37 和-38
及其應(yīng)用磁盤提交的資料通過引用納入申請(qǐng)人:將以磁盤形式提供序列表通過弓I用納入本文。這些磁盤以復(fù)份提供且僅包 含計(jì)算機(jī)可讀形式的“序列表”。這些磁盤分別標(biāo)有“拷貝1”和“拷貝2”。這些磁盤內(nèi)的 文件名為"UPN-U4623PCT sequence listing.txt”。
背景技術(shù)：
腺病毒是雙鏈DNA病毒，基因組大小約為36千堿基(kb)，由于能夠在多種靶組織 中實(shí)現(xiàn)高效基因轉(zhuǎn)移以及較大的轉(zhuǎn)基因容量，它被廣泛用于基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用。通常，腺病毒的 El基因缺失，被取代為由所選啟動(dòng)子、感興趣基因cDNA序列和聚A信號(hào)組成的轉(zhuǎn)基因盒，產(chǎn) 生復(fù)制缺陷型重組病毒。腺病毒的形態(tài)特征是由三種主要蛋白和許多群體小蛋白VI、VIII、IX、IIIa和 Iva2組成的二十面體衣殼，這三種主要蛋白是六鄰體(II)、五鄰體基質(zhì)(III)和突結(jié)尾絲 (knobbed fibre)(IV)[W. C. Russell, J.Gen Virol.，81 :2573_3704(2000 年 11 月)]。病 毒基因組為線性雙鏈DNA，末端蛋白共價(jià)連接于含有末端反向重復(fù)(ITR)的5’末端。病毒 DNA與高堿性蛋白VII和小肽pX(之前稱為mu)密切相連。另一種蛋白V與此DNA-蛋白 復(fù)合物包裝在一起，并通過蛋白VI提供與衣殼的結(jié)構(gòu)連接。該病毒也含有病毒編碼的蛋白 酶，這種蛋白酶是加工某些結(jié)構(gòu)蛋白以產(chǎn)生成熟的感染性病毒所必需的。已經(jīng)開發(fā)了一種對(duì)包括人、猿猴、牛、馬、豬、羊、犬和負(fù)鼠腺病毒在內(nèi)的哺乳動(dòng)物 腺病毒家族進(jìn)行分類的方法。這種分類方法的開發(fā)基礎(chǔ)是該家族內(nèi)的腺病毒序列凝集紅 血細(xì)胞的能力不同。結(jié)果得到了六個(gè)亞組，現(xiàn)在稱為亞組A、B、C、D、E和F。參見T. Shenk φ, Adenoviridae =The Viruses and theirR印Iication (腺病毒科病毒及其復(fù)制)，第 67章，選自FIELD' S VIROLOGY(菲爾德病毒學(xué))，第6版，B. N Fields等編，(LR出版社 (Lippincott Raven Publishers)，費(fèi)城，1996)，第 111-2112 頁(yè)。已報(bào)道可使用重組腺病毒將異源分子遞送至宿主細(xì)胞。參見美國(guó)專利6，083，716， 它描述了兩種黑猩猩腺病毒的基因組。猿猴腺病毒C5、C6和C7已經(jīng)描述于美國(guó)專利 7，247，472，它可用作疫苗載體。其他黑猩猩腺病毒描述于WO 2005/1071093，可用于制造腺
病毒疫苗載體。本領(lǐng)域需要能有效遞送分子到靶點(diǎn)并盡可能降低人群中已有的免疫力對(duì)所選腺 病毒血清型的影響的載體。發(fā)明概述本文提供了亞家族E中五種新型猿猴腺病毒的分離的核酸序列和氨基酸序列以 及含有這些序列的載體。還提供了許多使用本發(fā)明所述載體和細(xì)胞的方法。這些腺病毒包 括 SAdV-39、SAdV-25. 2、SAdV-26、SAdV-30、SAdV-37 和 SAdV-38。本文所述方法包括通過給予本發(fā)明所述載體將一種或多種所選異源基因遞送到 哺乳動(dòng)物患者。用本文所述組合物進(jìn)行接種能夠呈遞所選抗原從而引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)。 基于這些猿猴腺病毒的載體也可用于在體外制造異源基因產(chǎn)物。這種基因產(chǎn)物本身可用于各種目的，例如本文所述的。本文將更加詳細(xì)地描述本發(fā)明的這些和其他實(shí)施方式以及優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了全部分離自黑猩猩排泄物的猿猴腺病毒39、SAdV-25. 2、SAdV_26、 SAdV-30、SAdV-37和SAdV_38的新的核酸和氨基酸序列。還提供了新型腺病毒載體和產(chǎn)生基于這些序列的載體的包裝細(xì)胞系，用于在體外 產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)或片段或其它制劑。本發(fā)明還提供了用于遞送治療或疫苗目的的異源分子 的組合物。這些治療性或疫苗組合物含有攜帶插入的異源分子的腺病毒載體。此外，所述 新型SAdV序列可用于提供產(chǎn)生重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體所必需的輔助功能。因此，提供 了在此種產(chǎn)生方法中利用這些序列的輔助構(gòu)建物、方法和細(xì)胞系。術(shù)語(yǔ)“基本上同源”或“基本上相似”指核酸或其片段時(shí)，表示當(dāng)任選地將含相應(yīng)核 苷酸插入或缺失的序列與另一核酸(或其互補(bǔ)鏈)排列對(duì)比時(shí)，對(duì)比的序列至少約95-99% 核苷酸序列相同。術(shù)語(yǔ)“基本上同源”或“基本上相似”指氨基酸或其片段時(shí)，表示當(dāng)任選地將含相 應(yīng)氨基酸插入或缺失的序列與另一氨基酸(或其互補(bǔ)鏈)排列對(duì)比時(shí)，對(duì)比的序列至少約 95-99 %的氨基酸序列相同。優(yōu)選在全長(zhǎng)序列，或其蛋白，或其至少8個(gè)氨基酸、或更理想至 少15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的片段上具有上述同源性。本文描述了合適片段的實(shí)例。本文核酸序列所用術(shù)語(yǔ)“序列同一性百分率”或“相同”指當(dāng)作最大排列對(duì)比時(shí)兩 個(gè)序列中的殘基相同。當(dāng)將一個(gè)序列與另一個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)需要缺口時(shí)，根據(jù)沒有缺口罰 分的較長(zhǎng)序列計(jì)算評(píng)分程度。保留多核苷酸或由其編碼的多肽的功能的序列最相同。序列 同一性比較的長(zhǎng)度需要是基因組全長(zhǎng)(例如，約36kbp)、基因的開放讀框的全長(zhǎng)、蛋白、亞 基、或酶[參見，例如提供腺病毒編碼區(qū)域的表]、或至少約500到5000個(gè)核苷酸的片段。 然而，也可能要求較小片段之間的同一性，例如至少約9個(gè)核苷酸、通常至少約20到24個(gè) 核苷酸、至少約28到32個(gè)核苷酸、至少約36或更多核苷酸的片段。類似地，蛋白全長(zhǎng)或其 片段的氨基酸序列的“序列同一性百分比”可容易地確定。適宜的是，片段長(zhǎng)度至少為大約 8個(gè)氨基酸，也可長(zhǎng)達(dá)大約700個(gè)氨基酸。本文描述了合適片段的實(shí)例。同一性可使用文中所述用默認(rèn)設(shè)置的算法和計(jì)算機(jī)程序來(lái)容易地確定。優(yōu)選在蛋 白質(zhì)、酶、亞基的全長(zhǎng)或至少約8個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的片段上具有這種同一性。然而，這種同一 性可基于較短的區(qū)域，適合產(chǎn)生相同的基因產(chǎn)物的區(qū)域。如本文所述，用各種從公共渠道獲得或購(gòu)得的多序列比對(duì)程序 (MultipleSequence Alignment Programs)進(jìn)行比對(duì)，例如可通過互聯(lián)網(wǎng)Web服務(wù)器獲得的 "Clustal W[Thompson 等，1994，Nucleic Acids Res，22，4673-4680]?；蛘?，也可使用載體 NTI 實(shí)用程序[英杰公司(InVitrogen)]。還有許多本領(lǐng)域已知的算法也可用于測(cè)量核 苷酸序列同一性，包括包含在上述程序中的算法。作為另一個(gè)實(shí)例，可使用GCG 6.1版中的 程序FastaTM來(lái)比較多核苷酸序列。FastaTM可得出查詢序列與檢索序列之間最佳重疊區(qū) 域的比對(duì)和序列同一性百分比。例如，可使用GCG 6.1版提供的FastaTM及默認(rèn)參數(shù)(字 長(zhǎng)為6和用于計(jì)分矩陣的NOPAM系數(shù))來(lái)確定核酸序列之間的序列同一性百分比，該程序 此處引用作為參考?？刹捎孟嗨瞥绦蜻M(jìn)行氨基酸比對(duì)。雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員可視需要改變?cè)O(shè)置，但通常這些程序都以默認(rèn)設(shè)置使用。或者，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可采用能夠象上述算法 和程序一樣得出同一性水平或進(jìn)行比對(duì)的其他算法和計(jì)算機(jī)程序?！爸亟M”用于多核苷酸時(shí)表示該多核苷酸是克隆、限制或連接步驟以及產(chǎn)生不同于 天然發(fā)現(xiàn)的多核苷酸的構(gòu)建物的其他過程的不同組合的產(chǎn)物。重組病毒是包含重組多核苷 酸的病毒顆粒。該術(shù)語(yǔ)分別包括原始多核苷酸構(gòu)建物的復(fù)制物以及原始病毒構(gòu)建物的子 代?！爱愒础北硎狙苌砸环N與其所比較的實(shí)體的其余部分在基因型上不同的實(shí)體。例 如，通過遺傳工程技術(shù)引入來(lái)源于不同物種的質(zhì)?；蜉d體的多核苷酸是異源多核苷酸。從 其天然編碼序列上取下并操作性連接于天然情況下不連接的編碼序列的啟動(dòng)子是異源啟 動(dòng)子。已被克隆入病毒基因組或病毒載體中的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)是異源重組位點(diǎn)，其中 所述病毒基因組在天然情況下不含該位點(diǎn)。當(dāng)具有重組酶編碼序列的多核苷酸被用于遺 傳改變正常情況下不表達(dá)該重組酶的細(xì)胞時(shí)，多核苷酸和重組酶對(duì)于該細(xì)胞而言都是異源 的。如本說明書和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語(yǔ)“包含”和其變形形式，包括“含有”、“包括”等 其它形式指包含其它組分、元素、數(shù)值、步驟等。術(shù)語(yǔ)“由…組成”不包括其它組分、元件、整 數(shù)、步驟等。I.猿猴腺病毒序列本發(fā)明提供了分離自與腺病毒天然相關(guān)的其它材料的猿猴腺病毒39(SAdV_39)、 SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38的核酸序列和氨基酸序列。A.核酸序列本發(fā)明的SAdV-39核酸序列包括SEQ ID NO 1的核苷酸1-36553。本發(fā)明的 SAdV-25. 2核酸序列包括SEQ ID NO 130的核苷酸1-36629。本發(fā)明的SAdV_26核酸序列 包括SEQ ID NO 162的核苷酸1-36628。本發(fā)明的SAdV_30核酸序列包括SEQ ID NO 98 的核苷酸1-36621。本發(fā)明的SAdV-37核酸序列包括SEQ ID NO :33的核苷酸1-36634。本 發(fā)明的SAdV-38核酸序列包括SEQ IDNO 65的核苷酸1-36494。見納入本文參考文獻(xiàn)中的序列表。一實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸序列還包括分別 與SEQ ID NO :1、130、162、98、130或65的序列互補(bǔ)的鏈，以及與以下序列和它們的互補(bǔ)鏈 的序列相對(duì)應(yīng)的RNA和cDNA序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸序列還包括與序列表有 98. 5%以上，更優(yōu)選約99%以上同一性的序列。一個(gè)實(shí)施方式中還包括SEQ ID N0:l、130、 162、98、130或65中所提供序列以及它們互補(bǔ)鏈的天然變體和工程構(gòu)建修飾物。例如，這種 修飾包括本領(lǐng)域已知的標(biāo)記、甲基化、以及用簡(jiǎn)并核苷酸取代一個(gè)或多個(gè)天然產(chǎn)生的核苷 酸。
-38的序列以及它 少有15個(gè)核苷酸， 表達(dá)所需的腺病毒
-實(shí)施方式中，提供了 SAdV-39, SAdV-25. 2、-26、-30、-37 或
們的互補(bǔ)鏈、與其互補(bǔ)的cDNA和RNA的片段。合適的片段在長(zhǎng)度上至 并包含功能性片段，即在生物學(xué)上感興趣的片段。例如，功能性片段可
產(chǎn)物，或用于產(chǎn)生重組病毒載體。這種片段包含下表所列的基因序列和片段。下表提供了 SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38序列的轉(zhuǎn)錄區(qū)和開放閱讀框。對(duì)于某些基因，其轉(zhuǎn) 錄區(qū)和開放閱讀框(ORF)位于與SEQ ID NO :1、130、162、98、130或65的互補(bǔ)鏈上。見例如 E2b、E4和E2a。還顯示了其編碼蛋白的分子量。注意，SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37 或-38的Ela開放閱讀框和E2b開放閱讀框含有內(nèi)部剪接位點(diǎn)。這些剪接位點(diǎn)在下表中標(biāo) 出οSAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38腺病毒核酸序列可用于治療制劑和構(gòu)建 各種載體系統(tǒng)和宿主細(xì)胞。如本文所用，載體所包含的適合的核酸分子包括，裸DNA、質(zhì)粒、 病毒、粘?；蛴坞x體。這些序列和產(chǎn)物可單獨(dú)應(yīng)用，或與其它腺病毒序列或片段聯(lián)用，或與 其它腺病毒或非腺病毒序列的元件聯(lián)用。所述SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38序 列序列還可作為反義遞送載體、基因治療載體或疫苗載體應(yīng)用。因此，本發(fā)明還提供含有所 述SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38序列的核酸分子、基因遞送載體和宿主細(xì)胞。例如，本發(fā)明包括含有本發(fā)明猿猴Ad ITR序列的核酸分子。另一實(shí)施方式中，本 發(fā)明提供含有編碼所需Ad基因產(chǎn)物的本發(fā)明猿猴Ad序列的核酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員在 閱讀了本文提供的信息后不難明白采用本發(fā)明序列構(gòu)建其它核酸分子。一實(shí)施方式中，本文鑒定的猿猴Ad基因區(qū)域可用于載體向細(xì)胞遞送異源分子。例 如，為在包裝宿主細(xì)胞中產(chǎn)生病毒載體的目的而產(chǎn)生表達(dá)腺病毒衣殼蛋白(或其片段)的 載體?？稍O(shè)計(jì)順式表達(dá)的這類載體。或者，可設(shè)計(jì)這類載體來(lái)提供穩(wěn)定含有能表達(dá)所需腺 病毒功能的序列，如Ela、Elb、末端重復(fù)序列、E2a、E2b、E4、E40RF6區(qū)域的細(xì)胞。此外，所述腺病毒基因序列或其片段可用于提供產(chǎn)生輔助依賴性病毒(如缺失了 必須功能的腺病毒載體或腺相關(guān)病毒(AAV))所必須的輔助功能。對(duì)于這種產(chǎn)生方法，本發(fā) 明的SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38序列以類似于人Ad所述的方式用于此方法 中。然而，由于本發(fā)明的SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38序列和人Ad序列之間 的序列差異，采用SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38序列大大降低或消除了在帶有 人Ad El功能的宿主細(xì)胞，如在rAAV產(chǎn)生時(shí)可產(chǎn)生傳染性腺病毒污染物的293細(xì)胞中與輔 助功能同源重組的可能性。在許多關(guān)于人腺病毒血清型的文獻(xiàn)中已詳細(xì)描述了利用腺病毒輔助功能產(chǎn) 生rAAV的方法。見例如美國(guó)專利6，258，595和其中引用的參考文獻(xiàn)。也可見美國(guó)專利 5, 871, 982 ；WO 99/14354 ；WO 99/15685 ；WO 99/47691。這些方法也可用于產(chǎn)生非人血清型 AAV，包括非人靈長(zhǎng)動(dòng)物AAV血清型。提供必須輔助功能(如Ela、Elb、E2a和/或E40RF6) 的SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38序列尤其可用于提供必須的腺病毒功能，同時(shí) 盡量減少或消除與人類來(lái)源典型的rAAV-包裝細(xì)胞中存在的任何其它腺病毒的重組可能 性。因此，這些rAAV產(chǎn)生方法中，可采用選出的SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38 序列的基因或開放閱讀框?；蛘撸@些方法中可采用重組SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38載體。這 類重組猿猴腺病毒載體可包括，例如雜交的黑猩猩Ad/AAV，其中黑猩猩Ad序列側(cè)接由AAV 3'和/或5' ITR組成的rAAV表達(dá)盒，和在控制其表達(dá)的調(diào)控序列控制下的轉(zhuǎn)基因。本領(lǐng) 域技術(shù)人員會(huì)懂得其它猿猴腺病毒載體和/或SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38 基因序列還可用于產(chǎn)生依賴腺病毒輔助的rAAV和其它病毒。
在另一實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)了用于能在宿主細(xì)胞中遞送和表達(dá)所選腺病毒基因產(chǎn)物 以實(shí)現(xiàn)所需生理效應(yīng)的核酸分子。例如，可將含有編碼SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37 或_38Ela蛋白序列的核酸分子遞送給患者，用于癌癥治療。任選地，可用液體載體配制此 分子，優(yōu)選靶向癌細(xì)胞。這類制劑可與其它癌癥治療劑(如順鉬、紫杉醇等)聯(lián)用。本領(lǐng)域 技術(shù)人員不難明白，本文提供的腺病毒序列還有其它用途。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解，SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38序列不 難適用于各種病毒和非病毒載體系統(tǒng)以在體外、離體或體內(nèi)遞送治療性和免疫原性分子。 例如，在各種rAd和非rAd載體系統(tǒng)中可采用SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38猿 猴Ad序列。這些載體系統(tǒng)可包括，如質(zhì)粒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒、痘苗病毒和腺相關(guān) 病毒系統(tǒng)。這些載體系統(tǒng)的選擇不限制本發(fā)明。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生本發(fā)明的猿猴和猿猴病毒衍生的蛋白質(zhì)的分子。載有包含 本發(fā)明猿猴Ad DNA序列的多核苷酸的這種分子可包括裸DNA、質(zhì)粒、病毒或其它基因元件 形式。B. SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37 或-38 腺病毒蛋白本發(fā)明還提供上述SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38腺病毒的基因產(chǎn)物， 如本文所述腺病毒核酸編碼的蛋白質(zhì)、酶、及其片段。本發(fā)明還包括具有用其它方法產(chǎn)生的 這些核酸序列編碼的氨基酸序列的SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38蛋白、酶及其 片段。這些蛋白包括上表所鑒定的開放閱讀框所編碼的蛋白、下表中參照序列表中提供的 SEQ ID NO鑒定的蛋白以及所述蛋白質(zhì)和多肽的片段。 因此，本發(fā)明一方面提供基本純的，即沒有其它病毒和蛋白質(zhì)的獨(dú)特猿猴腺病毒 蛋白質(zhì)。優(yōu)選這些蛋白質(zhì)至少10%同源，更優(yōu)選60%同源，最優(yōu)選95%同源?！獙?shí)施方式中，本發(fā)明提供獨(dú)特的猿猴衍生的衣殼蛋白。如本文所用，猿猴衍生的 衣殼蛋白包括上述含SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38衣殼蛋白或其片段的任何 腺病毒衣殼蛋白，包括但不限于，嵌合性衣殼蛋白、融合蛋白、人工衣殼蛋白、合成的衣殼蛋 白和重組衣殼蛋白，不限于產(chǎn)生這些蛋白的方法。這些猿猴腺病毒衍生的衣殼蛋白宜含有與本文所述不同腺病毒血清 型衣殼區(qū)或其片段，或修飾的猿猴衣殼蛋白或片段組合的一個(gè)或多個(gè)SAdV-39、 SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38區(qū)域或及片段(如五鄰體、六鄰體、尾絲或其片段)。“與嗜 性改變相關(guān)的衣殼蛋白的修飾”在這里包括改變的衣殼蛋白，即五鄰體、六鄰體或尾絲蛋白 區(qū)域或其片段，如尾絲區(qū)的球形突出區(qū)，或編碼它們的多核苷酸，因此其特異性被改變。可用本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)猿猴Ad或人或非人來(lái)源的另一 Ad血清型來(lái)構(gòu)建猿猴衍生的衣殼。 這類Ad可獲自各種來(lái)源，包括ATCC、商業(yè)來(lái)源和學(xué)術(shù)來(lái)源，或此Ad序列可獲自GenBank或 其它合適來(lái)源。提供了SAdV-39 [SEQ ID NO :6]、SAdV-25. 2 [SEQ ID NO :135]、-26 [SEQID NO: 167], -30[SEQ ID NO 103]、-37[SEQ ID NO 38]或 _38[SEQ ID NO 70]的五鄰體蛋白的 氨基酸序列。這些五鄰體蛋白或其特定片可適當(dāng)?shù)赜糜诟鞣N目的。合適片段的例子包括根 據(jù)以上和SEQ ID而6、103、135、38、70、167或70中提供的氨基酸編號(hào)，具有^端和/或 C-端截短的約50、100、150或200個(gè)氨基酸的五鄰體。其它合適的片段包括較短的內(nèi)部片 段、C-端或N-端片段。也可修飾該五鄰體蛋白用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種目的。還提供了SAdV-39 [SEQ ID NO :11]、SAdV_25. 2 [SEQ ID NO 140]、-26 [SEQ ID NO: 172]、-30 [SEQ ID NO : 108]、-37 [SEQ ID NO 43]或-38 [SEQ IDNO 75]六鄰體蛋白的氨基 酸序列。這些六鄰體鄰體蛋白或其特定片可適當(dāng)?shù)赜糜诟鞣N目的。合適片段的例子包括 根據(jù)以上和SEQ ID而11、140、172、108、43或75中提供的氨基酸編號(hào)，具有^端和/或 C-端截短的約50、100、150、200、300、400或500個(gè)氨基酸的六鄰體。其它合適的片段包括 較短的內(nèi)部片段、C-端或N-端片段。例如，一個(gè)合適的片段是該六鄰體蛋白的環(huán)區(qū)(結(jié)構(gòu) 域)，命名為DEi和rei，或其超變區(qū)。這些片段包括跨越該猿猴六鄰體蛋白的氨基酸殘基 約125-443 ；約138-441 ；或較小片段如跨越殘基約138-163 ；約170-176 ；約195-203 ；約 223-246 ；約 253-374 ；約 287-297 ；和 404-430 的區(qū)域，參見 SEQ ID NO :11、140、172、108、 43或75。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難鑒定其它合適的片段。也可修飾該六鄰體蛋白用于本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的各種目的。因?yàn)樵摿忬w蛋白是腺病毒血清型的決定簇，這種人工六鄰體 蛋白可產(chǎn)生具有人工血清型的腺病毒。其它人工衣殼蛋白也可用本發(fā)明的黑猩猩Ad五鄰 體序列和/或尾絲序列和/或其片段構(gòu)建。一實(shí)施方式中，可能需要用SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38六鄰體蛋白 序列產(chǎn)生具有改變的六鄰體蛋白的腺病毒。改變六鄰體蛋白的一種適宜方法見美國(guó)專利 5，922，315中所述，通過引用納入本文。在這種方法中，腺病毒六鄰體的至少一個(gè)環(huán)區(qū)域被 另一腺病毒血清型的至少一個(gè)環(huán)區(qū)域代替。因此被改變的腺病毒六鄰體蛋白的至少一個(gè)環(huán) 區(qū)是SAdV-39的猿猴Ad六鄰體環(huán)區(qū)。一實(shí)施方式中，SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37 或-38六鄰體蛋白的一個(gè)環(huán)區(qū)被另一腺病毒血清型的一個(gè)環(huán)區(qū)所替代。另一實(shí)施方式中， 用SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38六鄰體的該環(huán)區(qū)來(lái)替代另一腺病毒血清型的 環(huán)區(qū)。合適的腺病毒血清型如本文所述不難從人或非人血清型中選擇。選擇合適的血清型 不是要限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38 六鄰體蛋白還有其它用途。提供了SAdV-39 [SEQ ID NO 22], SAdV-25. 2 [SEQ ID NO 151]、-26 [SEQID NO: 183]、-30 [SEQ ID NO 118]、-37 [SEQ ID NO 54]或-38 [SEQ ID NO 85]的尾絲蛋白的氨 基酸序列。這些尾絲蛋白或其特定片可適當(dāng)?shù)赜糜诟鞣N目的。一種合適的片段是位于SEQ ID NO :22、151、183、119、54或85內(nèi)的尾絲結(jié)(fiber knob)。其它合適的片段例子包括具 有根據(jù)以上和SEQ ID NO :22、151、183、119、54或85中提供的氨基酸編號(hào)的約50、100、150 或200個(gè)氨基酸的N-端和/或C-端截短的尾絲。其它合適的片段包括內(nèi)部片段。也可用 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種技術(shù)修飾此尾絲蛋白。
SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、_37或-38的獨(dú)特蛋白片段的長(zhǎng)度至少為8個(gè)氨基 酸。然而，也可方便地使用其他所需長(zhǎng)度的片段。此外，本發(fā)明提供引入后能提高SAdV39、 SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38基因產(chǎn)物產(chǎn)量和/或表達(dá)的此類修飾，如構(gòu)建融合分子， 其中SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38基因產(chǎn)物的全部或某片段融合(直接或通過 接頭)于融合伴侶而得到增強(qiáng)。其它合適的修飾包括但不限于截短編碼區(qū)(如蛋白或酶) 以去除通常被切斷的前蛋白或原蛋白產(chǎn)生成熟的蛋白或酶和/或突變編碼區(qū)以提供分泌 性基因產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白還可進(jìn)行其它修飾。本發(fā)明還包括與本文提供的 SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38蛋白同一性至少約99%的蛋白質(zhì)。如本文所述，本發(fā)明的含SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38的腺病毒衣殼 蛋白的載體特別適合于以下應(yīng)用，即用中和抗體來(lái)去除其它Ad血清型載體以及其它病毒 載體的作用。rAd載體在反復(fù)基因治療或?yàn)榧訌?qiáng)免疫應(yīng)答(疫苗的效價(jià))的重復(fù)給藥中有 特殊優(yōu)點(diǎn)。某些情況下可能需要采用SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38基因產(chǎn)物(如 衣殼蛋白或其片段)的一種或多種來(lái)產(chǎn)生抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”本文用于指能特異性結(jié)合某 表位的免疫球蛋白分子?？贵w可有各種形式，如高親和力多克隆抗體、單克隆抗體、合成抗 體、嵌合型抗體、重組抗體和人源化抗體。這些抗體有免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE 類型。這些抗體也可采用本領(lǐng)域已知許多方法這之一產(chǎn)生?？捎檬熘某Ｒ?guī)技術(shù)如 Kohler和Milstein及其眾多已知改進(jìn)的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生適合的抗體。可將已知的重組技術(shù)應(yīng) 用于針對(duì)這些抗原開發(fā)的多克隆或單克隆抗體以產(chǎn)生類似的所需高效價(jià)抗體[見例如PTC 專利申請(qǐng) PTC/GB85/00392 ；英國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào) GB2188638 ；Amit 等，1986 Science, 233 747-753 ；Queen 等，1989 Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. USA, 86 10029-10033 ；PTC 專利申請(qǐng) PTC/W09007861 ；和 Riechmann 等，Nature, 332 :323_327 (1988) ；Huse 等，1988a Science, 246 :1275-1281]?；蛘撸ㄟ^操作針對(duì)本發(fā)明抗原的動(dòng)物或人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)產(chǎn)生這類 抗體。見例如，E Mark 禾口 Padlin 的"Humanization of Monoclonal Antibodies"(單克 隆抗體的人源化)，第四章，The Handbook of Experimental Pharmacology (實(shí)驗(yàn)藥物手 冊(cè))，第 113 卷，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (單克隆抗體的藥理學(xué))， SV 出版社(Springer-Verlag) (1994 年 6 月)；Harlow 等，Using Antibodies ALaboratory Manual (抗體使用實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約；Harlow等，1989, Antibodies A Laboratory Manual (抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，冷泉港，紐約；Harlow 等，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883 ；和 Bird 等，1988，Science 242 :423_437。本發(fā)明還提供抗獨(dú) 特型抗體(Ab2)和抗-抗-獨(dú)特型抗體(Ab3)。例如參見Μ. Wettendorff等，‘‘Modulation of anti-tumor immunity byanti-idiotypic antibodies “(用抗獨(dú)特型抗體i周節(jié)抗 腫瘤免疫力)，選自IdiotypicNetwork and Diseases (獨(dú)特型網(wǎng)絡(luò)和疾病)，J. Cemy和 J. Hiernaux 編，1990，J. Am. Soc. Microbiol.，華盛頓特區(qū):203_229 頁(yè)]。可用本鄰域技術(shù) 人員所熟知的技術(shù)生產(chǎn)這些抗獨(dú)特型和抗_抗_獨(dú)特型抗體。這些抗體可用于各種目的， 包括診斷和臨床方法及試劑盒。在某些情況下可能需要在本發(fā)明的SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38基因 產(chǎn)物、抗體或其它構(gòu)建物上引入可檢測(cè)標(biāo)記或標(biāo)簽。本文所用的可檢測(cè)標(biāo)記是單獨(dú)或與另一分子相互作用時(shí)能提供可檢測(cè)信號(hào)的分子。最理想的是該標(biāo)記可肉眼檢測(cè)，如通過熒光， 便于在免疫組化分析或免疫熒光顯微鏡中使用。例如，合適的標(biāo)記包括異硫氰基熒光系 (FITC)、藻紅蛋白(PE)、別藻蘭蛋白(APC)、科里膦-O(CPO)或串聯(lián)染料，PE-花青-5 (PC5) 和PE-得克薩斯紅(ECD)。所有這些熒光染料可商品化獲得，它們的用途是本領(lǐng)域知道的。 其它有用的標(biāo)記是膠體金標(biāo)記。其它有用的標(biāo)記還包括放射活性化合物或元素。此外，標(biāo)記 還包括各種酶系統(tǒng)，它們能在試驗(yàn)中產(chǎn)生比色信號(hào)，如葡萄糖氧化酶(利用葡萄糖作底物) 可釋放過氧化氫，存在過氧化物酶和氫供體如四甲基聯(lián)苯胺(TMB)時(shí)，此產(chǎn)物可產(chǎn)生呈蘭 色的氧化TMB。其它例子包括辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、己糖激酶和能與葡 萄糖-6-磷酸脫氫酶的結(jié)合，后者能與ATP、葡萄糖和NAD+反應(yīng)，在其它產(chǎn)物中產(chǎn)生NADH， 其因340nm波長(zhǎng)吸光值增加而可檢測(cè)。本發(fā)明方法所用的其它標(biāo)記系統(tǒng)可通過其它方法，如利用包埋有染料的著色乳膠 微粒(Bangs實(shí)驗(yàn)室，印第安納州)來(lái)代替酶與靶序列形成偶聯(lián)物，從而提供可視信號(hào)，表明 應(yīng)用試驗(yàn)中存在得到的復(fù)合物。將標(biāo)記與所需分子偶聯(lián)或結(jié)合的方法是類似的常規(guī)方法，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 知道。標(biāo)記物結(jié)合的已知方法已有描述[見例如，Handbook of Fluorescentprobes and Research Chemicals (熒光探針和研究用化學(xué)制劑手冊(cè))，第六版，R. Ρ· M. Haugland，分 子探針有限公司(Molecular Probes, Inc.)，尤金，俄勒岡州，1996 ;Pierce Catalog and Handbook, Life Science and Analytical Research Products (皮爾其jf 目錄禾口手冊(cè)之生活 科學(xué)和分析研究產(chǎn)品)，皮爾斯化學(xué)品公司(PierceChemical Company)，羅克福德，伊利諾 斯州，1994/1995]。因此，標(biāo)記和偶聯(lián)方法的選擇不限制本發(fā)明的范圍。SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38的序列、蛋白和片段可用任何適當(dāng)?shù)姆?法產(chǎn)生，包括重組產(chǎn)生、化學(xué)合成或其它合成方法。合適的生產(chǎn)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員報(bào)熟 知的。見例如，Sambrook 等，Molecular Cloning :ALaboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手 冊(cè))，冷泉港出版社(紐約，冷泉港)?；蛘咭部捎檬熘墓滔嚯暮铣煞?MerrifieldJ.Am. Chem. Soc. ,85 2149(1962) ；Stewart 禾口 Young，Solid Phase Peptide Synthesis (固相月太 合成)(自由人(Freeman)，舊金山，1969)，27-62頁(yè))來(lái)合成肽。這些及其他適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)方 法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解，SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38序列 不難適用于各種病毒和非病毒載體系統(tǒng)以在體外、離體或體內(nèi)遞送治療性和免疫原性分 子。例如，一實(shí)施方式中，可將本文所述猿猴Ad衣殼蛋白和其它猿猴腺病毒蛋白用于基因、 蛋白質(zhì)和其它所需的診斷性、治療性和免疫原性分子的基于非病毒性蛋白的遞送。一個(gè)這 樣的實(shí)施方式中，將本發(fā)明的蛋白質(zhì)直接或間接連接于能靶向帶有腺病毒受體的細(xì)胞的分 子。對(duì)于這種靶向，優(yōu)選，例如具有細(xì)胞表面受體的配體的六鄰體、五鄰體、尾絲或其片段等 衣殼蛋白。適合于傳遞的分子選自文中所述治療性分子及其基因產(chǎn)物。各種接頭，包括脂 質(zhì)、聚賴氨酸等可用作接頭。例如，猿猴五鄰體蛋白可通過使用猿五鄰體序列生產(chǎn)融合蛋白 來(lái)容易地用于這種目的，所述生產(chǎn)方式類似于Medina-Kauwe LK等，Gene Ther. 2001年5 月；8(10) 795-803 和 Medina-KauweLK 等，Gene Ther. 2001 年 12 月；8(23) 1753-1761 PJf 述。此外，如美國(guó)專利申請(qǐng)20010047081所述，猿猴Ad蛋白IX的氨基酸序列可用于靶向載 體至細(xì)胞表面受體。合適的配體包括CD40抗原，含有RGD或聚賴氨酸的序列等。還有其它
16猿猴Ad蛋白，包括例如六鄰體蛋白和/或尾絲蛋白可用于這些或類似的目的。其它SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38腺病毒蛋白可單獨(dú)或與其它腺病 毒蛋白聯(lián)用于各種目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白這一點(diǎn)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解 SAdV腺病毒蛋白還有其它用途。II.重組腺病毒載體本發(fā)明的組合物包括用于治療或疫苗目的的能向細(xì)胞遞送異源分子的載體。如本 文所用，載體可包含任何遺傳元件，包括但不限于裸DNA、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、游離體、質(zhì) ?；虿《?。這些載體含有SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38的猿猴腺病毒DNA和小 基因。“小基因”或“表達(dá)盒”指所選異源基因和在宿主細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)翻譯、轉(zhuǎn)錄和/或基因產(chǎn) 物表達(dá)所需的其它調(diào)控元件的組合。通常設(shè)計(jì)SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38衍生的腺病毒載體，以使該 小基因位于核酸分子中，而該核酸分子在所選腺病毒基因的天然區(qū)域中含有其它腺病毒序 列。如果需要，可將該小基因插入現(xiàn)有基因區(qū)域中，以破壞該區(qū)域的功能?；蛘撸蓪⒃撔?基因插入部分或完全缺失的腺病毒基因的位點(diǎn)內(nèi)。例如，可使該小基因位于可選擇的位點(diǎn)， 如功能性El缺失位點(diǎn)或功能性E3缺失位點(diǎn)等中。術(shù)語(yǔ)“功能性缺失”指通過突變或修飾去 除或損傷足夠量的基因區(qū)域，以使該基因區(qū)域不再能夠通過基因表達(dá)產(chǎn)生功能性產(chǎn)物。如 果需要，可去除整個(gè)基因區(qū)域。在本申請(qǐng)的其它地方討論用于破壞或缺失基因的其它合適 位點(diǎn)。例如，為了產(chǎn)生用于產(chǎn)生重組病毒的載體，該載體可含有該小基因和腺病毒基因 組的5’端或腺病毒基因組的3’端，或同時(shí)含有腺病毒基因組的5’和3’端。腺病毒基因 組的5’端含有包裝和復(fù)制所必需的5’順式元件；即5’末端反向重復(fù)(ITR)序列(用作復(fù) 制起點(diǎn))和天然5’包裝增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域(含有包裝線性Ad基因組所需序列和El啟動(dòng)子的增 強(qiáng)子元件)。腺病毒基因組的3’端包含包裝和衣殼化所必需的3’順式元件(含有ITR)。 重組腺病毒適合含有5’和3’腺病毒順式元件，小基因位于5’和3’腺病毒序列之間?；?于SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38的腺病毒載體也可含其它腺病毒序列。這些基于SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38的腺病毒載體宜含衍生 自本發(fā)明腺病毒基因組的一種或多種腺病毒元件。一實(shí)施方式中，該載體含SAdV39、 SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38的腺病毒ITR和同一腺病毒血清型的其它腺病毒序列。另 一實(shí)施方式中，該載體含不同腺病毒血清型而非提供此ITR腺病毒衍生的腺病毒序列。如本文所述，假型腺病毒指該腺病毒的衣殼蛋白來(lái)自與提供ITR的腺病毒不同的 腺病毒。此外，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)用本文所述腺病毒構(gòu)建嵌合或雜交腺病 毒。見例如美國(guó)專利7，291，498。選擇載體中存在的ITR的腺病毒來(lái)源和其它腺病毒序列的來(lái)源不限制本發(fā)明。各 種腺病毒株可從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(馬納薩斯，弗吉尼亞)獲得，或通過咨詢各種商業(yè) 和學(xué)術(shù)來(lái)源而獲得。此外，許多菌株的序列可從各種數(shù)據(jù)庫(kù)，包括例如，PubMed和GenBank 獲得。發(fā)表的文獻(xiàn)中已描述了從其它猿猴或人腺病毒制備的同源腺病毒載體[見例如，美 國(guó)專利5，240, 846]。許多類型腺病毒的DNA序列可獲自GenBank，包括Ad5 [GenBank登錄 號(hào)M73260]?？色@得任何已知腺病毒血清型，如血清型2、3、4、7、12和40的腺病毒序列，還包括目前已鑒定的人類型。在本發(fā)明的載體構(gòu)建物中也可采用已知能感染非人動(dòng)物(如猿 猴)的相似腺病毒。參見例如，美國(guó)專利6，083，716。如上所述獲得用于構(gòu)建本文所述載體的病毒序列、輔助病毒(如果需要)和重組 病毒顆粒，以及其它載體組分和序列。本發(fā)明的SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38 猿猴腺病毒序列的DNA序列可用于構(gòu)建此類載體和用于制備此載體的細(xì)胞系?？捎脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生形成本發(fā)明載體的核酸序列的修飾，包括序列缺 失、插入和其它突變，這些修飾并包含在該實(shí)施方式的范圍內(nèi)。A. “小基因，，根據(jù)本文提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠了解用于選擇轉(zhuǎn)基因、克隆和構(gòu)建“小 基因”，并將其插入病毒載體的方法。1.轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因是編碼感興趣的多肽、蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物，并與其側(cè)接的載體序列異源的 核酸序列。核酸編碼序列以允許轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或表達(dá)的方式操作性 地與調(diào)節(jié)組分相連。轉(zhuǎn)基因序列的組成取決于所得到的載體的用途。例如一類轉(zhuǎn)基因序列包含報(bào)道 序列，該序列在表達(dá)后產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。這種報(bào)道序列包括但不限于編碼以下物質(zhì)的DNA 序列β "內(nèi)酰胺酶、β "半乳糖苷酶(LacZ)、堿性磷酸酶、胸腺激酶、綠色熒光蛋白(GFP)、 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、螢光素酶、膜結(jié)合蛋白(如002、004、008)、流感血凝素蛋白和本 領(lǐng)域熟知的存在高親和力抗體或可通過常規(guī)方法產(chǎn)生所述抗體的其他物質(zhì)，以及含有膜結(jié) 合蛋白的融合蛋白，該膜結(jié)合蛋白適當(dāng)?shù)嘏c血凝素或Myc等物質(zhì)的抗原標(biāo)記區(qū)融合。當(dāng)這 些編碼序列與驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的調(diào)節(jié)元件相關(guān)聯(lián)時(shí)，可提供由常規(guī)方法檢測(cè)的信號(hào)，所述常規(guī) 方法包括酶法、放射顯影法、比色法、熒光法或其他光譜測(cè)定、熒光激活細(xì)胞分選測(cè)定與免 疫測(cè)定，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射性免疫測(cè)定(RIA)和免疫組織化學(xué)。例如，當(dāng) 標(biāo)記序列是LacZ基因時(shí)，通過測(cè)定β -半乳糖苷酶的活性來(lái)檢測(cè)攜帶信號(hào)的載體的存在。 當(dāng)轉(zhuǎn)基因是GFP或螢光素酶時(shí)，攜帶信號(hào)的載體可用光度計(jì)通過顏色或光的產(chǎn)生來(lái)觀測(cè)?！獙?shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因是編碼具有生物或醫(yī)藥用途的產(chǎn)物的非標(biāo)記序列，所述產(chǎn) 物例如蛋白質(zhì)、肽、RNA、酶或催化性RNA。所需RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖體RNA、催化 性RNA和反義RNA。有用的RNA序列的一個(gè)例子是消除靶核酸序列在經(jīng)處理的動(dòng)物中表達(dá) 的序列。可將轉(zhuǎn)基因用于治療，例如治療遺傳缺陷，作為癌癥治療劑或疫苗，用于誘導(dǎo)免疫 應(yīng)答，和/或達(dá)到預(yù)防性疫苗目的。本文所用的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答指分子(如基因產(chǎn)物)誘導(dǎo) 針對(duì)該分子的T細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的能力。本發(fā)明還包括使用多個(gè)轉(zhuǎn)基因，例如用 來(lái)糾正或減輕多亞基蛋白質(zhì)所致疾病。在某些情況下，可采用不同的轉(zhuǎn)基因編碼蛋白質(zhì)的 各亞基，或編碼不同肽或蛋白質(zhì)。當(dāng)編碼蛋白質(zhì)亞基的DNA很大時(shí)這尤其適合，所述蛋白質(zhì) 例如免疫球蛋白、血小板衍生的生長(zhǎng)因子或抗肌萎縮蛋白。為使細(xì)胞產(chǎn)生多亞基蛋白質(zhì)，用 含有各自不同亞基的重組病毒感染細(xì)胞?；蛘?，蛋白質(zhì)的不同亞基可由同一轉(zhuǎn)基因編碼。 在這種情況下，單個(gè)轉(zhuǎn)基因包含編碼各亞基的DNA，而各亞基的DNA由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) (IRES)隔開。當(dāng)編碼各亞基的DNA較小時(shí)，例如編碼亞基的DNA與IRES的總體積小于5 千堿基對(duì)時(shí)，這尤其適合。作為IRES的替代，DNA可用編碼在翻譯后階段自我切割的2A肽的序列隔開。參見，例如M. L.Donnelly 等，J. Gen. Virol.，78 (第一部分)13-21 (1997 年 1月)；Furler, S.等人，Gene Ther.，8 (11) :864_873 (2001 年 6 月)；Klump H.等人，Gene Ther.，8 (10) 811-817 (2001年5月)。該2A肽明顯小于IRES，使得其非常適合用于空間 成為制約因素之時(shí)。然而，選定的轉(zhuǎn)基因可編碼任何生物活性產(chǎn)物或其他產(chǎn)物，例如研究所
需的產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因的選擇不限制該實(shí)施方式。2.調(diào)節(jié)元件除了以上就小基因而言的主要元件以外，載體還包含必需的常規(guī)控制元件，所述 常規(guī)控制元件以允許轉(zhuǎn)基因在以下所述細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或表達(dá)的方式操作性地與轉(zhuǎn) 基因相連，所述細(xì)胞為本發(fā)明產(chǎn)生的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染或病毒所感染。本文所用的“操作性相連 接的”序列包括與感興趣基因毗連的表達(dá)調(diào)控序列和反式作用或遠(yuǎn)距離調(diào)控感興趣基因的 表達(dá)調(diào)控序列。表達(dá)控制序列包括適宜的轉(zhuǎn)錄起始、終止、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列；有效的RNA加工 信號(hào)，例如剪接和聚腺苷酸化(PolyA)信號(hào)；穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA的序列；增強(qiáng)翻譯效率的序 列(即=Kozak共有序列)；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；以及在需要時(shí)增強(qiáng)編碼產(chǎn)物分泌的 序列。許多表達(dá)控制序列，包括天然的、組成型的、誘導(dǎo)型的和/或組織特異性的啟動(dòng)子 是本領(lǐng)域已知并可利用的。組成型啟動(dòng)子的例子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒羅斯肉瘤病毒 (RSV)LTR啟動(dòng)子(任選連有RSV增強(qiáng)子)、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(任選連有CMV增強(qiáng) 子)[參見，例如=Boshart等，Cell,41 :521_530 (1985) ]、SV40啟動(dòng)子、二氫葉酸還原酶啟 動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動(dòng)子和EFl α啟動(dòng)子(英杰公司)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，并受外源提供的化合物、環(huán)境因素如溫度或 存在細(xì)胞的特定生理狀態(tài)如急性期、特定分化階段的調(diào)控，或只在復(fù)制性細(xì)胞中受調(diào) 節(jié)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和可誘導(dǎo)系統(tǒng)可從多種商業(yè)來(lái)源獲得，包括但不限于英杰公司、克隆 技術(shù)公司(Clontech)和阿里阿德公司(Ariad)。已知的還有許多本領(lǐng)域技術(shù)人員易于 選擇的其他系統(tǒng)。例如，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括鋅誘導(dǎo)型綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動(dòng)子和地 塞米松(Dex)-誘導(dǎo)型小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子。其它誘導(dǎo)型系統(tǒng)包括Τ7聚合 酶啟動(dòng)子系統(tǒng)[W0 98/10088]；蛻皮激素昆蟲啟動(dòng)子[No等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 3346-3351(1996)],四環(huán)素-抑制性系統(tǒng)[Gossen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 5547-5551 (1992)]，四環(huán)素-誘導(dǎo)型系統(tǒng)[Gossen 等，Science，378 :1766_1769 (1995)， 也參見 Harvey 等，Curr. Opin. Chem. Biol.，2 :512_518 (1998)]。其它系統(tǒng)包括 FK506 二聚體、采用甘珀二醇(castradiol)的VP16或p65、聯(lián)苯酚米勒留酮(murislerone)、 RU486-誘導(dǎo)型系統(tǒng)[Wang 等，Nat. Biotech.，15 :239_243 (1997)和 Wang 等，Gene Ther.， 4 432-441 (1997)]和雷帕霉素-誘導(dǎo)型系統(tǒng)[Magrosei 等，J. Clin. Invest.，100 2865-2872 (1997)]。一些誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的有效性隨時(shí)間提高。在這種情況下，可通過將多個(gè) 阻抑物以串聯(lián)形式插入，如通過IRES將TetR與TetR連接，來(lái)提高這種系統(tǒng)的有效性?；?者，可以在篩選所需功能之前等待至少3天?？赏ㄟ^已知方式提高所需蛋白的表達(dá)，以提高 該系統(tǒng)的有效性。例如，使用土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)。在另一個(gè)實(shí)施方案中使用了轉(zhuǎn)基因的天然啟動(dòng)子。當(dāng)需要轉(zhuǎn)基因的表達(dá)模擬天然表達(dá)時(shí)，可優(yōu)選天然啟動(dòng)子。當(dāng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)必須瞬時(shí)或發(fā)育調(diào)節(jié)、或以組織特異性的方式 或響應(yīng)特定轉(zhuǎn)錄刺激而調(diào)節(jié)時(shí)，可使用天然啟動(dòng)子。在另外的實(shí)施方案中，也可使用其他天 然表達(dá)控制元件，例如增強(qiáng)子元件、聚腺苷酸化位點(diǎn)或Kozak共有序列以模擬天然表達(dá)。轉(zhuǎn)基因的另一實(shí)施方案包含操作性連接于組織特異性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因。例如， 如果需要在骨骼肌中表達(dá)，應(yīng)該使用在肌肉中有活性的啟動(dòng)子。這包括編碼以下產(chǎn)物的 基因的啟動(dòng)子骨骼肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、抗肌萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶以及活 性高于天然啟動(dòng)子的合成肌肉啟動(dòng)子(參見Li等，Nat. Biotech.，17 :241-245 (1999))。 已知的組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例有肝特異性的(白蛋白，Miyatake等，J.Virol. ,71 5124-32(1997)；乙肝病毒核心啟動(dòng)子，Sandig 等，Gene Ther.，3 1002-9 (1996)甲胎蛋 白(AFP)，Arbuthnot 等，Hum. Gene Ther.，7 1503-14 (1996))、骨的骨鈣蛋白(Stein 等， Mol. Biol. R印·，24 185-96 (1997))；骨唾液蛋白(Chen 等，J. Bone Miner. Res. , 11 654-64(1996))、淋巴細(xì)胞特異性的(CD2，Hansal 等，J. Immunol. 161 1063-8 (1998)；免疫 球蛋白重鏈；T細(xì)胞受體鏈)、神經(jīng)元特異性的(例如神經(jīng)元_特異性烯醇酶(NSE)啟動(dòng)子 (Andersen 等，Cell. Mol. Neurobiol.，13 :503_15 (1993))、神經(jīng)絲輕鏈基因(Piccioli 等， Proc. Natl. Acad. Sci.，美國(guó)，88 :5611_5 (1991))，以及神經(jīng)元-特異性 vgf 基因(Piccioli 等，Neuron，15 :373-84(1995)))等。任選地，攜帶編碼有治療用途或免疫原性產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因的載體還可含有可選擇 標(biāo)記基因，或報(bào)道基因可包含編碼遺傳霉素、潮霉素或嘌呤霉素(purimycin)抗性等的序 列。這種可選擇的報(bào)道基因或標(biāo)記基因(優(yōu)選位于有待包裝到病毒顆粒中的病毒基因組 之外)，可用來(lái)傳導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞中存在質(zhì)粒的信號(hào)，例如氨芐青霉素抗性。載體的其他成分可 包括復(fù)制起點(diǎn)?？赏ㄟ^常規(guī)方法選擇這些和其他啟動(dòng)子與載體元件，許多這種序列可獲得 [參見例如=Sambrook等人，以及本文引用的參考文獻(xiàn)]。利用本文提供的技術(shù)和序列，結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)產(chǎn)生這些載體。這 些技術(shù)包括如教科書中所述的常規(guī)cDNA克隆技術(shù)[Sambrook等，MolecularCloning =A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Press (冷泉港出版 社)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，紐約]、使用腺病毒基因組的重疊寡核苷酸序列、聚合 酶鏈反應(yīng)和提供所需核苷酸序列的任何合適方法。III.病毒載體的制造一實(shí)施方式中，用猿猴腺病毒質(zhì)粒(或其它載體)來(lái)產(chǎn)生腺病毒載體。一實(shí)施方 式中，所述腺病毒載體是復(fù)制缺陷型腺病毒顆粒。一實(shí)施方式中，所述腺病毒顆粒由于缺失 Ela和/或Elb基因而變得復(fù)制缺陷?；蛘?，所述腺病毒通過其他方式變得復(fù)制缺陷，任選 仍舊保留Ela和/或Elb基因。所述腺病毒載體的腺病毒基因組中也可包含其他突變，如 溫度敏感性突變或其它基因缺失。其它實(shí)施方式中，需要在腺病毒載體中保持完整的Ela 和/或Elb區(qū)。這種完整的El區(qū)可位于腺病毒基因組的天然位置中，或置于天然腺病毒基 因組的缺失位點(diǎn)(如E3區(qū))中。在用于將基因遞送給人(或其它哺乳動(dòng)物)細(xì)胞的猿猴腺病毒載體的構(gòu)建中，可 將一系列腺病毒核酸序列用于該載體。例如，可由形成一部分重組病毒的猿猴腺病毒序列 中清除全部或一部分腺病毒延遲早期基因E3。相信猿猴E3的功能與重組病毒顆粒的功能 和產(chǎn)生無(wú)關(guān)。也可構(gòu)建至少E4基因的0RF6區(qū)域缺失，更需要整個(gè)E4區(qū)缺失(因?yàn)樵搮^(qū)域的功能冗余)的猿猴腺病毒載體。本發(fā)明另一種載體的延遲早期基因E2a中含有缺失。也 可在猿猴腺病毒基因組的晚期基因L1-L5中產(chǎn)生缺失。相似地，中間基因IX和IVa2中的 缺失可用于一些目的?？梢栽谄渌Y(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)腺病毒基因組中產(chǎn)生其它缺失。上述缺失 可單獨(dú)使用，即本文所述使用的腺病毒序列可僅在一個(gè)區(qū)域中含有缺失?；蛘?，可以任何組 合形式使用能有效破壞其生物學(xué)活性的整個(gè)基因或其部分的缺失。例如，在一種示范性載 體中，腺病毒序列可缺失El基因和E4基因，或El、E2a和E3基因，或El和E3基因，或E1、 E2a和E4基因，缺失或不缺失E3，等等。如上所述，這類缺失可與其它突變，如溫敏型突變 聯(lián)用，以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果?？梢栽谙俨《绢w粒的病毒感染力和繁殖所需的缺失腺病毒基因產(chǎn)物存在下培養(yǎng) 缺少任何必需腺病毒序列(如Ela、Elb、E2a、E2b、E4 0RF6、Li、L2、L3、L4和L5)的腺病毒 載體?？梢栽谝环N或多種輔助構(gòu)建物(如質(zhì)?；虿《?或包裝宿主細(xì)胞的存在下培養(yǎng)腺病 毒載體，從而提供這些輔助功能。參見例如，納入本文作參考的1996年5月9日公布的國(guó) 際專利申請(qǐng)W096/13597中描述的"最小"人Ad載體的制備技術(shù)。1.輔助病毒因此，根據(jù)用于攜帶小基因的病毒載體的猿猴腺病毒基因含量，可能需要輔助腺 病毒或非復(fù)制型病毒片段來(lái)提供足夠的猿腺病毒基因序列，以便產(chǎn)生含有該小基因的感染 性重組病毒顆粒。有用的輔助病毒含有腺病毒載體構(gòu)建物中不存在和/或轉(zhuǎn)染了載體的包 裝細(xì)胞系不表達(dá)的所選腺病毒基因序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，該輔助病毒是復(fù)制缺陷型病 毒，除上述序列外還含有各種腺病毒基因。這種輔助病毒宜與El表達(dá)細(xì)胞系聯(lián)用。輔助病毒也可形成聚陽(yáng)離子偶聯(lián)物，如Wu等，J. Biol. Chem.，374 16985-16987(1989) ；K. J. Fisher 和 J. M. Wilson, Biochem. J.，299 49 (1994 年 4 月 1 日) 所述。輔助病毒可任選地含有第二種報(bào)道小基因。本領(lǐng)域已知許多這類報(bào)道基因。輔助病 毒上存在不同于腺病毒載體上的轉(zhuǎn)基因的報(bào)道基因能獨(dú)立監(jiān)測(cè)Ad載體和輔助病毒用第二 種報(bào)道物區(qū)分純化后得到的重組病毒和輔助病毒。2.補(bǔ)充細(xì)胞系為了產(chǎn)生任一上述基因中發(fā)生缺失的重組猿猴腺病毒(Ad)，如果缺失基因區(qū)域的 功能是病毒復(fù)制或感染所必需的，必須通過輔助病毒或細(xì)胞系，即補(bǔ)充或包裝細(xì)胞系向該 重組病毒提供該功能。在許多情況下，可利用表達(dá)人El的細(xì)胞系反式補(bǔ)充黑猩猩Ad載體。 這特別有利，因?yàn)?，由于本發(fā)明黑猩猩Ad序列和目前可得的包裝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的人Ad El序 列之間的差異，使用現(xiàn)有含人El的細(xì)胞能防止在復(fù)制和產(chǎn)生過程中產(chǎn)生能夠復(fù)制的腺病 毒。然而，在某些情況下，可能需要利用表達(dá)El基因產(chǎn)物的細(xì)胞系產(chǎn)生El缺失的猿猴腺病 毒。已經(jīng)描述過這類細(xì)胞系。參見例如，美國(guó)專利6，083，716。如果需要，可利用本文提供的序列產(chǎn)生至少在所選母體細(xì)胞系表達(dá)所用的啟動(dòng) 子轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)來(lái)自SAdV39的腺病毒El基因的包裝細(xì)胞或細(xì)胞系。誘導(dǎo)型或組成型 啟動(dòng)子可用于此目的。本說明書中其它地方詳細(xì)描述了這類啟動(dòng)子的例子。選擇親本細(xì) 胞以產(chǎn)生表達(dá)任何所需的SAdV39基因的新細(xì)胞系。如果不受限制，這類母體細(xì)胞系可以 是 HeLa[ATCC 登錄號(hào) CCL 2]、A549 [ATCC 登錄號(hào) CCL 185]、HEK 293、KB [CCL 17]、底特律 (Detroit)[如底特律510，CCL 72]和WI_38[CCL 75]細(xì)胞等。這些細(xì)胞系均可獲自位于 弗吉尼亞州瑪納薩斯(Manassas，Virginia) 20110-2209大學(xué)大道10801號(hào)的美國(guó)典型培養(yǎng)
21物保藏中心(American Type Culture Collection)。其它合適的親本細(xì)胞系可獲自其它來(lái)源。這類表達(dá)El的細(xì)胞系可用于產(chǎn)生重組猿猴腺病毒El缺失型載體。此外或或者， 可利用與產(chǎn)生重組猿病毒載體所用方法基本相同的方法構(gòu)建表達(dá)一種或多種猿腺病毒基 因產(chǎn)物，如Ela、Elb、E2a和/或E4 0RF6的細(xì)胞系。這類細(xì)胞系可用于反式補(bǔ)充編碼這些 產(chǎn)物的必需基因中缺失的腺病毒載體，或提供包裝輔助依賴性病毒(如腺伴隨病毒)所必 需的輔助功能。本發(fā)明制備宿主細(xì)胞涉及諸如裝配選定的DNA序列等技術(shù)?？墒褂贸Ｒ?guī)技 術(shù)實(shí)現(xiàn)這種裝配。這種技術(shù)包括公知的且描述于前文引用的Sambrook等的著作中的cDNA 和基因組克隆、使用腺病毒基因組的重疊寡核苷酸序列，結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、合成方法以 及提供所需核苷酸序列的其他合適方法。在另一個(gè)替代方式中，通過腺病毒載體和/或輔助病毒反式提供必需腺病毒基因 產(chǎn)物。在這種情況下，合適的宿主細(xì)胞可選自各種生物體，包括原核(例如細(xì)菌)細(xì)胞和 真核細(xì)胞，包括昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。特別適合的宿主細(xì)胞選自任何哺乳動(dòng) 物物種，包括但不限于，A549.WEHI、3T3、IOT1/2、HEK 293細(xì)胞或PERC6 (這二者均表達(dá)功能 性腺病毒 El) [Fallaux, FJ 等，(1998)，Hum Gene Ther,9 1909-1917]、Saos、C2C12、L 細(xì) 胞、HT1080、HepG2以及衍生自哺乳動(dòng)物，包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和倉(cāng)鼠的原代成纖維細(xì) 胞、肝細(xì)胞和成肌細(xì)胞細(xì)胞。選擇細(xì)胞的哺乳動(dòng)物來(lái)源和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的類型(即成纖維 細(xì)胞、肝細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等)不限制本發(fā)明。3.病毒顆粒的組裝和細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染當(dāng)通過轉(zhuǎn)染遞送含有小基因的載體時(shí)，通常將約5 μ g- οο μ g DNA、優(yōu)選約 10 μ g-50 μ g DNA遞送給約1 X IO4-I X IO13個(gè)細(xì)胞、優(yōu)選約1 X IO5個(gè)細(xì)胞。然而，可根據(jù)諸 如所選載體、遞送方法和所選宿主細(xì)胞等因素調(diào)整宿主細(xì)胞與載體DNA的相對(duì)量。該載體可以是本領(lǐng)域已知或上述任何載體，包括裸DNA、質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘 粒、附加體、病毒等。可通過本領(lǐng)域已知或上述任何方式，包括轉(zhuǎn)染和感染將載體引入宿主 細(xì)胞中。一個(gè)或多個(gè)腺病毒基因可穩(wěn)定地整合入宿主細(xì)胞基因組，作為附加體穩(wěn)定表達(dá)，或 者瞬時(shí)表達(dá)?；虍a(chǎn)物可全部瞬時(shí)表達(dá)，在附加體上或穩(wěn)定整合；或者，一些基因產(chǎn)物可穩(wěn) 定地表達(dá)，而另一些瞬時(shí)表達(dá)。此外，各腺病毒基因的啟動(dòng)子可彼此獨(dú)立地選自組成型啟 動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或天然腺病毒啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可由生物體或細(xì)胞的特定生理狀態(tài)調(diào)節(jié) (即分化狀態(tài)或復(fù)制或靜息細(xì)胞)或由(例如)外源添加因子調(diào)節(jié)。也可使用技術(shù)人員已知和本說明書中討論的技術(shù)將這些分子(如質(zhì)粒或病毒)引 入宿主細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方式中，采用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染技術(shù)，如CaPO4R染或電穿孔。用常規(guī)技術(shù)將所選腺病毒的DNA序列(以及轉(zhuǎn)基因和其它載體元件)組裝到各種 中間質(zhì)粒中，并用該質(zhì)粒和載體產(chǎn)生重組病毒顆粒。這些技術(shù)包括如教科書中所述的常規(guī) cDNA克隆技術(shù)[Sambrook等，同上]、使用腺病毒基因組的重疊寡核苷酸序列、聚合酶鏈反 應(yīng)和提供所需核苷酸序列的任何合適方法。采用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染技術(shù)，例如CaPOjX 淀技術(shù)。所用的其它常規(guī)方法包括病毒基因組的同源重組、測(cè)定瓊脂覆蓋層中的病毒空斑、 測(cè)定信號(hào)產(chǎn)生的方法等。例如，在構(gòu)建和組裝含所需小基因的病毒載體后，在輔助病毒的存在下將該載體 體外轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系中。在輔助和載體序列之間發(fā)生同源重組，這使得載體中的腺病毒轉(zhuǎn)基因序列能夠被復(fù)制并包裝到病毒顆粒衣殼中，產(chǎn)生重組病毒載體顆粒。目前產(chǎn)生這類 病毒顆粒的方法是基于轉(zhuǎn)染的方法。然而，本發(fā)明不限于這類方法。得到的重組猿猴腺病毒可用于將所選轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到所選細(xì)胞中。重組病毒在包裝 細(xì)胞系中增殖的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明El缺失重組猿猴腺病毒載體證明可用于將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn) 移到非猿猴，優(yōu)選人的細(xì)胞中。IV.使用重組腺病毒載體可用基于重組猿猴腺病毒-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38的載體將基因體 外、離體和體內(nèi)遞送給病人或非猿猴病獸。本文所述的重組腺病毒載體可用作體外產(chǎn)生異源基因編碼產(chǎn)物的表達(dá)載體。例 如，可將含插入到El缺失部位某基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染入上述El表達(dá)細(xì)胞系中?；?者，在另一所選細(xì)胞系中采用復(fù)制活性腺病毒。然后以常規(guī)方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使該重組腺 病毒從啟動(dòng)子表達(dá)基因產(chǎn)物。然后，用已知的常規(guī)蛋白質(zhì)分離和回收方法回收培養(yǎng)物中的
基因產(chǎn)物。SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38衍生的重組猿猴腺病毒載體提供了有效 的基因轉(zhuǎn)移載體，可在體外或離體情況下將所選轉(zhuǎn)基因遞送給所選宿主細(xì)胞，甚至在該生 物已有一種或多種AAV血清型的中和抗體時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，rAAV與細(xì)胞離體混合， 使用常規(guī)方法培養(yǎng)被感染的細(xì)胞，并將被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞回輸給患者。這些組合物尤其適用于 治療目的和免疫接種目的的基因遞送，所述免疫接種包括誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。更通常的情況是，SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38重組腺病毒載體可用 于遞送治療性或免疫原性分子，如上所述。不難理解這兩種用途，即本發(fā)明的重組腺病毒特 別適合反復(fù)遞送重組腺病毒載體的治療方案。這類方案一般包括遞送病毒衣殼不同的一系 列病毒載體?？筛淖兠看魏罄m(xù)給藥的病毒衣殼，或者在預(yù)先選擇的特定血清型衣殼給藥次 數(shù)(如一次、兩次、三次、四次或更多次)后改變。因此，方案可包括遞送rAd與第一猿猴衣 殼、遞送rAd與第二猿猴衣殼和遞送第三猿猴衣殼。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，有各種單獨(dú)采用 本發(fā)明Ad衣殼，聯(lián)合采用，或與其它腺病毒(優(yōu)選無(wú)免疫交叉反應(yīng)性的腺病毒)聯(lián)用的方 案。任選地，這類方案可包括給予rAd與其他非人靈長(zhǎng)動(dòng)物腺病毒、人腺病毒或人工序列的 衣殼。該方案的各階段可包括用一種Ad衣殼進(jìn)行一系列注射(或其它遞送途徑)，然后用 另一種不同Ad來(lái)源的衣殼進(jìn)行一系列注射。或者，所述SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、_37 或-38載體可用于涉及其它非腺病毒介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)，包括其它病毒系統(tǒng)、非病毒遞送系 統(tǒng)、蛋白質(zhì)、肽和其它生物活性分子的方案。以下章節(jié)關(guān)注于可通過本發(fā)明的腺病毒載體遞送的示范性分子。A. Ad-介導(dǎo)的治療分子的遞送在一個(gè)實(shí)施方式中，按照已公開的基因治療方法將上述重組載體給予人?？蓪y 帶所選轉(zhuǎn)基因的猿猴病毒載體給予患者，優(yōu)選懸浮于生物相容性溶液或藥學(xué)上可接受的遞 送載體。合適的載體包括無(wú)菌鹽水。已知是藥學(xué)上可接受的載體且為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的其它水性和非水性等滲無(wú)菌注射溶液以及水性和非水性無(wú)菌混懸液均可用于此目的。猿猴腺病毒載體的給予量應(yīng)足以轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞并應(yīng)提供足夠的基因傳送和表達(dá)水 平以提供療效而無(wú)副作用，或有醫(yī)學(xué)上可接受的生理作用，這可由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員確定。 常規(guī)和藥學(xué)上可接受的給藥途徑包括但不限于直接遞送至視網(wǎng)膜和其它眼內(nèi)遞送方法、直接遞送至肝、吸入、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、直腸、口服、和其它胃腸道 外給藥途徑。如果需要，可根據(jù)轉(zhuǎn)基因或病癥來(lái)組合或調(diào)節(jié)給藥途徑。給藥途徑主要取決 于所治療疾病的特性。病毒載體的劑量主要取決于以下因素，例如治療的病癥、患者的年齡、體重和健 康狀況，因此可依患者而改變。例如，治療有效的病毒載體的成人或獸用劑量通常為約 100 μ L-IOOmL載體，其中病毒顆粒的濃度為約IxIO6-IxIO15個(gè)顆粒，約1χ10η-1χ1013個(gè)顆 粒，或約1χ109-1χ1012個(gè)顆粒。劑量范圍取決于動(dòng)物大小和給藥途徑。例如，適用于肌肉內(nèi) 注射的人用或獸用劑量(約80kg動(dòng)物)約為一個(gè)部位lx109-5xl012個(gè)顆粒/毫升。任選 地，可遞送至多個(gè)給藥部位。在另一個(gè)例子中，適用于口服制劑的人用或獸用劑量可以約為 IXIO11-IXIO15個(gè)顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)給藥途徑、利用該重組載體的治療或疫苗應(yīng) 用調(diào)節(jié)這些劑量?？杀O(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因或免疫原的表達(dá)水平，或循環(huán)抗體水平以確定給藥頻率。本 領(lǐng)域技術(shù)人員不難了解測(cè)定給藥頻率時(shí)間選擇的其它方法。任選的方法步驟包括給予該病毒載體的同時(shí)、之前、之后給予合適量的短時(shí)作用 免疫調(diào)節(jié)劑。所選的免疫調(diào)節(jié)劑本文定義為能抑制針對(duì)本發(fā)明重組載體的中和抗體產(chǎn)生的 制劑，或能抑制可消除該載體的溶細(xì)胞性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制劑。此免疫調(diào)節(jié)劑可干擾 T輔助細(xì)胞亞組(；或！^)和B細(xì)胞之間的相互作用，從而抑制中和抗體形成?；蛘撸撁?疫調(diào)節(jié)劑可抑制Thi細(xì)胞和CTL之間的相互作用從而降低載體的CTL消除作用。各種有用 的免疫調(diào)節(jié)劑和其使用劑量已公開，見例如，Yang等，J.Virol.，70 (9) (1996/9) ； 1996/5/2 公開的國(guó)際專利申請(qǐng)W096/12406 ；和國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US96/03035，均納入本文作參考。1.治療性轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因編碼的有用的治療性產(chǎn)物包括激素與生長(zhǎng)因子和分化因 子，包括但不限于胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素(GH)、甲狀旁腺激素(PTH)、生長(zhǎng)激素釋 放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、黃體激素(LH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、血管內(nèi)皮生 長(zhǎng)因子(VEGF)、促血管生成素、血管抑制素、粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)、促紅細(xì)胞生產(chǎn)素 (EPO)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(aFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰 島素生長(zhǎng)因子I和II (IGF-I和IGF-II)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族中的任一個(gè)(包括TGFjgK 素、抑制素)、或骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)BMP1-15中的任一個(gè)、生長(zhǎng)因子中的調(diào)蛋白/神經(jīng)調(diào) 節(jié)蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族的任一個(gè)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白NT-3和NT-4/5、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng) 營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、神養(yǎng)蛋白(neurturin)、聚集蛋白、腦信號(hào)蛋白/瓦解蛋白家族的任一個(gè)、 導(dǎo)蛋白-1和導(dǎo)蛋白-2、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、肝配蛋白、頭蛋白、sonichedgehog蛋白和 酪氨酸羥化酶。其他有用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物包括調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，包括但不限于細(xì)胞因子和 淋巴因子，例如血小板生成素(TPO)、白介素(IL)IL-I到IL-25(包括，例如IL_2、IL-4、 IL-12和IL-18)、單核細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)蛋白、白血病抑制因子、粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因 子、Fas配體、腫瘤壞死因子和干擾素、干細(xì)胞因子、flk-2/flt3配體。免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的基因 產(chǎn)物也可用于本發(fā)明。這些產(chǎn)物包括但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合 免疫球蛋白、人源化抗體、單鏈抗體、T細(xì)胞受體、嵌合T細(xì)胞受體、單鏈T細(xì)胞受體、I類和 II類MHC分子，以及經(jīng)改造的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因產(chǎn)物還包括補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，例如補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白、膜輔因子蛋白(MCP)、衰變加速因子(DAF)、CR1、CF2*CD59。其他有用的基因產(chǎn)物包括激素受體、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì) 和免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)的任一種。本發(fā)明包括膽固醇調(diào)節(jié)的受體，包括低密度脂蛋白(LDL)受 體、高密度脂蛋白(HDL)受體、極低密度脂蛋白(VLDL)受體和清除受體。本發(fā)明也包括以下 基因產(chǎn)物例如類固醇激素受體超家族的成員，包括糖皮質(zhì)激素受體和雌激素受體、維生素 D受體和其他核受體。此外，有用的基因產(chǎn)物包括轉(zhuǎn)錄因子，例如jun、fos、max、mad、血清 應(yīng)答因子(SRF)、AP-1、AP2、myb、MyoD和肌細(xì)胞生成蛋白、含ETS-盒的蛋白質(zhì)、TFE3、E2F、 ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT-盒結(jié)合蛋白、干擾素調(diào) 節(jié)因子(IRF-I)、維爾姆斯腫瘤蛋白、ETS-結(jié)合蛋白、STAT、GATA-盒結(jié)合蛋白，例如GATA-3 和翼狀螺旋蛋白的叉頭蛋白家族。其他有用的基因產(chǎn)物包括氨甲酰合成酶I、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合成 酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羥化酶、α -1抗胰 蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、膽色素原脫氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合成酶、支鏈 酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰-CoA脫氫酶、丙酰-CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA變位酶、戊二 酰-CoA脫氫酶、胰島素、β -葡糖苷酶、丙酮酸羧酸鹽、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸 脫羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)序列和抗肌萎縮蛋白cDNA 序列。其他有用的基因產(chǎn)物包括非天然產(chǎn)生的多肽，例如具有非天然產(chǎn)生的氨基酸序列 的嵌合或雜交多肽，所述非天然產(chǎn)生的氨基酸序列含有插入、缺失或氨基酸取代。例如，經(jīng) 單鏈改造的免疫球蛋白可用在某些免疫低下患者中。其他類型的非天然產(chǎn)生的基因序列包 括反義分子和催化性核酸，例如核酶，可用于降低靶標(biāo)的過表達(dá)。降低和/或調(diào)節(jié)基因表達(dá)對(duì)治療以細(xì)胞過度增殖為特征的過度增殖性疾病，例如 癌癥和銀屑病，尤其理想。靶多肽包括，與正常細(xì)胞相比，僅在過度增殖細(xì)胞中產(chǎn)生或在過 度增殖細(xì)胞中以更高水平產(chǎn)生的多肽。靶抗原包括癌基因，例如myb、myc、fyn和易位基因 如bCr/abl、ras、srC、P53、neu、trk和EGRF編碼的多肽。除了作為靶抗原的癌基因產(chǎn)物，用 于抗癌治療和保護(hù)性治療方案的靶多肽包括B細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)和T細(xì)胞淋 巴瘤的T細(xì)胞受體的可變區(qū)，在某些些實(shí)施方案中，它們也用作自身免疫疾病的靶抗原。其 他腫瘤相關(guān)多肽也可用作靶多肽，例如腫瘤細(xì)胞中水平較高的多肽，包括單克隆抗體17-1A 所識(shí)別的多肽和葉酸結(jié)合多肽。其他合適的治療性多肽和蛋白質(zhì)包括通過賦予抗自身免疫相關(guān)靶標(biāo)的廣譜基礎(chǔ) 保護(hù)性免疫應(yīng)答來(lái)治療患自身免疫疾病和紊亂的個(gè)體的多肽和蛋白，所述自身免疫相關(guān)靶 標(biāo)包括細(xì)胞受體和產(chǎn)生“自我”定向抗體的細(xì)胞。T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病包括類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、斯耶格倫綜合征、結(jié)節(jié)病、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、 自身免疫甲狀腺炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、銀屑病、脈管 炎、韋格納肉芽腫病、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。這些疾病均以結(jié)合內(nèi)源性抗原并引發(fā)自身 免疫疾病相關(guān)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的T細(xì)胞受體(TCR)為特征。本發(fā)明的猿猴腺病毒載體特別適合需要多種腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因遞送的治療方 案，例如，包括再次遞送相同轉(zhuǎn)基因的方案或包括遞送其它轉(zhuǎn)基因的組合方案。這類方 案可包括給予SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38腺病毒載體，然后再次給予來(lái)自相同血清型腺病毒的載體。特別理想的方案包括給予SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37 或-38猿猴腺病毒載體，其中第一次給予的載體的腺病毒衣殼序列的來(lái)源不同于后續(xù) 一次或多次所用病毒載體的腺病毒衣殼序列的來(lái)源。例如，治療方案包括給予SAdV39、 SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38載體和重復(fù)給予一種或多種血清型相同或不同的腺病 毒載體。另一實(shí)施方式中，治療方案包括給予一種腺病毒載體，隨后反復(fù)給予SAdV39、 SAdV-25. 2、-26，-30、-37或-38載體，所述載體的衣殼來(lái)源不同于第一次遞送的腺病毒載 體的衣殼，并任選還給予另一種來(lái)源相同，或優(yōu)選不同于前一次給藥步驟中載體腺病毒衣 殼的載體。這些方案不限于用遞送用SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38猿猴序列 構(gòu)建的腺病毒載體。而且，這些方案可容易地采用其它腺病毒序列，包括但不限于其它猿 猴腺病毒序列(如Pan9或C68、C1等)，其它非人靈長(zhǎng)動(dòng)物腺病毒序列或人腺病毒序列，與 SAdV39、SAdV-25. 2，、-26、_30、_37或-38載體中的一種或多種聯(lián)用。此說明書中討論了這 種猿猴、其它非人靈長(zhǎng)動(dòng)物和人腺病毒血清型的例子。另外，這些治療方案包括同時(shí)或依次 遞送SAdV39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38腺病毒載體，聯(lián)用非腺病毒載體、非病毒載體 和/或各種其它有用的治療化合物或分子。本發(fā)明不限于這些治療方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員 不難明白這些方案。B. Ad-介導(dǎo)的免疫原性轉(zhuǎn)基因的遞送所述重組SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38載體也可用作免疫原性組合 物。本文的免疫原性組合物是這樣一種組合物，將其遞送給哺乳動(dòng)物，優(yōu)選靈長(zhǎng)動(dòng)物后，能 針對(duì)其所遞送的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物產(chǎn)生體液(如抗體)或細(xì)胞(如細(xì)胞毒T細(xì)胞)免疫應(yīng)答的。 重組猿猴Ad在其任意腺病毒序列中可含有編碼所需免疫原的基因缺失。與人來(lái)源的腺病 毒相比，這種猿猴腺病毒可能更適合作為不同種動(dòng)物的重組活病毒疫苗，但不僅限于此用 途。重組腺病毒可用作任何病原體的預(yù)防性或治療性疫苗，對(duì)于該病原體，已鑒定到對(duì)誘導(dǎo) 免疫應(yīng)答至關(guān)重要且能夠限制其傳播的抗原，并可獲得其cDNA。這類疫苗(或其它免疫原性)組合物配制在合適的遞送載體中，如上所述。通常， 免疫原性組合物的劑量在上述治療組合物的劑量范圍內(nèi)。可監(jiān)測(cè)所選基因的免疫水平，以 確定對(duì)加強(qiáng)免疫的需求(如果有的話)。評(píng)估血清中的抗體效價(jià)后，可能需要任選的加強(qiáng)免疫?？扇芜x將本發(fā)明疫苗組合物配制成含有其它組分，包括例如佐劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié) 劑、防腐劑等。疫苗領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這類組分。合適佐劑的例子包括但不限于脂質(zhì)體、明 礬、單磷酰脂質(zhì)A和任何生物學(xué)活性因子，如細(xì)胞因子、白介素、趨化因子、配體和其優(yōu)化組 合?？赏ㄟ^(例如)質(zhì)粒或病毒載體在體內(nèi)表達(dá)所述的某些生物活性因子。例如，這類佐 劑可與編碼抗原的初免DNA疫苗一起給藥，以便相對(duì)于只用編碼該抗原的DNA疫苗初免后 產(chǎn)生的免疫應(yīng)答提高抗原特異性免疫應(yīng)答。以"免疫原性量"給予重組腺病毒，即，在給藥途徑中能夠有效轉(zhuǎn)染所需細(xì)胞并 提供足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的所選基因表達(dá)水平的重組腺病毒用量。提供保護(hù)性免疫時(shí)，認(rèn)為 該重組腺病毒是用于防止感染和/或疾病復(fù)發(fā)的疫苗組合物?；蛘?，或此外，本發(fā)明的載體可含有編碼能引發(fā)對(duì)所選免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的肽、 多肽或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因。預(yù)計(jì)本文所述的重組SadV載體能高度有效低誘導(dǎo)針對(duì)插入的該 載體表達(dá)的異源抗原蛋白的溶細(xì)胞性T細(xì)胞和抗體。
例如，免疫原可選自各種病毒科。需要免疫應(yīng)答來(lái)抵御的病毒科的實(shí)例包括小 RNA病毒科，其包括導(dǎo)致約50%普通感冒病例的鼻病毒屬；腸病毒屬，其包括脊髓灰質(zhì)炎病 毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒和人腸病毒(例如甲肝病毒)；以及口瘡病毒屬，其主要在非人動(dòng) 物中導(dǎo)致口蹄疫。在小1 離病毒科內(nèi)，靶抗原包括￥ 1、￥ 2、￥ 3、￥ 4和￥ 6。另一病毒科 包括杯狀病毒科，其包括諾沃克病毒群體，它是流行性胃腸炎的重要病原體。另一種對(duì)于用 于靶向抗原從而在人或非人動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的理想病毒科是披膜病毒科，該科包括甲 型病毒屬，該甲型病毒屬包括辛德畢斯病毒、羅斯河病毒、和委內(nèi)瑞拉、東部和西部馬腦炎 病毒和風(fēng)疹病毒屬，包括風(fēng)疹病毒。黃病毒科包括登革熱、黃熱、日本腦炎、圣路易斯腦炎和 蜱媒性腦炎病毒。其他靶抗原可從丙型肝炎或冠狀病毒科產(chǎn)生，其中包括許多非人病毒，例 如感染性支氣管炎病毒(家禽)、豬傳染性胃腸病毒(豬)、豬凝血性腦脊髓炎病毒(豬)、 貓感染性腹膜炎病毒(貓)、貓腸冠狀病毒(貓)、狗冠狀病毒(狗)和可導(dǎo)致普通感冒和 /或非-甲型、乙型或丙型肝炎的人呼吸冠狀病毒。在冠狀病毒科內(nèi)，靶抗原包括El (也稱 為M或基質(zhì)蛋白)、E2 (也稱為S或突起蛋白)、E3 (也稱為HE或血凝素-依爾替糖)、糖蛋 白(并非所有冠狀病毒中都有)或N(核衣殼)。其它抗原可靶向彈狀病毒科，包括水皰病 毒屬(例如皰疹口炎病毒)和狂犬病病毒屬(例如狂犬病)。在彈狀病毒科內(nèi)，適當(dāng)?shù)目乖稍从贕蛋白或N蛋白。包括出血熱病毒例如馬爾 堡和埃博拉病毒的絲狀病毒科可能是合適的抗原來(lái)源。副黏病毒科包括1型副流感病毒、3 型副流感病毒、3型牛副流感病毒、腮腺炎病毒(流行性腮腺炎病毒)、2型副流感病毒、4型 副流感病毒、新城疫病毒(雞)、牛瘟病毒、麻疹病毒(其包括麻疹和犬瘟熱)，以及肺病毒 (其包括呼吸道合胞病毒)。流感病毒被分在正黏病毒科內(nèi)，并且是抗原(例如HA蛋白、m 蛋白)的合適來(lái)源。布尼亞病毒科包括布尼亞病毒屬(加利福尼亞腦炎，拉克羅斯腦炎)、 白蛉熱病毒屬(裂谷熱)、漢坦病毒屬(普馬拉是hemahagin熱病毒)、內(nèi)羅畢病毒屬(內(nèi) 羅畢綿羊病)和各種未命名的銀環(huán)蛇病毒(bungavirus)。沙粒病毒科提供抗LCM和拉沙 熱病毒的抗原來(lái)源。呼腸孤病毒科包括呼腸孤病毒屬、輪狀病毒屬(其導(dǎo)致兒童急性腸胃 炎)、環(huán)狀病毒屬和科羅拉多蜱熱病毒屬(科羅拉多蜱熱病毒屬、Lebombo病毒屬(人)、馬 變性腦病病毒屬、藍(lán)舌病病毒屬)。逆轉(zhuǎn)錄病毒科包括致腫瘤RNA病毒亞科，該亞科包括人和獸醫(yī)疾病，例如貓白血 病病毒、HTLVI和HTLVII、慢病毒亞科(包括HIV、猿免疫缺陷病毒、貓免疫缺陷病毒、犬感 染性貧血病毒和泡沫病毒亞科)。在慢病毒中，已經(jīng)描述且不難選擇許多合適抗原。合適的 HIV和SIV抗原的實(shí)例包括但不限于gag、pol、Vif、Vpx、VPR、Env、Tat、Nef和Rev蛋白，及 其各種片段。例如，Env蛋白的合適片段可包括其任何亞基，如gpl20、gpl60、gp41或其較 小片段，如，長(zhǎng)度至少約為8個(gè)氨基酸的片段。相似地，可選擇tat蛋白的片段。[參見美 國(guó)專利 5，891，994 和美國(guó)專利 6，193,981。]還參見，在 D. H. Barouch 等，J. Virol. ,75(5) 2462-2467 (2001 年 3 月)禾口 R. R. Amara 等，Science, 292 :69_74 (2001 年 4 月 6 日)中所 描述的HIV和SIV蛋白。在另一個(gè)例子中，可利用HIV和/或SIV免疫原性蛋白質(zhì)或肽形 成融合蛋白或其它免疫原性分子。參見例如，2001年8月2日公開的WO 01/54719和1999 年4月8日公開的WO 99/16884所述的HIV-I Tat和/或Nef融合蛋白和免疫方案。本發(fā) 明不限于本文所述的HIV和/或SIV免疫原性蛋白或肽。此外，已經(jīng)描述過對(duì)這些蛋白的 各種修飾，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難進(jìn)行這些修飾。參見，例如在美國(guó)專利5，972，596中描述
27了修飾的gag蛋白。另外，任何所需的HIV和/或SIV免疫原均可單獨(dú)或聯(lián)合遞送。這類 組合可包括由一種載體或多種載體表達(dá)。任選地，另一種聯(lián)合遞送可包括遞送一種或多種 表達(dá)的免疫原與遞送一種或多種蛋白質(zhì)形式的免疫原。下面更詳細(xì)地討論這種聯(lián)合。乳多空病毒科包括多瘤病毒亞科(BKU和J⑶病毒)和乳頭瘤病毒亞科(與癌癥 或乳頭瘤的惡性進(jìn)展有關(guān))。腺病毒科包括導(dǎo)致呼吸疾病和/或腸炎的病毒(EX、AD7、ARD、 0. B.)。細(xì)小病毒科包括貓細(xì)小病毒(貓腸炎)、貓全白細(xì)胞減少病病毒、狗細(xì)小病毒和豬細(xì) 小病毒科。皰疹病毒科包括α-皰疹病毒亞科，其中包括單純皰疹病毒屬(HSVI，HSVII)、水 痘病毒屬(假性狂犬病、水痘帶狀皰疹)和β-皰疹病毒亞科巨細(xì)胞病毒屬(HCMV，鼠巨細(xì) 胞病毒)和Y-皰疹病毒亞科淋巴隱病毒屬、EBV(伯基特淋巴瘤)、傳染性鼻氣管炎、馬雷 克病病毒和鼻病毒。痘病毒科包括脊椎動(dòng)物痘病毒亞科，包括正痘病毒屬(天花和牛痘病 毒)、副痘病毒屬、禽痘病毒屬、山羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒屬和昆蟲痘病毒亞科。 嗜肝DNA病毒科包括乙肝病毒?？赡苁呛线m抗原來(lái)源的一種未分類病毒是丁型肝炎病毒。 其他的病毒來(lái)源包括鳥感染性粘液囊病病毒和豬呼吸和生殖綜合征病毒。甲型病毒科包括 馬動(dòng)脈炎病毒和各種腦炎病毒。用于免疫人或非人動(dòng)物的抗其他病原體的免疫原包括，例如，感染人和非人脊椎 動(dòng)物的細(xì)菌、真菌、寄生微生物或多細(xì)胞寄生蟲，或來(lái)自癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的病原體。細(xì) 菌病原體的例子包括致病性革蘭陽(yáng)性球菌，包括肺炎雙球菌；葡萄球菌；和鏈球菌。致病 性革蘭陰性球菌包括腦膜炎球菌、淋球菌。致病性腸革蘭氏陰性桿菌包括腸桿菌科；假單 胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和埃肯菌屬；類鼻疽假單孢菌屬；沙門菌屬；志賀菌屬；嗜血桿菌屬 莫拉菌屬；杜克雷嗜血桿菌(H. ducreyi)(其導(dǎo)致軟下疳)；布魯桿菌；野兔熱弗朗西絲 菌(Franisellatularensis)(其導(dǎo)致兔熱病)；耶爾森菌屬(巴斯德菌屬)；念珠狀鏈桿 菌和螺菌屬；革蘭陽(yáng)性桿菌，其包括單核細(xì)胞增多李斯特菌；紅斑丹毒絲菌；白喉棒狀桿菌 (Corynebacterium diphtheria)(白喉)；霍亂；炭疽桿菌(B. anthracis)(炭疽)；多諾萬(wàn) 病(腹股溝肉芽腫)和巴爾通體病。致病性厭氧菌引起的疾病包括破傷風(fēng)；肉毒中毒；其 它梭菌??；結(jié)核??；麻風(fēng)病；和其它分枝桿菌病。致病性螺旋體疾病包括梅毒；密螺旋體病 雅司病、品他病和地方性梅毒；以及鉤端螺旋體病。較高致病性細(xì)菌和致病性真菌導(dǎo)致的 其他感染包括放線菌??；諾卡菌??；隱球菌病、芽生菌病、組織胞漿菌病和球孢子菌??；念 珠菌病、曲霉病和毛霉?。绘咦咏z菌??；副球孢子菌病、石樣真菌病、球擬酵母病、足分枝菌 病和著色真菌病；以及皮真菌病。立克次體感染包括斑疹傷寒熱、落磯山斑疹熱、Q熱和立 克次氏體痘。支原體和衣原體感染的實(shí)例包括支原體肺炎、性病性淋巴肉芽腫、鸚鵡熱和 圍產(chǎn)期衣原體感染。致病性真核細(xì)胞包括致病性原生動(dòng)物和蠕蟲，并且由其產(chǎn)生的感染包 括阿米巴病、瘧疾、利什曼病、錐蟲病、弓形體病、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii), Trichans、鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、巴貝蟲病、賈第蟲病、旋毛蟲病、絲蟲病、血吸蟲 病、線蟲、吸蟲(trematode)或吸蟲(fluke)感染和絳蟲(絳蟲)感染。這些生物體和/或其產(chǎn)生的毒素中有許多已被疾病控制中心[(⑶C)，健康與人 類服務(wù)部(D印artment of Heath and Human Services)，美國(guó)]認(rèn)定為是可用于生物 攻擊的物質(zhì)。例如，某些此類生物物質(zhì)包括目前分類為A類物質(zhì)的炭疽桿菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)及其毒素(肉毒桿菌毒素)、鼠 疫耶爾森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)、大天花(天花)、野兔熱弗朗西絲菌(Franisellatularensis)(兔熱病)和病毒性出血熱[絲狀病毒(例如埃博拉病毒、馬爾堡病毒) 和沙粒病毒[例如拉沙病毒、馬丘博病毒]；目前分類為B類物質(zhì)的伯內(nèi)特科克斯立 克次體(Coxiella burnetti) (Q熱)、布魯桿菌(布魯桿菌病)、鼻疽伯克霍爾德氏菌 (Burkholderia mallei)(鼻疽)、假鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomallei) (類鼻疽)、蓖麻(Ricinus communis)及其毒素(蓖麻蛋白毒素)、產(chǎn)氣莢膜梭菌 (Clostridium perfringen)及其毒素(ε 毒素)、葡萄球菌(Staphylococcus)及其毒素 (腸毒素B)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)(鸚鵡熱)、水安全性威脅(如霍亂弧菌 (Vibrio cholerae)、細(xì)小隱孢子菌(Cryptosporidiumparvum))、斑疹傷寒(普氏立克氏體 (Richettsia powazekii))和病毒性腦炎(如α -病毒如委內(nèi)端拉馬腦炎、東方馬腦炎、西 方馬腦炎；所有這些目前分類為B類病原；和日本病毒與漢坦病毒，其目前分類為C類病 毒。此外，其他如此分類或不同分類的生物體也可能在將來(lái)可被鑒定和/或用于這種目的。 容易理解的是，本文所述的病毒載體和其他構(gòu)建體可用于傳遞來(lái)自這些生物體的抗原、病 毒、其毒素或其他副產(chǎn)物，這可預(yù)防和/或治療這些生物物質(zhì)引起的感染或其他不良反應(yīng)。預(yù)計(jì)施用SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38載體來(lái)遞送抗T細(xì)胞可變區(qū) 的免疫原能引發(fā)包括CTL在內(nèi)的免疫應(yīng)答來(lái)消除T細(xì)胞。在RA中，已鑒定了參與該疾病的 數(shù)種特定TCR可變區(qū)。這些110 包括￥-3、￥-14、￥-17和￥(1-17。因此，遞送編碼這些多肽 中至少一種的核酸序列將引發(fā)以參與RA的T細(xì)胞為目標(biāo)的免疫應(yīng)答。在MS中，已鑒定了 參與該疾病的數(shù)種特定TCR可變區(qū)。這些TCR包括V-7和Va-10。因此，遞送編碼這些多 肽中至少一種的核酸序列將引發(fā)以參與MS的T細(xì)胞為靶點(diǎn)的免疫應(yīng)答。在硬皮病中，已鑒 定了參與該疾病的數(shù)種特定TCR可變區(qū)。這些TCR包括V-6、V-8、V_14和V α -16,V α -3C、 Va -7、V α -14、V α -15、V α -16、V α -28禾口 Va -12。因此，遞送編碼這些多肽中至少一種的 重組猿猴腺病毒將引發(fā)以參與硬皮病的T細(xì)胞為目標(biāo)的免疫應(yīng)答。C. Ad-介導(dǎo)的遞送方法可監(jiān)測(cè)所選基因的治療水平或免疫力水平，以確定對(duì)加強(qiáng)免疫的需求(如果 有的話)。評(píng)估血清中的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，或任選評(píng)估血清中的抗體效價(jià)后，可能需要 任選的加強(qiáng)免疫。任選地，可以單獨(dú)給藥或各種聯(lián)合給藥方案來(lái)遞送重組SAdV-39、 SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38載體，例如，與包括其它活性成分的方案或療程聯(lián)用或在初 免_加強(qiáng)方案中遞送。本領(lǐng)域已經(jīng)描述過各種方案，不難進(jìn)行選擇。例如，初免-加強(qiáng)方案可包括給予DNA(如質(zhì)粒)載體，以使免疫系統(tǒng)對(duì)第二次加 強(qiáng)給予傳統(tǒng)抗原，如蛋白質(zhì)或攜帶編碼這種抗原的序列的重組病毒產(chǎn)生免疫力。參見例 如，納入作參考的2000年3月2日公開的WO 00/11140。或者，免疫方案可包括給予重組 SAdV-39、SAdV-25. 2、-30、-37或-38載體以加強(qiáng)對(duì)攜帶抗原或蛋白質(zhì)載體(病毒或DNA載 體)的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)替換方式中，免疫方案包括給予蛋白質(zhì)后用編碼抗原的載體加 強(qiáng)。一實(shí)施方式中，描述的對(duì)所選抗原的初次和加強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法是通過遞送載有 所述抗原的質(zhì)粒DNA載體，然后用重組SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38載體加強(qiáng)。 一實(shí)施方式中，該初免_加強(qiáng)方案包括表達(dá)初免和/或加強(qiáng)載體攜帶的多種蛋白質(zhì)。見例 如，R. R. Amara, Science, 292 :69_74 (2001/4/6)，其描述了表達(dá)用于對(duì) HIV 和 SIV 產(chǎn)生免疫 應(yīng)答的蛋白亞單位的多蛋白方案。例如，DNA初免時(shí)通過一種轉(zhuǎn)錄物遞送Gag、Pol、Vif、VPX和 Vpr 和 Env、Tat 和 Rev?；蛘撸稍谥亟M SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37 或-38 腺病 毒構(gòu)建物中遞送SIV Gag、Pol和HIV-I Env。其它方案見W099/16884和WO 01/54719。然而，初免-加強(qiáng)方案不限于HIV的免疫或遞送這些抗原。例如，初免可包括遞送 第一 SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38載體，然后用第二 Ad載體或含有蛋白質(zhì)形 式的該抗原的組合物加強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)例中，初免_加強(qiáng)方案可提供針對(duì)產(chǎn)生該抗原的病毒、 細(xì)菌或其它生物體的保護(hù)性免疫應(yīng)答。在另一實(shí)施方式中，初免-加強(qiáng)方案提供可用檢測(cè) 所治療病癥的存在的常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定的療效。初免組合物可以劑量依賴性方式給予身體的不同部位，這取決于所需免疫應(yīng)答靶 向的抗原。本發(fā)明不受注射量或部位，或藥物載體的限制。另外，該方案可包括初免和/或 加強(qiáng)步驟，各步驟可包括每小時(shí)、每天、每周、每月或每年給予的單次給藥或劑量。例如，該 哺乳動(dòng)物可接受載體中含有約10 μ g-50 μ g質(zhì)粒的一個(gè)或兩個(gè)劑量。DNA組合物的所需用 量約為1μ g-ΙΟ,ΟΟΟμ g DNA載體。劑量可以在約1-1000 μ g DNA/kg對(duì)象體重的范圍中變 化。宜根據(jù)哺乳動(dòng)物的種類和條件選擇遞送量或遞送部位。本文描述了適合將該抗原遞送給哺乳動(dòng)物的載體的劑量單位?？赏ㄟ^懸浮或溶解 于藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的運(yùn)載體如等滲鹽水；等滲鹽溶液或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于這 類給藥中的其它制劑中，制備給藥載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解合適的載體，載體的種類主要 取決于給藥途徑?？砂凑丈鲜鐾緩綄⒈疚乃鼋M合物給予哺乳動(dòng)物，例如在采用可生物降 解的生物相容性聚合物的緩釋制劑中遞送，或用膠束、凝膠和脂質(zhì)體原位(on-site)遞送。 任選地，初免步驟也包括給予初免組合物、合適量的佐劑，如本文所述。優(yōu)選地，將初免組合物給予哺乳動(dòng)物對(duì)象約2-27周后，給予加強(qiáng)組合物。用有效 量的含有或能夠遞送與初免DNA疫苗所給抗原相同的抗原的加強(qiáng)組合物給予該加強(qiáng)組合 物。該加強(qiáng)組合物由衍生自同一病毒來(lái)源(如本發(fā)明腺病毒序列)或另一來(lái)源的重組病毒 載體組成?；蛘撸摗凹訌?qiáng)組合物”可以是含有初免DNA疫苗編碼的相同但是蛋白或多肽形 式的抗原的組合物，此組合物可在宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在另一實(shí)施方式中，該加強(qiáng)組合物 含有編碼抗原的DNA序列，例如載體，如熟知的細(xì)菌或病毒載體，所述DNA序列受指導(dǎo)其在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的控制。對(duì)加強(qiáng)組合物的主要要求是該組合物的抗原是 與初免組合物編碼抗原相同的或能交叉反應(yīng)的抗原。在另一實(shí)施方式中，所述SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38載體也適合 用于各種免疫和治療方案。這類方案可包括與不同血清型衣殼的Ad載體同時(shí)或依次遞 送SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38載體的方案，與非Ad載體同時(shí)或依次遞送 SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、_37或-38載體的方案，與蛋白質(zhì)、肽和/或其它有生物活性 的治療或免疫原性化合物同時(shí)或依次遞送SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38載體 的方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解這些應(yīng)用。再在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供這些病毒衣殼(任選是完整或重組病毒顆 ?；蚩找職?的應(yīng)用，即通過遞送腺病毒SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38給對(duì) 象來(lái)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)應(yīng)答，或者增強(qiáng)或輔助另一活性劑的細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答。SAdV-39、 SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38衣殼可單獨(dú)遞送或與活性劑組合遞送以增強(qiáng)其免疫應(yīng)答。 有利地，可實(shí)現(xiàn)所需效應(yīng)同時(shí)使宿主不受血清型E腺病毒的影響。在另一方面，提供了在有此需要的對(duì)象中誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素α的方法，包括遞送SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38衣殼到對(duì)象。再在另一個(gè)方面，提供了在培養(yǎng)物 中產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子(如INF-α)/趨化因子的方法。該方法包括在適合產(chǎn)生包括 干擾素α等在內(nèi)的細(xì)胞因子/趨化因子的條件下培養(yǎng)含有樹突細(xì)胞和本文所述SAdV-39、 SAdV-25. 2、-26、-30、-37 或-38 衣殼的培養(yǎng)物。如此產(chǎn)生的細(xì)胞因子可用于各種應(yīng)用。例如，就IFNa而言，本文所述的產(chǎn)品特別 理想，因?yàn)檎J(rèn)為該產(chǎn)品將優(yōu)于市售重組制造的IFNa，市售IFNa僅含一種或兩種細(xì)菌中產(chǎn) 生的IFNa亞型。相反，估計(jì)該方法能夠制造多種亞型的天然人IFNa，預(yù)計(jì)能得到更廣譜 的作用。據(jù)信，每種亞型具有特定的生物活性。此外，預(yù)計(jì)通過本文提供方法制造的天然干 擾素在免疫方面與患者天然產(chǎn)生的干擾素相同，從而降低通常由于形成針對(duì)重組產(chǎn)生的干 擾素的中和抗體而造成藥物被對(duì)象的免疫系統(tǒng)排斥的風(fēng)險(xiǎn)。以下實(shí)施方式將闡明SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38的克隆和示范性 重組SAdV-39、SAdV-25. 2、-26、-30、-37或-38載體的構(gòu)建。這些實(shí)施方式只是為了說明 而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1-猿猴腺病毒的分離從美國(guó)路易斯安那大學(xué)伊比利亞研究中心(University of Louisiana NewIberia Research Center, 4401W. Admiral Doyle Drive, New Iberia, Louisiana, USA)的黑猩 猩群以及美國(guó)德州大學(xué)安德森癌癥中心(Michael Ε. Keeling Center forComparative Medicine and Research, University of Texas M.D.Anderson CancerCenter, Bastrop, Texas,USA)的黑猩猩群體獲得糞便樣品。將黑猩猩糞便樣品懸浮于漢克斯平衡鹽溶液，取 上清液通過0. 2微米注射濾器無(wú)菌過濾。將100 μ 1過濾的各樣品接種到人細(xì)胞系Α549培 養(yǎng)物上。將這些細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素和50 μ g/ml慶大霉素的Ham F12上。培養(yǎng)大約1-2周后，在含有若干接種物的細(xì)胞培養(yǎng)物中出現(xiàn)明顯的肉眼可見的細(xì)胞 病變效應(yīng)(CPE)。采用已經(jīng)公開的標(biāo)準(zhǔn)的腺病毒純化氯化銫梯度技術(shù)從A549細(xì)胞培養(yǎng)物中 純化腺病毒。由德國(guó)恰根基因組服務(wù)部分(Qiagen Genomic services, Hilden，Germany) 完成純化腺病毒DNA的分離和測(cè)序?；诓《綝NA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析法，被稱為猿猴腺病毒25. 2 (SAdV-25. 2)、猿 猴腺病毒26 (SAdV-26)、猿猴腺病毒30 (SAdV_30)、猿猴腺病毒37 (SAdV_37)、猿猴腺病毒 38 (SAdV-38)和猿猴腺病毒39 (SAdV-39)的腺病毒測(cè)定為與人亞組E處于同一亞組。序列分析顯示，與SAdV-26的六鄰體具有最接近的六鄰體匹配的是黑猩猩腺病毒 6 (98. 4%同一性)，具有最接近的尾絲匹配的是人腺病毒4 (93 %同一性)。序列分析顯示，與SAdV25. 2病毒具有最接近的基因組匹配的是猿猴(黑猩猩) 腺病毒25 [Genbank登錄號(hào)AC000011]。SAdV25之前被稱為C68或Pan9 [美國(guó)專利No 6083716]。在核酸水平上，通過載體NTI-AlignX測(cè)得SAdV25. 2和SAdV25之間的同一性為 94%。在六鄰體(氨基酸)水平上，SAdV-25. 2與具有兩種保守性氨基酸改變和兩種非保 守性改變的猿猴腺病毒25有99%同一性。下表比較了 SAdV25. 2和SAdV25六鄰體序列的 氨基酸改變，以SAdV25. 2六鄰體(SEQ ID NO 140)為參考。兩個(gè)序列的編號(hào)是相同的。氨基酸殘基SEP ID NO 140
改變 SAdV-25.2 0^&SAdV25)
181 404 477 497 838
Glu(Lys)(非保守) Lys (Arg)
Ala (Thr)(非保守) Ala (Ser)
(Ala) Thr (非保守)用來(lái)產(chǎn)生載體的方法是先產(chǎn)生完整的El-缺失腺病毒載體的細(xì)菌質(zhì)粒分子克隆， 然后將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入El補(bǔ)充細(xì)胞系HEK293以拯救病毒載體。為產(chǎn)生El-缺失腺病毒載體的分子克隆，首先產(chǎn)生已在其中插入罕見切割限制酶 I-CeuI和PI-SceI的識(shí)別位點(diǎn)以代替El缺失的El-缺失腺病毒的質(zhì)粒分子克隆。表達(dá)盒 的兩側(cè)為I-CeuI和Pl-Scel，用這些限制性酶切割，并將表達(dá)盒連接入El-缺失腺病毒質(zhì)粒 克隆。將包含所需表達(dá)盒以代替El缺失的質(zhì)粒腺病毒分子克隆轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞以拯救 重組腺病毒載體。發(fā)現(xiàn)先用限制性酶消化從質(zhì)粒釋放線形腺病毒基因組將有助于轉(zhuǎn)染后的 拯救。實(shí)施例2-用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建基于SAdV-39、SAdV-25. 2、SAdV-26、 SAdV-30、SAdV-37或SAdV_38的El-缺失的質(zhì)粒分子克隆 A. SAdV-39的載體構(gòu)建按照描述制備采用SAdV-39 (亞組E)的El缺失載體。1.構(gòu)建 pSR3:如下所述將側(cè)接SwaI位點(diǎn)的含有SmaI、HindII、EcoRV位點(diǎn)的接頭克隆入用EcoRI 和NdeI切割的pBR322。將寡聚體SEQ ID NO 196 :SV25 頂部AATTATTTAAATCCCGGGTATCAA-GCTTGATAGATATCATTTAAAT 禾口SEQ ID NO 197 :SV25 底部TAATTTAAATGATATCTATCAAGCTTGATACCCGGGATTTAAAT 一起退火形成接頭。2. SAdV-39病毒左端到HindIII位點(diǎn)(7152)的克隆用HindIII消化病毒DNA并將7152bp的左端片段克隆入用SmaI和HindIII消化 的 pSR3 以產(chǎn)生 pSR3 C39LE。3. El功能缺失以及I-CeuI和PI-SceI位點(diǎn)的插入將質(zhì)粒pC39LE的SnaBI和NdeI (Klenow填入)之間切除以刪除Ela和大部分Elb 編碼區(qū)；在其位置連接入一 DNA片段(從帶有I-CeuI和PI-SceI位點(diǎn)的pBleuSK I-PI獲 得的EcoRV片段)以產(chǎn)生pC39LEIP。4.從NheI位點(diǎn)到SAdV-39病毒右端(35779)的克隆用NheI消化SAdV_39病毒DNA并將775bp的右端片段克隆入pC39LEIP的EcoRV 和NheI之間以產(chǎn)生pC39LE IP RE。5. SAdV-39 病毒 NheI 片段(3033-35779)的克隆用HindIII消化質(zhì)粒pC37_LE_IP-RE并連接入32746bp的病毒NheI片段。具有 正確取向的克隆稱為PC39IP。B.采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建基于SAdV-25. 2的El-缺失質(zhì)粒分子克隆
按照描述制備采用SAdV-25. 2 (亞組E)的El缺失載體。1.構(gòu)建 pSR6:如下所述將側(cè)接PacI位點(diǎn)的含有SmaI、AscI、AvrII、EcoRV位點(diǎn)的接頭克隆入用 EcoRI 和 NdeI 切割的 pBR322。將寡聚體SEQ ID NO 198 :pSR6 頂部AATTTTAATTAACCCGGGTATCGGC-GCGCCTTAACCTAGGGATAGATATCTTAATTAA 禾口SEQ ID NO 199 :pSR6 底部TATTAATTAAGATATCTATCCCTAGGTTAAGGCGCGCCGATACCCGGGTTAA-TTAA 一起退火形成 接頭。2.病毒左端到AscI位點(diǎn)(7959)的克隆用AscI消化病毒DNA并將7959bp的左端片段克隆入用SmaI和AscI消化的pSR6 以產(chǎn)生 PSR5C25. 2LE。3. El功能缺失以及I-CeuI和ΡΙ-SceI位點(diǎn)的插入用SnaBI+Ndel 消化質(zhì)粒 pSR5 C25. 2LE ；用 Klenowi真入 NdeI 位點(diǎn)。連接入pBleuSK I-PI 的 EcoRV 片段以產(chǎn)生 PSR5C25. 2LE IP。4.從XbaI位點(diǎn)克隆病毒右端(30071)用Xbal+EcoRV 消化質(zhì)粒 pSR5 C25. 2LE IP。連接入 SAdV-25. 2DNA 的 6559bp 的右 端(XbaI消化)片段以產(chǎn)生pAdC12-LE-IP-RE。5.病毒中部XbaI片段(6037-30071)的克隆用XbaI 消化質(zhì)粒 pAdC12-LE-IP-RE。連接入 SAdV-25. 2DNA 的 24034bp 的片段以 產(chǎn)生 pAdC25. 2IP。C.采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建基于SAdV-26的El-缺失質(zhì)粒分子克隆按照描述制備采用SAdV-26 (亞組E)的El缺失載體。1.構(gòu)建 pSR5:將側(cè)接SwaI位點(diǎn)的含有SmaI、ClaI、XbaI、SpeI、EcoRV位點(diǎn)的接頭克隆入用EcoRI 和NdeI切割的pBR322。將合成的寡核苷酸SV39T，SEQID NO 194AATTATTTAAATCCCGGGGATCATCGATGATCTC TAGAGATCACTAGTCTAGGATATCATTTAAA 和 SV39B，SEQ ID NO 195TATTTAAATGATATCCTAGACTAG T-GATCTCTAGAGATCATCGATGATCCCCGGGATTTAAAT 退火產(chǎn)生接頭。2.病毒左端到XbaI位點(diǎn)(6029)的克隆用XbaI消化病毒DNA并將6kb片段(左端和右端)凝膠純化并連接入用SmaI和 XbaI消化的pSR5。3. El功能缺失以及I-CeuI和ΡΙ-SceI位點(diǎn)的插入用SnaBI+Ndel 消化質(zhì)粒 pSR5_C12_LE ；用 Klenow 填入 NdeI 位點(diǎn)。連接入 pBleuSK I-PI 的 EcoRV 片段以產(chǎn)生 pAdC12-LE-IP。4.從XbaI位點(diǎn)克隆病毒右端(30158)用Xbal+EcoRV 消化質(zhì)粒 pAdC12-LE_IP。連接入 SAdV_26DNA 的 6471bp 的右端 (XbaI 消化)片段以產(chǎn)生 pAdC12-LE-IP-RE。5.病毒中部XbaI片段(6029-30158)的克隆
用Xbal+EcoRV 消化質(zhì)粒 pAdC12-LE_IP-RE。連接入 SAdV_26DNA 的 24129bp 的片 段以產(chǎn)生PC26IP。D. SAdV-30的載體構(gòu)建按照描述制備采用SAdV-30 (亞組E)的El缺失載體。1.構(gòu)建 pSR3 如下所述將側(cè)接SwaI位點(diǎn)的含有SmaI、HindII、EcoRV位點(diǎn)的接頭克隆入用EcoRI 和NdeI切割的pBR322。將寡聚體SEQ ID NO 196 :SV25 頂部 AATTATTTAAATCCCGGGTATCAAGCTTGATAGATATCATTTAAAT 禾口SEQ ID NO 197 :SV25 底部TAATTTAAATGATATCTATCAAGCTTGATACCCGG-GATTTAAAT 一起退火形成接頭。2.病毒左端到HindIII位點(diǎn)(7146)的克隆用HindIII消化病毒DNA并將7146bp的左端片段克隆入用SmaI和HindIII消化 的 pSR3 以產(chǎn)生 pSR3C30LE。3. El功能缺失以及I-CeuI和ΡΙ-SceI位點(diǎn)的插入用SnaBI+Ndel 消化質(zhì)粒 pSR3C30LE ；用 Klenow 填入 NdeI 位點(diǎn)。連接入 pBleuSK I-PI的EcoRV片段以產(chǎn)生pC30LE IP。用EcoRI消化pC30LE IP以破壞內(nèi)部EcoRI位點(diǎn) (從左ITR開始1040bp的位置上)，用Klenow聚合酶填入突出端并重連接。如此產(chǎn)生了質(zhì) 粒 PC3OLE IP (EcoRI 缺失)。4.從HindIII位點(diǎn)克隆病毒右端(33048)用Hindlll+EcoRV 消化質(zhì)粒 pC30 LE IP(EcoRI 缺失)。連接入 SAdV_30DNA 的 3574bp的右端(HindIII消化)片段以產(chǎn)生pC30-LE_IP-RE。5.病毒中部XbaI (6035)到EcoRI (33631)片段的克隆用Xbal+Hindlll 消化質(zhì)粒 pC30_LE-IP_RE。連接入 SAdV_30DNA 的 27596bp 的片 段以產(chǎn)生PC30IP。E. SAdV-37的載體構(gòu)建按照描述制備采用SAdV-37 (亞組E)的El缺失載體。1.構(gòu)建 pSR3 如下所述將側(cè)接SwaI位點(diǎn)的含有SmaLHindII、EcoRV位點(diǎn)的接頭克隆入用EcoRI 和 NdeI 切割的 pBR322。將寡聚物SEQ ID NO 196 :SV25 頂部AATTATTTAAATCCCGGGTATCA AGCTTGATAGAT-ATCATTTAAAT 和 SEQID NO 197 :SV25 底部TAATTTAAATGATATCTATCAAGCTTGATACCCGGGATTTAAAT 一起退火形成接頭。2. SAdV-37病毒左端到HindIII位點(diǎn)(7147)的克隆用HindIII消化病毒DNA并將7147bp的左端片段克隆入用SmaI和HindIII消化 的 pSR3 以產(chǎn)生 pSR3C37LE。3. El功能缺失以及I-CeuI和ΡΙ-SceI位點(diǎn)的插入將pSR3 C37LE質(zhì)粒的SnaBI和NdeI (Klenow填入)之間切除以刪除Ela和大部分 Elb編碼區(qū)；在其位置連接入一 DNA片段(從帶有I-CeuI和PI-SceI位點(diǎn)的pBleuSK I-PI 獲得的EcoRV片段)以產(chǎn)生pSR3 C37LEIP。
4.從 HindIII 位點(diǎn)克隆 SAdV-37 病毒右端(33048)用Hindlll+EcoRV 消化質(zhì)粒 pC37LE IP。連接入 SAdV_37DNA 的 3575bp 的右端 (Hindi11 消化)片段以產(chǎn)生 pC37-LE-IP-RE。5. SAdV-37 病毒 HindIII 片段(23522-33060)的克隆用HindIII消化質(zhì)粒pC37-LE-IP-RE并連接入9538bp的病毒HindIII片段。具 有正確取向的克隆稱為pC37del Xba Pac。6. SAdV-37 病毒 XbaI (6036) PacI (30181)的克隆用XbaI 和 PacI 消化質(zhì)粒 pC37del Xba Pac 并連接入 24145bp 的病毒 XbaI-PacI 片段從而產(chǎn)生PC37IP。F.構(gòu)建El-缺失腺病毒載體為插入用I-CeuI和PI-SceI識(shí)別位點(diǎn)代替El缺失的DNA區(qū)段，使用了質(zhì)粒 pBleuSK I-PI0 質(zhì)粒 pBleuSK I-PI 含有插入 pBluescript II SK(+)(斯圖特基因公司 (Stratagene))的EcoRV位點(diǎn)的654bp片段。該654bp片段帶有罕見切割限制酶Ι-Ceul和 PI-SceI的識(shí)別位點(diǎn)。為插入用I-CeuI和PI-SceI識(shí)別位點(diǎn)代替El缺失的DNA區(qū)段，用 EcoRV消化pBleuSK I-PI并將654bp的片段連接入腺病毒基因組El缺失的位置。插入的 DNA的序列顯示在下面，其側(cè)接EcoRV識(shí)別位點(diǎn)。下劃線表示I-CeuI和PI-SceI的識(shí)別序 列。SEQ ID NO 200 GATATCATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAAGCTCAGATC TCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTT GTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATG AAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGGTACGAAACCGCTGA TCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG TGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGG GGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCT ATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCAGATCTGCAGATCTGAATTCATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAAT GAAATGGCATTATGGGTATTATGGGTCTGCATTAATGAATCGGCCAGATATC為構(gòu)建表達(dá)流感病毒核蛋白的El-缺失腺病毒載體，將編碼Hmi甲型流感病毒 NP 的核苷酸序列(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai, GenBank 登錄號(hào) AF389119. 1)密碼 子優(yōu)化并完整合成(CG公司(Celtek Genes)，納什維爾，田納西州)。構(gòu)建由人巨細(xì)胞病 毒早期啟動(dòng)子、合成內(nèi)含子(獲自質(zhì)粒PCI(普洛麥格公司(Promega)，麥迪遜，威斯康星 州)、密碼子優(yōu)化的甲型流感NP編碼序列和牛生長(zhǎng)激素聚酰苷酸化信號(hào)構(gòu)成的表達(dá)盒。在 含有上述表達(dá)盒的質(zhì)粒pShuttle CMV PI FluA NP上分別側(cè)接罕見切割限制酶I-CeuI和 PI-SceI (NEB公司(New England Biolabs))的識(shí)別位點(diǎn)。為產(chǎn)生El-缺失腺病毒載體的分 子克隆，如本實(shí)施例之前部分的描述產(chǎn)生已在其中插入罕見切割限制酶I-CeuI和PI-SceI 的識(shí)別位點(diǎn)以代替El缺失的El-缺失腺病毒的質(zhì)粒分子克隆。然后用I-CeuI和PI-SceI 消化El-缺失腺病毒質(zhì)粒并連接入表達(dá)盒(用相同的酶消化)。將所得腺病毒質(zhì)粒分子克 隆轉(zhuǎn)染入HEK 293細(xì)胞以拯救重組腺病毒載體。發(fā)現(xiàn)先用限制性酶消化從質(zhì)粒釋放線形腺 病毒基因組將有助于轉(zhuǎn)染后的拯救。
實(shí)施例3-交叉中和抗體的評(píng)價(jià)用通過直接免疫熒光監(jiān)測(cè)的感染抑制中和抗體試驗(yàn)評(píng)價(jià)野生型SAdV-39、 SAdV-25. 2、SAdV-26、SAdV-30、SAdV-37和SAdV_38的交叉中和活性，并與人腺病毒5 (亞種 C)和黑猩猩腺病毒7(SAdV-24)以及人混合IgG進(jìn)行比較。人混合IgG是市售的并被批準(zhǔn) 用于免疫削弱患者，它含有能抵抗正常人群會(huì)接觸到的許多抗原的抗體。人混合IgG中猿 猴腺病毒中和抗體的存在與否反映了常規(guī)人群中這些腺病毒的抗體的流行率。如下進(jìn)行試驗(yàn)。將從注射過HAdV-5或SAdV_24的兔子獲得的血清樣品在56°C加 熱滅活35分鐘。將野生型腺病毒(IO8顆/孔)稀釋于無(wú)血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培 養(yǎng)基(DMEM)，并與用DMEM作2倍連續(xù)稀釋的熱滅活血清樣品一起37°C溫育1小時(shí)。隨后 在載玻片含105單層A549細(xì)胞的孔中加入血清-腺病毒混合物。1小時(shí)后在各孔的細(xì)胞中 添加ΙΟΟμΙ 20%胎牛血清(FBS)-DMEM并在5% C02下37°C培育22小時(shí)。然后，用PBS將 細(xì)胞沖洗兩次并用DAPI和抗HAdV-5的山羊FITC標(biāo)記的廣譜交叉反應(yīng)性抗體(Virostat) 染色，隨后用低聚甲醛固定(4%，30分鐘)并用0.2%TritOn透化(4°C，20分鐘)。在顯微 鏡下對(duì)FITC陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)以確定感染水平。NAB效價(jià)反映了與天然血清對(duì)照相比以50% 或更高水平抑制腺病毒感染的最高血清稀釋度。當(dāng)效價(jià)值< 1/20時(shí)，中和抗體濃度低于檢 出限，即低于1/20。種類病毒抗-HAdV-5抗-SAdV-24人混合IgG
CHAdV-51/81，920< 1/201/640
ESAdV-24(C7)< 1/201/655，3601/20
SAdV-25. 2< 1/201/655，3601/40
SAdV-261/201/40，9601/20
ESAdV-30< 1/201/1，2801/20
SAdV-37< 1/201/3201/20
SAdV-39< 1/201/3201/20這些數(shù)據(jù)表明，常規(guī)人群對(duì)這些腺病毒的免疫反應(yīng)性極低。這些數(shù)據(jù)還表明，上表 中不與HAdV-5和SAdV-24交叉反應(yīng)的猿猴腺病毒可用于涉及連續(xù)遞送腺病毒的方法，例如 初免_加強(qiáng)方案或癌癥治療。實(shí)施例4-細(xì)胞因子誘導(dǎo)從人外周血單核的細(xì)胞(PBMC)分離類漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞，在96孔板的培養(yǎng)基內(nèi) 培養(yǎng)并用腺病毒感染。48小時(shí)后將細(xì)胞離心，收集上清并分析干擾素α的存在。更具體地說，從賓西法尼亞大學(xué)(University of Pennsylvania) AIDS研究中心 (CFAR)免疫學(xué)中心獲得PBMC。然后采用MB公司(Miltenyi Biotec)的“人類漿細(xì)胞樣樹 突細(xì)胞分離試劑盒”，按照試劑盒上提供的說明用300，000，000個(gè)這些細(xì)胞來(lái)分離類漿細(xì)胞 樣樹突細(xì)胞(PDC)。使用該試劑盒分離基于除去PBMC中除pDC外的所有其他細(xì)胞類型。最終的細(xì)胞數(shù)通常隨供體而不同，但范圍在400，000-700，000個(gè)細(xì)胞。如此便通 過分析眾多供者產(chǎn)生了數(shù)據(jù)(如下文所討論)。盡管出乎意料，但當(dāng)分析眾多供體的細(xì)胞 時(shí)，基于干擾素或其他其他細(xì)胞因子釋放的亞組分離維持。將細(xì)胞培養(yǎng)在添加了 L-谷氨酰胺、10 %胎牛血清(梅地亞技術(shù)公司 (Mediatech)) UOmM Hepes緩沖液(英杰公司)、抗生素(青霉素、鏈霉素和慶大霉素_來(lái)自梅地亞技術(shù)公司)和人白細(xì)胞介素3(20ng/mL-R&D)的RPMI-1640培養(yǎng)基(梅地亞技術(shù) 公司)中。以10，000的感染復(fù)數(shù)(MOI)(每個(gè)細(xì)胞10，000個(gè)病毒，濃度為106細(xì)胞/ml) 在細(xì)胞中直接加入野生型腺病毒。48小時(shí)后將細(xì)胞離心，測(cè)定上清中干擾素α的存在。用 PBL生物醫(yī)療實(shí)驗(yàn)室(PBLBiomedical Laboratories)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒 采用制造商推薦的試驗(yàn)方法測(cè)量細(xì)胞因子。研究顯示，亞組C腺病毒產(chǎn)生無(wú)法檢出量的IFNα (該試驗(yàn)的檢出限為1250pg/ mL)。相反，亞組E腺病毒的所有檢測(cè)成員產(chǎn)生IFN α，且產(chǎn)生的IFNa通常遠(yuǎn)高于亞組B腺病毒。在腺病毒的篩選中同時(shí)檢測(cè)了許多其他細(xì)胞因子。然而，通常，相比亞組C腺病 毒，亞組E腺病毒產(chǎn)生顯著較高水平的IL-6、RANTES、MIP-I α、TNF-α、IL-8和IP-IO0亞 組B腺病毒在誘導(dǎo)IFN α、IL-6、RANTES和MIPl α方面的性能也優(yōu)于亞組C腺病毒。由于在該研究中沒有觀察到顯著的細(xì)胞裂解，說明細(xì)胞因子是通過細(xì)胞與亞組E 腺病毒接觸而產(chǎn)生的，與感染以及缺少任何顯著量的病毒復(fù)制無(wú)關(guān)。在另一項(xiàng)研究中(未顯示)，如上所述將細(xì)胞與空C7衣殼蛋白(AD亞組Ε)或 UV-滅活的腺病毒C7病毒載體(UV滅活造成交聯(lián)，消除腺病毒基因表達(dá))一起培育。在這 些研究中，與完整C7相比，在空衣殼和滅活病毒載體中都觀察到相同或更高水平的IFNa。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞或產(chǎn)生趨化因子的細(xì)胞，如PBMC、PBL和樹突 細(xì)胞，接觸亞組E腺病毒成員的衣殼會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞因子，尤其是IFN α，或趨化因子，其誘導(dǎo)量 遠(yuǎn)高于其他腺病毒亞組。因此，該亞組成員可用于在培養(yǎng)物中誘導(dǎo)干擾素α以及較少量的 許多其他細(xì)胞因子/趨化因子。對(duì)IFNa而言，這種制造方法特別理想，因?yàn)閾?jù)信它比重組制造的IFN α好。相反， 估計(jì)本文提供的方法能夠制造多種亞型的天然人IFNa，預(yù)計(jì)能產(chǎn)生廣譜作用。據(jù)信，每種 亞型具有特定的生物活性。此外，預(yù)計(jì)通過本文提供方法制造的天然干擾素在免疫方面與 患者天然產(chǎn)生的干擾素相同，從而降低通常由于形成針對(duì)重組產(chǎn)生的干擾素的中和抗體而 造成藥物被對(duì)象的免疫系統(tǒng)排斥的風(fēng)險(xiǎn)。亞組E腺病毒產(chǎn)生的其他細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素(IL)-6、IL_8、IP_10、巨噬細(xì) 胞炎性蛋白-1 α (ΜΙΡ-1 α )、RANTES和腫瘤壞死因子α。從培養(yǎng)物中純化這些細(xì)胞因子/ 趨化因子的方法以及這些細(xì)胞因子/趨化因子的治療或佐劑用途已在文獻(xiàn)中描述過。此 外，市售的柱或試劑盒可用來(lái)純化按照本發(fā)明制備的細(xì)胞因子/趨化因子。采用本發(fā)明制 造的細(xì)胞因子/趨化因子可用于許多適應(yīng)癥。例如，本文所述的細(xì)胞因子包括，干擾素α (IFNa )、腫瘤壞死因子a (TNF a )、 IP-10(干擾素Y誘導(dǎo)蛋白)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)和IL-8。已經(jīng)描述過IFNa可用于治 療流感、肝炎(例如，包括乙肝和丙肝)和許多贅生性疾病，如腎癌(腎細(xì)胞癌)、黑色素 瘤、惡性腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、類癌瘤、淋巴瘤和白血病(如慢性髓細(xì)胞性白血病和毛細(xì)胞 白血病)。按照本文的描述制造的IFNa亞型的混合物可采用已知技術(shù)純化。參見例如WO 2006/085092，其描述了單克隆抗體和柱純化的應(yīng)用。其他技術(shù)已在文獻(xiàn)中描述。按照本文的描述制造的IFNa可采用已知方法純化。參見，例如，美國(guó)專利 4，680，260，美國(guó)專利 4，732，683 和 G. Allen, Biochem J.，207 :397_408 (1982)。已經(jīng)描述 IFNa可用于治療包括例如銀屑病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的自身免疫性疾病。干擾素γ誘導(dǎo)蛋白IP- ο可用作血管發(fā)生的有力抑制劑并且具有很強(qiáng)的胸腺依賴性抗腫瘤效應(yīng)。因此，再在另一方面，提供了在適合產(chǎn)生細(xì)胞因子的條件下培育含樹突細(xì)胞的培 養(yǎng)物和亞組E腺病毒衣殼來(lái)制造IFN α的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，從健康供體(優(yōu)選人)抽取血液并采用已知技術(shù)制備外周血 粒細(xì)胞(PBL)或外周血單核的細(xì)胞(PBMC)。在一個(gè)實(shí)施方式中，按照本發(fā)明所述方法，PBL 被用作產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，PBMC被用作產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞。在另 一個(gè)實(shí)施方式中，采用已知技術(shù)從PBL或PBMC分離類漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞，例如采用市售的 德國(guó)MB公司的“人類漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞分離試劑盒”。將選出的細(xì)胞與合適的培養(yǎng)基和腺 病毒亞組E衣殼蛋白一起懸浮培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定合適的培養(yǎng)基。然而， 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基是RPMI-1640培養(yǎng)基?；蛘撸煞奖愕剡x擇其他培養(yǎng)基。細(xì)胞可培養(yǎng)在合適容器內(nèi)，如微滴定孔、燒瓶或較大容器。一實(shí)施方式中，細(xì)胞濃 度為每毫升培養(yǎng)基約1，000，000細(xì)胞。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定其他合適的細(xì) 胞濃度。有利地，本發(fā)明不要求使用干擾素作為引物。然而，如果需要，培養(yǎng)基中可含有合 適的細(xì)胞因子，IL-3，以刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。一種合適的濃度為約20ng/mL。然而，也可使用其 他濃度。—實(shí)施方案中，在含有細(xì)胞的培養(yǎng)物中引入腺病毒衣殼蛋白?？刹捎帽疚乃鋈?何形式(例如，病毒顆粒，包括空衣殼蛋白，含Ad亞組E衣殼的病毒載體，等等)將腺病毒 衣殼蛋白遞送到培養(yǎng)物。通常將衣殼蛋白懸浮于合適載體，如培養(yǎng)基、鹽水等。以每個(gè)細(xì)胞約100到100，000個(gè)腺病毒亞組E顆粒的量在培養(yǎng)物中加入腺病毒亞 組E衣殼是合適的。然后培育混合物，例如在約28-40°C下培育，在約35-37°C下培育，或在 約37 °C時(shí)培育。通常，大約12-96小時(shí)后，或約48小時(shí)后將細(xì)胞離心并收集上清。在避免細(xì)胞裂 解的條件下進(jìn)行離心是合適的，這樣可減少或消除上清液中存在的細(xì)胞碎片。離心能夠?qū)?細(xì)胞因子與細(xì)胞分離，從而得到粗分離的細(xì)胞因子。可利用排阻柱以及其他已知的柱和方 法從腺病毒和腺病毒衣殼等中進(jìn)一步純化細(xì)胞因子。如此純化的這些細(xì)胞因子可用于制劑中以及用于各種應(yīng)用。如上所述且不限于理論，腺病毒亞組E的免疫增強(qiáng)和/或產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力似 乎是基于細(xì)胞和腺病毒衣殼之間的接觸，而與腺病毒顆粒的感染或復(fù)制能力無(wú)關(guān)。因此，一 實(shí)施方式中，空腺病毒亞組E顆粒(即其中未包裝表達(dá)任何腺病毒或轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的DNA的 腺病毒衣殼)被遞送到細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用了非感染性野生型亞組E顆粒或 包裝入腺病毒亞組E衣殼的重組腺病毒載體(顆粒)。將這些病毒顆粒滅活的合適技術(shù)是 本領(lǐng)域已知的，其中包括但不限于，例如，UV照射(能有效交聯(lián)基因組DNA從而阻止表達(dá))。上面引用的所有文獻(xiàn)通過參考結(jié)合于本文。許多修飾和變化包含在上面定義的說 明書范圍內(nèi)，并且估計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。對(duì)組合物和方法的這種修飾和改變， 如對(duì)不同小基因或載體劑量或免疫調(diào)節(jié)物的選擇被認(rèn)為在附加權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
38
權(quán)利要求
一種腺病毒，其具有包含選自下組的衣殼蛋白的衣殼(a)SAdV-39的六鄰體蛋白，SEQ ID NO11的氨基酸1-940；SAdV-30的六鄰體蛋白，SEQ ID NO108的氨基酸1-938；SAdV-25.2的六鄰體蛋白，SEQID NO140的氨基酸1-933；SAdV-37的六鄰體蛋白，SEQ ID NO43的氨基酸1-942；SAdV-38的六鄰體蛋白，SEQ ID NO75的氨基酸1-930；SAdV-26的六鄰體蛋白，SEQ ID NO172的氨基酸1-937；(b)SAdV-39的五鄰體蛋白，SEQ ID NO6的氨基酸1-532；SAdV-30的五鄰體蛋白，SEQ ID NO103的氨基酸1-533；SAdV-25.2的五鄰體蛋白，SEQID NO135的氨基酸1-531；SAdV-37的五鄰體蛋白，SEQ ID NO38的氨基酸1-542；SAdV-38的五鄰體蛋白，SEQ ID NO70的氨基酸1-539；SAdV-26的五鄰體蛋白，SEQ ID NO167的氨基酸1-546；和(c)SAdV-39的尾絲蛋白，SEQ ID NO22的氨基酸1-489；SAdV-30的尾絲蛋白，SEQ ID NO118的氨基酸1-445；SAdV-25.2的尾絲蛋白，SEQ ID NO151的氨基酸1-443；SAdV-37的尾絲蛋白，SEQ ID NO54的氨基酸1-445；SAdV-38的尾絲蛋白，SEQ ID NO85的氨基酸1-425；SAdV-26的尾絲蛋白，SEQ ID NO183的氨基酸1-425；和所述衣殼將攜帶操作性連接于指導(dǎo)其在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或表達(dá)的表達(dá)控制序列的異源分子衣殼化。
2.如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其特征在于，還包含復(fù)制和衣殼化必需的5’和3’腺病 毒順式元件。
3.如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒缺乏所有或部分El基因。
4.如權(quán)利要求3所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒是復(fù)制缺陷型的。
5.如權(quán)利要求5所述的腺病毒，其特征在于，所述病毒具有雜交衣殼。
6.如權(quán)利要求5所述的腺病毒，其特征在于，所述載體包含選自SAdV-39、SAdV-30、 SAdV-25. 2、SAdV-37、SAdV-38 或 SAdV-26 中多于一種的衣殼蛋白。
7.—種重組腺病毒，其具有含六鄰體的衣殼和SAdV的異源核酸序列，所述六鄰體含 有猿猴腺病毒六鄰體蛋白片段，其中所述SAdV六鄰體蛋白片段是具有長(zhǎng)約50個(gè)氨基酸的 N-末端或C-末端截短的SEQ ID NO: 11，108，140，43，75或172所示的SAdV六鄰體蛋白， 或選自下組SEQ ID NO :11、108、140、43、75 或 172 的氨基酸殘基 125-443 ；SEQ ID NO :11、108、140、43、75 或 172 的氨基酸殘基 138-441 ；SEQ ID NO :11、108、140、43、75 或 172 的氨基酸殘基 138-163 ；SEQ ID NO :11、108、140、43、75 或 172 的氨基酸殘基 170-176 ；和SEQ ID NO :11、108、140、43、75 或 172 的氨基酸殘基 404-430。
8.如權(quán)利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述衣殼還包含SAdV-39、SAdV-30、 SAdV-25. 2、SAdV-37、SAdV-38 或 SAdV-26 尾絲蛋白。
9.如權(quán)利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述衣殼還包含SAdV-39、SAdV-30、 SAdV-25. 2、SAdV-37、SAdV-38 或 SAdV-26 五鄰體蛋白。
10.如權(quán)利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述腺病毒是包含復(fù)制和衣殼化必 需的5’和3’腺病毒順式元件的假型腺病毒，所述順式元件包含腺病毒5’末端反向重復(fù)和 腺病毒3’末端反向重復(fù)。
11.如權(quán)利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述腺病毒包含編碼產(chǎn)物的核酸序列，所述核酸序列操作性連接于指導(dǎo)所述產(chǎn)物在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的序列。
12.如權(quán)利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述重組腺病毒包含一個(gè)或多個(gè)腺病毒基因。
13.如權(quán)利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述重組腺病毒是復(fù)制缺陷型的。
14.如權(quán)利要求13所述的重組腺病毒，其特征在于，所述重組腺病毒的腺病毒El缺失。
15.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的病毒和藥學(xué)上可接受的載體。
16.一種靶向具有腺病毒受體的細(xì)胞的方法，所述方法包括給對(duì)象遞送如權(quán)利要求 1-14中任一項(xiàng)所述的病毒。
17.一種選自下組的分離的猿猴腺病毒核酸SEQ ID NO 1的猿猴腺病毒39核酸1-36553及其互補(bǔ)序列； SEQ ID NO 130的猿猴腺病毒25. 2核酸1-36629及其互補(bǔ)序列； SEQ ID NO 162的猿猴腺病毒26核酸1-36628及其互補(bǔ)序列； SEQ ID NO 98的猿猴腺病毒30核酸1-36621及其互補(bǔ)序列； SEQ ID NO 33的猿猴腺病毒37核酸1-36634及其互補(bǔ)序列； SEQ ID NO 65的猿猴腺病毒38核酸1-36494及其互補(bǔ)序列。
18.—種載體，其包含選自下組中一個(gè)或多個(gè)的猿猴腺病毒核酸序列猿猴腺病毒 39，SEQ ID NO 1 ； SAdV-25. 2, SEQ ID NO 130 ；猿猴腺病毒 26，SEQ ID NO: 162，猿猴腺病毒30，SEQ ID NO 98 ；猿猴腺病毒37，SEQID NO 33 ；猿猴腺病毒38，SEQ ID NO 65 的(a)5，末端反向重復(fù)(ITR)序列；(b)腺病毒Ela區(qū)；(c)腺病毒Elb區(qū)，或其選自下組的片段小T、大Τ、IX和IVa2區(qū)的開放讀框；(d)E2b區(qū)，包括pTP、聚合酶和IVa區(qū)的開放讀框；(e)Ll區(qū)，或其選自下組的片段52/55kD蛋白和IIIa蛋白的開放讀框；(f)L2區(qū)，或其選自下組的片段五鄰體、VII、VI和X蛋白的開放讀框；(g)L3區(qū)，或其選自下組的片段VI、六鄰體或內(nèi)切蛋白酶的開放讀框；(h)E2a蛋白，包括DNA結(jié)合蛋白(DBP)的開放讀框；(i)L4區(qū)，或其選自下組的片段100kD蛋白、33kD同源物、22kD同源物和VIII的開放 讀框；(j)E3 區(qū)，或其選自下組的片段12· 5K、CRl-α、gpl9K、CRl-β、CRl-γ、CRl-δ、 RID- α、RID- β和14. 7Κ的開放讀框；(k)L5區(qū)，或其選自下組的片段尾絲蛋白的開放讀框；(1)E4 區(qū)，或其選自下組的片段:E4 0RF6/7、E4 0RF6、E4 0RF4、E4 0RF3、E4 0RF2 禾口 E4 ORFl的開放讀框；和 (m)3’ ITR0
19.一種由權(quán)利要求18所述核酸序列編碼的猿猴腺病毒蛋白。
20.一種組合物，其包含選自下組的一種或多種猿猴腺病毒蛋白 Ela，選自 SEQ ID NO :30、127、159、62、95 和 191 所示氨基酸序列;Elb，小 T/19K，選自 SEQ ID NO :24、120、153、56、89 或 185 所示氨基酸序列；Elb，大 T/55K，選自 SEQ ID NO :2、99、131、34、66 或 163 所示氨基酸序列; IX，選自SEQ ID NO :3、100、132、35、67或164所示氨基酸序列; 52/55D，選自 SEQ ID NO :4、101、133、36、68 或 165 所示氨基酸序列; Illa，選自 SEQ ID NO :5、102、134、37、69 或 166 所示氨基酸序列; 五鄰體，選自SEQ ID NO :6、103、135、38、70或167所示氨基酸序列； VII，選自 SEQ ID NO :7、104、136、39、71 或 168 所示氨基酸序列; V，選自SEQ ID NO :8、105、137、40、72或169所示氨基酸序列; pX，選自SEQ ID NO :9、106、138、41、73或170所示氨基酸序列; VI，選自 SEQ ID NO :10、107、139、42、74 或 171 所示氨基酸序列; 六鄰體，選自SEQ ID N0:ll、108、140、43、75或172所示氨基酸序列; 內(nèi)切蛋白酶，選自SEQ ID N0:12、109、141、44、76或173所示氨基酸序列; IOOkD,選自 SEQ ID NO :13、110、142、45、77 或 174 所示氨基酸序列; 33kD，選自 SEQ ID NO :32、129、161、64、97、97 或 193 所示氨基酸序列； 22kD，選自 SEQ ID NO :26、122、155、58、91 或 187 所示氨基酸序列； VIII，選自 SEQ ID NO :14、111、143、46、78 或 175 所示氨基酸序列; E3/12.5K，選自 SEQ ID NO 15、123、144、47、79 或 176 所示氨基酸序列; CRl-α，選自 SEQ ID NO :27、112、156、59、92 或 188 所示氨基酸序列; gpl9K，選自 SEQ ID NO :16、124、145、48、87 或 177 所示氨基酸序列;CRl-β，選自SEQIDNO:17、113、146、49、80 或 178 所示氨基酉堯序列CRl-Y，選自SEQIDNO:18、114、147、50、81 或 179 所示氨基酉堯序列CRl-S，選自SEQIDNO:19、115、148、51、82 或 180 所示氨基酉堯序列RID-α，選自SEQIDNO:20、116、149、52、83 或 181 所示氨基酉堯序列RID-β，選自SEQIDNO:21、117、150、53、93 或 182 所示氨基酉堯序列E3/14.7K，選自 SEQ ID NO :28、125、158、60、84 或 189 所示氨基酸序列；和 尾絲，選自SEQ ID NO :22、118、151、54、85或183所示氨基酸序列。
21. —種靶向具有腺病毒受體的細(xì)胞的方法，所述方法包括給對(duì)象遞送如權(quán)利要求 20所述的組合物，所述組合物包含一種或多種選自六鄰體、五鄰體或尾絲的猿猴腺病毒 SAdV-39、-25. 2、-26、-30、-37 和-38 蛋白。
全文摘要
一種包含猿猴腺病毒SAdV-39、-25.2、-26、-30、-37和-38序列以及受調(diào)節(jié)序列控制的異源基因的重組載體。還公開了表達(dá)猿猴腺病毒SAdV-39、-25.2、-26、-30、-37和-383基因的細(xì)胞系。提供了使用所述載體和細(xì)胞系的方法。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101883858SQ200880118591
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2008年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月28日
發(fā)明者J·M·威爾森, L·H·范登伯格, S·羅伊 申請(qǐng)人:賓夕法尼亞州立大學(xué)托管會(huì)