專利名稱：一種β-葡萄糖苷酶、編碼基因、載體、工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種β-葡萄糖苷酶、編碼基因、載體、工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β -葡萄糖苷酶可以催化水解多種β -葡萄糖苷健，具有底物廣譜性，和多種生物功能(1) β -葡萄糖苷酶用于纖維素的水解纖維素是自然界最豐富的碳資源，從纖維素分解為葡萄糖需要3種酶協(xié)同作用。 β -葡萄糖苷酶可以將纖維二糖水解為葡萄糖，而纖維素酶組分中β -葡萄糖苷酶含量少，活力低，因此成為纖維素酶解的瓶頸。因此篩選或者通過基因工程改造得到高活性的 β-葡萄糖苷酶對纖維素有效降解具有重要意義。(2) β -葡萄糖苷酶用于烷基糖苷和芳香基糖苷的合成烷基糖苷、芐基糖苷和烯基糖苷不僅是糖化學(xué)中重要的中間體，同時也是一類可生物降解的非離子表面活性劑，廣泛應(yīng)用于化妝品、制藥、食品和去污劑行業(yè)。酶法合成烷基糖苷和芳香基糖苷具有很大的潛在市場。其特點是選擇性好，產(chǎn)品純度高，收率高，制備條件溫和。(3) β -葡萄糖苷酶制備高生物活性苷元的應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)，自然界多種具有高生物活性的物質(zhì)，由于大部分以糖苷形式存在而降低了其的活性。利用葡萄糖苷酶水解掉葡萄糖后可以得到高活性的苷元。比如，人參皂甙是人參中的主要有效成分，含量約4%，但并非所有的人參皂甙都有很高的生物活性。如具有強烈抗癌作用的人參皂甙他2，在人參中的質(zhì)量比僅為10-5。而以低活性的人參二醇類皂甙Rg3為底物，β -葡萄糖苷酶可以水解掉一個葡萄糖后得到人參皂甙他2。比如，大豆異黃酮具有的很多重要的生理功能，研究發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮苷元的生理活性遠比其相應(yīng)糖苷的活性高。大豆異黃酮中97% 99%是以大豆異黃酮糖苷形式存在， 苷元形式僅為大豆異黃酮總量的 3%。利用葡萄糖苷酶可以水解大豆異黃酮糖苷為高生物活性的大豆異黃酮苷元。據(jù)報道白藜蘆醇具有抑制腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗過敏和具有冠心病、 缺血性心臟病的防治作用，白藜蘆醇已被列為抗心血管、抗癌最有前途的藥物之一。干燥虎杖根莖中白藜蘆醇含量僅為0. _0.2%，而虎杖苷含量約為2%左右。酶法水解虎杖苷制備白藜蘆醇具有反應(yīng)溫和、環(huán)境友好、工藝簡單等優(yōu)點，是值得深入研究的制備方法。本發(fā)明的β-葡萄糖苷酶序列經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同肽蛋白序列，而本發(fā)明的葡萄糖苷酶編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種葡萄糖苷酶、編碼基因、載體、工程菌及其應(yīng)用，該 β-葡萄糖苷酶能夠水解虎杖苷制備白藜蘆醇。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種β-葡萄糖苷酶基因(Yl)，所述基因具有與SEQ ID Ν0:2所示的多核苷酸序列70-100%的同源性，具體優(yōu)選所述基因具有SEQ ID NO :2所示的多核苷酸序列。atgaaaatcttaagtacgaatattctcattgttagtctggtccttttggttggatgtagt60
cagccggaatcttcacagcaagcctccaatcctaaaatggatgcctttattaatgacttg120
atgctgaagatgacgctggaagaaaaaatcggacagctaaaccttcccgttgcgggtggc180
cctgccaccggcattgccgtaaataaaggtcttgaagataaaatacgggcagggcaagta240
ggtggaatctttggtgtgtgggggcccgataaagttagaaaggtgcaggagattgcagtg300
aatgaatcacgactgaagatccctctgttttttggattggatgtaattcacgggcacaaa360
actatctacccgataccactgggtatggccgccacgtgggacatgtcgttaattgaacgt420
ggtgcccagttggctgcgcaggaagcatcagccgaaggattgaactggaccttctcaccc480
atggtggatatttcccgcgaccctcgctggggtcgtatttcagaaggctctggtgaagat540
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gccggcagagattataacacagtggatatgagtcgtgctacgatgtataatttttttctt720
cctccttataaagctgcgctggatgctggtgcggccagtatcatgagttcatttaatgta780
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gaagaacaaatcgatcaggcatgccgcagaatattggaagC C 3.3.3. 3. C 3.3.attgggattg1080
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cgtgcagatattattgtagcggtgttgggcgaatcgcaaagcatgtcgggtgagtcgtcc1560
agccgtacacagttagatctcccggaaagccaaaaagaactattgaaggcactcgtaaaa1620
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attgccgatgtgttgtttggtaac tacaatccttccggtaaactgcctgcaacgtttccg1800
cgaagcgtgggccaggttccgttgtattacaatcacttgaatacaggccgcccctggaat1860
ggtattgatgacaccaagtttaaatccaactacctggacgaagccaatgtgcccttgtat1920
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caagagttgaaaggcaatgaaacattaacggccacggtaacggtaacgaataccggaaac2040
tacgaaggcg aggaaactgt gcagttatac attcgcgatg tggtgggatc ggtgtctcgc2100
ccgatgaaag agctgaaagg cttttcaaag atcaatctta agcccggaga aagtaagcaa2160
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tgggaaccgg gcgattttga aatcatgatt ggctccaatt cccgcgatgt aaaaatggct2280
tctataaact ggaagaaata a2301
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO :2所示多核苷酸的變體，只要其與該多
核苷酸具有70%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的變位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的肽蛋白的功能。另外，可與SEQ ID NO 2所示多核苷酸序列雜交的多核苷酸(至少具有50%同源性，優(yōu)選至少具有70%同源性)，也在本發(fā)明保護范圍之列，特別是在嚴格條件下可與本發(fā)明所述核苷酸序列雜交的多核苷酸。所述“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2SSC，0. 1% SDS，60°C;或( 雜交時加用變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 小牛血清，0. 1% Ficoll, 420C ；或(3)僅在兩條序列之間的同源性至少在95% 以上，更好是97%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的肽蛋白與SEQ ID NO 1所示的肽蛋白有相同的生物學(xué)功能和活性。編碼本發(fā)明所述葡萄糖苷酶的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離多核苷酸。這些技術(shù)包括但不局限于(1)用探針與基因或cDNA 文庫雜交以檢出同源性的多核苷酸序列和( 表達文庫的活性篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的多核苷酸片段，該表達文庫可以包括環(huán)境宏基因組文庫。本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得⑴從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；⑵化學(xué)合成DNA序列以獲得所述肽蛋白的雙鏈DNA?？捎贸Ｒ?guī)方法從這些cNDA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于) (I)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；⑵標志基因功能的出現(xiàn)或喪失；(3)通過測定生物學(xué)活性， 來檢測基因表達的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。如上所述得到的本發(fā)明所述的β -葡萄糖苷酶基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規(guī)方法雙脫氧鏈終止法測定。這類多核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列測序需反復(fù)進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列， 才能拼接全長的cDNA序列。一種β -葡萄糖苷酶基因編碼的β -葡萄糖苷酶(肽蛋白)，所述β -葡萄糖苷酶具有與SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列95%-100%的同源性，具體優(yōu)選所述的β -葡萄糖苷酶具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。Met Lys lie Leu Ser Thr Asn lie Leu lie Val Ser Leu Val Leu Leu151015Val Gly Cys Ser Gln Pro Glu Ser Ser Gln Gln Ala Ser Asn Pro Lys202530Met Asp Ala Phe lie Asn Asp Leu Met Leu Lys Met Thr Leu Glu Glu0066]3540450067]LyslieGlyGlnLeuAsnLeuProValAlaGlyGlyProAlaThrGly0068]5055600069]IleAlaValAsnLysGlyLeuGluAspLyslieArgAlaGlyGlnVal0070]657075800071]GlyGlyliePheGlyValTrpGlyProAspLysValArgLysValGln0072]8590950073]GlulieAlaValAsnGluSerArgLeuLyslieProLeuPhePheGly0074]1001051100075]LeuAspVallieHisGlyHisLysThrlieTyrProlieProLeuGly0076]1151201250077]MetAlaAlaThrTrpAspMetSerLeulieGluArgGlyAlaGlnLeu0078]1301351400079]AlaAlaGlnGluAlaSerAlaGluGlyLeuAsnTrpThrPheSerPro0080]1451501551600081]MetValAsplieSerArgAspProArgTrpGlyArglieSerGluGly0082]1651701750083]SerGlyGluAspProTyrLeuGlySerLeulieAlaGlnAlaMetVal0084]1801851900085]ArgGlyTyrGlnGlyAsnAspLeuAlaAlaThrAsnThrlieMetAla0086]1952002050087]CysValLysHisPheAlaLeuTyrGlyAlaAlaGluAlaGlyArgAsp0088]2102152200089]TyrAsnThrValAspMetSerArgAlaThrMetTyrAsnPhePheLeu0090]2252302352400091]ProProTyrLysAlaAlaLeuAspAlaGlyAlaAlaSerlieMetSer0092]2452502550093]SerPheAsnValValAspGlylieProAlaSerGlyAsnLysTrpLeu0094]2602652700095]LeuThrAspValLeuArgLysGlnTrpGlyPheLysGlyPheValVal0096]2752802850097]SerAspTyrThrSerlieAsnGluMetlieAsnHisGlyMetGlyAsp0098]2902953000099]LeuLysThrValSer Ser Leu Ala Leu Asn Ala Gly Met Asp Met Asp0100]3053103153200101]MetValGlyGluGlyPheLeuThrThrLeuLysLysSerlieGluGlu0102]3253303350103]LysThrValThrGluGluGlnlieAspGlnAla CysArgArglieLeu0104]3403453500105]GluAlaLysTyrLysLeuGlyLeuPheAspAspProTyrLysTyrlie0106]3553603650107]SerGluGluArgAlaAlaLysGluValPheAsnAsnAspThrArgGln0108]3703753800109]ValAlaArgGlnLeuAlaAlaHisSerPheValLeuLeuLysAsnLys0110]3853903954000111]AspGlnLeuLeuProLeuAsnLysThrLysThrMetAlaPhelieGly0112]4054104150113]ProLeuAlaAsnAsnGlnArgAspMetLeuGlyThrTrpVallieGly0114]4204254300115]GlyGluTrpAspLysSerValSerValLeuGluGlyValLysAsnAla0116]4354404450117]LeuGlyGluLysGlyLysValLeuHisAlaLysGlyAlaAsnlieThr0118]4504554600119]AsnAspProGluMetlieLysArgLeuAsnPhePheGlyGlnProAsn0120]4654704754800121]ValValLeuAspGluArgSerSerGlnAlaMetLeuGlnGluAlaVal0122]4854904950123]AlaThrAlaSerArgAlaAsplielieValAlaValLeuGlyGluSer0124]5005055100125]GlnSerMetSerGlyGluSerSerSerArgThrGlnLeuAspLeuPro0126]5155205250127]GluSerGlnLysGluLeuLeuLysAlaLeuValLysThrGlyLysLys0128]5305355400129]ValValLeuValLeuPheThrGlyArgProLeuThrLeuThrTrpGlu0130]5455505555600131]AspGluAsnValAspAlalieLeuAsnValTrpAlaProGlyHisGlu0132]5655705750133]AlaGlyAsnAlalieAlaAspValLeuPheGlyAsnTyrAsnProSer0134]5805855900135]GlyLysLeuProAlaThrPheProArgSerValGlyGlnValProLeu0136]5956006050137]TyrTyrAsnHisLeuAsnThrGlyArgProTrpAsnGlylieAspAsp0138]6106156200139]ThrLysPheLysSerAsnTyrLeuAspGluAlaAsnValProLeuTyr0140]6256306356400141]ProPheGlyPheGlyLeuSerTyrThrThrPheGlyPheSerAsplie0142]6456506550143]ThrLeuSerLysGlnGluLeuLysGlyAsnGluThrLeuThrAlaThr
660665670Val Thr Val Thr Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Gly Glu Glu Thr val gln675680685Leu Tyr lie Arg Asp Val Val Gly Ser Val Ser Arg Pro Met lys glu690695700Leu Lys Gly Phe Ser Lys lie Asn Leu Lys Pro Gly Glu Ser lys gln705710715Val Ser Phe Glu lie Thr Pro Asn Asp Leu Lys Phe Tyr Asn tyr asp725730Leu Lys Tyr Glu Trp Glu Pro Gly Asp Phe Glu lie Met lie gly ser 740745750Asn Ser Arg Asp Val Lys Met Ala Ser lie Asn Trp Lys Lys755760765本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶序列經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和核苷酸數(shù)據(jù)庫分別進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同肽蛋白序列和核苷酸序列，屬于新型葡萄糖苷酶，命名為 β -葡萄糖苷酶(Yi)。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEO ID NO. 1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在95%以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。本發(fā)明所述肽蛋白的片段、衍生物或類似物是指基本上保持本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶相同的生物學(xué)功能或活性的肽蛋白，可以是下列情形 (I) 一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代， 并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；(II) 一個或多個氨基酸殘基上的某個基團被其它基團取代；(III)成熟肽蛋白與另一種化合物(比如延長肽蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(IV)附加的氨基酸序列融合進成熟的肽蛋白而形成的肽蛋白序列(如用來純化此肽蛋白的序列或蛋白原序列)。所述肽蛋白可以是重組蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是純天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的肽蛋白可以是糖基化的。本發(fā)明的肽蛋白還可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還涉及一種含有所述的β -葡萄糖苷酶基因的重組載體，以及所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。本發(fā)明還涉及所述葡萄糖苷酶基因在制備重組葡萄糖苷酶中的應(yīng)用，具體的所述的應(yīng)用為構(gòu)建含葡萄糖苷酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至宿主體內(nèi)，將獲得的重組基因工程菌進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組葡萄糖苷酶基因。本發(fā)明所述β -葡萄糖苷酶基因可插入到載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明所述β -葡萄糖苷酶基因的重組載體?！拜d體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體還包括但不限于在細菌中表達的基于T7啟動子的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pcDNA3. 1 載體和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定， 任何質(zhì)粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達載體，優(yōu)選PET載體系列以其其它原核表達載體系列。表達載體一個重要特征是通常含有復(fù)制起始點、啟動子、標記基因和翻譯調(diào)控元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含β -葡萄糖苷酶基因和合適的轉(zhuǎn)錄/ 翻譯調(diào)控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA序列、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA的合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的Iac或trp啟動子；噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA表達順式作用因子，通常大約有10到300 個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100 到270個堿基對的SV40增強子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子
等此外，表達載體優(yōu)選包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白， 或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素等。本發(fā)明所述含β -葡萄糖苷酶基因或含有β -葡萄糖苷酶基因的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細胞，以構(gòu)成含有該基因或重組載體的基因工程菌?！八拗骷毎敝冈思毎?， 如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9 ；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞等。用本發(fā)明所述的基因(DNA序列)或含有所述基因(DNA序列)的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，可用本領(lǐng)域技術(shù)熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收 DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的方法為本領(lǐng)域眾所周知， 可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的 β-葡萄糖苷酶。一般來說有以下步驟(1)用本發(fā)明的葡萄糖苷酶基因(或變異體)，或用含有該基因的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主細胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；(3)從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。在步驟O)中，根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細胞生長在適當(dāng)?shù)募毎芏群?，用合適的方法誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在步驟(3)中，重組肽蛋白可包被于細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但不限于常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。本發(fā)明的要點在于提供了 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，在已知該氨基酸序列和核苷酸序列的情況下，該氨基酸序列和核苷酸序列的獲得，以及相關(guān)載體、宿主細胞的獲得，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說均是顯而易見的。本發(fā)明還涉及所述的β-葡萄糖苷酶在水解虎杖苷制備白藜蘆醇中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為在ρΗ為3 7的0. 1 0. 5mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，加入等體積的 0. 5 5mg/ml虎杖苷水溶液，混合均勻，以0. 5 5mg/ml的β -葡萄糖苷酶為催化劑，所述的β -葡萄糖苷酶的終濃度為0. 01 0. lmg/ml，混勻后于25 40°C搖床反應(yīng)10 20小時，取反應(yīng)液3000 6000rpm離心5分鐘，沉淀物即為白藜蘆醇粗制品，后處理精制后制成白藜蘆醇。具體的，所述的應(yīng)用為⑴配制pH = 4的0. 2mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液； (2)取一支試管，加入上述緩沖液20ml，加入lmg/ml虎杖苷溶液20ml，混合均勻，加入Img/ ml的β-葡萄糖苷酶:3ml，混勻后于37°C搖床反應(yīng)12小時，取反應(yīng)液5000rpm離心5分鐘， 沉淀物即為白藜蘆醇粗制品，虎杖苷以及白藜蘆醇粗品分別用液相色譜儀進行分析，液相色譜條件Irregular C18柱4. 6_，5 μ m)；流動相乙腈-水Q5 75)；體積流量1. OmL/min ；柱溫35°C ；檢測波長:306nm ；進樣量:20μ L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一種葡萄糖苷酶、編碼基因、載體、工程菌及其應(yīng)用，該葡萄糖苷酶能夠水解虎杖苷制備白藜蘆醇， 環(huán)境友好，產(chǎn)率高，應(yīng)用前景廣闊。


圖1 β -葡萄糖苷酶降解七葉苷的結(jié)果，1-加樣組，2-空白組；圖2 β -葡萄糖苷酶催化對硝基苯-β -D-葡萄糖苷(ONPG)最適ρΗ的測定；圖3 β -葡萄糖苷酶催化對硝基苯-β -D-葡萄糖苷(ONPG)最適溫度的測定；圖4虎杖苷標準品的液相色譜圖；圖5白藜蘆醇標準品的液相色譜圖；圖6白藜蘆醇粗品的液相色譜圖；圖7ρΗ對β -葡萄糖苷酶水解虎杖苷的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1 β -葡萄糖苷酶Yl基因的七葉苷篩選方法
配制LB固體培養(yǎng)基。LB固體培養(yǎng)基的終濃度組成為胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂粉15g/L、用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7. 0，溶劑為水，在 15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min。冷卻培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基未凝固前加入終濃度為 2. 5%的檸檬酸鐵銨(過濾除菌)和0. 的七葉苷(過濾除菌)，培養(yǎng)基冷卻后，將待篩選的微生物接種于該培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)M小時，微生物菌落周圍有黑色斑點的即為陽性(圖 1)。實施例2 =Yl基因全長的cDNA篩選與克隆構(gòu)建土壤基因組文庫。根據(jù)實施例1方法篩選陽性克隆并構(gòu)建亞文庫，通過基因序列測定(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測定)，得到SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列。根據(jù)SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，通過體外擴增技術(shù)獲得SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的β-葡萄糖苷酶基因，將該基因克隆至pET 28a中間載體(杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康中心保存)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉(zhuǎn)入E. Coil BL21中，得到工程菌E. Coil BL21/pET 28a/Yl。實施例3 :Y1蛋白的表達將實施例2獲得的E. Coil BL21/pET 28a/Yl在含IOOmL 50 μ g/mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中搖床過夜培養(yǎng)。將IOml過夜培養(yǎng)后的菌液倒入IL 50 μ g/mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，直到菌液OD6tltl達到0. 6-0. 8時加入IPTG終濃度為1. Ommol/L，誘導(dǎo) 5h后，離心收集菌體，菌體用25ml磷酸緩沖液pH7. 4使其重懸浮，加入溶菌酶，溶菌酶終濃度為lmg/ml，并反復(fù)凍融使細胞破碎。離心取上清，含Yl蛋白的上清用0. 22 μ m醋酸纖維素濾膜過濾后鎳柱親和層析進行純化獲得Yl純酶。實施例4 =Yl催化對硝基苯- β -葡萄糖苷測定最適催化條件本發(fā)明以對硝基苯-β-葡萄糖苷(ONPG)為底物，Yl催化裂解一分子ONPG得到一份子對硝基苯酚，通過測定對硝基苯酚在450nm波長的UV吸收來測定動力學(xué)曲線以分析測定Yl最適催化條件。分別用ρΗ4· 94,5. 39,5. 91,6. 24,6. 47,6. 81,6. 98,7. 38,7. 5、7· 73,8. 04,8. 34、 8. 69,9. 18磷酸緩沖液(0. 15mol/L)將實施例3取得的Yl純酶配成lmg/ml的酶液，再取各 PH值的磷酸緩沖液3ml和對應(yīng)pH值的酶液1ml，再分別加入:3mlONPG (lmg/ml)，30°C保溫， 測定波長450nm處的動力學(xué)曲線，得出Yl最適pH值約為7. 5 (圖2)。用0. 15mol/L的磷酸緩沖液(pH7. 5)將實施例3取得的Yl酶配成lmg/ml的酶液， 分別取該酶液1ml，并分別加入3ml磷酸緩沖液(pH7. 5)和!MlONPG (lmg/ml)，分別在10、 15、20、25、30、35、45、50°C溫度條件下(10°C _50°C )，測定波長450nm處的動力學(xué)曲線(圖 3)，得出Yl最適溫度約為35°C。實施例6 =Yl催化虎杖苷方法分別用pH4. 0和pH5. 0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(0. 2mol/L)配制成lmg/ml的Yl 酶液，分別將PH4. 0和pH5. 0上述緩沖液20ml與lmg/ml虎杖苷溶液20ml混合均勻，再分別加入上述PH4. 0和pH5. 0的Yl酶液:3ml，混勻后于37°C搖床反應(yīng)12小時，反應(yīng)結(jié)束，取反應(yīng)液5000rpm離心5分鐘，棄去上清液，沉淀為白藜蘆醇粗品?；⒄溶諛藴势?、白藜蘆醇標準品及白藜蘆醇粗品分別用液相色譜儀進行分析(圖4-7)。液相色譜條件=IrregularC18 柱(25(toimX4. 6mm, 5 μ m)；流動相乙腈-水(25 75)；體積流量1. OmL/min ；柱溫 35°C;檢測波長306nm ；進樣量20μ L。結(jié)論該Yl酶能催化虎杖苷為白藜蘆醇，轉(zhuǎn)化率約為 52%。
權(quán)利要求
1.一種β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于所述基因具有與SEQ ID NO :2所示的多核苷酸序列70-100%的同源性。
2.如權(quán)利要求1所述的葡萄糖苷酶基因，其特征在于所述基因具有SEQID NO 2 所示的多核苷酸序列。
3.一種由權(quán)利要求1所述的葡萄糖苷酶基因編碼的葡萄糖苷酶。
4.如權(quán)利要求3所述β-葡萄糖苷酶，其特征在于所述β-葡萄糖苷酶具有與SEQID NO. 1所示氨基酸序列95% -100%的同源性。
5.如權(quán)利要求3所述的葡萄糖苷酶，其特征在于所述的葡萄糖苷酶具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
6.一種含有如權(quán)利要求1所述的葡萄糖苷酶基因的重組載體。
7.一種由權(quán)利要求6所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
8.如權(quán)利要求1所述β-葡萄糖苷酶基因在制備重組β -葡萄糖苷酶中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為構(gòu)建含葡萄糖苷酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至宿主體內(nèi)，將獲得的重組基因工程菌進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組葡萄糖苷酶基因。
10.一種如權(quán)利要求3所述的葡萄糖苷酶在水解虎杖苷制備白藜蘆醇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β-葡萄糖苷酶、編碼基因、載體、工程菌及β-葡萄糖苷酶水解虎杖苷制備白藜蘆醇的應(yīng)用，所述β-葡萄糖苷酶基因具有與SEQ ID NO2所示的多核苷酸序列70-100％的同源性，所述β-葡萄糖苷酶基因編碼的β-葡萄糖苷酶具有與SEQ ID NO.1所示氨基酸序列95％-100％的同源性；本發(fā)明β-葡萄糖苷酶能夠水解虎杖苷制備白藜蘆醇，環(huán)境友好，產(chǎn)率高，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N9/42GK102321647SQ20111026653
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者李海峰, 藍袁洋, 黃黎鋒 申請人:杭州師范大學(xué)