專利名稱：冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢合成代謝甘露醇相關(guān)酶、基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與葡萄糖出發(fā)合成代謝甘露醇的相關(guān)酶、編碼這些酶的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
冬蟲(chóng)夏草(Cordyc印s sinensis (Berk.) Sacc.)又稱冬蟲(chóng)草、蟲(chóng)草，它是寄生在幼蟲(chóng)蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合體。冬蟲(chóng)夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。 冬蟲(chóng)夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在冬蟲(chóng)夏草資源調(diào)查、無(wú)性型確證、活性成分分離分析和作用機(jī)理、開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲(chóng)夏草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽(yáng)，主治腎虛，陽(yáng)痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)，冬蟲(chóng)夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。天然蟲(chóng)草具有嚴(yán)格的寄生性以及特殊的生態(tài)環(huán)境，故其產(chǎn)量很低，價(jià)格高昂。野生冬蟲(chóng)夏草由于受生長(zhǎng)環(huán)境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進(jìn)展不大，野生冬蟲(chóng)夏草代用品研究多集中在液體發(fā)酵上。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草菌絲體、提取物或發(fā)酵液，是解決冬蟲(chóng)夏草藥源的一種有效途徑。冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢已被證明是冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型存在形式，具有與天然冬蟲(chóng)夏草相同的活性成分和藥效，實(shí)驗(yàn)表明，人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢得到的菌絲，經(jīng)毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲(chóng)草化學(xué)組成、 藥理作用基本一致，可代替天然蟲(chóng)草生產(chǎn)蟲(chóng)草制品，以彌補(bǔ)自然資源的短缺。冬蟲(chóng)夏草中大量的甘露醇是一種非特異性免疫增強(qiáng)及調(diào)節(jié)劑，可激活機(jī)體的免疫活性細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞、淋巴因子及單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，從而攻擊癌細(xì)胞，發(fā)揮其抗月中瘤作用° Chatterjee 等(Chatterjee, Srinivasan et al. Cordyceps sinensis structure of cordycepic acid[J]. J Am Pharm Assoc, 1957,46 :114-117.)首次甘露醇從蟲(chóng)草中分離出來(lái)，誤以為其結(jié)構(gòu)是1，3，4，5-四羥基環(huán)己烷酸，被譽(yù)為“蟲(chóng)草酸”。后經(jīng) Sprecher 等(Sprecher, Sprinson. A reinvestigation ofthe“ Cordycepic acid" [J]. J Org Chem,1996,28(9) :490-494.)再次鑒定，確認(rèn)“蟲(chóng)草酸”的真實(shí)結(jié)構(gòu)為D-甘露醇。甘露醇，又名D-甘露糖醇、己六醇、木蜜醇，分子式C6H14O6，是山梨醇的同分異構(gòu)體，二者都為六元醇。甘露醇為無(wú)色針狀或斜方柱狀晶體或白色結(jié)晶狀粉末，無(wú)臭、味甜、有引濕性，甜度為蔗糖的57%-72%，熔點(diǎn)為166°C _170°C，密度為1. 4^kg/L，易溶于水，微溶于乙醇和甘油，幾乎不溶于醚、酮和其他碳?xì)浠衔?，?duì)稀酸、稀堿穩(wěn)定，是多元醇中惟一一種不吸濕的晶體。甘露醇是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品及相關(guān)領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)有許多微生物，如酵母、絲狀真菌、乳酸菌等，可以利用碳水化合物為底物合成甘露醇而不生成山梨醇，從而避免甘露醇與山梨醇分離上的困難。通過(guò)微生物發(fā)酵途徑來(lái)生產(chǎn)甘露醇的研究越來(lái)越多，并且已取得了一定的研究進(jìn)展，但是關(guān)于甘露醇生物合成代謝的研究還很少見(jiàn)，特別是對(duì)冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢中合成代謝甘露醇的研究還集中于發(fā)酵條件的優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)以上存在的不足和需要解決的技術(shù)問(wèn)題，對(duì)“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢合成代謝甘露醇相關(guān)酶及其編碼基因進(jìn)行深入研究，提供了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與葡萄糖出發(fā)合成代謝甘露醇的酶、編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一組來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與葡萄糖出發(fā)合成代謝甘露醇的酶，包括(1)己糖激酶序列為SEQ ID No. 1的manAl蛋白、序列為SEQ ID No. 2的manA2 蛋白、序列為SEQ ID No. 3的manA3蛋白、序列為SEQ ID No. 4的manA4蛋白、序列為SEQ ID No. 5的manA5蛋白和序列為SEQ ID No. 6的manA6蛋白；(2)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶序列為SEQ ID No. 7 ^manBl蛋白、序列為SEQ IDNo. 8的 manB2蛋白和序列為SEQ ID No. 9的manB3蛋白；(3)甘露醇-I-P脫氫酶序列為SEQ ID No. 10的manC蛋白。本發(fā)明還涉及所述的酶在生物催化葡萄糖制備甘露醇中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及編碼上述酶的基因。具體的，所述基因包括(1)己糖激酶基因序列為SEQ ID No. 11的manAl基因、序列為SEQ ID No. 12的 manA2基因、序列為SEQ ID No. 13的manA3基因、序列為SEQ IDNo. 14的manA4基因、序列為SEQ ID No. 15的manA5基因和序列為SEQID No. 16的manA6基因；(2)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因序列為SEQ ID No. 17的manBl基因、序列為SEQ IDNo. 18的manB2基因和序列為SEQ IDNo. 19的manB3基因；(3)甘露醇-I-P脫氫酶基因序列為SEQ IDNo. 20的manC基因。所述的基因可用于構(gòu)建能夠生物催化葡萄糖制備甘露醇的基因工程菌，以擴(kuò)大甘露醇或其衍生物的產(chǎn)量。本發(fā)明還涉及能夠提供上述酶及基因的菌株——中國(guó)被毛孢(Hirsrtella Sinensis) L0106，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)為CCTCC No =M 2011278，保藏日期2011年8月5日。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明從原理上對(duì)葡萄糖合成甘露醇代謝途徑進(jìn)行了詳細(xì)研究，包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來(lái)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過(guò)調(diào)節(jié)甘露醇生物合成基因的表達(dá)，賦予宿主甘露醇的高表達(dá)性。


圖1為糖酵解途徑注釋圖；圖2為果糖-甘露糖代謝途徑注釋圖3為“百令”生產(chǎn)菌中國(guó)被毛孢參與葡萄糖出發(fā)合成甘露醇代謝途徑注釋圖；圖4為甘露醇功能基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖；圖5為克隆載體pGEM-T Easy與表達(dá)載體pET_28b物理圖譜；圖6為重組克隆質(zhì)粒pGEM-T Easy/man gene物理圖譜；圖7為重組菌E. coli JM109/pGEM-T Easy/man gene菌落PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖；圖8為重組表達(dá)質(zhì)粒pET18b/man gene構(gòu)建過(guò)程示意圖；圖9為重組表達(dá)質(zhì)粒pET18b/man gene物理圖譜；圖10為甘露醇功能蛋白SDS-PAGE圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。實(shí)施例1 “百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢的培養(yǎng)菌株來(lái)源先從青海采集天然冬蟲(chóng)夏草，并將其帶回杭州進(jìn)行分離篩選，得到了 L0106菌株，并經(jīng)菌種鑒定該菌株為中國(guó)被毛孢(Hirsrtella Sinensis)，該菌種保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)為CCTCCNo =M 2011278，保藏日期:2011年8月5日。將該菌種接種于斜面，培養(yǎng)基配方(此為固化之前的液體配方，按下述比例配制好之后再制成斜面)為葡萄糖2.0% (W/v，l%表示IOOmL培養(yǎng)基中含有l(wèi)g，下同)、玉米粉 1.0%,土豆汁0. 5%、糊精0. 5%、酵母粉0. 5%、麩皮1. 0%、蠶蛹粉2. 0%、蛋白胨1. 0%、 硫酸鎂0. 05%、磷酸二氫鉀0. 05%、瓊脂粉1. 0%，余量為水，在12 16°C培養(yǎng)25天；然后將菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為葡萄糖1. 0%、糖蜜1. 0%、蠶蛹粉0. 5%、黃豆餅粉1. 0%、酵母膏0. 5%、硫酸鎂0. 01%、磷酸二氫鉀0. 02%，余量為水，置于搖床上，溫度 12 16°C培養(yǎng)25天，培養(yǎng)結(jié)束后在無(wú)菌條件下，進(jìn)行固液分離，并將固體置于無(wú)菌器具，備用。實(shí)施例2 “百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢總RNA的提取用TRIzoI試劑提取總RNA，步驟具體為1)液氮研磨取Ig濕菌體放入研缽中， 反復(fù)加入液氮充分研磨至粉末狀，分裝到預(yù)冷的1.5mL離心管中，加入ImLTRIzol試劑，混勻，冰上靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。2)RNA分離加入0. 2mL氯仿，用力震蕩混勻15s，冰上靜置2 3min, 4°C、12000rpm離心15min,分層，取上層水相，約600 μ L0 3) RNA 沉淀加入500 μ L異丙醇，在冰上靜置10min，4°C、12000rpm離心lOmin，棄上清。4) RNA洗滌加入ImL 75%乙醇，將沉淀懸起，冰上靜置10min，4°C、7500rpm離心15min ；重復(fù)上面洗滌步驟，再洗一遍。5)溶解RNA 將離心管置于冰上敞開(kāi)干燥5 lOmin，加適量DEPC水溶解。實(shí)施例3 “百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢RNA樣品測(cè)序提取樣品總RNA后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段(200_700bp)，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成第一條cDNA鏈，然后合成第二條cDNA鏈，再經(jīng)過(guò)QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加polyA并連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測(cè)序文庫(kù)用Illumina GAIIx進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，即raw data或raw reads0除去原始測(cè)序reads中只含adaptor序列的reads，備以后續(xù)分析。實(shí)施例4 “百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢RNA短讀序列組裝使用短 reads 組SOAPdenovo (Li，Zhu et al. De novo assembly of human genomes with massively parallel short read sequencing[J]. Genome Res,2010,20: 265-272.)做轉(zhuǎn)錄組從頭組裝。SOAPdenovo首先將具有一定長(zhǎng)度overlap的reads連成更長(zhǎng)的不含N的Contig片段。然后我們將reads比對(duì)回Contig,通過(guò)paired-end reads 確定來(lái)自同一轉(zhuǎn)錄本的不同Cont i g以及這些Cont i g之間的距離，SOAPdenovo將這些 Contig連在一起，中間未知序列用N表示，這樣就得到kaffold。進(jìn)一步利用paired-end reads對(duì)kaffold做補(bǔ)洞處理，最后得到含N最少，兩端不能再延長(zhǎng)的Unigene序列。最后，將 Unigene 序列與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù) nr、Swiss-Prot、KEGG 禾Π COG 做 blastx 比對(duì)(evalue < 0.00001)，取比對(duì)結(jié)果最好的蛋白確定Unigene的序列方向。如果不同庫(kù)之間的比對(duì)結(jié)果有矛盾，則按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的優(yōu)先級(jí)確定Unigene的序列方向，跟以上四個(gè)庫(kù)皆對(duì)比不上的 Unigene 我們用軟件 ESI^can(Iseli，Jongeneel et al. ESTScan :a program for detecting,evaluating,and reconstructing potential coding regions in EST sequences[J]. In Proceedings of 9th InternationalConference on Intelligent Systems for Molecular Biology. AAAIPress,Menlo Park, CA, pp. 1999,138-148.)預(yù)測(cè)其編碼區(qū)并確定序列的方向。對(duì)于能確定序列方向的Unigene給出其從5'到3'方向的序列，對(duì)于無(wú)法確定序列方向的Unigene給出組裝軟件得到的序列。實(shí)施例5 “百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢Unigene功能注釋功能注釋信息給出Unigene的蛋白功能注釋、Pattiway注釋、COG功能注釋和 Gene Ontology(GO)功能注釋。首先，通過(guò)blastx將Unigene序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)nr、 Swiss-Prot,KEGG和COG (evalue < 0. 00001)，得到跟給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。根據(jù)KEGG注釋信息能進(jìn)一步得到Unigene 的I^ttiway注釋。將Unigene和COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)Unigene可能的功能并對(duì)其做功能分類統(tǒng)計(jì)。根據(jù)nr注釋信息，使用Blast2G0軟件(Conesa，Gotz et al. Blast2G0 :a universal tool for annotation,visualization and analysis in functional genomics research[J] .Bioinformatics，2005，21(18) :3674-3676.)得到 Unigene 的 GO 注釋信息。得到每個(gè) Unigene 的 GO 注釋后，用 WEGO 軟件(Ye，F(xiàn)ang et al. WEGO :a web tool for plotting GO annotations [J] · Nucleic Acids Research, 2006，34 :293-297.)對(duì)所有 Unigene做GO功能分類統(tǒng)計(jì)，從宏觀上認(rèn)識(shí)該物種的基因功能分布特征。實(shí)施例6 “百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢甘露醇代謝途徑分析圖1、圖2分別是KEGG代謝途徑注釋中的糖酵解途徑(mapOOOlO)和果糖-甘露糖代謝途徑(map00051)，圖1中已注釋的酶是已檢測(cè)到的“百令”生產(chǎn)菌中國(guó)被毛孢糖酵解途徑相關(guān)酶類，從圖中可以看出，我們檢測(cè)到了從葡萄糖出發(fā)合成6-磷酸果糖的2種酶共9個(gè)Unigene ；圖2中已注釋的酶是已檢測(cè)到的“百令”生產(chǎn)菌中國(guó)被毛孢果糖_甘露糖代謝途徑相關(guān)酶類，從圖中可以看出，我們檢測(cè)到了甘露醇-I-P脫氫酶的1個(gè)Unigene。 利用該注釋信息，我們得到了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與葡萄糖出發(fā)合成甘露醇代謝途徑注釋圖(圖3)，并進(jìn)一步得到了參與從葡萄糖出發(fā)生物合成甘露醇的10個(gè)Unigene。通過(guò)NCBI中的ORF Finder軟件在線檢測(cè)，找出了這10個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框(SEQ
ID No.11 20)并得到了相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列(SEQ IDNo. 1 10)。實(shí)施例7 “百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢合成代謝甘露醇相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)運(yùn)用GENE RUNNER引物設(shè)計(jì)軟件根據(jù)預(yù)測(cè)得到的各基因開(kāi)放閱讀框DNA序列設(shè)計(jì)引物，用于克隆“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢合成代謝甘露醇的相關(guān)基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下所列manAl 基因正向引物5，ATGTTGGCCGCCATCAGATCTC 3，反向引物5，TTACTCGAGGGGGAAGCTCCATG 3，manAl 基因長(zhǎng)度為 927bp ；manA2 基因正向引物5，ATGGTGGCAAAGACGGCCC 3，反向引物5，CTACCGGTGCCTGTTCCACC 3，manA2 基因長(zhǎng)度為 1356bp ；manA3 基因正向引物5，ATGTTGCAGCGGATGGGCAAATG 3，反向引物5，TTATTCAATTAGGGAGAGGGTGTCG 3，manA3 基因長(zhǎng)度為 548bp ；manA4 基因正向引物5，ATGACCCTCGTCGAGGAGGTGC 3，反向引物5，TTAACCGCAGGCGGAGAGGCG 3，manA4 基因長(zhǎng)度為 1137bp ；manA5 基因正向引物5，ATGGGCAAGGGCTTTGCCC 3，反向引物5，TCATGATGCGCGACTCGCATC 3，manA5 基因長(zhǎng)度為 1038bp ；manA6 基因正向引物5，ATGTGTGTGTCGTCGGGTTG 3，反向引物5，TCACCCGAGCGGTGCAAG 3，manA6 基因長(zhǎng)度為 378bp ；manBl 基因正向引物5，ATGCTGCTGCAGATAGGCCGG 3，反向引物5，TTACTCTTCCTCGTCGCCT 3，manBl 基因長(zhǎng)度為 452bp ；manB2 基因正向引物5，ATGCTGGCTCCCCTTTCGACTC 3，反向引物5，TTACGTCTCCGGGTCCGAGTTC 3，manB2 基因長(zhǎng)度為 717bp ；manB3 基因
正向引物 5，ATGCTGATCCCGACCGACTTCATC 3，
反向引物 5，TTAGGGGCTGCTCGTGGAGCC 3，manB3 基因長(zhǎng)度為 414bp ；manC 基因正向引物5，ATGTTGACAGCAGCTTTCCTCGTC 3，反向引物5，TTAGGCGTTTTCGCAGGCAATG 3，manC 基因長(zhǎng)度為 407bp ；實(shí)施例8 “百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢合成代謝甘露醇相關(guān)基因的克隆先按照實(shí)施例1提供的方法培養(yǎng)出中國(guó)被毛孢發(fā)酵菌絲體后，再按照實(shí)施例2所提供的方法對(duì)中國(guó)被毛孢進(jìn)行總RNA的提取，得到總RNA后按下述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢合成代謝甘露醇相關(guān)基因的克隆1、cDNA第一鏈的合成采用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(TaKaRa)從 Total RNA中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。一般情況，在真核生物mRNA3’末端都有一個(gè)PolyA結(jié)構(gòu)， A堿基的數(shù)量在十至幾百個(gè)不等，利用這一結(jié)構(gòu)可以利用Oligo(dT)引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板合成cDNA第一鏈，本發(fā)明采用由TaKaRa獨(dú)自開(kāi)發(fā)的dT區(qū)域的序列 (PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 中提供)為引物，如果獲得的mRNA完整性較好，那么通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程可以得到物種中所有酶蛋白編碼基因的cDNA第一鏈。2、功能基因cDNA第二鏈的合成以合成的cDNA第一鏈為模板，利用Pfu DNA聚合酶以及各功能基因的引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件設(shè)置如下Pfu DNA Ploymerase PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系
體系構(gòu)成體積(μι)無(wú)核酸水82.5緩沖液104 xdNTP0.5引物12引物22cDNA第一鏈2Pfu1總體系100Pfu DNA Ploymerase PCR 擴(kuò)增條件
權(quán)利要求
1.冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與葡萄糖出發(fā)合成代謝甘露醇的酶，包括(1)己糖激酶序列為SEQID No. 1的manAl蛋白、序列為SEQ ID No. 2的manA2蛋白、序列為SEQ ID No. 3的manA3蛋白、序列為SEQ ID No. 4的manA4蛋白、序列為SEQ ID No. 5的manA5蛋白和序列為SEQ ID No. 6的manA6蛋白；(2)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶序列為SEQID No. 7的manBl蛋白、序列為SEQ ID No. 8的 manB2蛋白和序列為SEQ ID No. 9的manB3蛋白；(3)甘露醇-I-P脫氫酶序列為SEQID No. 10的manC蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的酶在生物催化葡萄糖制備甘露醇中的應(yīng)用。
3.編碼權(quán)利要求1所述酶的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因包括(1)己糖激酶基因序列為SEQID No. 11的manAl基因、序列為SEQ ID No. 12的manA2 基因、序列為SEQ ID No. 13的manA3基因、序列為SEQ ID No. 14的manA4基因、序列為SEQ ID No. 15的manA5基因和序列為SEQ ID No. 16的manA6基因；(2)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因序列為SEQID No. 17的manBl基因、序列為SEQ ID No. 18 的manB2基因和序列為SEQ ID No. 19的manB3基因；(3)甘露醇-I-P脫氫酶基因序列為SEQIDNo. 20的manC基因。
5.如權(quán)利要求3所述的基因在構(gòu)建能夠生物催化葡萄糖制備甘露醇的基因工程菌中的應(yīng)用。
6.中國(guó)被毛孢(HirsutellaSinensis)L0106，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址 中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)為CCTCC No =M 2011278，保藏日期2011年8月5曰。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢(Hirsutella sinensis)參與葡萄糖出發(fā)合成代謝甘露醇的相關(guān)酶、編碼這些酶的基因及其應(yīng)用。所述相關(guān)酶包括(1)己糖激酶序列為SEQ ID No.1～6的manA1～A6蛋白；(2)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶序列為SEQ ID No.7～9的manB1～B3蛋白；(3)甘露醇-1-P脫氫酶序列為SEQ ID No.10的manC蛋白。本發(fā)明從原理上對(duì)“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢葡萄糖合成甘露醇代謝途徑進(jìn)行了詳細(xì)研究，包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來(lái)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過(guò)調(diào)節(jié)甘露醇生物合成基因的表達(dá)，賦予宿主甘露醇的高表達(dá)性。
文檔編號(hào)C12N9/04GK102373190SQ20111026716
公開(kāi)日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者吳暉, 李邦良, 柳志強(qiáng), 沈寅初, 薛亞平, 袁水金, 許峰, 許靜, 鄭裕國(guó), 陳麗芳 申請(qǐng)人:杭州中美華東制藥有限公司, 浙江工業(yè)大學(xué)