專利名稱：去氫甲睪酮單克隆抗體、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及去氫甲睪酮單克隆抗體，以及去氫甲睪酮 完全抗原的合成、單克隆抗體的制備方法，本發(fā)明還公開了該種單克隆抗體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
去氫甲睪酮(l-Dehydro-17a-methyltestosterone，DMT,CAS :72-63_9)，是一種 人工合成的蛋白同化雄性類固醇激素，在醫(yī)學(xué)上可用于治療再生障礙性貧血、男性發(fā)育遲 緩、男性更年期、骨折及燒傷處理、氮負(fù)平衡等。由于其具有蛋白同化作用，經(jīng)常被非法用于 畜牧生產(chǎn)、提高運(yùn)動(dòng)員成績(jī)及添加到營養(yǎng)補(bǔ)充劑中。目前DMT的檢測(cè)方法多為儀器檢測(cè)方法，如GC-MS、LC_MS等，但樣品前處理過程復(fù) 雜，分析速度慢，儀器昂貴，尤其不適合大量樣品的篩查與檢測(cè)?；诳乖?抗體之間的專一特異性建立的免疫學(xué)檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異 性強(qiáng)、價(jià)格低廉和處理量大等特點(diǎn)，可彌補(bǔ)儀器分析的不足，近年來在國內(nèi)外都有廣泛的研 究和應(yīng)用。DMT的分子質(zhì)量為300. 44，屬于半抗原，必須連接到大分子載體物質(zhì)(如蛋白 質(zhì))上形成完全抗原后才能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。但目前尚未見制備DMT完全抗原 和單克隆抗體并利用其進(jìn)行快速檢測(cè)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于去氫甲睪酮檢測(cè)的單克隆抗體。利用該單克隆抗體具有親和 力高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于建立高靈敏度的DMT快速檢測(cè)方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供DMT完全抗原的合成及其單克隆抗體制備的方法。本發(fā)明的去氫甲睪酮單克隆抗體，是由保藏號(hào)為CGMCC No. 3807的小鼠單克隆抗 體雜交瘤細(xì)胞株UJS-1D6F10B4所分泌。上述小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株UJS-1D6F10B4已于2010年5月11日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3807。該小鼠單克隆 抗體雜交瘤細(xì)胞株UJS-1D6F10B4也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述的DMT完全抗原的合成及單克隆抗體的制備方法基本步驟為(1)肟 化通過DMT與羧甲基羥胺反應(yīng)，引入具有反應(yīng)活性的氨基基團(tuán)，并進(jìn)行檢測(cè)確認(rèn)；(2)完 全抗原制備通過活化酯法，將具有氨基的去氫甲睪酮肟偶聯(lián)到鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)和雞 卵清蛋白(OVA)載體上，并進(jìn)行檢測(cè)確認(rèn)；(3)動(dòng)物免疫將制備的具有免疫活性免疫原 DMT-KLH免疫Balb/C小鼠，并采用間接ELISA檢測(cè)其效價(jià)；⑷細(xì)胞融合采用聚乙二醇 (PEG)法將經(jīng)免疫的Balb/C小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合；(5)雜交 瘤細(xì)胞篩選利用建立起的間接ELISA方法檢測(cè)融合細(xì)胞上清，篩選出陽性的雜交瘤細(xì)胞； (6)雜交瘤細(xì)胞亞克隆采用有限稀釋法將陽性孔的細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，以得到純化的雜交 瘤細(xì)胞株；(7)雜交瘤細(xì)胞株的亞型鑒定采用小鼠單克隆抗體免疫膠體金亞型試劑盒對(duì)單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定。(8)單抗的制備及IC5tl值、交叉反應(yīng)率和親和力的測(cè)定采用 ELISA方法對(duì)得到的單克隆抗體進(jìn)行IC5tl、親和力和特異性進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明去氫甲睪酮單克隆抗體的應(yīng)用，可以應(yīng)用于去氫甲睪酮的快速檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明獲得的DMT單抗雜交瘤細(xì)胞株可穩(wěn)定地分泌特異性單 克隆抗體；(2)獲得的單抗與DMT具有較高的親和力(親和常數(shù)為5. 53 X 109L/mol)和較高 的靈敏度(IC50值為7.57yg/L) ； (3)單抗對(duì)DMT具有顯著的專一性，與類似物丙酸睪酮酯 (TP)、群勃龍(TB)的交叉反應(yīng)率低于1%。因此，本發(fā)明可用于去氫甲睪酮的快速檢測(cè)。


圖1. DMT肟化前后的薄層層析分析；圖2. DMT肟化前后的紅外光譜；圖3. DMT免疫抗原(DMT-KLH)的紫外吸收?qǐng)D譜；圖4. DMT包被抗原(DMT-OVA)的紫外吸收?qǐng)D譜；圖5. DMT單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi) 容或范圍。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本發(fā)明是通過在不同的蛋白載體上偶聯(lián)一定數(shù)目的DMT分子，制備能免疫動(dòng)物的 完全抗原DMT-KLH和用于ELISA的包被抗原DMT-BSA ；再利用完全抗原DMT-KLH免疫Balb/ C小鼠，經(jīng)過細(xì)胞融合并利用間接ELISA篩選，并經(jīng)過亞克隆純化培養(yǎng)，得到了穩(wěn)定分泌DMT 單克隆抗體、高親和力、高特異性的雜交瘤細(xì)胞株。實(shí)施例1制備DMT完全抗原(I)DMT 的B虧化稱取IOOmg DMT溶于4mL吡啶，加入65mg羧甲基羥胺半鹽酸(MSDS)，置于烘箱 40°C反應(yīng)2h ；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除吡啶，殘余物用50ml乙酸乙酯溶解，加適量水洗3 4次； 取上層油樣物，加入適量無水硫酸鈉干燥；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯，乙醚重結(jié)晶，得到 DMT的肟化物，命名為DMT-CMA。(2)完全抗原的合成采用活化酯法A液取上述DMT-CMA7mg、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 3mg、1_乙 基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.Hcl)3. 5mg，加入到500ul 二甲基甲酰胺 (DMF)中，溶解后室溫避光震蕩Ih ;B液稱取載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)和雞卵清蛋白 (OVA)各20mg,分別溶于4. 5ml含30% DMF的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中，4°C預(yù)冷。將A 液預(yù)冷后逐滴緩慢加入到B液中，并不斷震蕩，控制滴入速度使A液在IOmin左右加完，加 完后繼續(xù)震蕩30min，然后4°C繼續(xù)反應(yīng)4h ；反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液裝入透析袋，6小時(shí)換一次 透析液，三天后冷凍干燥保存。(3)動(dòng)物免疫選擇健康的6 8周齡的Ballb/C小鼠進(jìn)行免疫。第一次免疫使用弗氏完全佐劑 乳化，以后采用不完全佐劑乳化。每只小鼠每次的免疫劑量為50 μ g，采用皮下多點(diǎn)注射。四免7天后采血測(cè)效價(jià)，選擇效價(jià)高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。四免15天后加強(qiáng)免疫，不使用 免疫佐劑，劑量仍為50 μ g，腹腔注射。(4)細(xì)胞融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)的準(zhǔn)備復(fù)蘇凍存的SP2/0細(xì)胞，置入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，用含 有15 μ g/mL 8-A的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)15 20h后換液。融合前一周細(xì)胞保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。飼 養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備四免17天后制備飼養(yǎng)細(xì)胞，取一只6 10周齡BALB/c小鼠，眼眶取血，斷頸處死 小鼠，浸泡于75%酒精中消毒5 15min。在無菌條件下，用無菌眼科剪刀剪開皮膚，暴露 腹膜。用無菌眼科剪刀將腹膜間開一小口，用玻璃滴管加入約5mL無血清1640培養(yǎng)液，輕 輕吹吸數(shù)次再將腹腔內(nèi)液體吸出，并重復(fù)一次。IOOOrpm離心lOmin，棄上清，用選擇性培養(yǎng) 液(HAT)懸浮，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至2 X IO5個(gè)/mL。將飼養(yǎng)細(xì)胞移入4塊96孔培養(yǎng) 板中，每孔100 μ L，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待用。免疫小鼠脾臟細(xì)胞的制備四免18天后將加強(qiáng)免疫的小鼠眼球放血并分離血清，斷頸處死后浸泡于75%酒 精中消毒5 15min，在無菌條件下取出脾臟，去除脾臟周圍的脂肪和其它組織，用無血清 1640培養(yǎng)液沖洗后，將脾臟置于平皿上的200目不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器內(nèi)芯研磨擠壓過 篩，用無血清1640培養(yǎng)液沖洗；將脾細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)至50mL離心管，IOOOrpm離心5min，棄去上 清，并重復(fù)一次。用少量不完全培養(yǎng)液懸浮，加入臺(tái)盼蘭染液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞融合將已計(jì)數(shù)的SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞按1 4 10的比例混合于50mL塑料離心管 內(nèi)，用不完全培養(yǎng)液補(bǔ)充至45mL，混勻后1200rpm離心lOmin，棄去上清，輕輕震蕩離心管。 在預(yù)先調(diào)至37°C的水浴中按以下程序進(jìn)行融合在Imin內(nèi)緩慢加入PEG 4000溶液lmL，靜 置Imin ；在2min內(nèi)緩慢加入ImL RPMI 1640不完全培養(yǎng)液并輕輕搖動(dòng)；3min內(nèi)緩慢加入 30mLRPMI 1640不完全培養(yǎng)液。IOOOrpm離心lOmin，棄上清，用35mL HAT選擇性培養(yǎng)基懸 浮，輕輕吹勻，然后按150 μ L/孔加到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，放入37°C、5% CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)；在融合后的第4天和第8天進(jìn)行HAT選擇性培養(yǎng)基換液；從第12天開始培養(yǎng) 液更換為HT培養(yǎng)基。(5)雜交瘤細(xì)胞篩選在雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)到占孔底1/4左右時(shí)吸取上清，使用建立好的間接ELISA進(jìn)行 陽性篩選。間接ELISA的基本參數(shù)為包被抗原濃度1 μ g/mL ；包被條件37°C Ih ；封閉液為 2%617，封閉條件為371311;—抗作用條件為371211;二抗?jié)舛葹? 5000，二抗作用條 件為370C 2h ；顯色時(shí)間15min。(6)雜交瘤細(xì)胞亞克隆亞克隆的前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞(同細(xì)胞融合中的飼養(yǎng)細(xì)胞準(zhǔn)備)。將陽性孔中的 細(xì)胞吹散成懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用HT (培養(yǎng)基添加劑)稀釋到5 40個(gè)細(xì)胞/mL ；將細(xì)胞 懸液分別加入已培養(yǎng)有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板的小孔中，每孔0. ImL,使每孔相應(yīng)分別為 0. 5 4個(gè)細(xì)胞；將細(xì)胞培養(yǎng)板放在5% C02，37°C飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 5天后觀 察各孔中細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并將記錄每孔細(xì)胞中生長(zhǎng)情況(克隆數(shù)量和大小)，換培養(yǎng)液頻率視細(xì)胞生長(zhǎng)的速率而定，一般約3天更換一次。培養(yǎng)7 10天，根據(jù)克隆生長(zhǎng)快慢，分批 抽取培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至孔底的1/4時(shí)，開始測(cè)定培養(yǎng)液中的相應(yīng)特異性 抗體活性，選擇抗體效價(jià)高、呈單個(gè)克隆生長(zhǎng)、形態(tài)良好的細(xì)胞孔，繼續(xù)按上法再進(jìn)行克隆 和擴(kuò)大培養(yǎng)；經(jīng)過三次亞克隆及反復(fù)凍存與復(fù)蘇后，最終獲得一株穩(wěn)定分泌DMT特異性單 克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；將所得細(xì)胞株進(jìn)行凍存。(7)雜交瘤細(xì)胞株的亞型鑒定使用小鼠單抗亞型鑒定試劑盒(Envirologix公司)對(duì)獲得的單克隆抗體雜交瘤 細(xì)胞株培養(yǎng)液上清進(jìn)行免疫球蛋白亞型鑒定，其亞型為IgGl型，輕鏈類型為κ型。(8)單抗的制備及IC5tl值、交叉反應(yīng)率和親和力的測(cè)定單抗的制備取8-10周齡Balb/C小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油0. 5mL ； 10天后每只小鼠腹腔 接種5 X IO5個(gè)雜交瘤細(xì)胞；10天分階段收集腹水，將收集腹水通過辛酸_硫酸銨法純化后， 獲得的單抗置于_20°C保存。IC50值、交叉反應(yīng)率和親和力的測(cè)定采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法測(cè)定單抗對(duì)DMT、丙酸睪酮酯(testosterone propionate, TP)、群勃龍(trenbolone，TB)的IC5tl值包被封閉后，先加入50 μ L不同 濃度(0ng/mL,0. 01ng/mL,0. 05ng/mL,0. 25ng/mL,1. 25ng/mL,6. 25ng/mL,31. 25ng/mL, 156. 25ng/mL, 781. 25ng/mL) DMT、TP或TB標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度2個(gè)平行，再加入50 μ L最佳 稀釋倍數(shù)的一抗。交叉反應(yīng)率=(IC5ciDMiyiC5tl競(jìng)爭(zhēng)物)X 100%。結(jié)果見表1。表1單抗IC5tl和交叉反應(yīng)率 通過運(yùn)用origin軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Iogict 4參數(shù)擬合，制備的單抗最低檢測(cè)限 (IC15值)分別為0. 30 μ g/L，說明所得到的抗體具有較高的檢測(cè)靈敏度，可用于DMT的免疫 分析。抗體的親和力為親和力的測(cè)定DMT單抗的親和常數(shù)=抗體相對(duì)分子質(zhì)量/(抗體蛋白濃度X效 價(jià))。單抗蛋白濃度的測(cè)定按公式進(jìn)行計(jì)算蛋白質(zhì)濃度(mg/mL) = 1. 45A280-0. 74A260 ；效 價(jià)的測(cè)定采用間接ELISA法。最終測(cè)得的單抗蛋白濃度為0.868mg/mL，其抗體效價(jià)為1 32000，單抗的親和 常數(shù)為5. 53X IO9LAioI。一般認(rèn)為親和常數(shù)K在IO8 IOltl之間即為高親和力的單抗，說 明本研究得到的單克隆抗體可以應(yīng)用于DMT免疫分析方法的開發(fā)。綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡 依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。
權(quán)利要求
去氫甲睪酮單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCC No.3807的小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株UJS-1D6F10B4所分泌。
2.權(quán)利要求1所述的去氫甲睪酮單克隆抗體，其特征在于按照下述步驟制備得到(1) 肟化通過去氫甲睪酮與羧甲基羥胺反應(yīng)，引入具有反應(yīng)活性的氨基基團(tuán)，并進(jìn)行檢測(cè)確 認(rèn)；(2)完全抗原制備通過活化酯法，將具有氨基的去氫甲睪酮肟偶聯(lián)到鑰孔血藍(lán)蛋白 和雞卵清蛋白載體上，并進(jìn)行檢測(cè)確認(rèn)；(3)動(dòng)物免疫將制備的具有免疫活性免疫原免 疫Balb/C小鼠，并采用間接ELISA檢測(cè)其效價(jià)；⑷細(xì)胞融合采用聚乙二醇法將經(jīng)免疫 的Balb/C小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；(5)雜交瘤細(xì)胞篩選利用建立起的 間接ELISA方法檢測(cè)融合細(xì)胞上清，篩選出陽性的雜交瘤細(xì)胞；(6)雜交瘤細(xì)胞亞克隆采 用有限稀釋法將陽性孔的細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，以得到純化的雜交瘤細(xì)胞株；(7)雜交瘤細(xì)胞 株的亞型鑒定采用小鼠單克隆抗體免疫膠體金亞型試劑盒對(duì)單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定； (8)單抗的制備及IC5(I值、交叉反應(yīng)率和親和力的測(cè)定采用ELISA方法對(duì)得到的單克隆抗 體進(jìn)行IC5(I、親和力和特異性進(jìn)行測(cè)定。
3.權(quán)利要求1所述的去氫甲睪酮單克隆抗體的應(yīng)用，可以應(yīng)用于去氫甲睪酮的快速檢測(cè)。
4.分泌權(quán)利要求1所述的去氫甲睪酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，是保藏編號(hào)為 CGMCCNo. 3807的小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株UJS-1D6F10B4。
全文摘要
本發(fā)明去氫甲睪酮單克隆抗體、制備方法及其應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。公開了去氫甲睪酮單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCC No.3807的小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株所分泌。通過在不同的蛋白載體上偶聯(lián)一定數(shù)目的去氫甲睪酮分子，制備具有免疫原性的完全抗原和用于ELISA的包被抗原；再利用完全抗原免疫Balb/C小鼠，經(jīng)過細(xì)胞融合并利用間接ELISA篩選，并經(jīng)過亞克隆純化培養(yǎng)，得到了能穩(wěn)定分泌DMT單克隆抗體、高親和力、高特異性的雜交瘤細(xì)胞株；本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)DMT具有較高的親和力和靈敏度，并具有顯著的專一性，與類似物丙酸睪酮酯、群勃龍的交叉反應(yīng)率低于1％。本發(fā)明可以應(yīng)用于去氫甲睪酮的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N5/20GK101885774SQ201010213218
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者儲(chǔ)曉剛, 張勛, 王云, 董英 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)