一種快速篩選制備小分子類物質(zhì)單克隆抗體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速篩選制備小分子類物質(zhì)單克隆抗體的改良方法。主要包括三個(gè)抗體制備條件的變化：1)具用1/10～50脾臟用于細(xì)胞融合制備小分子類物質(zhì)單克隆抗體；2)脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞融合時(shí)混合的比例為1∶1；3)融合細(xì)胞株篩選方法采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(一步法)，通過(guò)此方法可以一步得到與小分子類物質(zhì)有陽(yáng)性反應(yīng)的融合細(xì)胞株。本發(fā)明建立了一種可通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(一步法)篩選對(duì)小分子類物質(zhì)有陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株，解決了傳統(tǒng)篩選方法篩選量大，篩選周期長(zhǎng)的問(wèn)題，大大降低了小分子類物質(zhì)單克隆抗體制備的周期和成本。
【專利說(shuō)明】
一種快速篩選制備小分子類物質(zhì)單克隆抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種快速篩選制備小分子類物質(zhì)單克隆抗體的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]單克隆抗體技術(shù)，是指將某種抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)融合，形成雜交瘤細(xì)胞，并分離篩選出單個(gè)雜交瘤細(xì)胞，再將其擴(kuò)增，最終分離純化制得單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞具有雙重特性，既能如骨髓瘤細(xì)胞般持續(xù)繁殖，又能如B淋巴細(xì)胞般分泌針對(duì)單一抗原決定簇的特異性抗體，即單克隆抗體。盡管單克隆抗體越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域，但是自1975年問(wèn)世以來(lái)，制備單克隆抗體一直沿用傳統(tǒng)方法，成為一經(jīng)典技術(shù)發(fā)展的瓶頸。制備單克隆抗體包括抗原制備，動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選、亞克隆、凍存復(fù)蘇、雜交瘤細(xì)胞及單克隆抗體特性的鑒定以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)等一系列復(fù)雜步驟，一般要花費(fèi)6個(gè)月以上的時(shí)間。其中雜交瘤細(xì)胞的篩選這一步驟最為耗時(shí)。
[0003]目前篩選小分子類物質(zhì)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，都是采用兩步法，先通過(guò)酶聯(lián)免疫篩選出對(duì)小分子與載體蛋白復(fù)合物有陽(yáng)性反應(yīng)的單克隆抗體，再通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制法篩選出對(duì)小分子抗原有陽(yáng)性反應(yīng)的單克隆抗體。此方法耗時(shí)且繁瑣，而且傳統(tǒng)的單克隆制備方法細(xì)胞融合多數(shù)采用骨髓瘤細(xì)胞:脾細(xì)胞=I: 5-10之間的比例融合，通過(guò)一次融合，一般會(huì)有數(shù)千上萬(wàn)孔雜交瘤細(xì)胞，融合較好的時(shí)候100 %的孔里都有多克隆雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但是最終只有不到10%的孔里面含有目標(biāo)雜交瘤細(xì)胞，所以要從如此多的雜交瘤細(xì)胞中篩選出目標(biāo)雜交瘤細(xì)胞，其篩選量是非常巨大的。一輪篩選通常需要進(jìn)行幾十次間接elisa實(shí)驗(yàn)，花費(fèi)數(shù)周時(shí)間，這大大增加了單克隆抗體的制備周期，也增加了生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述現(xiàn)有小分子類物質(zhì)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種優(yōu)化的細(xì)胞融合方式和直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA( —步法)篩選雜交瘤細(xì)胞的方法，此方法可以大大縮短了小分子類物質(zhì)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)周期。
[0005]本發(fā)明一種快速篩選制備小分子類物質(zhì)單克隆抗體(以苯乙醇胺A為例)的方法，包括如下步驟:
[0006]I)用純化的苯乙醇胺A-BSA人工抗原免疫BALB/C小鼠；
[0007]2)取免疫完成后的小鼠脾臟，分離小鼠的脾臟細(xì)胞，等分為10-50份，液氮保存?zhèn)溆?；取一份脾臟細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 (I: I)融合，并在含有HAT的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；
[0008]3)直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(—步法)篩選出對(duì)苯乙醇胺A有陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株(圖1)，并分別進(jìn)行保存；
[0009]4)用陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞株制備單一的抗苯乙醇胺A單克隆抗體。
[0010]本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化的細(xì)胞融合方式和一步法雜交瘤細(xì)胞篩選的方法，大大地縮短了制備小分子類物質(zhì)單克隆抗體的周期，大大地節(jié)約時(shí)間和成本。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為本發(fā)明一步法(直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA)篩選雜交瘤細(xì)胞株的示意圖。
[0012]圖2為本發(fā)明方法制得的抗苯乙醇胺A抗體的抑制ELISA檢測(cè)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫
[0014]用純化的苯乙醇胺A-BSA人工抗原皮下多點(diǎn)注射免疫6-8周雌性BALB/C鼠(每只小鼠200 μ I)，首次免疫注射時(shí)，分別100 μ g/mL的免疫抗原100 μ L，與等量弗氏完全佐劑充分乳化，腹腔直接注射。間隔兩周后，取用樣的抗原，與100 μ L不完全佐劑乳化，同樣方法注射。兩周后取血測(cè)定抗體的效價(jià)。
[0015]實(shí)施例2抗苯乙醇胺A單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備
[0016]經(jīng)腹腔注射苯乙醇胺A-BSA結(jié)合物加強(qiáng)免疫小鼠，4天后，將小鼠處死。取免疫完成后的小鼠脾臟，分離小鼠的脾臟細(xì)胞，等分為10-50份，液氮保存；取一份脾臟細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 (I: I)融合，接種4-10個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后在含HAT的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)。
[0017]實(shí)施例3抗苯乙醇胺A單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的篩選
[0018]將50 μ I溶于CB緩沖液濃度為100納克每毫升的苯乙醇胺A-OVA結(jié)合物加到96孔酶標(biāo)板的小孔中，4°C放置一晚上。第二天將苯乙醇胺A-牛血清白蛋白結(jié)合包被的96孔酶標(biāo)板用洗液(含有0.05% Tween的PBS緩沖液)洗兩次。然后用封閉液(I % BSA/洗液)室溫封閉2小時(shí)。將封閉液倒掉，然后實(shí)驗(yàn)組將50 μ I苯乙醇胺A溶液(濃度為10 μ g/ml)和50 μ I實(shí)施例2得到雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液分別加到96孔板，對(duì)照組用50 μ I不含苯乙醇胺A的溶劑和50 μ I雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液加到96孔板中。室溫孵育I小時(shí)，將上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ IHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體加入96孔酶標(biāo)板的小孔中，室溫孵育I小時(shí)，用洗液洗2次，加入100 μ ITMB顯色反應(yīng)底物，室溫顯色30分鐘后2mol/LH2SO4終止，肉眼即可觀察陽(yáng)性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組無(wú)色，對(duì)照組黃色即可判定此雜交瘤細(xì)胞株為抗苯乙醇胺A特異性的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。
[0019]實(shí)施例4雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)
[0020]單克隆雜交瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，經(jīng)過(guò)系列的稀釋制備濃度為I個(gè)細(xì)胞/200 μ I的單細(xì)胞懸液。將200 μ I的單細(xì)胞懸液加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(I細(xì)胞/0.2ml/孔)。在37°C，5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。約10天左右選擇單克隆孔，檢測(cè)抗體，選擇抗體OD值高、細(xì)胞生長(zhǎng)好的克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、建系、保存。
[0021]實(shí)施例5抗苯乙醇胺A單克隆抗體的制備和純化
[0022]腹腔注射成年BALB/C鼠0.1ml不完全福氏佐劑，I周后腹腔注射實(shí)施例4得到的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的抗苯乙醇胺A單克隆雜交瘤細(xì)胞株(16個(gè)細(xì)胞/小鼠)，2-4周左右小鼠腹部可見(jiàn)明顯膨大，用注射器吸取腹水。離心后吸取上清，用硫酸銨飽和沉淀后，再用蛋白A或蛋白G親和層析柱繼續(xù)純化。
[0023]實(shí)施例6抗體效價(jià)的測(cè)定
[0024]將50 μ I溶于CB緩沖液濃度為10 μ g每毫升的苯乙醇胺A-0VA結(jié)合物加到96孔酶標(biāo)板的小孔中，4°C放置過(guò)夜。第二天將苯乙醇胺A-OVA結(jié)合包被的96孔酶標(biāo)板用洗液(含有0.05% Tween的PBS緩沖液)洗兩次。然后用封閉液(1% BSA/洗液)室溫封閉2小時(shí)。將封閉液倒掉，然后將抗體稀釋100倍后，按1: 4的比例系列稀釋，將ΙΟΟμΙ各個(gè)稀釋度的抗體加到96孔板，室溫孵育2小時(shí)，將上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ I HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體加入96孔酶標(biāo)板的小孔中，室溫孵育I小時(shí)，用洗液洗2次，加入100 μ I TMB顯色反應(yīng)底物，室溫顯色30分鐘后2mol/L H2SO4終止，在波長(zhǎng)為450納米讀光吸收值。OD值大于陰性對(duì)照2.1倍的最高的稀釋倍數(shù)即為抗體的效價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所述抗苯乙醇胺A抗體的效價(jià)為102400。
[0025]實(shí)施例7抗體親和力測(cè)定
[0026]將50 μ I溶于CB緩沖液濃度為10 μ g每毫升的苯乙醇胺A-0VA結(jié)合物加到96孔酶標(biāo)板的小孔中，4°C放置一晚上。第二天將苯乙醇胺A-牛血清白蛋白結(jié)合包被的96孔酶標(biāo)板用洗液(含有0.05% Tween的PBS緩沖液)洗兩次。然后用封閉液(1% BSA/洗液)室溫封閉2小時(shí)。先將抗苯乙醇胺A抗體與不同濃度的苯乙醇胺A孵育，然后將該孵育液加到96孔板中，室溫孵育2小時(shí)，將上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ IHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體加入96孔酶標(biāo)板的小孔中，室溫孵育I小時(shí)，用洗液洗2次，加入100 μ ITMB顯色反應(yīng)底物，室溫顯色30分鐘后2mol/L H2SO4終止，在波長(zhǎng)為450納米讀光吸收值。抗體的親和力用公式A。/ (A0-A) = Ι+Κ/a。計(jì)算，A。為苯乙醇胺A濃度為O時(shí)的OD值，A為苯乙醇胺A濃度為a。時(shí)的OD值，K為親和常數(shù)的倒數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所述的抗苯乙醇胺A抗體的親和力大約為1.6 X 10 SM。
[0027]實(shí)施例8苯乙醇胺A抗體IC4。的測(cè)定
[0028]將50 μ I溶于CB緩沖液濃度為50ng/ml的苯乙醇胺A-OVA結(jié)合物加到96孔酶標(biāo)板的小孔中，4°C放置過(guò)夜。第二天將苯乙醇胺A-OVA結(jié)合包被的96孔酶標(biāo)板用洗液(含有0.05% Tween的PBS緩沖液)洗兩次。然后用封閉液(I % BSA/洗液)室溫封閉2小時(shí)。將封閉液倒掉，將50 μ I不同稀釋度(0.01-100ng/ml，每一濃度均作三復(fù)孔)的苯乙醇胺A溶液，然后加入50 μ 11: 10000倍稀釋的抗體，混勻。室溫孵育I小時(shí)，將上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ I HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育I小時(shí)，用洗液洗2次，加入100 μ I TMB顯色反應(yīng)底物，室溫顯色30分鐘后2mol/L H2SO4終止，在波長(zhǎng)為450nm讀光吸收值。以競(jìng)爭(zhēng)物苯乙醇胺A競(jìng)爭(zhēng)濃度為橫坐標(biāo)，以加入競(jìng)爭(zhēng)物苯乙醇胺A的檢測(cè)孔的OD450nni(B)與未加競(jìng)爭(zhēng)物的對(duì)照孔的OD450nni(B。)的比例，稱為結(jié)合率)為縱坐標(biāo)制作競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，得到IC5。。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所述抗苯乙醇胺A抗體的IC5。為5ng/ml (圖 2)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用1/10?50脾臟用于細(xì)胞融合制備小分子類物質(zhì)單克隆抗體。2.脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞融合時(shí)混合的比例為1:1。3.融合細(xì)胞株篩選方法采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(—步法)，通過(guò)此方法可以一步得到與小分子類物質(zhì)有陽(yáng)性反應(yīng)的融合細(xì)胞株。4.根據(jù)權(quán)利1-3所述的3個(gè)抗體制備條件同樣適合于青霉素等其它小分子類物質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK105884899SQ201510007043
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2015年1月8日
【發(fā)明人】張偉
【申請(qǐng)人】成都酷賽生物技術(shù)有限公司, 上海酷賽生物技術(shù)有限公司