專利名稱：抗兔出血癥病毒vp60蛋白單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗兔出血癥病毒(RHDV) VP60蛋白單克隆抗體，屬于生物技術領域，涉 及抗體工程技術，具體為抗兔出血癥病毒(RHDV) VP60蛋白單克隆抗體。
背景技術：
兔出血癥(RHD)，又稱兔瘟，是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種以急性、高度 傳染性、大面積死亡為特征的兔傳染病，感染兔通常48 72 h死亡，主要特征為傳染性 極強、呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死、臟器水腫、淤血和出血等變化，給全世界養(yǎng)兔業(yè)造成了 巨大的經(jīng)濟損失。國際獸醫(yī)局將該病列為B類傳染病，我國農(nóng)業(yè)部96號令頒布為二類疫 病。
朋DV屬杯狀病毒，病毒粒子呈球型，為二十面體對稱，無囊膜。病毒含有一條單股 正鏈RNA，由7437個核苷酸組成，與一般的杯狀病毒不同，RHDV只有2個開放閱讀框架 (ORF) ， ORFI位于基因組5'端，從核苷酸10延伸至核苷酸7041，約占整個基因組的94%。 朋DV的ORFI基因序列為NH2-P16-P23-2C解旋酶-P30-VPg-3C樣蛋白酶-3D聚合酶-衣 殼蛋白-COOH。衣殼蛋白是RHDV唯一的結構蛋白，稱為VP60，其基因片段長度為1 740 bp， 共編碼580個氨基酸，與誘導抗病毒感染的免疫反應直接相關。用純化的RHDV病毒作為 免疫原制備單克隆抗體的效價通常偏低，不利于RHDV單克隆抗體的應用。利用桿狀病毒 表達系統(tǒng)表達的RHDV VP60重組蛋白制備的單克隆抗體可為VP60蛋白研究和RHDV免疫 學方法建立提供必要的試劑和技術手段，對探索VP60蛋白的生物學功能區(qū)域和建立RHDV 特異、敏感的檢測方法等具有重要意義。

發(fā)明內容
技術問題 本發(fā)明的目的是提供抗兔出血癥病毒VP60蛋白單克隆抗體。本發(fā)明 的單克隆抗體是用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的重組VP60蛋白為抗原，免疫BALB/c小鼠， 利用雜交瘤技術制備獲得的，能特異識別RHDV衣殼蛋白。兔出血癥病毒重組VP60蛋白 是將RHDV VP60基因克隆于桿狀病毒表達系統(tǒng)的穿梭載體并通過轉染在昆蟲細胞中表達 的蛋白。
技術方案
一種抗兔出血癥病毒RHDV衣殼蛋白VP60單克隆抗體，其特征在于該單克隆 抗體是雜交瘤細胞株A3C產(chǎn)生的，雜交瘤細胞株A3C于2009年3月24日寶藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC一C200921。制備方法包括
1) RHDV重組VP60蛋白的制備根據(jù)RHDV VP60序列設計一對引物，用RT-PCR方 法擴增RHDV衣殼蛋白VP60基因，通過克隆、轉化得到重組穿梭載體Bacmid-VP60，用此質粒轉染Sf9昆蟲細胞，得到重組病毒rAcV-Bac-VP60，用此重組病毒感染Sf9昆蟲 細胞，經(jīng)免疫熒光法、Western-blotting、血凝實驗鑒定重組VP60蛋白表達，獲得免疫 用重組VP60蛋白；2) 小鼠免疫用血凝效價為13 kg 2的RHDV重組VP60蛋白免疫6 8周齡的雌性 BALB/c小鼠，免疫程序為皮下注射弗氏完全佐劑乳化的抗原200iiL/只，2周后皮下 注射弗氏不完全佐劑乳化的等量抗原，間隔2周后，再皮下注射弗氏不完全佐劑乳化的 等量抗原，融合前3天腹腔注射等量不加佐劑的抗原加強免疫；3) 細胞融合取SP2/0骨髓瘤細胞與免疫的BALB/c小鼠脾細胞按l : 5 1 : 10的比例混合于50 mL離心管中，充分混勻，l,OOOrpm離心10min，棄上清，用手掌輕擊管底，使細胞松散 均勻，置40。C水浴預熱，用lmL吸管在45s內加完預熱至4(TC的50。/。PEG-4000 1mL，邊 加邊輕輕振蕩，然后在90s內加入30mL預熱至37'C的DMEM不完全培養(yǎng)基，室溫靜置 10min， 1,000rpm離心10min，棄上清，加入20mL含20^FCS和HAT的DMEM培養(yǎng)基重懸。 分裝到已有飼養(yǎng)細胞的96孔板上，于5。/。C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7d后，觀察細胞的生長狀況， 用含有20Q/。FCS和HT的DMEM培養(yǎng)基換出l/2培養(yǎng)基；14d后，改用含20。/。FCS和HT的 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當融合的細胞生長至96孔板孔底面積的l/5時，取上清進行抗體檢測；4) 雜交瘤篩選用包被液為0. 05 mol/L pH 9. 6碳酸鹽緩沖液對起始血凝效價為13 bg 2的兔出血 癥肝病料上清液和桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的血凝效價為13 log 2VP60蛋白進行倍比稀釋， 用稀釋至l: 27的液體包被ELISA板，100yL/孔，置4。C包被過夜；PBST洗滌3次，每 次5min，最后一次拍干；以2%明膠封閉每孔，200uL/孔，37'C放置2h; PBST洗漆3 次，每次5min，最后一次拍干；將細胞上清、1 : IOO稀釋的陽性參考血清和1 : 100稀 釋的陰性參考血清，加入相應孔內，100uL/孔，37。C作用90 min; PBST洗滌3次，每 次5min，最后一次拍干；加入1 : 2000稀釋的酶標羊抗鼠IgG， 100uL/孔，37'C放置 60min; PBST洗滌5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB- H202， 100uL/孔， 室溫避光顯色10min;每孔加入50uL 2 mol/L硫酸終止反應；經(jīng)酶標儀測定0D450nm 值以空白對照調零，P為各檢測孔的值，N為陰性參考血清的0D45。值，當陰性參考血清 的OD柳值^0.1，陽性參考血清的OD柳值與陰性參考血清的OD45o值的比值^2.1，即陰、 陽性對照成立的前提下，P/N^2.1的檢測孔判為陽性，1. 5《P/N<2.1的檢測孔判為可 疑，P/N<1. 5的檢測孔判為陰性；5) 有限稀釋法對雜交瘤細胞亞克隆首先將陽性孔活細胞用臺盼蘭進行染色和計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成100 個細胞/15mL培養(yǎng)基，將稀釋的細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.15mL， 37'C， 5 。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 5d后，顯微鏡下可觀察到克隆細胞的形成，記錄下只有單個 克隆生長孔，8 9d時取細胞上清，及時進行ELISA檢測；選擇陽性的單克隆細胞再進 行同樣的亞克隆3次以上，直至亞克隆后所有細胞孔上清檢測均為陽性、且各孔檢測OD 值較接近；將多次亞克隆培養(yǎng)后的陽性孔細胞擴大培養(yǎng)，并凍存，獲得穩(wěn)定分泌抗RHDV VP60蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株A3C;6)抗RHDVVP60蛋白單克隆抗體的制備將石蠟油注射成年BALB/c小鼠，0. 5 mL /只，致敏7天后，將陽性雜交瘤細胞株 A3C用0.01MPBS稀釋后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5xlC^ lxl(^個細胞，0.2mL， 5 IO天后采取腹部明顯鼓起小鼠的腹水，11000g，離心5min，收集上清，小量分裝，-70 'C保存。有益效果本發(fā)明的特點和優(yōu)點如下1、 本發(fā)明提供的RHDV重組蛋白VP60抗原制備方法簡便可行；2、 本發(fā)明提供的抗RHDV衣殼蛋白VP60的單克隆抗體特異性強，制備方法簡單；3、 本發(fā)明提供的特異性單克隆抗體可用于VP60蛋白的研究和RHDV免疫學檢測方 法的建立。4、 獲得穩(wěn)定分泌抗RHDVVP60蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株A3C，測得A3C腹 水ELISA效價為1:327600，經(jīng)鑒定該單克隆抗體既可與表達的重組VP60蛋白特異性結 合，又可與RHDV特異性結合，均出現(xiàn)單一一條反應條帶，證明抗RHDVVP60蛋白單 克隆抗體是RHDV衣殼蛋白VP60特異性抗體。


圖1重組轉移載體的酶切鑒定，圖中l(wèi)是限制性內切酶(Sal I/Xho I酶切)消化 重組轉移載體，2是DNA分子量標準(DL-2 000) ， 3是DNA分子量標準(DL-15 000)。圖2重組Bacmid的PCR鑒定，圖中1是DNA分子量標準(DL-15 000) ， 2是DNA分 子量標準(DL-2 000)， 3是用pUC/M13上、下游引物對重組Bacmid PCR鑒定，4是用 pUC/M13上游引物與特異性VP60基因下游引物對重組BacmidPCR鑒定，5是用pUC/M13 上、下游引物對Bacmid PCR鑒定。圖3表達蛋白的免疫熒光鑒定，在感染重組病毒的細胞內有強烈的熒光反應。雜交瘤細胞株A3C，于2009年3月24日寶藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC， 地址武漢武漢大學郵編430072,保藏編號為CCTCC—C200921。
具體實施方式
6(一)表達重組VP60蛋白表達載體的構建參照GenBank中中國吉林株RHDV基因組序列(AY523410),利用Primer 5. 0軟件自 行設計一對引物。上游引物P1: 5， -ATA GTCGAC ATG GAG GGC AAA G-3';下游引物P2: 5， -GCC TCG AGT CAG ACA TAA GM MG CCA-3，。在上游引物的5'端加入Sal I酶切 位點，下游引物的5'端引入Xho I酶切位點。用RT-PCR方法擴增RHDV衣殼蛋白VP60 基因(王芳等，兔出血癥病毒衣殼蛋白在昆蟲細胞中的表達及對家兔的免疫保護效果， 畜牧獸醫(yī)學報，2008，39(10)，1382~1387),經(jīng)酶切消化后連接到供體質粒pFastBac l (購 買于Invitrogen公司)上，轉化DH5a感受態(tài)細胞，提取質粒用Sal I和Xho I酶切，經(jīng) 鑒定得到重組轉移載體pFastBaC l-VP60(王芳等，兔出血癥病毒衣殼蛋白在昆蟲細胞中 的表達及對家兔的免疫保護效果，畜牧獸醫(yī)學報，2008,39(10)，1382~1387)(圖2)，然 后用此質粒轉化含有穿梭載體Bacmid(購買于Invitrogen公司)的E. coli DHlOBac(購 買于Invitrogen公司)感受態(tài)細胞，提取質粒，以通用pUCM13上游引物(購買于 Invitrogen公司)和特異性VP60下游引物進行PCR鑒定。同時設立未插入外源基因片 段的DH10Bacmid質粒(購買于Invitrogen公司)對照組，以pUCM13上、下游引物(購 買于Invitrogen公司)進行PCR鑒定。經(jīng)篩選得到重組桿狀病毒穿梭質粒Bacmid-VP60 (王芳等，兔出血癥病毒衣殼蛋白在昆蟲細胞中的表達及對家兔的免疫保護效果，畜牧獸 醫(yī)學報，2008,39(10)，1382~1387)(圖3)。(二)重組VP60蛋白的表達1、 昆蟲細胞轉染以Lipofectamin 2000為共轉染試劑，用重組桿狀病毒穿梭質粒Bacmid-VP60(王芳 等，兔出血癥病毒衣殼蛋白在昆蟲細胞中的表達及對家兔的免疫保護效果，畜牧獸醫(yī)學 報，2008, 39 (10),1382~1387)轉染Sf9 (購買于Invitrogen公司)單層細胞。轉染后每 12h觀察一次，直到細胞病變明顯時，收集細胞及上清液，作為重組桿狀病毒原液4'C保 存。將含目的基因VP60的重組桿狀病毒命名為rAcV-Bac-VP60(王芳等，兔出血癥病毒 衣殼蛋白在昆蟲細胞中的表達及對家兔的免疫保護效果，畜牧獸醫(yī)學報，2008， 39 (10),1382~1387)。2、 間接免疫熒光檢測(IFA)鑒定用此重組病毒感染于24孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)的對數(shù)生長期Sf9昆蟲細胞，培養(yǎng)至發(fā) 生病變時，用間接免疫熒光法(IFA)檢測重組蛋白的表達，結果顯示，重組桿狀病毒感 染的Sf9細胞具有很強的特異性熒光(圖4)，說明VP60蛋白得到表達。3、 Western-blotting鑒定將重組病毒以W的體積比感染Sf9細胞，96h后收集病變細胞及培養(yǎng)液，分裝于1. 5m L離心管中，3000rpm/min，離心5 min，培養(yǎng)上清保留，細胞用PBS重懸細胞洗滌2次 后，溶于500 uLPBS，反復凍融3次后，超聲裂解，3000rpm/min，離心5 min，取上 清，加入上樣緩沖液，煮沸5分鐘，11000g，離心lmin，取上清20 pL進行蛋白質電泳(SDS-PAGE)，同時以感染野生Bacmid的Sf9細胞裂解產(chǎn)物和Sf9細胞裂解產(chǎn)物作 為對照樣品。采用半干轉印法，取下凝膠，0.65 mA/cm2，轉印1.5h后，將其轉印于硝 酸纖維膜(NC膜)上，應用RHDV高免血清按常規(guī)方法進行Western-blotting反應，電泳 和轉印結果顯示VP60基因在昆蟲細胞中表達了大小約為60kD的特異性條帶，而對照 樣品感染野生Bacmid的Sf9細胞裂解產(chǎn)物和Sf9細胞裂解產(chǎn)物均未顯示相應的條帶。 免疫印跡與電泳的目的條帶位置相符，說明目的蛋白得到表達。 4、血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)鑒定分別取感染重組病毒的細胞裂解上清和細胞培養(yǎng)上清50 u L于圓底大孔血凝板以生 理鹽水作2倍比稀釋后，加入等體積1%人"0"型紅細胞懸液，振蕩均勻后，置于4'C作 用45分鐘后觀察結果。同時以其他重組桿狀病毒感染細胞產(chǎn)物作為陰性對照，以RHDV 病兔肝臟l: 5勻漿上清作為陽性對照。結果顯示，感染細胞裂解上清和細胞培養(yǎng)上清血 凝效價均可達212以上，而其他重組桿狀病毒感染細胞產(chǎn)物無血凝反應。于圓底大孔血凝板加入50uLRHDV血清，以生理鹽水作2倍比稀釋后，加入4個血 凝單位的表達蛋白于每孔，將血凝板置37'C，作用30分鐘后，每孔加1%人"0"型紅細 胞懸液50ixL，立即搖勻，置4'C作用45分鐘。結果顯示，表達的VP60蛋白的血凝特性 可被RHDV高免血清所抑制，表明表達的VP60蛋白具有與RHDV相似的生物學活性。 (三)雜交瘤細胞株的建立1、小鼠免疫用血凝效價為13 log 2 RHDV重組VP60蛋白免疫6 8周齡的雌性BALB/c小鼠，免疫 程序為皮下注射弗氏完全佐劑乳化的抗原200ixL/只，2周后皮下注射弗氏不完全佐劑 乳化的等量抗原，間隔2周后，再皮下注射弗氏不完全佐劑乳化的等量抗原，融合前3 天腹腔注射等量不加佐劑的抗原加強免疫。 2、細胞融合按常規(guī)方法進行(劉秀梵，單克隆抗體在農(nóng)業(yè)上的應用(第l版)[M].合肥安徽 科學技術出版社，1994:18 30.)。取SP2/0骨髓瘤細胞與VP60蛋白免疫的BALB/c小鼠 脾細胞按l : 5 1 : 10的比例混合于50mL離心管中，充分混勻，l,OOOrpm離心10min， 棄上清。用手掌輕擊管底，使細胞松散均勻，置40。C水浴預熱。用lmL吸管在45s內加完 預熱至4(TC 50%PEG-4000 1mL，邊加邊輕輕振蕩，然后在90s內加入30mL預熱至37。C 的DMEM(購買于Invitrogen公司)不完全培養(yǎng)基，室溫靜置10min， 1,000ipm離心10min， 棄上清，加入20mL含20XFCS(小牛血清，購買于上?；廴松锟萍脊こ萄芯克?和HAT (購買于Invitrogen公司)DMEM培養(yǎng)基重懸。分裝到已有飼養(yǎng)細胞的96孔板上，于5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7d后，觀察細胞的生長狀況，用含有20。/。FCS和HT (購買于Invitrogen 公司)的DMEM培養(yǎng)基換出l/2培養(yǎng)基。14d后，改用含20。/。FCS和HT的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當融合細胞生長至96孔板孔底面積的l/5時，取上清進行抗體檢測。3、 雜交瘤篩選用重組VP60蛋白和RHDV包被進行雙重間接ELISA，分別對細胞培養(yǎng)上清進行檢測， 篩選出對RHDV和VP60重組蛋白呈為陽性的雜交瘤細胞。用包被液為0. 05 mol/L pH 9. 6 碳酸鹽緩沖液對起始血凝效價為13log2的兔出血癥肝病料上清液和桿狀病毒表達系統(tǒng)表 達血凝效價為13log2的VP60蛋白進行倍比稀釋，用稀釋至l: 2'的液體包被ELISA板， 100uL/孔，置4'C包被過夜；PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；以2%明膠封 閉每孔，200nL/孔，37。C放置2h; PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；將細胞上清、i: ioo稀釋的陽性參考血清和i: ioo稀釋的陰性參考血清，加入相應孔內，ioouL/孔，37。C作用90 min; PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；加入1 : 2000 稀釋的酶標羊抗鼠IgG， 100pL/孔，37。C放置60min; PBST洗滌5次，每次5min，最后 一次拍干；加入底物TMB- H202， 100 u L/孔，室溫避光顯色10min;每孔加入50 u L 2 mol/L 硫酸終止反應；經(jīng)酶標儀測定0D450nm值以空白對照調零，P為各檢測孔的值，N為陰 性參考血清的OD徊值，當陰性參考血清的OD柳值蕓O.l，陽性參考血清的OD柳值與陰性 參考血清的0D45。值的比值^2.1，即陰、陽性對照成立的前提下，P/NS2.1的檢測孔判 為陽性，1. 5《P/N<2. 1的檢測孔判為可疑，P/N〈1.5的檢測孔判為陰性。4、 有限稀釋法對雜交瘤細胞亞克隆對于篩選所得的分泌特異性單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，及時采用有限稀釋法(劉 秀梵，單克隆抗體在農(nóng)業(yè)上的應用(第1版)[M].合肥安徽科學技術出版社， 1994:35-36.)進行亞克隆。首先將陽性孔活細胞用臺盼蘭進行染色和計數(shù)，用DMEM 完全培養(yǎng)基(注首次亞克隆應加HT)稀釋成100個細胞/15mL培養(yǎng)基，將稀釋的細胞 懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.15mL， 37°C， 5%(:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 5d后， 顯微鏡下可觀察到克隆細胞的形成，記錄下只有單個克隆生長孔，8~9d時取細胞上清， 及時進行ELISA檢測；選擇陽性的單克隆細胞再進行同樣的亞克隆3次以上，直至亞克 隆后所有細胞孔上清檢測均為陽性、且各孔檢測OD值較接近。將多次亞克隆培養(yǎng)后的 陽性孔細胞擴大培養(yǎng)，并凍存，獲得穩(wěn)定分泌抗RHDV VP60蛋白單克隆抗體的雜交瘤 細胞株A3C。雜交瘤細胞株A3C，于2009年3月24日寶藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 CCTCC,地址武漢武漢大學郵編430072，保藏編號為CCTCC一C200921 。 (四)抗RHDVVP60蛋白單克隆抗體的制備將石蠟油注射成年BALB/c小鼠，0. 5 mL /只，致敏7天后，將陽性雜交瘤細胞用0. 01MPBS稀釋后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5xl06 lxl07， 0.2 mL， 5~10夭后采 取腹部明顯鼓起小鼠的腹水，11000g，離心5min，收集上清，小量分裝，-70匸保存。(五) 抗RHDVVP60蛋白單克隆抗體的腹水效價測定用PBS緩沖液1:100稀釋單克隆抗體腹水，然后進行倍比稀釋，加入用桿狀病毒表達 系統(tǒng)表達的VP60蛋白包被的酶標板，100 uL/孔，37°C，孵育90 min; PBST洗滌3次， 每次5min，最后一次拍干；加入l : 2000稀釋的服P標記羊抗鼠IgG, 100uL/孔，37°C， 孵育60min; PBST洗滌5次，每次5min，最后一次拍千；加入底物TMB- HA， 100uL/孔， 室溫避光顯色10min;每孔加入50nL2mol/L硫酸終止反應；經(jīng)酶標儀測定OD450值。以 陰性0D450值小于0.2，檢測孔與陰性OM50值的比值大于2.1判為陽性，以陽性孔的最大 稀釋度作為單克隆抗體的腹水效價。結果顯示，A3C細胞株腹水間接ELISA效價為 1:327600。(六) 抗RHDV VP60蛋白單克隆抗體與重組蛋白和RHDV反應原性與特異性鑒定 用Western-blotting (馮仁青，郭振泉.現(xiàn)代抗體技術及其應用(第l版)[M].北京北京大學出版社，2006:199 206.)鑒定所得單克隆抗體腹水的反應原性與特異性。用表達的重組蛋白和RHDV在12X分離膠，5X濃縮膠中進行SDS-PAGE電泳后，將凝膠在Tris-Gly緩沖系統(tǒng)中轉印到硝酸纖維膜(NC膜)上，0.65mA/cm2，轉印100分鐘，5%脫脂奶封閉，以單克隆抗體作為一抗，以HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，DAB顯色試劑盒顯色。結果顯示，該單克隆抗體既可與表達的重組蛋白特異性結合，又可與RHDV特異性結合，均出現(xiàn)單一一條反應條帶，證明抗RHDVVP60蛋白單克隆抗體是RHDV衣殼蛋白VP60特異性抗體。10
權利要求
1、一種抗兔出血癥病毒RHDV衣殼蛋白VP60單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體是雜交瘤細胞株A3C產(chǎn)生的，雜交瘤細胞株A3C于2009年3月24日寶藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC—C200921。
2、 根據(jù)權利要求1所述的一種抗RHDV衣殼蛋白VP60單克隆抗體，其特征在于，是由以下方法制備而獲得的1) RHDV重組VP60蛋白的制備根據(jù)RHDV VP60序列設計一對引物，用RT-PCR方法擴增RHDV衣殼蛋白VP60基因， 通過克隆、轉化得到重組穿梭載體Bacmid-VP60，用此質粒轉染Sf9昆蟲細胞，得到重 組病毒rAcV-Bac-VP60 ，用此重組病毒感染Sf9昆蟲細胞，經(jīng)免疫熒光法、 Western-blotting、血凝實驗鑒定重組VP60蛋白表達，獲得免疫用重組VP60蛋白；2) 小鼠免疫血凝效價為13 log 2的RHDV重組VP60蛋白免疫6 8周齡的雌性BALB/c小鼠，免疫 程序為皮下注射弗氏完全佐劑乳化的抗原200uL/只，2周后皮下注射弗氏不完全佐劑 乳化的等量抗原，間隔2周后，再皮下注射弗氏不完全佐劑乳化的等量抗原，融合前3 天腹腔注射等量不加佐劑的抗原加強免疫；3) 細胞融合取SP2/0骨髓瘤細胞與免疫的BALB/c小鼠脾細胞按l : 5 1 : 10的比例混合于50 mL離心管中，充分混勻，l,OOOrpm離心10min，棄上清，用手掌輕擊管底，使細胞松散 均勻，置40。C水浴預熱，用lmL吸管在45s內加完預熱至40。C的50。/。PEG-4000 1mL，邊 加邊輕輕振蕩，然后在90s內加入30mL預熱至37'C的DMEM不完全培養(yǎng)基，室溫靜置 10min， l,OOOrpm離心lOmin，棄上清，加入20mL含20^FCS和HAT的DMEM培養(yǎng)基重懸； 分裝到已有飼養(yǎng)細胞的96孔板上，于5。/。C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7d后，觀察細胞的生長狀況， 用含有20。/。FCS和HT的DMEM培養(yǎng)基換出l/2培養(yǎng)基；14d后，改用含20。/。FCS和HT的 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當融合的細胞生長至96孔板孔底面積的l/5時，取上清進行抗體檢測；4) 雜交瘤篩選用包被液為0. 05 mol/L pH 9. 6碳酸鹽緩沖液對起始血凝效價為13 bg 2的兔出血 癥肝病料上清液和桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的血凝效價為13 bg 2的VP60結構蛋白進行稀 釋，用稀釋至l: 27的液體包被ELISA板，100uL/孔，置4'C包被過夜；PBST洗滌3次， 每次5min，最后一次拍干；以2%明膠封閉每孔，200yL/孔，37。C放置2h; PBST洗滌 3次，每次5min,最后一次拍干；將細胞上清、1 : 100稀釋的陽性參考血清和1 : 100稀釋的陰性參考血清，加入相應孔內，100 uL/孔，37。C作用90 niin; PBST洗滌3次， 每次5min，最后一次拍干；加入l : 2000稀釋的酶標羊抗鼠IgG， 100uL/孔，37'C放置 60min; PBST洗滌5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB- H202， 100uL/孔， 室溫避光顯色10min;每孔加入50 ii L 2 mol/L硫酸終止反應；經(jīng)酶標儀測定OD450nm 值以空白對照調零，P為各檢測孔的值，N為陰性參考血清的0D45。值，當陰性參考血清 的0D45。值^0,1，陽性參考血清的0D頓值與陰性參考血清的0D45。值的比值^2.1，即陰、 陽性對照成立的前提下，P/N^2.1的檢測孔判為陽性，1. 5《P/N<2.1的檢測孔判為可 疑，P/N〈1.5的檢測孔判為陰性；5) 有限稀釋法對雜交瘤細胞亞克隆首先將陽性孔活細胞用臺盼蘭進行染色和計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成100 個細胞/15mL培養(yǎng)基，將稀釋的細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.15mL， 37°C， 5 %(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 5d后，顯微鏡下可觀察到克隆細胞的形成，記錄下只有單個 克隆生長孔，8 9d時取細胞上清，及時進行ELISA檢測；選擇陽性的單克隆細胞再進 行同樣的亞克隆3次以上，直至亞克隆后所有細胞孔上清檢測均為陽性孔、且各孔檢測 OD值較接近；將多次亞克隆培養(yǎng)后的陽性孔細胞擴大培養(yǎng)，并凍存，獲得穩(wěn)定分泌抗 RHDVVP60蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株A3C，雜交瘤細胞株A3C，于2009年3月 24日寶藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，地址武漢武漢大學郵編430072， 保藏編號為CCTCC一C200921;6) 抗RHDVVP60蛋白單克隆抗體的制備將石蠟油注射成年BALB/c小鼠，0. 5 mL /只，致敏7天后，將陽性雜交瘤細胞株 A3C用0. OIMPBS稀釋后注入小鼠腹腔,每只小鼠注射5xl06 1 ><107個細胞，0.2 mL， 5 IO天后采取腹部明顯鼓起小鼠的腹水，11000g，離心5min，收集上清，小量分裝，-70 'C保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗兔出血癥病毒(RHDV)VP60蛋白單克隆抗體，屬于生物技術領域。取SP2/0骨髓瘤細胞與用RHDV重組VP60蛋白免疫的BALB/c小鼠脾細胞進行細胞融合，用HAT培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)后，用重組VP60蛋白和RHDV進行雙重ELISA篩選，分別對細胞培養(yǎng)上清進行檢測、篩選獲得穩(wěn)定分泌抗RHDV VP60蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株A3C，測得A3C腹水ELISA效價為1∶327600，經(jīng)鑒定該單克隆抗體既可與表達的重組VP60蛋白特異性結合，又可與RHDV特異性結合，均出現(xiàn)單一一條反應條帶，證明抗RHDV VP60蛋白單克隆抗體是RHDV衣殼蛋白VP60特異性抗體。
文檔編號C07K16/10GK101519447SQ20091002962
公開日2009年9月2日 申請日期2009年4月8日 優(yōu)先權日2009年4月8日
發(fā)明者何孔旺, 張則斌, 徐為中, 芳 王, 波 胡, 范志宇, 蔡少平 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院