一種鼠源單克隆抗體及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及抗體技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明設(shè)及一種新的重組抗人抗狂犬病毒 單克隆抗體的單克隆抗體，及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 狂犬病是由狂犬病毒所致的自然疫源性或動物源性人畜共患急性傳染病，流行性 廣，病死率幾近百分之百，對人民生命健康造成嚴重威脅。人狂犬病主要通過患病動物咬 傷、抓傷或由粘膜感染引起，在特定的條件下還可通過呼吸道氣溶膠傳染。傳染動物主要是 犬（超過90%)，其次是貓。根據(jù)中國疫情報告系統(tǒng)資料，1998年后狂犬病疫情年增長幅度 越來越高，死亡人數(shù)不斷攀升。
[0003] 對于狂犬病毒暴露后預(yù)防，WK)推薦的處理方法是全程注射狂犬疫苗，同時合并注 射抗狂犬病馬血清巧RIG)或抗狂犬病毒人免疫球蛋白（HRIG)。但HRIG由于來源限制價格 昂貴，而馬血清制品則較易發(fā)生嚴重的過敏反應(yīng)，所W現(xiàn)今國際上已經(jīng)公認有必要用重組 單克隆抗體取代狂犬病毒暴露后預(yù)防中使用的抗狂犬病毒血源抗體。
[0004] 此外，抗狂犬病毒重組單克隆抗體具有中和效果好、安全性好、成本低、可大量生 產(chǎn)等優(yōu)點，具有取代邸IG和皿IG的潛在能力，可用于狂犬病的暴露后預(yù)防。陳哲等人運用 瞻菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，采集多個具有高滴度狂犬病毒抗體的狂犬病毒疫苗注射者外周血淋 己細胞，構(gòu)建了抗狂犬病毒Fab基因工程抗體文庫，并對抗體庫進行富集篩選，獲得特異 性抗狂犬病毒基因工程抗體Fab段，并將其命名為RVFabS。由于小分子抗體在親和力和中 和活性方面均低于全抗體，于是他們將上述F油抗體RVF油8的輕鏈和重鏈基因分別克隆進 入全抗體表達載體化cA-化并轉(zhuǎn)染昆蟲S巧細胞，利用桿狀病毒/昆蟲細胞系統(tǒng)實現(xiàn)全抗 體的分泌型表達得到全抗體RVIgGS。并進一步對其進行功能鑒定，結(jié)果表明RVIgGS具有 較好的中和活性，能達到876. 61IU/mg，完全具備了中和國際標準攻擊毒株CVS-11株的能 力（病毒學(xué)報.2010. 7; 26(4) : 271-275)(中國專利；人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗體 (RVF油8)，公開號CN101812131A)。
[0005] 華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司將RVF油8的全抗體基因序列在CH0 細胞表達系統(tǒng)中表達，構(gòu)建出成功高效表達該抗體的工程細胞，并把得到的單克隆抗體 命名為NC08。該方法操作工藝簡便、產(chǎn)品表達水平高、生產(chǎn)的抗體質(zhì)量均一性及穩(wěn)定 性好，具備產(chǎn)業(yè)化價值（中國專利；重組人抗狂犬病毒單克隆抗體的制備方法，公開號 CN101100663A)。此外，NC08與本公司之前開發(fā)的醒57組成組合制劑，可進一步擴大對狂 犬病毒毒株的覆蓋。
[0006] 在NC08及其組合制劑進行臨床前研究及臨床研究的過程中，W及將來成為藥物 后患者應(yīng)用的過程中，為了研究藥物代謝及保證用藥安全，需要檢測受試者(動物或人）或 患者血清的NC08濃度或者需要檢測人抗NC08的抗體。在某些情況下，可能需要從現(xiàn)有產(chǎn) 品中檢測有無NC08的添加。因此，迫切需要一種能有效、快速檢測NC08和人抗NC08抗體 的廣品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明需要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種抗NCOS單克隆抗體，用于檢測 NC08濃度和人抗NC08抗體。
[0008] 本發(fā)明需要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種編碼上述抗NC08單克隆抗體的 DNA分子。
[0009] 本發(fā)明需要解決的第=個技術(shù)問題是提供一種表達載體。
[0010] 本發(fā)明需要解決的第四個技術(shù)問題是提供一種真核宿主細胞。
[0011] 本發(fā)明需要解決的第五個技術(shù)問題是提供一種該重組抗NC08單克隆抗體的制備 方法。
[0012] 本發(fā)明需要解決的第六個技術(shù)問題是提供上述單克隆抗體的兩種用途。
[0013] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明一方面提供了一種重組抗NC08單克隆抗體，該抗體 含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序 列，重鏈可變區(qū)具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。
[0014] 本發(fā)明另一方面提供了編碼上述單克隆抗體的DNA分子。
[0015] 在一個較佳的實例中，該DNA分子含有SEQIDN0:3所示的編碼所述單抗輕鏈可 變區(qū)的核巧酸序列，W及SEQIDN0:4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核巧酸序列。
[0016] 本發(fā)明第S方面提供了一種表達載體，該表達載體含有上述DNA分子。
[0017] 本發(fā)明第四方面提供了一種宿主細胞，其特征在于，它含有上述表達載體。在一個 較佳的實例中，該宿主細胞是CH0細胞。
[0018] 本發(fā)明第五方面提供了一種制備上述單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包 括： a) 構(gòu)建含有權(quán)利要求2所述DNA分子的表達載體； b) 用步驟a)所述的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞； C)培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細胞； d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
[0019] 本發(fā)明提供的抗體可W在體外檢測NC08的濃度和人抗NC08抗體，本發(fā)明第六方 面提供了一種利用本發(fā)明所述抗體檢測NC08濃度的方法。在一個較佳的實例中，檢測方法 為橋聯(lián)化ISA法。該抗體可用于制備檢測試劑或者檢測試劑盒。
[0020] 本發(fā)明設(shè)及一種重組抗NC08單克隆抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)， 輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:2所示的氨 基酸序列。
[0021] 本文所用的術(shù)語"單克隆抗體(單抗)"指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該 群體中包含的單個抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體高特 異性地針對單個抗原位點，而且，與常規(guī)多克隆抗體制劑(通常是具有針對不同決定簇的不 同抗體）不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗 體的好處還在于它們是通過基因工程手段合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語"單 克隆"表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，該不應(yīng)被解釋成需要用任何特 殊方法來生產(chǎn)抗體。
[0022] 本文所用的術(shù)語"抗體"和"免疫球蛋白"是有相同結(jié)構(gòu)特征的約150000道爾頓 的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈（L)和兩個相同的重鏈化）組成。每條輕鏈通過一 個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重 鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)（VH)，其后是多個恒定區(qū)。 每條輕鏈的一端有可變區(qū)（VU，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相 對，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形 成界面。
[0023]本文所用的術(shù)語"可變"表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形 成各種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個抗體 可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補決定區(qū)（CDR)或超變區(qū)中的=個片段 中?？勺儏^(qū)中較保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)（FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個 FR區(qū)，它們大致上呈0-折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的=個CDR相連，在某些情況下可形成 部分0折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR-起形 成了抗體的抗原結(jié)合部位。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的 效應(yīng)功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細胞毒性。
[0024] 單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來制得。例如，單克隆抗體可用 雜交瘤方法制得，或用重組DNA方法制得，也可從瞻菌體抗體庫中分離獲得。
[00巧]本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明重組抗NC08單克隆抗體的DNA分子。在一個較佳的 實例中，該DNA分子含有SEQIDN0:3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核巧酸序列，化及 SEQIDN0:4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核巧酸序列。
[0026]在獲得編碼本發(fā)明重組抗NC08單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核巧酸序 列后，通?？赏ㄟ^W下方法來制備本發(fā)明的單克隆抗體。
[0027]首先，提供含有編碼本發(fā)明單克隆抗體的核巧酸序列的表達載體。
[0028] 編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段來制得。 例如，可根據(jù)本發(fā)明公開的序列人工合成或用PCR法擴增得到編碼該單克隆抗體重鏈可變 區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核巧酸序列。然后，用本領(lǐng)域熟知的各種方法通過選擇合適的酶切位點 將該些核巧酸序列插入合適的表達載體中，使它們分別在表達載體所攜帶的重鏈恒定區(qū)編 碼序列和輕鏈恒定區(qū)編碼序列之前，并使它們在同一閱讀框內(nèi)。
[0029]本發(fā)明中所用的表達載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的各種市售的表達載體，例如購 自Qiagen和Promega公司的表達載體，W及可購得的表達載體pM冊(杭州安瑞普生物制品 研究有限公司）。
[0030] 隨后，用上述獲得的表達載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞。"宿主細胞"一般包括原核細 胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主 細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。在本發(fā)明中，較佳的宿主細胞是CH0細胞。
[0031] 用表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法有很多種，所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿 主。將異源多核巧酸導(dǎo)入哺乳動物細胞中的方法是本領(lǐng)域所知的，其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 染、磯酸巧沉淀、？〇1713'6]16 (1，5-二甲基-1，5-二氮^ 亞甲基聚甲漠化物)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原 生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染W(wǎng)及將DNA直接顯微注射到胞核中。在本發(fā)明中，較 佳的方法是電穿孔法或脂質(zhì)體介導(dǎo)法等。
[0032] 然后，在適合本發(fā)明單克隆抗體表達的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細胞。用常規(guī) 的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Se地arose,哲基磯灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換 層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化 得到本發(fā)明的重組抗NC08單克隆抗體。
[0033] 所得單克隆抗體可用常規(guī)手段來鑒定。單克隆抗體的結(jié)合特異性可用免疫沉淀或 體外結(jié)合試驗，如放射性免疫測定巧IA)或酶聯(lián)免疫吸附測定巧LISA)來測定。單克隆抗 體的結(jié)合親和力例如可用Scatchard分析方法來測定。
[0034] 本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明的單克隆抗體用于檢測NC08具有特異性強、靈敏度高 的優(yōu)點，能在NC08進行臨床前研究及臨床研究的過程中，W及將來成為藥物后患者應(yīng)用的 過程中，快速、準確檢測受試者(動物或人）或患者的血清NC08濃度；還可用于檢測人抗 NC08抗體；在某些情況下，還可用于從現(xiàn)有產(chǎn)品中檢測有無NC08的添加。
【附圖說明】
[003引 圖1 ;還原SDS-PAGE電泳檢測NC08F(ab'）2純度，泳道1為制備所得NC08F(油'）2,泳道2為NC08。
[0036] 圖2 ;載體pM冊-L，并且標明了其中的元件及酶切位點，其中，15G9-L為輕鏈基因； polyA為多聚腺巧化信號；AmpR為氨節(jié)青霉素抗性基因。
[0037] 圖3;載體pM冊-H，并且標明了其中的元件及酶切位點，其中，15G9-H為重鏈基因， polyA為多聚腺巧化信號；AmpR為氨節(jié)青霉素抗性基因。
[003引 圖4 ;NC08濃度-0D值擬合曲線。
【具體實施方式】
[0039] 下面將結(jié)合實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉該些實施例只 是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明。
[0040] 實施例中未標明來源的實驗試劑