本發(fā)明屬于植物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及功能連鎖標記0707-1及其在玉米種質(zhì)改良中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

優(yōu)質(zhì)蛋白玉米(qualityproteinmaize，qpm)是高賴氨酸玉米，營養(yǎng)價值堪與牛奶媲美，產(chǎn)量接近甚至部分品種超過普通玉米，大大改善了南美、非洲和亞洲等一些以玉米為主食的發(fā)展中國家人群因缺乏賴氨酸、色氨酸引起的營養(yǎng)不良癥。培育優(yōu)質(zhì)蛋白玉米，將極大的改善玉米籽粒的品質(zhì)效益，綜合提高農(nóng)民的收益。然而優(yōu)質(zhì)蛋白玉米是以熱帶種質(zhì)資源為背景進行的改良，在熱帶地區(qū)表現(xiàn)為良好的硬質(zhì)胚乳籽粒。引進中國后，熱帶種質(zhì)往往表現(xiàn)為生育期延遲、籽粒軟質(zhì)或半軟質(zhì)，不耐儲藏和感病等較差農(nóng)藝性狀，需要將熱帶種質(zhì)中的修飾因子轉(zhuǎn)到溫帶種質(zhì)的骨干自交系中，然而由于修飾基因及其互作的調(diào)控因子遺傳調(diào)控機理復(fù)雜，導(dǎo)致這個轉(zhuǎn)化過程很漫長，而且最后得到的很多轉(zhuǎn)化系還不是全硬質(zhì)胚乳，農(nóng)藝表現(xiàn)不如全硬質(zhì)胚乳。中國地域和氣候差別很大，經(jīng)過千辛萬苦育成的優(yōu)質(zhì)蛋白玉米品種的適宜區(qū)域非常有限，很難大范圍推廣，大大制約了優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的發(fā)展。因此，深入解析優(yōu)質(zhì)蛋白玉米胚乳發(fā)育過程中的調(diào)控因子及修飾機理，將大大加快其分子育種效率，為農(nóng)民帶來巨大的經(jīng)濟效益。

成熟的玉米粒中，胚和胚乳是基本的組成部分，分別占8％～10％(胚)和80％～85％(胚乳)，因此玉米籽粒中80％左右的蛋白質(zhì)是由胚乳提供的。胚乳作為主要的營養(yǎng)儲存器官，大部分儲存物質(zhì)是以淀粉粒和蛋白體的形式儲藏在胚乳中，通常二者分別占胚乳干重的70％和10％。而玉米種子中的儲存蛋白根據(jù)不同的溶解性分為清蛋白(albumin，水溶，3％)，球蛋白(globulin，鹽溶，3％)，谷蛋白(glutelin，堿溶，34％)和醇溶蛋白(prolamin，醇溶，60％)。因此提高玉米籽粒所缺少的氨基酸含量，其關(guān)鍵核心在于提高胚乳中醇溶蛋 白的含量。

玉米醇溶蛋白(zein)基因家族是一個大家族，分為α(19-和22-kd)、β(15-kd)、γ(50-，27-和16-kd)和δ(18-和10-kd)四個亞家族。自b73基因組序列公布以后，前人利用已有的序列信息進行基因組bac序列比對后發(fā)現(xiàn)，在玉米醇溶蛋白基因家族中19-kda和22-kda的α-zein亞家族基因分別有26和16個拷貝(copynumber)，其它分子量的zein基因均為單拷貝。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，各亞家族的蛋白質(zhì)之間在蛋白序列水平上并沒有序列保守性，只是異源醇溶蛋白混合物的總稱，但是它們翻譯后都定位于胚乳細胞粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔，有序地包裝形成蛋白體(proteinbody，pb)，是胚乳品質(zhì)(軟質(zhì)或硬質(zhì))最主要的影響因素之一。與此同時，研究人員已發(fā)現(xiàn)醇溶(zein)蛋白合成后儲存于蛋白體中，不同zein亞家族蛋白在蛋白體中的空間排列高度有序：γ-和β-zein定位在蛋白體的外周區(qū)域，而α-和δ-zein定位在中央?yún)^(qū)域。任何破壞這種嚴格空間排列結(jié)構(gòu)的突變體都會導(dǎo)致蛋白體變形形成軟質(zhì)胚乳。

優(yōu)質(zhì)蛋白玉米(qualityproteinmaize，qpm)到目前為止已經(jīng)研究了半個多世紀，在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的促進作用，但是由于o2突變體籽粒是軟質(zhì)胚乳，千粒重及抗病性較差，很難實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。在qpm玉米中，zein蛋白含量下降了60％，而non-zein互補性地上升，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)組的平衡的同時，也極大的提高了賴氨酸含量。與此同時，前人的研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)蛋白玉米中27-kdγ-zein的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平是普通野生型和普通o2突變體玉米的2-3倍；在優(yōu)質(zhì)蛋白玉米和普通o2突變體的f2群體中，胚乳的修飾程度和27-kdγ-zein的表達水平正相關(guān)。

然而，優(yōu)質(zhì)蛋白玉米胚乳修飾因子究竟是什么？它的作用機理是怎樣的？這些至今仍然是困擾玉米育種者和遺傳學(xué)家的難題，給農(nóng)業(yè)上篩選優(yōu)質(zhì)蛋白玉米造成阻礙。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供功能連鎖標記0707-1及其在玉米種質(zhì)改良中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種鑒定優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的方法，所述方法包 括：對待測玉米進行檢測，確定該玉米中是否存在27-kdγ-zein的主效修飾因子，若是存在則表明該待測玉米是優(yōu)質(zhì)蛋白玉米；其中，所述的27-kdγ-zein的主效修飾因子與seqidno:1(464bp)所示的多核苷酸(或其互補鏈)完全連鎖。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的方法還包括：確定該玉米中是否存在核苷酸序列如seqidno:2(2070bp)所示的多核苷酸(或其互補鏈)；若是同時存在seqidno:1和seqidno:2所示的多核苷酸(或它們的互補鏈)，則表明該待測玉米是優(yōu)質(zhì)蛋白玉米。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，對待測玉米進行檢測的方法包括：基因測序方法；或pcr擴增方法；或southern雜交方法。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的方法是pcr擴增方法，包括：以待測玉米基因組為模板，以特異性擴增seqidno:1或其片段和seqidno:2所示的多核苷酸或其片段(seqidno:2特有的片段)的引物來擴增，若同時獲得針對該兩條序列的擴增產(chǎn)物，則表明該待測玉米是優(yōu)質(zhì)蛋白玉米。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的特異性擴增seqidno:1或其特有片段和seqidno:2所示的多核苷酸或其特有片段的引物是seqidno:3和seqidno:4所示序列的引物。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸包括：

(1)核苷酸序列如seqidno:1所示的多核苷酸；或

(2)與(1)的多核苷酸特異性互補(或結(jié)合)的多核苷酸。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸還包括：

(3)核苷酸序列如seqidno:2所示的多核苷酸；或

(2)與(3)的多核苷酸特異性互補(或結(jié)合)的多核苷酸。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的與(1)的多核苷酸特異性互補的多核苷酸是引物對，所述引物對的擴增產(chǎn)物包括seqidno:1所示的多核苷酸。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的引物對是seqidno:3和seqidno:4所示序列的引物對。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于鑒定優(yōu)質(zhì)蛋白 玉米。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于鑒定優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的試劑盒，所述的試劑盒中包含特異性識別核苷酸序列如seqidno:1所示的多核苷酸的試劑。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包含特異性識別seqidno:2所示的多核苷酸的試劑。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中包含：seqidno:3和seqidno:4所示序列的引物對。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1a、sds-page檢測普通玉米自交系中27-kdγ-zein蛋白表達差異。

圖1b、sds-page檢測ibmsyn10群體單株27kd蛋白表達差異，b為b73，m為mo17。

圖2、sds-page檢測27-kdγ-zein蛋白表達情況，其表達量表現(xiàn)為顯著的劑量效應(yīng)。

k0326y：k0326y純合自交系；

k0326y×b73：k0326y為母本，b73為父本；

b73×k0326y：b73為母本，k0326y為父本；

b73：b73純合自交系。

圖3、不同自交系中27-kdaγ-zeingene表達計算。

a：sds-page分析b73及xf134自交系。

b：xf134和b73測序27kd基因。xf134中序列為：ccgccgccaccatgccactac(seqidno:5)；b73中序列為：ccgccgccggttcatctgccgccgccaccatgccactac(seqidno:6)。

c：xf134與b73、k0326y和mo17雜交cdna測序單克隆片段統(tǒng)計。

圖4a、sds-page分析自然群體自交系中27-kdγ-zein蛋白表達量。

圖4b、sds-page分析ibm單倍體群體中27-kdγ-zein蛋白表達量。

圖5、gwas關(guān)聯(lián)分析27-kdγ-zein蛋白修飾因子。

圖6、qtl連鎖分析27-kdγ-zein蛋白修飾因子。

圖7a-f、27-kdγ-zein蛋白修飾因子染色體精細定位和克隆。

圖8、mo17和b73定位區(qū)間的基因組比對差異。

a：mo17和b73測序基因組比對。

b：差異區(qū)間mo17詳細注釋，其中復(fù)制區(qū)間表示為紅色(且以虛線框標示)，1，2，3和4分別代表27-kdaγ-zeingene，grmzm2g565441，grmzm2g138976和grmzm5g873335。位于基因2和3部分區(qū)域中的綠色箭頭標線及黑色箭頭標線代表復(fù)制區(qū)間設(shè)計的多態(tài)性功能連鎖標記0707-1(464bp或2070bp)。

圖9、功能性標記0707-1標記驗證36份qpm自交系。

a：sds-page分析各自交系中27-kdγ-zein蛋白表達情況。

b：pcr分析各自交系中多態(tài)性功能連鎖標記0707-1的存在情況。

圖10、功能性標記0707-1標記驗證近等基因系cm105、cm105o2及cm105mo2。

a：sds-page分析cm105、cm105o2及cm105mo2中27-kdγ-zein蛋白表達情況。

b：pcr分析cm105、cm105o2及cm105mo2中多態(tài)性功能連鎖標記0707-1的存在情況。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，首次在定位到27-kdγ-zein的主效修飾因子1個，其位于7號染色體120mb附近的一個100kb范圍內(nèi)，進一步研究確認這個修飾因子為27-kdγ-zein基因的一個多拷貝。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人確立了鑒定該多拷貝基因的分子標記物以及鑒定方法，從而為鑒定優(yōu)質(zhì)蛋白玉米提供了有效的途徑。

如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。

如本文所用，“特有片段”是指僅存在于seqidno:1所示序列中的序列片段，或僅存在于seqidno:2所示序列中的序列片段，而在基因組的其它序列中不存在該“特有片段”。

27-kdγ-zein主效修飾因子

本領(lǐng)域已經(jīng)證實，27-kdγ-zein表達上調(diào)是優(yōu)質(zhì)蛋白玉米胚乳修飾必需的，但是這個基因本身不是修飾因子，而是一個修飾因子的效應(yīng)子，因為優(yōu)質(zhì)蛋白玉米和普通野生型及普通o2突變體的27-kdγ-zein基因序列并無差異，所以調(diào)控27-kdγ-zein表達上調(diào)的因子才應(yīng)該是修飾因子。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，mo17的27-kdγ-zein表達比b73顯著高出約1倍，因此本發(fā)明人預(yù)期mo17可能含有部分調(diào)控27-kdγ-zein的修飾因子(圖1)。

基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，所述的27-kdγ-zein主效修飾因子可被應(yīng)用于作為玉米良種選擇的分子標記。因此，本發(fā)明提供了所述的27-kdγ-zein的主效修飾因子的新用途，用于鑒定優(yōu)質(zhì)蛋白玉米?？梢詫Υ郎y玉米進行檢測，確定該玉米中是否存在本發(fā)明新發(fā)現(xiàn)的27-kdγ-zein主效修飾因子；若是存在該修飾因子，則表明該待測玉米是優(yōu)質(zhì)蛋白玉米。

功能連鎖標記及其用途

雖然確定了本發(fā)明所述的27-kdγ-zein主效修飾因子，但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該27-kdγ-zein主效修飾因子為27-kdγ-zein基因的一個多拷貝。若是采用小區(qū)域內(nèi)基因測序方法(非全基因組測序或大區(qū)段測序)，雙拷貝的27-kdγ-zein在序列上不易于與單拷貝的27-kdγ-zein基因有效地區(qū)分；采用pcr方法也無法實現(xiàn)區(qū)分。

因此，還需進一步尋找可以鑒定所述的27-kdγ-zein主效修飾因子存在與否的簡單、方便的方法。經(jīng)過深入研究后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了所述27-kdγ-zein主效修飾因子附近存在一段與該因子完全連鎖的區(qū)段，即seqidno:1(464bp)所示的多核苷酸。該區(qū)段僅在存在27-kdγ-zein主效修飾因子的玉米基因組中存在，因此可以作為27-kdγ-zein主效修飾因子的功能連鎖標記，通過鑒定該區(qū)段的存在與否來準確地確定27-kdγ-zein主效修飾因子存在與否，若存在seqidno:1(464bp)所示的多核苷酸，表明27-kdγ-zein主效修飾因子存在。

此外，本發(fā)明還提供了另一段功能連鎖標記，即seqidno:2(2070bp)所示的多核苷酸。該段功能連鎖標記不存在于所述27-kdγ-zein主效修飾因子上，但存在于原27-kdγ-zein基因上(見圖8)。通過鑒定該區(qū)段的存在與否來準確地確定27-kdγ-zein主效修飾因子存在與否，若同時存在seqidno:2(2070bp)所示的多核苷酸以及seqidno:1(464bp)所示的多核苷酸，表明27-kdγ-zein主效修飾因子存在。

基于本發(fā)明的上述新發(fā)現(xiàn)，提供一種分離的多核苷酸，包括：

(1)具有seqidno:1所示的核苷酸序列的多核苷酸；

(2)具有seqidno:2所示的核苷酸序列的多核苷酸。

上述的兩條多核苷酸來自于玉米基因組中，但是在玉米的不同品種中，其基因組中相應(yīng)于seqidno:1或seqidno:2所示的多核苷酸可能存在少數(shù)或極少數(shù)核苷酸位點上的變化。因此，本發(fā)明還涉及seqidno:1或seqidno:2所示的多核苷酸的變異體，多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。具體地，本發(fā)明也包括以下多核苷酸：

(3)核苷酸序列在嚴格條件下能夠與(1)或(2)限定的核苷酸序列雜交的多核苷酸；

(4)與(1)限定的核苷酸序列有90％以上，優(yōu)選95％以上，更優(yōu)選98％以上，最優(yōu)選99％以上相同性的核苷酸序列；或(5)與(1)-(4)任一限定的核苷酸序列互補(優(yōu)選完全互補)的核苷酸序列。

本發(fā)明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna可以是單鏈的或是雙鏈的。

本發(fā)明還涉及與seqidno:1或seqidno:2可雜交的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與所述的多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指：(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等。

鑒定植物基因組中是否存在seqidno:1或seqidno:2的多核苷酸可以采用本領(lǐng)域已知的多種方法，包括但不限于：基因測序方法，聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)方法，southern交方法，特定的限制性內(nèi)切酶酶切方法等。在本發(fā)明揭示的內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠方便地確定所應(yīng)用的方法，實現(xiàn)鑒定玉米的目的。因此，這些方法均應(yīng)被包含在本發(fā)明中。

功能連鎖標記的檢測方法及試劑

本發(fā)明還提供了特異性識別核苷酸序列如seqidno:1所示的多核苷酸的試劑，以及特異性識別核苷酸序列如seqidno:2所示的多核苷酸的試劑。所述的試劑可應(yīng)用于鑒定為優(yōu)質(zhì)蛋白玉米。所述的試劑可以是引物。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，通過設(shè)計特異性擴增所述多核苷酸的引物，以待測玉米的基因組為模板，若能擴增獲得所述的多核苷酸，則表明該植物是優(yōu)質(zhì)蛋白玉米品種。作為更優(yōu)選的方式，所述的引物是seqidno:3和seqidno:4所示序列的引物。應(yīng)理解，基于本發(fā)明提供的序列信息，可以設(shè)計更多的候選引物用于鑒定，這也應(yīng)被包含在本發(fā)明中。

在本發(fā)明的具體實施例中，通過pcr擴增方法，以待測玉米的基因組為模板，以seqidno:3和seqidno:4為引物，進行擴增。并且，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測，產(chǎn)生兩條條帶的表示待測玉米的基因組中同時存在seqidno:1和seqidno:2的序列，也即存在所述的27-kdγ-zein主效修飾因子，鑒定為優(yōu)質(zhì)蛋白玉米；僅存在對應(yīng)于seqidno:2的序列的一個條 帶的，鑒定為非優(yōu)質(zhì)蛋白玉米。

特異性識別核苷酸序列如seqidno:1所示的多核苷酸的試劑，以及特異性識別核苷酸序列如seqidno:2所示的多核苷酸的試劑可被包含在包裝中，制備成用于鑒定優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的試劑盒。

所述的試劑盒中，除了包含本發(fā)明的用于識別多核苷酸的試劑，還可包含其他用于蛋白或基因鑒定的試劑，例如(但不限于)：pcr擴增試劑，免疫印跡試劑，電泳試劑等等。此外，還可包括：使用說明書，序列分析軟件。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

材料和方法

1、植物材料

收集溫帶自交系、38份優(yōu)質(zhì)蛋白玉米自交系(qpm自交系)及280份ibmsyn10單倍體自交系，分別來源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)和美國內(nèi)布拉斯加大學(xué)林肯分校。

三份近等基因cm105、cm105o2和cm105mo2及非洲優(yōu)質(zhì)蛋白玉米自交系k0326y來源于美國內(nèi)布拉斯加大學(xué)林肯分校。

全部遺傳材料于2013年11月海南三亞播種自交繁殖。

2、醇溶蛋白提取及27-kdγ-zein表型鑒定

在提取每一份自交系醇溶蛋白時，為了提高樣品的準確度和代表性，本發(fā)明人將收獲晾曬后的玉米種子混合20粒，利用咖啡研磨機(electricgrinder)研磨4-5次，3-5分鐘后稱重100mg的磨粉樣品用作醇溶蛋白提取。稱重后，將100mg粉末加入至1毫升醇溶蛋白提取液中(70％酒精，2％巰基乙醇，v/v，3.75mm四硼酸鈉(ph10)，0.3％sds)，室溫靜置2小時后13000rpm離心20分鐘(eppendorf)，提取100微升上清液至一個新的1.5毫升離心管中，加入10 微升10％sds，混合均勻后在45℃，val模式下(eppendorf)抽真空70分鐘后用100微升雙蒸水溶解備用。最后吸取2微升醇溶蛋白提取液混合8微升蛋白加樣緩沖液至sds-page(15％)膠中檢測，以b73和mo17為標準樣品，與b73表達相同的記為1，與mo17表達相同的記為2構(gòu)建表型數(shù)據(jù)庫。

3、rna提取和純化

取50～100mg的不同時期胚乳組織，加入350μl去蛋白溶液和200μl氯仿。鋼珠打碎。取上清，再加200μl氯仿重復(fù)一次。取200μl上清，加入1mltrizol試劑，振蕩混勻室溫放置5min。加入200μl上清氯仿，混勻冰上5min。12000rpm，4℃離心15min。取400μl上清液小心轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，加入等量體積的異丙醇，上下顛倒幾次混勻，室溫下放置15min。再12000rpm，4℃離心15min。小心移去上清液，防止rna沉淀丟失。再用depc水配制70％乙醇洗滌1次，12000rpm，4℃離心5min。盡量徹底地吸走上清，將rna放在室溫，待乙醇完全揮發(fā)掉。最后沉淀用20μldepc水溶解。

4、cdna合成

cdna合成使用superscriptiiifirst-standsynthesis試劑盒(lifescience)。在rnase-free的無菌離心管中將2μgrna與1μloligo(dt)和1μldntpmixture混勻，用水補齊到10μl，置于65℃水浴5分鐘。迅速取出，冰浴1分鐘。加入以下組分并混勻：10×reactionbuffer2μl；25mmmgcl24μl；0.1mdtt2μl；rnaseout1μl和1μlsuperscriptiiirt。將離心管輕輕混勻，快離后放置于50℃水浴鍋中50分鐘，最后置于85℃5分鐘使反轉(zhuǎn)錄酶失活后備用。

5、關(guān)聯(lián)分析

本發(fā)明人使用gapit軟件(版本：2.22)中的壓縮混合線性模型(pca群體結(jié)構(gòu)+kinship親緣關(guān)系)來進行g(shù)was的分析。kinship矩陣通過軟件emmax-kin(版本：beta-07mar2010)來計算，參數(shù)為-v-h-s-d10。pca的計算使用gcta軟件(版本：gcta64)，分為兩步：

第一，估計遺傳關(guān)系矩陣，參數(shù)為--autosome-num10--autosome--make-grm。

第二，將遺傳關(guān)系矩陣放到pca計算模塊，輸出特征值和特征向量，參數(shù)為：--grm-pca20。特征值最大的3個特征向量用于gwas的分析。

6、ibmsyn10群體基因分型和binmap的構(gòu)建

對于每一個群體的自交系而言，測序方法和snp檢測方法與親本方法相同，首先將去除標簽序列(7bp)的83bp的群體重測序read利用soapaligner，version2.21(soap2)比對到親本參考基因組上，結(jié)合已經(jīng)檢測到的親本間的snp物理坐標信息，得到群體測序片段的snp基因分型信息。其中檢測過程中，短序列比對只允許存在1bp的不匹配(mismatch)且質(zhì)量值≥5?；谟H本間和群體間的snp信息，即可得到此位點群體snp的基因分型數(shù)據(jù)(laietal.2010)。

binmap的構(gòu)建過程中，本發(fā)明人使用一個15snp滑動窗口步移的策略來檢測玉米自交系間的重組斷點，首先定義在一個子代連續(xù)的15個snp中，當遺傳自雙親的snp比值接近7:8(或8:7)時，這個位點即為一個重組斷點。在ibmsyn10群體中，由于采用染色體加倍的單倍體技術(shù)，本發(fā)明人檢測到的重組斷點都是純合基因型。檢測280份自交系的全部重組斷點后，本發(fā)明人以100kb為一個區(qū)間進行全基因組基因型劃分，同一基因型的snp標記利用perl腳本整合為一個擬合的染色體區(qū)段標記(binmarker)，最后，將全部280份群體自交系的bin標記整合為一個綜合的binmap遺傳圖譜。

最終，本發(fā)明人在280份群體自交系中利用perl腳本整合6618個bin標記，并利用joinmap4.1和mstmap組合構(gòu)建高密度的遺傳圖譜。首先利用joinmap4.1進行6,618個標記的兩點最大似然遺傳距離分析，得到全部標記的遺傳分群信息；然后利用mstmap軟件中的kosambimap功能進行每個分群內(nèi)的標記初步排序，最后利用joinmap4.1進行排序后的標記的遺傳重組率和遺傳距離的精細計算，進而構(gòu)建280份群體自交系的6,618個標記的高密度遺傳連鎖圖譜。

7、qtl作圖及分析

由于自交系表型數(shù)據(jù)的限制，本發(fā)明人選取194株ibmsyn10子代進行qtl分析，重新構(gòu)建了194份自交系材料的binmap遺傳圖譜，利用qtl cartographerunixversion1.17f軟件進行qtl分析(wangetal.2005)。利用復(fù)合區(qū)間作圖法(compositeintervalmapping)，對ibmsyn4和ibmsyn10群體進行玉米株高和開花期的qtl分析。運行參數(shù)均為默認值，qtl檢測lod閾值設(shè)置為2.5，qtl置信區(qū)間為lod值從峰值下降2對應(yīng)的區(qū)間，同時計算每個qtl對表型的貢獻率和加性效應(yīng)。其中ibmsyn4的1,339個標記的基因型數(shù)據(jù)由http://www.maizegdb.org/ancillary/qtl/ibm302cross.inp.獲取。

8、精細定位和克隆27-kdγ-zein調(diào)控因子

通過連鎖和關(guān)聯(lián)分析，本發(fā)明人首先將27-kdγ-zein調(diào)控因子定位于7號染色體129mb附近1mb左右的區(qū)間內(nèi)，然后構(gòu)建(mo17xb73)xb73回交群體收獲6912個籽粒。每個籽粒首先被切出2份，一個用來提取dna，一份用來提取醇溶蛋白，結(jié)合染色體步移的方法將調(diào)控因子定位在標記0916-2和ch7-120.35間100kb左右的范圍。

9、mo17自交系bac測序pacbio文庫構(gòu)建及測序

取5μg樣本dna，利用(covaris，美國)將dna打斷至10kb。片段化后的dna，用smrtbell^tmtemplateprepkit(pacbio，美國)構(gòu)建文庫：加入0.45倍體積beads(beckman，美國)進行純化，得到37ul溶解于elutionbuffer的sheareddna；隨后依次加入dnadamagerepairbuffer、nad+、atphigh、dntp和dnadamagerepairmix，37℃反應(yīng)20min，快速回到4℃，加入endrepairmix，25℃反應(yīng)5min，回到4℃；加入0.45倍體積beads進行純化，得到30ulend-repaireddna；隨后加入annealedbluntadapter(20μm)、templateprepbuffer、atplow和ligase，25℃反應(yīng)15min，65℃反應(yīng)10min，回到4℃；隨后加入exoiii和exovii，37℃反應(yīng)1hour，用0.45倍體積beads進行兩次純化，即可得到供測序的smrtbelltemplates。構(gòu)建好的smrtbelltemplates利用pacbiodna/polymerasekit，退火測序引物并將polymerase結(jié)合到smrtbelltemplates上，隨后在pacbiorsii平臺上進行測序反應(yīng)。

10、southernblotting雜交

用ctab法提取玉米植株的葉片基因組dna。用限制性內(nèi)切酶(ecori)對40μg基因組dna進行酶切，在0.7％的瓊脂糖凝膠中進行條帶分離并轉(zhuǎn)印于尼龍膜(gehealthcare)。最終用north2southchemiluminescenthybridizationanddetectionkit(thermo)對目標片段的雜交信號進行分析。雜交所用標記探針片段為用27kd基因片段。

實施例1、27-kdγ-zein蛋白修飾因子的劑量效應(yīng)

玉米胚乳在受精過程中，其胚乳的基因型中有2份來源于母本，1份來源于父本，因此本發(fā)明利用k0326y(一份來源于非洲的優(yōu)質(zhì)蛋白玉米，含有27-kdγ-zein修飾因子)與常規(guī)玉米自交系b73(不含有27-kdγ-zein修飾因子)設(shè)計正反交實驗，來檢測其27-kdγ-zein修飾因子的遺傳表達模式。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純合自交系k0326y胚乳中27-kdγ-zein修飾因子為3份劑量表達量最高，隨后k0326y為母本(2份劑量)b73為父本(0份劑量)表達降低，然后以b73為母本(0份劑量)k0326y為父本(1份劑量)依次降低，最后b73純合自交系(0份劑量)表達量最低，如圖2。

實施例2、27-kdγ-zein蛋白修飾因子為順式作用元件

修飾因子包括順式或者反式作用元件，其中順式作用元件指同一dna分子中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的特異dna序列。包括啟動子、增強子等。反式作用因子指能直接或間接地識別或結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)，多為轉(zhuǎn)錄因子。

為了驗證27-kdγ-zein修飾因子的作用模式，本發(fā)明人在數(shù)百份普通玉米自交系中發(fā)現(xiàn)了一份特殊的自交系xf134，其27kd基因編碼序列與大多數(shù)普通自交系存在18bp的差異(圖3b)，因此其編碼的蛋白序列與普通自交系存在長度的多態(tài)性(圖3a)。因此利用xf134與b73和k0327y進行雜交后提取授粉18天的籽粒胚乳，反轉(zhuǎn)錄cdna測序27kd基因，通過統(tǒng)計方法計算屬于xf134和b73、k0327y的27kd序列，可以計算出其表達量，進而證明其順式或者反式作用元件(圖3c)。

統(tǒng)計結(jié)果最后證明，27-kdγ-zein蛋白修飾因子為順式作用元件(圖3c)。

實施例3、27-kdγ-zein蛋白修飾因子關(guān)聯(lián)和連鎖群體構(gòu)建

通過收集來源于熱帶和溫帶的多態(tài)性種質(zhì)資源，可以通過gwas和qtl定位的方法進行27-kdγ-zein修飾因子的定位分析。最終，本發(fā)明人收集了492份玉米自交系及280份ibmsyn10單倍體群體進行分析，其27-kdγ-zein基因表達量存在顯著的差異，部分結(jié)果如圖4a，4b。

實施例4、27-kdγ-zein蛋白修飾因子關(guān)聯(lián)和連鎖分析

利用構(gòu)建好的gwas關(guān)聯(lián)群體和ibmsyn10單倍體群體，結(jié)合二代測序技術(shù)和binmap基因分型技術(shù)，進行g(shù)was和qtl定位分析。

最終，在7號染色體120mb坐標定位到27-kdγ-zein主效修飾因子1個，如圖5和圖6。

實施例5、克隆27-kdγ-zein蛋白修飾因子

在gwas和qtl定位的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人構(gòu)建(b73xmo17)xb73bc1f1回交群體，獲得的每一個籽粒分為2份，1份用來提取dna，另外一份用來提取醇溶蛋白，進而利用染色體步移的方法進行基因精細定位和克隆。

最終，本發(fā)明人將27-kdγ-zein修飾因子鎖定在7號染色體120mb附近的一個100kb范圍內(nèi)，如圖7。

實施例6、候選27-kdγ-zein蛋白修飾因子區(qū)間bac庫測序

三代測序技術(shù)具有較長的讀長，gc偏好性較低的優(yōu)點，可以很好的對質(zhì)粒bac測序，在保障高覆蓋率(500x)的前提下，可以高效的降低測序過程中產(chǎn)生的隨機誤差，對基因組組裝和基因組變異進行檢測。據(jù)此，本發(fā)明利用三代單堿基測序技術(shù)對玉米自交系s-mo17^rf3rf3(在mo17自交系中轉(zhuǎn)入一個雄性不育基因)測序，挑選到候選區(qū)間2個陽性單克隆bac432和bac378，每一個序列覆蓋率5000x以上，同時結(jié)合二代測序數(shù)據(jù)獲得的mo17scaffold4130數(shù)據(jù)，分析mo17與b73在這100kb區(qū)間內(nèi)的基因組差異(圖8)，最終確認這個修飾因子為27-kdγ-zein基因的一個多拷貝。其中bac432、bac378和scaffold4130提交ncbi序列號為ku593569和ku593570。

實施例7、功能性標記0707-1的建立

如圖8b所示，紅色復(fù)制區(qū)間(虛線框標示處)為mo17相對b73基因組多余的拷貝，經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn)1號基因(27-kdaγ-zeingene)序列間無任何差異。

由于基因拷貝數(shù)較難通過pcr等手段測得，因此，雖然確定了修飾因子為27-kdγ-zein基因的一個多拷貝，仍然難以對玉米進行有效地測定以確定玉米中存在27-kdγ-zein基因的拷貝數(shù)、進而確定玉米的品質(zhì)。

為了區(qū)分出多余的拷貝(紅色區(qū)間)與普通自交系的差異，本發(fā)明人深入研究后發(fā)現(xiàn)，2，3號基因間存在序列多態(tài)性。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人確定了功能性多態(tài)性標記0707-1，該標記擴增產(chǎn)物seqidno:1(464bp)和seqidno:2(2070bp)，該標記與所發(fā)現(xiàn)的多一個拷貝的27-kdγ-zein基因完全連鎖，而在不具有多拷貝27-kdγ-zein基因的玉米的基因組中則只有seqidno:2(2070bp)擴增產(chǎn)物。因此，該多態(tài)性標記0707-1可應(yīng)用于進行27-kdaγ-zein基因單拷貝還是多拷貝的區(qū)分。

以0707-1f和0707-1r為引物，如果存在這一復(fù)制區(qū)間，則0707-1多態(tài)性標記pcr產(chǎn)物為2070bp和464bp兩個片段，如果不存在復(fù)制區(qū)間，則0707-1多態(tài)性標記pcr產(chǎn)物只有2070bp這一條片段。

>0707-1(464bp)

taaaggccagccatattctaaaaaattaaaaaaataaaaaatataatttgtagcctttaaacggttaaaaactagctaacatgatatatgtatatagattagaatatgtcatgtcgctaaagtcagcaactatcgacctaaccgaccgtctaacacgttggctccaacaattaccagcgatcggtatctaattatatgtcatacagtcattctgtttgttgcggtatggttacgcatctttgaaaaaacttgacccttccagtttatgccattacccacataaaatccacctcgagacaccacctaaaagtaaagaaaacatttatcaggaaacagattgataatacatgtcactagaccttagttctcgtaagtaaactagtgcaaagaattacctctttgtacaggttataaagatcaaggcgcttggcgttaaggattgcatcaggaaattcagctagtcc(seqidno:1)

>0707-1(2070bp)

taaaggccagccatattctaaaaatttaaaaaaaataaaaaaattattttttagcctttaaacggttaaaaactagctaacatgatatatgtatatagattagaatatgtcatgtcgctaaagtcagcaattatcgacctaaccgaccgtctaacaattaccagcgatcggtatctaattacctcttgttcaaccatcgccggctccaacataatggataccgatccaccggtcagcaagcccaccaatcaacaagccaacgttgacaccggatcgccggtccgaccgcatcagtcggtatccggcaacgattactactatgcaaacagtctataggtacaactaggtaagcgtgtccattggtctcttagatagatctaaccgtagatgcaattgtcatttgttaggggaatttttataaagccatacgagatgacagtgaaagagtttaagtgctaaatatgatctacagtgaaccaaaaactcgcttacacgcttgcacctaatagttgtttgta tagtaattgttgccatcggtatctaccgaacaagtcttaggtctatttggttggaatgtgactataaaaaaaattactataaattgtgagttgttaaaaacataaaaattgtttagtggaaatcactaaaagttgctaaaaattcttccatatatatttttacatagttacatttaaaagccgctaaaaacatgttcagatgtgctttcagttttatactgcaagaaaatcggcttttagatgaagaaaaaaaatgcttactaattccaaccgtttggtttgacttttgatttttagagacaaaagccgataaaagcaggtttagaggtgctttcagttttacactgcgagtaagtcaacttctagggaaagttgtttcctatatacaactgtttggtttgactttttggagaaaaagtcaaagccaaaaatcaaaccaaacacacacttgacactgttagatatgatctcttaaaccatatccagcaattcactattgactgcactatttgtatagtggagttcgaatatgaagataagtacgatgacgaagatagtcatactcttagttcaattatatccaatgccccgatgcattacaatttggtccgcaagtcacatgaaaaagagaagcattattgcgccagcagcttcagggcctcacacttccgtgctgttgcatcaaatgtttgattgatccagacaagggaaactaaaaacacaattgagattaatataaacaagaagcttacaccagcatctaaccaactactgtaggagcttgtctgtgttatcagttgttacatgttatataagcctcataataaccactaaattaacgagatgatacattcgaagactactacatacctggaaggccttgcccatctttccatcagcctattatctactctaatgattcttcccataaacatgggaccaaaggaaaagaaaaaaaaaacaagaaaattaagcatttcgtggtacagatgctgtatttgaaaaaccgttagctgcttttggtggtggtggcttcttcttgtagtttgctaagctacagtgggggcagatgtattccaaaccatctgtcttagcgtaatcctgcaagtaaagcacatgatggcatcaagtaactgatttccggcaagggtgagatcaacacaacccatcttcttgtttaccttgaaagtgcctagtccttgtcgtctgtcgcaaccaaagtgagcccattcaccacataaaccgcagttcacccaatctccaggtgcgctactgaaattacataaaaggagctgttagatattaacatgatattagtatttaggcagagatttgaaggaagatgccctcaaacctgtgacaaagtaagcagcattcgccatccacgtcatcatgcgccaactcatattccaacaagtatgtctcgtaatgtcttttcaatgtgttacctacaccctaaatatatacagagaagtgcacagaattagaacatcgcatttagcaggaccagaaaatcaagtatcagaaaactgaaataaatgtcatacagtcattctgtttgttgcggtatggttacgcatctttgaaaaaacttgacccttccagtttatgccattacccacataaaatccacctctagacaccacctaaaagtaaagaaaacatttatcaggaaacagattgataatacatgtcactagaccttagttctcataagtaaactagtgcaaagaattacctctttgtacaggttataaagatcaaggcgcttggcgttaaggattgcatcaggaaattcagctagtcc(seqidno:2)

引物序列如下：

0707-1f：5’-taaaggccagccatattctaaa-3’(seqidno:3)；

0707-1r：5’-ggactagctgaatttcctgatg-3’(seqidno:4)。

實施例8、功能性標記0707-1的驗證

為了驗證前述確定的功能性多態(tài)性標記0707-1，本發(fā)明人以0707-1f和0707-1r為引物，利用pcr技術(shù)檢驗了36份qpm自交系。

結(jié)果顯示，所有的qpm自交系都存在這一復(fù)制片段，如圖9。

同時，本發(fā)明人還利用該標記對3份近等基因系cm105，cm105o2及cm105mo2進行驗證，結(jié)果顯示cm105和cm105o2無拷貝序列，cm105mo2 存在拷貝序列，與27kd表達量顯著相關(guān)，如圖10。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。