本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及基因作為生物標(biāo)志物在結(jié)腸腺癌中的應(yīng)用，具體的涉及arfgef3作為生物標(biāo)志物在結(jié)腸腺癌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)腸癌是西歐、北美等發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是我國(guó)九大常見(jiàn)惡性腫瘤之一，在我國(guó)其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。在我國(guó)，因結(jié)腸癌死亡者，男性居惡性腫瘤死亡的第5位，女性居第6位。據(jù)臨床資料顯示，結(jié)腸癌患者術(shù)后，大概有40％到50％的患者會(huì)因?yàn)閺?fù)發(fā)或者惡化而導(dǎo)致死亡。結(jié)腸腺癌是結(jié)腸癌中最常見(jiàn)的一種，其發(fā)生發(fā)展涉及環(huán)境、基因、細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞信號(hào)通路、組織器官、免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等多個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程。

結(jié)腸腺癌起病隱匿，不易發(fā)現(xiàn)，大多患者就診時(shí)已到中晚期，失去了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。有報(bào)道表明，早期結(jié)腸腺癌患者術(shù)后5年生存率約為90％，而晚期患者僅為15％。因而，早發(fā)現(xiàn)早診斷是腫瘤獲得有效治療的關(guān)鍵。臨床上結(jié)腸腺癌的診斷主要依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室檢查如大便隱血(fobt)試驗(yàn)、細(xì)胞學(xué)診斷、組織病理學(xué)檢查、血清癌胚抗原(cea)測(cè)定等，纖維結(jié)腸鏡檢查，影像學(xué)診斷如結(jié)腸氣鋇雙重造影、ct掃描、mri、超聲切面顯像診斷、核素診斷，腸鏡是結(jié)腸腺癌診斷最可靠的方法，但具有侵入性、費(fèi)用昂貴，患者依從性差；ct和超聲檢查不易發(fā)現(xiàn)較小病變，對(duì)結(jié)腸腺癌的早期診斷受到一定限制；cea是臨床廣泛應(yīng)用的血清標(biāo)志物，其敏感性和特異性較低，主要用于結(jié)腸腺癌患者的治療監(jiān)測(cè)。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，一些新的生物標(biāo)志物已經(jīng)出現(xiàn)，不僅對(duì)結(jié)腸腺癌的病理診斷提供了很大的幫助，并為其預(yù)后判斷、治療方案的選擇提供了更全面的依據(jù)，在一定程度上發(fā)揮了獨(dú)特的作用。進(jìn)一步尋找與結(jié)腸腺癌相關(guān)的癌基因和抑癌基因作為評(píng)價(jià)其生物學(xué)行為的輔助指標(biāo)和作為靶向治療的靶點(diǎn)對(duì)于研究結(jié)腸腺癌具有重要的意義，同時(shí)也為精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)現(xiàn)提供了支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一，提供一種診斷產(chǎn)品，為實(shí)現(xiàn)結(jié)腸腺癌的早期診斷提供基礎(chǔ)。

本發(fā)明的目的之二，提供一種用于結(jié)腸腺癌臨床診斷和治療以及機(jī)制研究的分子標(biāo)志物。

本發(fā)明的目的之三，提供一種治療手段和藥物組合物，通過(guò)降低靶向分子的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)結(jié)腸腺癌的精準(zhǔn)分子治療。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測(cè)arfgef3表達(dá)水平的試劑在制備診斷早期結(jié)腸腺癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中，arfgef3在結(jié)腸腺癌患者中表達(dá)水平上調(diào)。

進(jìn)一步，所述試劑選自：

特異性識(shí)別arfgef3的探針；或

特異性擴(kuò)增arfgef3的引物；或

特異性結(jié)合arfgef3編碼的蛋白的抗體或配體。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述試劑是特異性擴(kuò)增arfgef3的引物，引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

本發(fā)明提供了一種診斷結(jié)腸腺癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過(guò)檢測(cè)樣本中arfgef3的表達(dá)水平來(lái)診斷早期結(jié)腸腺癌。所述“樣本”包括細(xì)胞、組織、臟器、體液(血液、血清、血漿、唾液、尿、腹水、囊腫液、淋巴液等)、糞便等。為了一些應(yīng)用，可使用培養(yǎng)的細(xì)胞或其它組織制備物。優(yōu)選的，所述樣本為組織、血液。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、制劑或試劑盒；其中，所述基因芯片包括固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對(duì)應(yīng)于arfgef3所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相載體，以及固定在固相載體上的arfgef3編碼的蛋白的特異性抗體或配體。

本發(fā)明提供了arfgef3在篩選預(yù)防或治療結(jié)腸腺癌潛在物質(zhì)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種篩選預(yù)防或治療結(jié)腸腺癌的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括：

用候選物質(zhì)處理表達(dá)或含有arfgef3基因或其編碼的蛋白的體系；和

檢測(cè)所述體系中arfgef3基因或其編碼的蛋白的表達(dá)或活性；

其中，若所述候選物質(zhì)可降低arfgef3基因的表達(dá)水平(優(yōu)選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療結(jié)腸腺癌的潛在物質(zhì)。所述體系選自：細(xì)胞體系、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系。

所述候選物質(zhì)包括(但不限于)：針對(duì)arfgef3基因或其上游或下游基因設(shè)計(jì)的干擾分子、核酸抑制物、結(jié)合分子(如抗體或配體)、小分子化合物等。

在本發(fā)明中，所述的方法還包括：對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于預(yù)防、緩解或治療結(jié)腸腺癌有用的物質(zhì)。

本發(fā)明提供了arfgef3在制備治療結(jié)腸腺癌的藥物組合物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述藥物組合物包括arfgef3功能性表達(dá)的抑制劑，所述抑制劑選自：以arfgef3為靶序列、且能夠抑制arfgef3基因表達(dá)的干擾分子，包括：shrna(小發(fā)夾rna)、小干擾rna(sirna)、dsrna、微小rna、反義核酸，或能表達(dá)或形成所述shrna、小干擾rna、dsrna、微小rna、反義核酸的構(gòu)建物；或特異性與arfgef3編碼的蛋白結(jié)合的結(jié)合分子(如能夠抑制arfgef3蛋白活性的抗體或配體)。

優(yōu)選的，所述的抑制劑為sirna。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，sirna的序列如seqidno.9、seqidno.10所示。

進(jìn)一步，所述藥物組合物還包括與所述抑制劑配伍的其他藥類(lèi)以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

本發(fā)明提供了一種治療結(jié)腸腺癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括：

arfgef3功能性表達(dá)的抑制劑；和

藥學(xué)上可接受的載體。

進(jìn)一步，所述arfgef3功能性表達(dá)的抑制劑選自：核酸抑制物，蛋白抑制劑，蛋白水解酶，蛋白結(jié)合分子，其能夠在蛋白或基因水平上下調(diào)arfgef3基因或其編碼的蛋白的表達(dá)或活性。

藥學(xué)上可接受的載體包括(但不限于)緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、生理食鹽、賦形劑、填充劑、凝結(jié)劑與調(diào)和劑、界面活性劑、擴(kuò)散劑、消泡劑。

附圖說(shuō)明

圖1是利用qpcr檢測(cè)arfgef3在結(jié)腸腺癌患者中的表達(dá)情況圖；

圖2是利用qpcr檢測(cè)sirna沉默結(jié)腸腺癌細(xì)胞中arfgef3基因圖；

圖3是利用蛋白免疫檢測(cè)sirna對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞中arfgef3蛋白的影響圖；

圖4是利用mtt法檢測(cè)arfgef3對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞增殖的影響圖；

圖5是利用transwell小室檢測(cè)arfgef3對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞遷移的影響圖；

圖6是transwell小室檢測(cè)arfgef3對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞侵襲的影響圖。

具體的實(shí)施方式

本發(fā)明經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，檢測(cè)結(jié)腸腺癌標(biāo)本中基因在結(jié)腸腺癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其中具有明顯表達(dá)差異的基因，探討其與結(jié)腸腺癌的發(fā)生之間的關(guān)系，從而為結(jié)腸腺癌的早期檢測(cè)及靶向治療尋找更好的途徑和方法。通過(guò)篩選，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了結(jié)腸腺癌中arfgef3顯著性上調(diào)。實(shí)驗(yàn)證明，sirna干擾沉默arfgef3，能夠有效地抑制結(jié)腸腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提示arfgef3可作為靶向基因應(yīng)用于結(jié)腸腺癌的診療中，為結(jié)腸腺癌的個(gè)性化治療提供了新途徑。

arfgef3基因

arfgef3基因位于6號(hào)染色體上，一種代表性的人arfgef3基因包括與目前國(guó)際公共核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)genebank中arfgef3基因(nc_000006.12)所示。在本發(fā)明中，arfgef3基因包括野生型、突變型或其片段。

本發(fā)明的人arfgef3核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂胮cr擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于pcr擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，并用市售的cdna庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cdna庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次pcr擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的實(shí)用性并不局限于對(duì)本發(fā)明的靶標(biāo)基因的任何特定變體的基因表達(dá)進(jìn)行定量。如果當(dāng)核酸或其片段與其它核酸(或其互補(bǔ)鏈)最佳比對(duì)時(shí)(具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔?，在至少大約60％的核苷酸堿基、通常至少大約70％、更通常至少大約80％、優(yōu)選至少大約90％、及更優(yōu)選至少大約95-98％核苷酸堿基中存在核苷酸序列相同性，則這兩個(gè)序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

或者，當(dāng)核酸或其片段與另一核酸(或其互補(bǔ)鏈)、一條鏈或其互補(bǔ)序列在選擇性雜交條件下雜交時(shí)，則其間存在基本同源或(相同性)。當(dāng)雜交比特異性整體喪失發(fā)生更具選擇性時(shí)，存在雜交選擇性。典型地，當(dāng)在至少大約14個(gè)核苷酸的一段序列存在至少大約55％相同性、優(yōu)選至少大約65％、更優(yōu)選至少大約75％及最優(yōu)選至少大約90％相同性時(shí)，發(fā)生選擇性雜交。如本文所述，同源對(duì)比的長(zhǎng)度可以是較長(zhǎng)的序列節(jié)段，在某些實(shí)施方案中通常為至少大約20個(gè)核苷酸，更通常為至少大約24個(gè)核苷酸，典型為至少大約28個(gè)核苷酸，更典型為至少大約32個(gè)核苷酸，及優(yōu)選至少大約36或更多個(gè)核苷酸。

因此，本發(fā)明的多核苷酸與genebank所示的arfgef3的核苷酸序列優(yōu)選具有至少70％、更優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％同源性。更優(yōu)選地，存在至少95％、更優(yōu)選至少98％同源性。

本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測(cè)定基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，測(cè)定基因表達(dá)的手段不是本發(fā)明的重要方面?？梢栽诒磉_(dá)水平上檢測(cè)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。

檢測(cè)技術(shù)

本發(fā)明的基因使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，這些技術(shù)包括但不限于：核酸測(cè)序、核酸雜交和核酸擴(kuò)增技術(shù)、免疫技術(shù)。

核酸測(cè)序技術(shù)的示例性非限制性實(shí)例包括但不限于鏈終止子(sanger)測(cè)序和染料終止子測(cè)序。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，由于rna在細(xì)胞中不太穩(wěn)定并且在實(shí)驗(yàn)中更易受到核酸酶攻擊，因此在測(cè)序前通常將rna逆表達(dá)成dna。

本發(fā)明可在檢測(cè)前或與檢測(cè)同時(shí)地對(duì)核酸(例如，ncrna)進(jìn)行擴(kuò)增。核酸擴(kuò)增技術(shù)的示例性非限制性實(shí)例包括但不限于：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、逆表達(dá)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)、表達(dá)介導(dǎo)的擴(kuò)增(tma)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr)、鏈置換擴(kuò)增(sda)和基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，某些擴(kuò)增技術(shù)(例如，pcr)需要在擴(kuò)增前將rna逆表達(dá)成dna(例如，rt-pcr)，而其他擴(kuò)增技術(shù)則直接擴(kuò)增rna(例如，tma和nasba)。

通常稱(chēng)為pcr的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用變性、引物對(duì)與相反鏈的退火以及引物延伸的多個(gè)循環(huán)，以指數(shù)方式增加靶核酸序列的拷貝數(shù)；tma的表達(dá)介導(dǎo)的擴(kuò)增(在基本上恒定的溫度、離子強(qiáng)度和ph的條件下自身催化地合成靶核酸序列的多個(gè)拷貝，其中靶序列的多個(gè)rna拷貝自身催化地生成另外的拷貝；lcr的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用與靶核酸的相鄰區(qū)域雜交的兩組互補(bǔ)dna寡核苷酸；其他擴(kuò)增方法包括例如：通常稱(chēng)為nasba的基于核酸序列的擴(kuò)增；使用rna復(fù)制酶(通常稱(chēng)為qβ復(fù)制酶)擴(kuò)增探針?lè)肿颖旧淼臄U(kuò)增；基于表達(dá)的擴(kuò)增方法；以及自我維持的序列擴(kuò)增。

合適的免疫法包括夾心免疫測(cè)定，例如夾心elisa，其中使用識(shí)別生物標(biāo)志物上不同表位的兩種抗體進(jìn)行該生物標(biāo)志物的檢測(cè)；放射免疫測(cè)定(ria)、直接、間接或?qū)Ρ让嘎?lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、酶免疫測(cè)定(eia)、熒光免疫測(cè)定(fia)、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉淀法和基于任何顆粒的免疫測(cè)定(如使用金顆粒、銀顆?；蛉槟z顆粒、磁性顆?；蛄孔狱c(diǎn))?？衫缭谖⒘康味ò寤驐l的形式中實(shí)施免疫法。

根據(jù)本發(fā)明的免疫法可基于，例如，以下方法中的任一種。

免疫沉淀法是最簡(jiǎn)單的免疫測(cè)定方法；這種方法測(cè)量沉淀物的量，在試劑抗體已與樣本一起孵育并與其中存在的靶抗原反應(yīng)以形成不溶性團(tuán)聚體之后形成所述沉淀。免疫沉淀反應(yīng)可以是定性的或是定量的。

在顆粒免疫測(cè)定中，多種抗體與該顆粒連接，且所述顆粒能夠同時(shí)結(jié)合很多抗原分子。這大大地加速了可見(jiàn)反應(yīng)的速度。這允許生物標(biāo)志物的快速且靈敏的檢測(cè)。

在免疫比濁法(immunonephelometry)中，抗體和生物標(biāo)志物上的靶抗原的相互作用引起免疫復(fù)合物的形成，所述免疫復(fù)合物太小而不能沉淀。但是，這些復(fù)合物將散射入射光，這可使用比濁計(jì)來(lái)測(cè)量?？稍诜磻?yīng)的幾分鐘之內(nèi)測(cè)定抗原(即生物標(biāo)志物)的濃度。

放射免疫測(cè)定(ria)法使用放射性同位素例如i125來(lái)標(biāo)記抗原或抗體。所使用的同位素發(fā)射γ射線，通常在除去非結(jié)合的(游離的)放射性標(biāo)記之后測(cè)量所述射線。與其它的免疫測(cè)定相比較，ria的主要優(yōu)勢(shì)在于更高的靈敏度、容易的信號(hào)檢測(cè)和確認(rèn)的、快速的測(cè)定。主要的劣勢(shì)在于由放射物的使用引起的健康和安全風(fēng)險(xiǎn)和與維護(hù)許可放射物安全和處理程序相關(guān)的時(shí)間和費(fèi)用。出于該原因，在常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中，ria已很大程度上被酶免疫測(cè)定所取代。

酶免疫測(cè)定(eia)發(fā)展為放射免疫測(cè)定(ria)的替代物。這些方法使用酶來(lái)標(biāo)記抗體或靶抗原。eia的靈敏度接近ria的靈敏度，且不存在由放射性同位素引起的危險(xiǎn)。用于檢測(cè)的最廣泛使用的eia方法之一是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)。elisa方法可使用兩種抗體，其一對(duì)于靶抗原是特異性的，而另一與酶偶聯(lián)，酶底物的添加引起化學(xué)發(fā)光信號(hào)或熒光信號(hào)的產(chǎn)生。

熒光免疫測(cè)定(fia)指使用熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記的免疫測(cè)定，所述熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記作用在底物上以形成熒光產(chǎn)物。熒光測(cè)量固有地比比色(分光光度法的)測(cè)量更加靈敏。因此，fia方法具有比利用吸收(光密度)測(cè)量的eia方法更高的分析靈敏度。

化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定使用化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，當(dāng)其被化學(xué)能激發(fā)時(shí)產(chǎn)生光；使用光檢測(cè)器測(cè)量發(fā)射。

因此，可使用熟知的方法進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的免疫法。在本發(fā)明的生物標(biāo)志物的檢測(cè)中可使用任何直接(如使用傳感器芯片)或間接的方法。

芯片、試劑盒

在本發(fā)明中芯片包括基因芯片、蛋白芯片；所述基因芯片包括固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對(duì)應(yīng)于arfgef3所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相載體，以及固定在固相載體上的arfgef3編碼的蛋白的特異性抗體或配體。

所述固相載體包括無(wú)機(jī)載體和有機(jī)載體，所述無(wú)機(jī)載體包括但不限于有硅載體、玻璃載體、陶瓷載體等；所述有機(jī)載體包括聚丙烯薄膜、尼龍膜等。

“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語(yǔ)“探針”通常指能通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸(往往稱(chēng)為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法。

本發(fā)明中的示例性探針包括pcr引物以及基因特異性dna寡核苷酸探針，例如固定于微陣列基底上的微陣列探針、定量核酸酶保護(hù)檢驗(yàn)探針、與分子條形碼連接的探針、以及固定于珠上的探針。

這些探針具有與靶點(diǎn)基因的特定的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。這里，所謂“互補(bǔ)”，只要是雜交即可，可以不是完全互補(bǔ)。這些多核苷酸通常相對(duì)于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是dna，也可以是rna，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過(guò)pna(polyamidenucleicacid，肽核酸)、lna(注冊(cè)商標(biāo)，lockednucleicacid，bridgednucleicacid，交聯(lián)化核酸)、ena(注冊(cè)商標(biāo)，2′-o,4′-c-ethylene-bridgednucleicacids)、gna(glycerolnucleicacid，甘油核酸)、tna(threosenucleicacid，蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的多核苷酸。

本發(fā)明的配體可包含能夠特異性結(jié)合arfgef3的肽、抗體或其片段、或適配體或寡核苷酸?？贵w可為能夠特異性結(jié)合該arfgef3的單克隆抗體、多克隆抗體或其片段。

本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒可用于檢測(cè)arfgef3基因或蛋白的表達(dá)水平，包含用于arfgef3檢測(cè)和/或定量的本發(fā)明的配體、和/或芯片。任選的與試劑盒的說(shuō)明書(shū)在一起。

試劑盒包括一種或多種無(wú)菌容器，這樣的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包裝、或本領(lǐng)域已知的其它合適的容器形式。這樣的容器可以由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔、或適于容器藥物的其它材料。

本發(fā)明中試劑盒或芯片可用于檢測(cè)包括arfgef3基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與結(jié)腸腺癌相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平，將結(jié)腸腺癌的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可大大提高結(jié)腸腺癌診斷的準(zhǔn)確率。

抑制劑和藥物組合物

基于發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種arfgef3的抑制劑，所述抑制劑的性質(zhì)對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)并不重要，只要它抑制arfgef3基因的功能性表達(dá)即可，這些抑制劑作為對(duì)于下調(diào)arfgef3有用的物質(zhì)，可用于預(yù)防或治療結(jié)腸腺癌。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述arfgef3的抑制劑是一種arfgef3特異性的小干擾rna分子。如本文所用，所述的“小干擾rna”是指一種短片段雙鏈rna分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mrna為靶目標(biāo)降解特定的mrna，這個(gè)過(guò)程就是rna干擾(rnainterference)過(guò)程。小干擾rna可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個(gè)正義鏈和一個(gè)反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個(gè)雙鏈rna復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來(lái)制備。因此，舉例來(lái)講，互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的，其后可通過(guò)退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈rna復(fù)合物。

在篩選有效的sirna序列時(shí)，本發(fā)明人通過(guò)大量的比對(duì)分析，從而找出最佳的有效片段。本發(fā)明人設(shè)計(jì)合成了多種sirna序列，并將它們分別通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染結(jié)腸腺癌細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，選出干擾效果最佳的sirna，進(jìn)一步地在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明對(duì)于該sirna在能有效的抑制細(xì)胞中arfgef3基因的表達(dá)水平，以及結(jié)腸腺癌細(xì)胞的增殖。

本發(fā)明的核酸抑制物如sirna可以化學(xué)合成，也可以通過(guò)一個(gè)重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達(dá)盒表達(dá)成單鏈rna之后進(jìn)行制備。sirna等核酸抑制物，可通過(guò)采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。

作為本發(fā)明的另外一種優(yōu)選方式，所述arfgef3的抑制劑是一種arfgef3編碼蛋白的特異性抗體或配體。根據(jù)本發(fā)明的配體可包含能夠特異性結(jié)合arfgef3的肽、抗體或其片段、或適配體或寡核苷酸?？贵w可為能夠特異性結(jié)合該arfgef3的單克隆抗體或其片段。根據(jù)本發(fā)明的配體可用可檢測(cè)的標(biāo)志物標(biāo)記，例如發(fā)光標(biāo)志物、熒光標(biāo)志物或放射性標(biāo)志物；替代地或另外，根據(jù)本發(fā)明的配體可用親和標(biāo)記物標(biāo)記，如生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素或his(如6-his)標(biāo)記物。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括但不限于：多克隆抗體、單克隆抗體、雙特定異性抗體、人源化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、片段(例如fab、f(ab')²、fv、二硫鍵fv、scfv、雙抗體)、由fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗-id)抗體和以上任何一者的表位結(jié)合的片段。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”還指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異性結(jié)合抗原的抗體結(jié)合部位的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何分類(lèi)(如igg、ige、igm、igd和iga)或亞分類(lèi)。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量的所述的arfgef3的抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物可用于抑制結(jié)腸腺癌。任何前述的arfgef3的抑制劑均可用于藥物組合物的制備。

如本文所用，所述“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞(宿主細(xì)胞)轉(zhuǎn)染試劑。

本發(fā)明可以采用用本領(lǐng)域熟知的多種方法來(lái)將所述的抑制劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動(dòng)物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。

優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進(jìn)行。比如，可直接將arfgef3的抑制劑通過(guò)諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過(guò)一定的途徑將攜帶arfgef3的抑制劑的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等，或sirna或shrna)遞送到靶點(diǎn)上，并使之表達(dá)活性的arfgef3抑制劑，具體情況需視所述的抑制劑的類(lèi)型而定，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種抗癌劑。在具體的實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種抑制arfgef3基因表達(dá)的化合物和至少一種化療劑。用于本發(fā)明的化療劑，包括但不限于：微管激活劑、烷化劑、抗贅生抗代謝物、鉑類(lèi)化合物、dna-烷化劑，抗腫瘤抗生素劑，抗代謝劑，微管蛋白穩(wěn)定劑，微管蛋白去穩(wěn)定劑，激素拮抗劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，hmg-coa抑制劑，cdk抑制劑，細(xì)胞周期蛋白抑制劑，胱天蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核酸，三鏈螺旋dna，核酸適體，和分子修飾的病毒、細(xì)菌和外毒素試劑。

可藥用載體可包括但不限于：病毒、脂質(zhì)體、納米顆?；蚓酆衔锛捌淙我饨M合。相關(guān)的遞送載劑可包括但不限于：脂質(zhì)體、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、無(wú)機(jī)(包括金屬)顆粒、以及細(xì)菌或病毒(例如桿狀病毒、腺病毒和逆表達(dá)病毒)、噬菌體、黏粒或質(zhì)粒載體。

本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療結(jié)腸腺癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。

本發(fā)明的藥物組合物還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。在治療過(guò)程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“包括”用于指短語(yǔ)“包括但不限于”，并與短語(yǔ)“包括但不限于”可以互換使用。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選與結(jié)腸腺癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集8例早期結(jié)腸腺癌患者的癌組織以及癌旁組織，所有患者手術(shù)前未接受過(guò)放療、化療，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過(guò)組織倫理委員會(huì)的同意。

2、rna樣品的制備

利用qiagen的組織rna提取試劑盒進(jìn)行組織rna的提取，按說(shuō)明書(shū)的具體步驟進(jìn)行操作。利用nanodrop2000對(duì)所提取的rna濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)rna完整性，agilent2100測(cè)定rin值。濃度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之間。

3、去除rrna

使用ribo-zero試劑盒除去總rna中的核糖體rna。

4、構(gòu)建cdna文庫(kù)

利用利用illumina的truseqrnasampleprepkit進(jìn)行cdna文庫(kù)的構(gòu)建，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

5、上機(jī)測(cè)序

使用hiseq4000測(cè)序平臺(tái)對(duì)cdna文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

6、高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用tophatv1.3.1進(jìn)行rna-seq讀段定位，通過(guò)cufflinksv1.0.3將rna-seq片段數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度，利用cuffdiff檢測(cè)差異表達(dá)，當(dāng)fdr<0.05時(shí)，認(rèn)為mrna顯著差異表達(dá)。

7、結(jié)果

與癌旁組織相比，arfgef3在結(jié)腸腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。

實(shí)施例2qpcr測(cè)序驗(yàn)證arfgef3基因的差異表達(dá)

1、對(duì)arfgef3基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本qpcr驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式收集結(jié)腸腺癌組織和癌旁組織樣本各60例。

2、rna提取步驟同實(shí)施例1。

3、qpcr檢測(cè)：

(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆表達(dá)緩沖液，10mmdntp，0.1mmdtt，30μmoligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。

按照rnapcrkit(amv)ver.3.0中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件進(jìn)行。

(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

設(shè)計(jì)arfgef3基因和管家基因gapdh的擴(kuò)增引物，由生工合成，arfgef3基因的引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示；管家基因gapdh的引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

配制以下反應(yīng)體系：sybrgreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μl，正反向引物(5μm)各1μl，模板cdna2.0μl，無(wú)酶水8.5μl，各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管，所有擴(kuò)增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35個(gè)循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀上進(jìn)行pcr反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進(jìn)行相對(duì)定量。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與癌旁組織相比，arfgef3基因在結(jié)腸腺癌組織中表達(dá)水平上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，同rna-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例3arfgef3基因的沉默

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株sw480，在37℃、5％co2、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用含10％胎牛血清和1％p/s的培養(yǎng)基rpmi-1640。使用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2、sirna設(shè)計(jì)

針對(duì)arfgef3基因的sirna序列：

陰性對(duì)照sirna序列(sirna-nc)：

正義鏈：5’-uucuccgaacgugucacgu-3’(seqidno.5)，

反義鏈：5’-acgugacacguucggagaa-3’(seqidno.6)；

sirna1：

正義鏈：5’-aucagaaucuguuuccaugga-3’(seqidno.7)，

反義鏈：5’-cauggaaacagauucugauga-3’(seqidno.8)；

sirna2：

正義鏈：5’-acuauaccuagauccauagga-3’(seqidno.9)，

反義鏈：5’-cuauggaucuagguauaguga-3’(seqidno.10)；

sirna3：

正義鏈為5’-uugacaaacuucauaaggcac-3’(seqidno.11)，

反義鏈為5’-gccuuaugaaguuugucaaag-3’(seqidno.12)

將細(xì)胞密度調(diào)整為按1×10⁵/ml，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入2ml在37℃、5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90％時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

在無(wú)雙抗、含10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購(gòu)自于invitrogen公司)的說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染。

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(sw480)、陰性對(duì)照組(sirna-nc)和實(shí)驗(yàn)組(20nm)(sirna1、sirna2、sirna3)，其中陰性對(duì)照組sirna與arfgef3基因的序列無(wú)同源性，濃度為20nm/孔，同時(shí)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3、qpcr檢測(cè)arfgef3基因的表達(dá)水平

3.1細(xì)胞總rna的提取

利用qiagen的細(xì)胞rna提取試劑盒進(jìn)行細(xì)胞rna的提取，按說(shuō)明書(shū)的具體步驟進(jìn)行操作。

3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實(shí)施例2。

3.3qpcr擴(kuò)增步驟同實(shí)施例2。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，干擾arfgef3基因表達(dá)組與對(duì)照組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2顯示，相比sw480、轉(zhuǎn)染空載sirna-nc、sirna1、sirna3組，sirna2組能夠顯著降低arfgef3的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例4蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

采用westernblot檢測(cè)sw480細(xì)胞在轉(zhuǎn)染干擾rna前后細(xì)胞中arfgef3蛋白的差異表達(dá)，以gapdh作為蛋白定量的內(nèi)參，其中arfgef3多克隆抗體購(gòu)自abcam公司。

1、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3

2、蛋白免疫印跡檢測(cè)

(1)使用裂解液(ripa)與pmsf配置成的蛋白裂解液裂解sw480細(xì)胞；

(2)使用bca法測(cè)定蛋白濃度，具體操作步驟參照cwbio公司的bca蛋白定量試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行；

(3)sds-page進(jìn)行凝膠電泳。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

根據(jù)凝膠圖像中目的蛋白arfgef3條帶及內(nèi)參gapdh條帶的灰度值，計(jì)算出比值，得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)三次。

4、結(jié)果

結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染sirna2組的arfgef3蛋白含量顯著低于空白對(duì)照組和sirna-nc組。

實(shí)施例5mtt法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3

2、mtt法檢測(cè)細(xì)胞增殖

1)脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48h后，胰酶消化接種到96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×10³個(gè)。

2)分別在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h、96h、120h后加入10μl/孔mtt試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h。

3)吸取孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150μldmso，震蕩10min。

4)放入酶標(biāo)儀中測(cè)定570nm波長(zhǎng)處的od值，繪制生長(zhǎng)曲線。

實(shí)驗(yàn)分三組，分別是空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染sirna-nc組和轉(zhuǎn)染sirna2，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

3、結(jié)果

結(jié)果如圖4所示：空白對(duì)照組同空載組無(wú)明顯差異，而轉(zhuǎn)染sirna2組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，上述結(jié)果表明arfgef3的表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)腸腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

實(shí)施例6arfgef3基因?qū)Y(jié)腸腺癌細(xì)胞凋亡的影響

使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)arfgef3基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。

1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實(shí)施例3。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。

3、步驟

1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，胰酶消化，用pbs洗細(xì)胞兩次(2000rpm離心5min)收集1-5×10⁵細(xì)胞。

2)細(xì)胞染色：加入500μl的bindingbuffer懸浮細(xì)胞，加入10μlannexin-v-fitc混勻后，加入5μl碘化丙啶(pi)，混勻；室溫避光孵育5～15min。

3)流式分析：以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用軟件modfit分析，觀察凋亡細(xì)胞百分比。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果：

轉(zhuǎn)染sirna2組的細(xì)胞凋亡率為(0.121±0.003)，轉(zhuǎn)染sirna-nc組的細(xì)胞凋亡率為(0.119±0.014)，干擾組與對(duì)照組之間的細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化，表明arfgef3對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞的凋亡無(wú)影響。

實(shí)施例7transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力

1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實(shí)施例3。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。

3、步驟：

(1)用無(wú)血清培養(yǎng)基濕潤(rùn)transwell小室，于37℃下放置2h。

(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h用胰酶消化計(jì)數(shù)，將3×10⁵個(gè)細(xì)胞用200μl無(wú)血清rpmi-1640培養(yǎng)液重懸，均勻接種于上室，下室中加入10％完全培養(yǎng)基，于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，取出濾膜。

(3)4％多聚甲醛固定，用蘇木素液在60℃下染色60min。

(4)在光鏡下，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果：

如圖5所示，轉(zhuǎn)染sirna2的結(jié)腸腺癌細(xì)胞穿膜數(shù)少于對(duì)照組，說(shuō)明arfgef3促進(jìn)結(jié)腸腺癌細(xì)胞sw480的遷移。

實(shí)施例8小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力

1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實(shí)施例3。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。

3、步驟：

(1)用無(wú)血清培養(yǎng)基濕潤(rùn)transwell小室，于37℃下放置2h。

(2)濾膜上包被人工基底膜膠，并在孵箱中聚合2h。

(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h用胰酶消化計(jì)數(shù)，將1×10⁶個(gè)細(xì)胞用200μl無(wú)血清rpmi-1640培養(yǎng)液重懸，均勻接種于上室，下室中加入10％完全培養(yǎng)基，于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，取出濾膜。

(4)4％多聚甲醛固定，用蘇木素液在60℃下染色60min。

(5)在光鏡下，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果：

如圖6所示，轉(zhuǎn)染sirna2的結(jié)腸腺癌細(xì)胞穿膜數(shù)少于對(duì)照組，說(shuō)明arfgef3促進(jìn)結(jié)腸腺癌細(xì)胞sw480的侵襲。

上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>基因作為生物標(biāo)志物在結(jié)腸腺癌中的應(yīng)用

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