一種桃及其近緣種植物的根癌病抗性鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種桃及其近緣種植物的根癌病抗性鑒定方法，在桃樹旺盛生長(zhǎng)季節(jié)選取莖粗5～15mm一年生枝條，用鋒利的裁紙刀在莖部從上向下刻8～10mm長(zhǎng)、5～8mm寬、深及木質(zhì)部的傷口，繼而在傷口內(nèi)平行切面夾入1～2片蘸有109cfu·mL?1致病農(nóng)桿菌菌液的圓濾紙片，隨后用封口膜在刻傷上部纏裹，將刻傷復(fù)位。進(jìn)行自來(lái)水噴霧30分鐘，制造合適的發(fā)病環(huán)境。接種后30～90天，用游標(biāo)卡尺調(diào)查各接種部位的最大瘤徑、接種位點(diǎn)上、下兩端莖粗、計(jì)算瘤徑比。根據(jù)瘤徑比劃分抗性等級(jí)，確定材料的根癌病抗性等級(jí)。該方法操作簡(jiǎn)單，利用刻傷皮層復(fù)位提高侵染效率，抗性評(píng)價(jià)考慮了待鑒定材料的種屬及生長(zhǎng)狀態(tài)差異，能夠比較準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)桃及其近緣種材料對(duì)根癌病的抗性等級(jí)。
【專利說(shuō)明】
-種桃及其近緣種植物的根癌病抗性鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種植物病害抗性鑒定方法，具體為一種桃及其近緣種植物的根癌病 抗性鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 桃及其近緣種植物主要為核果類果樹，在生產(chǎn)上其根系常常遭受根癌農(nóng)桿菌引起 的根癌病危害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。包括野生毛桃、李、杏、扁桃等近緣種果樹之間普遍可 W相互嫁接，從中篩選抗根癌病的材料作為化木及化木育種材料具有重要意義。對(duì)于核果 類果樹根癌病抗性鑒定，在接種方法上目前多通過(guò)根部刺傷或劃傷后，飽和接種農(nóng)桿菌溶 液，然后在生長(zhǎng)季結(jié)束后，挖出根系，調(diào)查植株根系發(fā)病情況，或者通過(guò)刺傷枝條莖部，然后 注射農(nóng)桿菌菌液，濕棉球包裹，創(chuàng)造農(nóng)桿菌侵染條件等，運(yùn)些方法存在著操作復(fù)雜，傷口或 針刺深度及接種量難W控制等缺點(diǎn);在抗性指標(biāo)評(píng)價(jià)方面，主要采用瘤徑大小或質(zhì)量、平均 瘤徑大小等做為病級(jí)劃分指標(biāo)或抗性等級(jí)的確定，欠缺對(duì)接種前植物材料種屬差異、植株 生長(zhǎng)狀態(tài)差異的考慮，其結(jié)果容易受到植物種屬、生長(zhǎng)狀態(tài)差異的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供了一種桃及其近緣種植物的根癌病抗 性鑒定方法，它通過(guò)簡(jiǎn)化接種操作、均一化接種量、制造發(fā)病關(guān)鍵期環(huán)境條件、采用瘤徑生 長(zhǎng)比作為抗性分級(jí)指標(biāo)，為桃及其近緣種材料的根癌病抗性評(píng)價(jià)提供了新的方法，可用于 親緣關(guān)系相近植物的根癌病抗性鑒定，篩選或評(píng)價(jià)抗性材料。
[0004] 本發(fā)明是W如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種桃及其近緣種植物的根癌病抗性鑒定方法，在5~9月份，選取待評(píng)價(jià)材料莖粗5~ 15mm-年生枝條，用鋒利的裁紙刀在莖部從上向下刻8~10mm長(zhǎng)、5~8mm寬、深及木質(zhì)部的 傷口，在傷口內(nèi)平行切面夾入1~2片薩有1〇9 C化.m[i致病農(nóng)桿菌菌液的圓濾紙片，然后 用封口膜在刻傷上部包裹，將刻傷復(fù)位。每株接種5個(gè)位點(diǎn)，若在同一枝條上接種，接種位點(diǎn) 間距20mmW上。接種對(duì)照為薩有無(wú)菌水的濾紙片。接種后3小時(shí)內(nèi)，對(duì)接種植株進(jìn)行自來(lái)水 噴霧30分鐘，在侵染關(guān)鍵期制造良好環(huán)境。接種后30~90天，用游標(biāo)卡尺調(diào)查各接種部位的 最大瘤徑、接種位點(diǎn)上下兩端莖粗、計(jì)算瘤徑比。根據(jù)瘤徑比評(píng)價(jià)材料的根癌病抗性。
[0005] 具體按如下步驟進(jìn)行： (1) 待測(cè)材料準(zhǔn)備:在田間嫁接或栽培待測(cè)試桃及其近緣種材料，如在溫室鑒定可栽植 在適當(dāng)容積的花盆中，進(jìn)行±、肥、水及病蟲害防治與管理，利用自然條件或溫室光溫條件 讓其快速生長(zhǎng)至滿足接種條件； (2) 根癌農(nóng)桿菌菌液的培養(yǎng)與標(biāo)準(zhǔn)帶菌濾紙片的制備:將農(nóng)桿菌致病菌株(如AT4-3)接 種于YEB液體培養(yǎng)基中，28°C下，200 rpm/min搖床培養(yǎng)約16h，培養(yǎng)好的菌液在5000 rpm/ min條件下離屯、10分鐘，用含0.01%吐溫20的滅菌蒸饋水重懸，并調(diào)整濃度為1 X 109c化· mL -1，將直徑5mm的滅菌濾紙片呈單片分散放置在培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中倒入農(nóng)桿菌菌液浸沒 濾紙片5分鐘，然后用膠頭吸管棄去多余菌液，蓋上培養(yǎng)皿蓋備用； (3 )農(nóng)桿菌接種:在5~9月份，選取待評(píng)價(jià)材料莖粗為5-15mm的一年生枝條，用鋒利的 裁紙刀在莖部從上向下刻8~10mm長(zhǎng)、5~8mm寬、深及木質(zhì)部的傷口，在傷口內(nèi)貼面夾入1~ 2片薩有109c化· mri致病農(nóng)桿菌菌液的圓濾紙片，然后用封口膜在刻傷上部包裹將刻傷復(fù) 位。每株接種5個(gè)位點(diǎn)，若在同一枝條上接種，接種位點(diǎn)間距20mmW上，對(duì)照為接種薩有無(wú)菌 水的濾紙片； (4)接種后噴霧:接種后3小時(shí)內(nèi)，對(duì)接種植株進(jìn)行自來(lái)水噴霧30分鐘，提高環(huán)境濕度； 巧)發(fā)病調(diào)查:接種后30~90天，用游標(biāo)卡尺調(diào)查各接種部位的最大瘤徑(腫瘤加枝條 直徑）、接種位點(diǎn)上下兩端莖粗(平均值為接種點(diǎn)枝條直徑）、計(jì)算瘤徑比（接種點(diǎn)腫瘤加枝 條直徑與枝條直徑比值）； (6) 抗性分級(jí)與評(píng)價(jià):用單一植株最大瘤徑比評(píng)價(jià)植株材料的根癌病抗性； (7) 個(gè)體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)與群體抗性分級(jí)： 0級(jí)，免疫:與對(duì)照無(wú)明顯差異，接種部位突起<1.0mm，瘤徑比(接種后產(chǎn)生的最大冠瘦 瘤直徑與接種部位枝條直徑比值)值為1，接種不發(fā)?。?1級(jí)，高抗:1<瘤徑比《1.2; 2級(jí)，中抗:1.2<瘤徑比《1.5; 3級(jí)，感病：1.5<瘤徑比《2; 4級(jí)，中感:2<瘤徑比《3; 5級(jí)，高感:瘤徑比>3。
[0006] 對(duì)于群體評(píng)價(jià)，病情指數(shù)的計(jì)算如下： 病情指數(shù)=(Σ (各級(jí)感病苗數(shù)X相應(yīng)病級(jí))/調(diào)查苗總數(shù)X 5) X 100% 群體抗性分級(jí)如下： 免疫，病情指數(shù)為0; 高抗，〇<病情指數(shù)《20; 中抗，20<病情指數(shù)《40; 感病，40<病情指數(shù)《60; 中感，60<病情指數(shù)《80; 高感，病情指數(shù)>80; 該發(fā)明的有益效果為，該鑒定方法操作簡(jiǎn)單，利用刻傷的皮層將攜帶根癌農(nóng)桿菌菌量 接近的濾紙圓片貼合在受傷組織部位中間，依靠植物自身傷口愈合過(guò)程進(jìn)行保濕和促進(jìn)病 原的侵染，不易因天氣干旱等造成接種失敗;抗性評(píng)級(jí)方法科學(xué)，利用瘤徑比進(jìn)行抗性分 級(jí)，考慮了植物材料因種屬差異、生長(zhǎng)狀態(tài)差異引起的評(píng)級(jí)差異。另外，運(yùn)種鑒定方法，對(duì)田 間或室內(nèi)生長(zhǎng)植株都適合。
【具體實(shí)施方式】
[0007] 實(shí)施舉例:桃及其近緣種8個(gè)植株個(gè)體的根癌病抗性評(píng)價(jià) (1)待測(cè)材料準(zhǔn)備:3月初，在溫室用營(yíng)養(yǎng)±作基質(zhì)，在50L的花盆中栽培實(shí)生毛桃、實(shí)生 山桃、Fa、大久保、絳桃、西藏3號(hào)(光核桃）、蒙古扁桃、、新疆野扁桃等8種植株，使其正常生 長(zhǎng)，并進(jìn)行日常上肥水及病蟲害管理； (2) 根癌農(nóng)桿菌菌液的培養(yǎng)與標(biāo)準(zhǔn)帶菌濾紙片的制備:將保存在-2(TC冰箱中的甘油與 YEB菌液混合的根癌農(nóng)桿菌致病菌株AT4-3挑取少量，在超凈臺(tái)上接種于裝有150ml Y邸液 體培養(yǎng)基的Ξ角瓶中，28°C下，200 rpm/min搖床培養(yǎng)約16h。培養(yǎng)好的菌液裝入離屯、管在 5000 rpm/min條件下離屯、10分鐘，菌體用含0.05%吐溫20的滅菌蒸饋水重懸，并調(diào)整濃度為 1 X 109c化· ml/i。將直徑5mm的滅菌濾紙片呈單片分散放置在培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中倒入農(nóng) 桿菌菌液浸沒濾紙片5分鐘，然后用膠頭吸管棄去多余菌液，蓋上培養(yǎng)皿蓋備用； (3) 根癌農(nóng)桿菌接種:在6月初，選取待評(píng)價(jià)材料莖粗為5-15mm的一年生枝條，用鋒利的 裁紙刀在莖部從上向下刻長(zhǎng)8-lOmm、寬5-8mm、深及木質(zhì)部的傷口，在傷口內(nèi)貼面夾入1片薩 有109c化/ml AT4-3農(nóng)桿菌菌液的濾紙片，然后用封口膜在刻傷上部包裹將刻傷復(fù)位。每株 接種5個(gè)位點(diǎn)。對(duì)照為接種薩有無(wú)菌水的濾紙片； (4) 接種后葉面噴霧:接種后1小時(shí)，對(duì)接種植株進(jìn)行自來(lái)水噴霧30分鐘，提高環(huán)境濕 度； 巧)發(fā)病調(diào)查:接種后60天，用游標(biāo)卡尺調(diào)查不同測(cè)試材料各接種部位的最大瘤徑(月中 瘤加枝條直徑）、接種位點(diǎn)上下兩端莖粗(平均值為接種點(diǎn)枝條直徑）、計(jì)算瘤徑比（接種點(diǎn) 腫瘤加枝條直徑與接種點(diǎn)枝條直徑比值）； (6) 抗性分級(jí)與評(píng)價(jià):用單一植株最大瘤徑比評(píng)價(jià)植株材料的根癌病抗性； (7) 個(gè)體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)與群體抗性分級(jí)： 0級(jí)，免疫:與對(duì)照無(wú)明顯差異，接種部位突起<1.0mm，瘤徑比(接種后產(chǎn)生的最大冠瘦 瘤直徑與接種部位枝條直徑比值)值為1，接種不發(fā)?。?1級(jí)，高抗:1<瘤徑比《1.2; 2級(jí)，中抗:1.2<瘤徑比《1.5; 3級(jí)，感病：1.5<瘤徑比《2; 4級(jí)，中感:2<瘤徑比《3; 5級(jí)，高感:瘤徑比>3。
[0008] 對(duì)于群體評(píng)價(jià)，病情指數(shù)的計(jì)算如下： 病情指數(shù)=(Σ (各級(jí)感病苗數(shù)X相應(yīng)病級(jí))/調(diào)查苗總數(shù)X 5) X 100% 群體抗性分級(jí)如下： 免疫，病情指數(shù)為0; 高抗，〇<病情指數(shù)《20; 中抗，20<病情指數(shù)《40; 感病，40<病情指數(shù)《60; 中感，60<病情指數(shù)《80; 高感，病情指數(shù)>80; (8) 桃及其近緣種材料8個(gè)植株個(gè)體對(duì)根癌±壤桿菌AT4-3引起的根癌病抗性評(píng)價(jià)結(jié)果 見表1。
[0009] 表1桃等8種材料對(duì)根癌上壤桿菌AT4-3的抗性鑒定結(jié)果_

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種桃及其近緣種植物的根癌病抗性鑒定方法，其特征在于:選取待評(píng)價(jià)材料莖粗5 ~15mm-年生枝條，用鋒利的裁紙刀在莖部從上向下刻8~10mm長(zhǎng)、5~8mm寬、深及木質(zhì)部 的傷口，在傷口內(nèi)平行切面夾入1~2片蘸有10 9 cfu · ml/1致病農(nóng)桿菌菌液的圓濾紙片，然 后用封口膜在刻傷上部纏裹，將刻傷復(fù)位，每株接種5個(gè)位點(diǎn)，若在同一枝條上接種，接種位 點(diǎn)間距20mm以上，接種對(duì)照為蘸有無(wú)菌水的濾紙片;接種后3小時(shí)內(nèi)，對(duì)接種植株進(jìn)行自來(lái) 水噴霧30分鐘，在侵染關(guān)鍵期制造良好環(huán)境;接種后30~90天，用游標(biāo)卡尺調(diào)查各接種部位 的最大瘤徑、接種位點(diǎn)上下兩端莖粗、計(jì)算瘤徑比，根據(jù)瘤徑比評(píng)價(jià)材料的根癌病抗性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桃及其近緣種植物的根癌病抗性鑒定方法，其特征在于： 它的具體步驟為： (1) 待測(cè)材料準(zhǔn)備:在田間嫁接或栽培待測(cè)試桃及其近緣種材料，如在溫室鑒定可栽植 在適當(dāng)容積的花盆中，進(jìn)行土、肥、水及病蟲害防治與管理，利用自然條件或溫室光溫條件 讓其快速生長(zhǎng)至滿足接種條件； (2) 根癌農(nóng)桿菌菌液的培養(yǎng)與標(biāo)準(zhǔn)帶菌濾紙片的制備:將農(nóng)桿菌致病菌株接種于YEB液 體培養(yǎng)基中，28°C下，200 rpm/min搖床培養(yǎng)約16h，培養(yǎng)好的菌液在5000 rpm/min條件下離 心10分鐘，用含0.01%吐溫20的滅菌蒸餾水重懸，并調(diào)整濃度為1 X 109cfu · ml/1;將直徑5mm 的滅菌濾紙片呈單片分散放置在培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中倒入農(nóng)桿菌菌液浸沒濾紙片5分鐘， 然后用膠頭吸管棄去多余菌液，蓋上培養(yǎng)皿蓋備用； (3 )農(nóng)桿菌接種:在5~9月份，選取待評(píng)價(jià)材料莖粗為5~15mm的一年生枝條，用鋒利的 裁紙刀在莖部從上向下刻長(zhǎng)8-10mm、寬5-8mm、深及木質(zhì)部的傷口，在傷口內(nèi)貼面夾入1~2 片蘸有1〇9 cfu ?ml/1致病農(nóng)桿菌菌液的圓濾紙片，然后用封口膜在刻傷上部纏裹將刻傷復(fù) 位，每株接種5個(gè)位點(diǎn)，若在同一枝條上接種，接種位點(diǎn)間距20mm以上，接種對(duì)照為蘸有無(wú)菌 水的濾紙片； (4) 接種后噴霧:接種后3小時(shí)內(nèi)，對(duì)接種植株進(jìn)行自來(lái)水噴霧30分鐘，提高環(huán)境濕度； (5) 發(fā)病調(diào)查:接種后30~90天，用游標(biāo)卡尺調(diào)查各接種部位的最大瘤徑、接種位點(diǎn)上 下兩端莖粗、計(jì)算瘤徑比； (6) 抗性分級(jí)與評(píng)價(jià):用單一植株的最大瘤徑比評(píng)價(jià)植株材料的根癌病抗性； (7) 個(gè)體抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)與群體抗性評(píng)價(jià)： 〇級(jí)，免疫:與對(duì)照無(wú)明顯差異，接種部位突起<1.〇mm，瘤徑比(接種后產(chǎn)生的最大冠癭 瘤直徑與接種部位枝條直徑比值)值為1，接種不發(fā)??； 1級(jí)，高抗:1<瘤徑比彡1.2; 2級(jí)，中抗:1.2<瘤徑比彡1.5; 3級(jí)，感?。?.5<瘤徑比彡2; 4級(jí)，中感:2<瘤徑比彡3; 5級(jí)，高感:瘤徑比>3; 對(duì)于群體評(píng)價(jià)，病情指數(shù)的計(jì)算如下： 病情指數(shù)=(Σ (各級(jí)感病苗數(shù)X相應(yīng)病級(jí))/調(diào)查苗總數(shù)X 5) X 100% 群體抗性分級(jí)如下： 免疫，病情指數(shù)為〇; 高抗，〇<病情指數(shù)<20; 中抗，20<病情指數(shù)<40; 感病，40<病情指數(shù)<60; 中感，60<病情指數(shù)<80; 高感，病情指數(shù)>80。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK106011222SQ201610343087
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】王新衛(wèi), 郝峰鴿, 王力榮, 朱更瑞, 方偉超, 陳昌文, 曹珂
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所